Rongeurs
Effet d’un nouveau médicament sur la croissance des tumeurs gastriques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tester une immunoglobuline administrée par la bouche sur des tumeurs de l'estomac suppose ici d'implanter la tumeur : 260 souris reçoivent des cellules cancéreuses injectées dans l'estomac au cours d'une chirurgie de dix à quinze minutes. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite un gavage quotidien pendant dix à quinze jours, une injection dans le ventre chaque jour pendant dix jours, et des séances d'imagerie sous anesthésie répétées. Le seul bénéfice avancé tient à la commodité de la prise orale pour les patients, et le porteur juge le recours aux animaux "indispensable" tout en indiquant avoir déjà vérifié in vitro la pertinence du modèle et l'absence de toxicité du produit.
Objectifs
Le développement des nouvelles thérapies pour le traitement des cancers reste un enjeu majeur. Parmi les nouvelles molécules thérapeutiques il y a les immunoglobulines de classe A qui ont un tropisme de distribution et d’action dans toutes les muqueuses de l’organisme dont le tractus digestif. Une de ces molécules a déjà montré des résultats encourageants chez des souris porteuses d’une tumeur d’adéno-carcinome colorectale avec une diminution de la tumeur. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de cette molécule sur des souris porteuses d’une tumeur à l’estomac.
Bénéfices attendus
Développement d’un nouveau médicament dont la prise orale facilite le traitement des patients.
Procédures
Chirurgie au niveau de l’estomac sur animal anesthésié : injection de cellules cancéreuses dans l’estomac, durée 10-15 minutes, geste réalisé 1 fois. Administration par voie orale sur animal vigile : durée 30 secondes, geste réalisé une fois par jour pendant 10 ou 15 jours. Injection dans le ventre sur souris vigile : durée 10 secondes, geste réalisé une fois par jour pendant 10 jours.
Impact sur les animaux
De façon plutôt rare, une infection de la plaie peut arriver suite à la chirurgie. Sinon, les nuisances peuvent provenir de : 1) Développement de la tumeur : douleur, gêne, impact sur l’appétit, perte de poids. 2) Le gavage répété : douleur lié au geste, impact sur l’appétit, perte de poids, stress. 3) Les injections intrapéritonéales : stress lié à la contention, douleur au site d’injection. 4) Les séances d’imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention, hypothermie.
Devenir
Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements post-mortem qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Nous souhaitons tester l’efficacité d’un médicament administré par voie orale sur la croissance d’une tumeur de l’estomac. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèles in vitro permettant de reproduire l’ensemble du tractus digestif dans un organisme aussi complexe que le corps. L’utilisation des animaux est donc indispensable. Néanmoins la pertinence du choix de notre modèle a été validé par des tests in vitro et l’absence de toxicité du produit a déjà été vérifiée.
Réduction
La 1ère étude de ce projet est une étude pilote qui permettra d’attester de l’efficacité ou non du nouveau médicament sur notre modèle. Si le résultat est négatif nous n’irons pas plus loin dans ce projet. Nous travaillerons à la fois sur des mâles et des femelles. Le suivi de la croissance tumorale et donc la visualisation de l’effet du traitement sur la taille de la tumeur se fera par imagerie non invasive permettant de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Un test statistique sera réalisé. Le nombre d'animaux pour l'étude a été déterminé en utilisant un logiciel dédié.
Raffinement
Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les actes expérimentaux seront réalisés sous anesthésie quand cela est nécessaire et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Une analgésie est mise en place au moment de la chirurgie et aussi en suivi post-opération si des signes de souffrance sont visibles. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix en imagerie optique. De plus cette espèce permet d’obtenir des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à partir d’un âge de 7 semaines correspondant à de jeunes adultes. A cet âge elles ont une taille raisonnable facilitant leur manipulation.
Etude de l’effet d’un traitement par RST-01 dans un nouveau modèle chronique de trouble de stress post-traumatique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Soumises à une stimulation électrique produisant un stress intense, puis ramenées quatre fois à ce même épisode pendant quatre minutes à chaque séance, 765 souris développent les symptômes recherchés d'un trouble de stress post-traumatique. Elles passent ensuite une série de tests comportementaux de cinq à quinze minutes et subissent plusieurs prélèvements sous contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'objet est de tester un dérivé de la mémantine contre ce trouble, puis de le comparer à la fluoxétine et à la sertraline, sans que les tests comportementaux employés soient nommés. Toutes sont tuées à la fin pour prélever tissus et fluides.
Objectifs
En 2024, 3,9 % de personnes sont atteintes de Trouble de Stress Post-Traumatique (TSPT) dans le monde selon l'Organisation Mondiale de la Santé dont 2 femmes pour 1 homme. Pour réduire les symptômes de ce trouble, de nombreux anti-dépresseurs sont utilisés. C'est le cas de la Kétamine qui a révélé des effets positifs chez des patients atteints de TSPT. Cependant elle a pu aussi mettre en avant chez le patient des effets secondaires important tels que des effets dissociatifs. D'autres molécules sont actuellement utilisées pour lutter contre la dépression telle que la Fluoxetine et la Sertraline. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes, la première d'entre elles étant de mettre au point des molécules similaires mais avec un bénéfice pharmacologique plus actif et sans effets secondaires. Une des pistes de traitement s'articule autour d'un dérivé direct de la Mémantine qui a eu des effets positifs sur des modèles de TSPT. Une question essentielle pour envisager le développement clinique de ce composé est de bien comprendre les spécificités et les conséquences pharmacologiques de ce traitement dans le TSPT. Ce projet a pour objectif de valider un nouveau modèle de TSPT chronique basé dans le but d’étudier la robustesse de l’induction de symptômes de TSPT chez la souris. Des marqueurs biologiques spécifiques du TSPT seront également analysés afin de caractériser le modèle. Une fois le protocole validé, le but sera de traiter les animaux avec ce dérivé à différentes doses et de la comparer dans un deuxième temps à la Fluoxetine et la Sertraline. Les marqueurs spécifiques qui reflètent la présence du TSPT dans le cerveau des souris seront analysés afin de déterminer si le traitement par ce dérivé de la Mémantine est susceptible de les modifier.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de valider un nouveau modèle de TSPT chronique et de révéler un effet positif de ce dérivé de la Mémantine sur les symptômes chronique de TSPT comparé aux molécules actuelles, et ainsi de faire progresser le développement pré-clinique d'un traitement plus efficace que celui utilisé aujourd'hui. A ce jour il n’existe aucun traitement pour le TSPT. Seuls les symptômes associés comme la dépression sont pris en charge. Il est donc important de trouver un traitement efficace suite à l’échec de la Kétamine en clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à un test de comportement suivi de 4 rappels afin d’induire les symptômes de TSPT (durée moyenne : 4-5min par test). Puis une série de plusieurs tests de comportement pour évaluer les différents symptômes de TSPT développés sera réalisée (durée moyenne : 5-15min par test). Plusieurs prélèvements sous contention seront effectués (durée : moins de 5 min). Une anesthésie générale sera réalisée pour effectuer des prélèvements sur l'animal (durée : moins de 15 min) puis lors de la mise à mort un prélèvement sera effectué.
Impact sur les animaux
Afin d’induire les symptômes de TSPT, certains animaux seront soumis à une stimulation électrique produisant soit un stress intense ou léger. Puis des séances de rappels seront réalisées pour réactiver ces éléments, produisant un stress léger à modéré pendant 4 minutes/rappel. Durant ces expériences, des prélèvements de sang auront lieu et engendreront un stress léger et sans lésion à l'animal. A la suite du protocole d’induction de TPST, plusieurs tests de comportement auront lieu, tests qui engendreront un stress léger de 5 à 15 minutes. Après ces tests de comportement, une anesthésie générale sera effectuée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter les tissus et fluides pour analyse et ainsi déterminer l’impact du traitement sur les marqueurs de la pathologie de TSPT.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours «in vivo» pour mîmer les symptômes pathologiques du TSPT et rechercher des biomarqueurs associés. En effet pour mîmer le TSPT chez l'humain et mesurer les différents paramètres évoluant lors de ce stress, certains points tels que le stress encouru, les impacts sur la mémoire, l'anxiété, la sociabilité, la perception douloureuse mais aussi le contexte de l'évènement traumatique (odeur, lieu) et les rappels de cet évènement ne peuvent être effectué que sur des modèles "in vivo".
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux à 16 par groupe et par sexe pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses de variances. Tous les tests comportementaux sont effectués sur les mêmes lots de souris pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous avons mis des options en fonction des résultats obtenues dans le but de réduire au maximum l’utilisation d’animaux pour notre étude.
Raffinement
Nous avons mis une option en fonction des résultats obtenues sur la perception douloureuse dans le but de réduire au maximum l’utilisation d’animaux pour notre étude mais surtout de s’assurer du bien-être de nos animaux. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 5 minutes par souris avant le début des expériences. Les animaux ayant subi un stress intense développent un phénotype anxieux mais on s’attend à ce que celui-ci soit modéré. Il sera révélé lors des différents tests comportementaux mais ne se traduit pas par des symptômes spontanés dans la cage d'hébergement. Si une altération de l'état est observée, une grille de score est utilisée pour identifier les points limites et déterminer la conduite à tenir.
Choix des espèces
Afin de refléter les symptômes du TSPT, la souris reste à ce jour un des modèles se rapprochant au plus près de l'humain et dont les capacités de mémoire, de stress, d'anxiété, de sociabilité et de perception douloureuse peuvent être étudiées en laboratoire. Les expériences débuteront sur des animaux de 10 semaines, âge adulte des souris.
ONCO-OT-Prostate : Evaluation de thérapies anti-cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées dans la prostate.
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 350
Jusqu'à 15 % d'animaux en plus sont inclus dans chaque étude pour former des groupes homogènes après la chirurgie. 2 800 souris et 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée directement dans la prostate sous anesthésie générale, une partie des animaux étant castrée lors d'une seconde intervention, avant des IRM d'une heure sous anesthésie et des traitements répétés par injection ou par voie orale. La société qui porte le projet se présente comme prestataire de services en recherche préclinique et affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité d'un candidat médicament, les reconstructions de tumeurs en 3D restant selon elle "marginales".
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer de la prostate est le deuxième plus mortel (environ 398 000 décès en 2022 pour environ 1,5 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer de prostate greffés directement au niveau de la prostate, les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
La greffe de la tumeur est faite sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). La castration des animaux sera réalisée sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min) L’IRM est réalisée sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités par injection (intraveineuse ou intrapéritonéale) ou par voie orale. Les traitements seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane), mais les animaux pourront être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si l’anesthésie est contre-indiquée. Les animaux seront immobilisés par une contention douce pour mesurer la taille des tumeurs (inférieur à 30 secondes) Les prélèvements de sang (1 minute) seront réalisés de préférence sous anesthésie générale (isoflurane) mais les animaux pourront également être immobilisés ponctuellement par une contention douce ou à l’aide d’un tube à contention si le geste est rapide (inférieur à 30 secondes) et génère moins de stress à l’animal que l’anesthésie générale elle-même.
Impact sur les animaux
- La castration pourra entrainer une douleur et une gêne modérée pendant 1 ou 2 jours - L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur lié une gêne, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite. Il est possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs, du poids et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. -A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger de 1 à 2 jours. -Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. L’injection intraveineuse, intrapéritonéale ou per os pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.
Devenir
Sachant que les animaux sont porteurs de tumeurs, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera deux groupes avec tumeur, un groupe contrôle (non traité ou traité avec le véhicule) et un groupe traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 5 à 15 animaux. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).
Raffinement
Les animaux sont pesés et le volume tumorale est estimé 2 fois/semaine minimum. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond des cages après les chirurgies et dès l’observation d’une perte de poids >10%. Une réhydration sera mis en place par perfusion sous cutanées et/ou alimentation humide pour les souris si necessaire. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. Les chirurgies sont réalisées sur matelas chauffants jusqu’au réveil de l’animal. La greffe est réalisée en condition aseptique sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique opiacé 30 min avant et un anesthétique local. Les animaux reçoivent une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien en pré-opératoire et post-opératire et des soins adaptés.. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible. Certaines administrations sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations de la SBEA. Dans le cas de chirurgie sans réveil une anesthésie profonde est réalisée avec administration d’un analgésique local (lidocaïne et bupivacaïne), d’un alpha2 agoniste et d’un opiacé débutée 30min avant la chirurgie. Les principaux points limites sont listés en détail dans les procédures. Si des signes cliniques sont observés, l’animal est mis en observation et un traitement est mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.
Radiothérapie vectorisée pour le traitement des cancers chez la souris : évaluation thérapeutique de nouveaux radiopharmaceutiques dans des modèles de tumeurs ectopiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
La nécrose de la tumeur greffée constitue le point limite qui déclenche la mise à mort. 750 souris au maximum vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures classées comme légères, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et les organes. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales, puis un radiopharmaceutique émetteur alpha dans la veine de la queue, et jusqu'à huit prélèvements de sang étalés sur 150 jours. Le porteur écrit que la tumeur, laissée pousser jusqu'à un volume qu'il compare à un kyste sur le flanc, n'entraîne ni gêne ni douleur, et classe les trois étapes du protocole en intervention légère.
Objectifs
L’objectif de notre projet est de développer de nouveaux traitements contre le cancer en radiothérapie interne vectorisée (RIV). La cible à détruire est la cellule tumorale, l’arme est le radioélément qui va émettre un rayon « toxique » pour cette cellule. L’élément radioactif est lié à une molécule qui reconnaît spécifiquement la tumeur afin de former un radiopharmaceutique, qui doit cibler et détruire la tumeur, tout en minimisant l’impact sur les tissus sains. Divers radiopharmaceutiques élaborés par notre équipe serons testés : nous disposons de différentes molécules couplées à différents éléments radioactifs emmeteurs alpha. Au maximum 3 radiopharmaceutiques seront testés par ans soit 15 maximum sur 5 ans..
Bénéfices attendus
La radiothérapie interne vectorisée (RIV) utilise principalement des émetteurs β-. L’utilisation d’émetteurs α, est une approche prometteuse pour améliorer cette thérapie vectorisée : les émetteurs α ont un parcours plus court dans la matière, à une énergie plus haute, que les émetteurs β-. L’énergie délivrée à la tumeur est donc plus importante, avec une meilleure épargne des tissus sains adjacents. Ce projet devrait permettre le développement de nouveaux radiopharmaceutiques plus efficaces et avec moins d’effets secondaires.
Procédures
Sur 5 ans 450 à 750 souris vigiles (maximum) reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales . Ces mêmes souris vigiles reçoivent une injection intraveineuse de radiopharmaceutique dans la veine latérale de la queue. Trois souris par groupe de 10 seront imagées 1 à 3 fois durant le protocole sous gaz anesthésiant pour 11 minutes d’imagerie (dans cellule d’imagerie chauffante avec du gel de protection oculaire). Pour chaque souris, un suivi d’hémato-toxicité sera réalisé (globules blancs, globules rouges plaquettes) par prélèvement de sang (40µl à J-7, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150) sous gaz anesthésiant et analgésique local (collyre tétracaïne). L'ensemble de la procédure durera 4 semaines à 150 jours.
Impact sur les animaux
La procédure de ce projet ne contient que des interventions légères. L'étape 1 : la greffe de tumeur en sous cutané est classée en procédure légère, elle n’entraine pas de douleur au volume maximum fixé , sauf en présence de nécrose qui est un point limite déterminé dans le projet. L'étape 2 : injection du radiopharmaceutique en intraveineuse n’est pas douloureuse, et les doses choisies non toxiques, c'est donc une intervention légère. Enfin l'étape 3 : suivi de l'efficacité du traitement : on ne laisse ne pousser tumeur que jusqu'à un volumemaximum équivalent d’un kyste sur le flanc qui n’entraîne pas de gène ni de douleur. Afin de limiter au mieux la nuisance pouvant être générée lors des prises de sang, celles ci sont faites sous anesthésie gazeuse, durent moins d’une minute et une goutte de tétracaïne est déposée pour insensibiliser la zone.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux. L'ensemble des animaux de la procédure doivent être mis à mort afin de prélever la tumeur et leurs organes pour analyse histologique. Ces prélèvement permettent de s'assurer de l'absence de toxicité des traitements.
Remplacement
Remplacer : la pathologie cancéreuse étant une pathologie complexe, il n’existe pas à ce jour de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui prennent en compte le microenvironnment , le sysème immunitaire, le corps dans toute sa globalité.
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées. Pour l'analyse des résultats, tous les tests statistiques seront réalisés sous Prism.
Raffinement
Pour chaque procédure, les souris bénéficient d’une période d'acclimatation d'une semaine. Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne selon une grille de score et de points limites qui permet de déterminer le palier de douleur (4 paliers allant de 0, absence de douleur, à 3, douleur sévère). L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. Afin de limiter au mieux la nuisance pouvant être générée lors des prises de sang, celles ci sont faites sous anesthésie gazeuse, durent moins d’une minute et une goutte de tétracaïne est déposée pour insensibiliser la zone. L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Après l’injection du traceur, l’animal est remis dans sa cage où il a libre accès à l’eau et à la nourriture pendant le temps nécessaire à la biodistribution du traceur (1h à 72h). Pendant l’acquisition d’imagerie, les souris sont anesthésiées durant les 11 minutes de l’examen sous isoflurane/O2. Elles sont placées dans une cellule d’imagerie chauffante à 37°C et une goutte d’ocrygel est déposée sur leur yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Elles sont remplacées dans leur cage dès le réveil avec libre accès à la nourriture et à l’eau
Choix des espèces
Leur petite taille, leur grande fécondité et leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font des animaux de choix. De plus, de nombreux modèles de tumeurs syngéniques ont été développés chez la souris : tumeur de souris greffée dans la souris, en opposition à tumeur xénogénique qui est une greffe entre 2 espèces différentes. Par ailleurs, l’existence de souches de souris immunodéprimées (souris dont le système immunitaire est défaillant et qui permet le développement d’une tumeur d’une autre espèce) permet de développer des modèles de tumeurs à partir de cellules humaines. Les tumeurs greffées en sous cutané sont des tumeurs du sein, de prostate, de myélome multiple, de poumons, de colon ou de leucémies aigues myéloïdes. Ces pathologies touchent les personnes adultes. C’est pourquoi on utilise des souris adultes. Les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe.
Développement de modèles de souris humanisées pour étudier la transformation de cellules sanguines humaines normales en leucémies aiguës pédiatriques et identifier des nouvelles possibilités thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Irradiées puis greffées avec des cellules sanguines humaines, 960 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 480 d'entre elles portant deux mini-os humains implantés sous la peau. Pour 240 souris, le protocole prévoit vingt injections, quarante administrations par voie orale et quinze séances d'imagerie sous anesthésie, et 480 subissent un prélèvement de moelle osseuse au fémur. Le porteur écrit qu'il est facile de mesurer la souffrance de la souris et d'y remédier rapidement, et indique dans la même demande que le développement de la leucémie entraîne une paralysie du train arrière. Toutes seront tuées pour prélever moelle osseuse, rate, colonne vertébrale et ossicules.
Objectifs
L’hématopoïèse est un processus finement régulé qui aboutit à la production de toutes les cellules sanguines, à partir de cellules souches et de progéniteurs (CSPH) localisés, chez l’adulte, dans la moelle osseuse. Nous souhaitons tester l’hypothèse selon laquelle certaines anomalies génétiques décrites dans des leucémies de l’enfant peuvent transformer des CSPH humaines normales. Il est établi que les caractéristiques fonctionnelles et d'expression des CSPH changent durant le processus de formation du système sanguin, débutant dans l'embryon et se concluant à l'âge adulte. Nous avons également montré que des facteurs solubles produits notamment par la moelle osseuse participent grandement au développement leucémique. La poursuite de notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes du développement leucémique à partir de cellules humaines sensibles à la transformation, ainsi que d’évaluer plus précisément la contribution de la moelle osseuse, dans ce processus et dans la réponse aux traitements. Pour cela, nous utiliserons des CSPH humaines dans lesquelles sera exprimée génétiquement une fusion entre deux gènes, découverte dans des leucémies de l’enfant et distinctes de celles de l’adulte, nous les transplanterons dans des modèles de souris receveuses permissives aux greffes de cellules d’origine étrangère dans lesquelles nous aurons implanté ou pas des petits fragments de moelle osseuse humaine normale (appelés ossicules). Les objectifs du projet sont les suivants : Objectif 1 : Définir la cellule à l’origine de la transformation leucémique chez l’enfant Nous voulons définir la ou les CSPH humaines sensibles au développement leucémique sous l’influence de la fusion génique d’intérêt, afin de mieux comprendre dans quel type cellulaire la pathologie est initiée. Objectif 2 : Etudier le rôle la moelle osseuse humaine sur le développement leucémique Nous voulons étudier l’influence de moelle osseuse humaine, avec des modèles appelés ossicules, sur le développement de la leucémie induite par l’anomalie génique étudiée. Objectif 3 : Etudier le rôle de la moelle osseuse humaine sur la réponse à des traitements Nous étudierons l’influence des modèles, appelés ossicules, sur la réponse des cellules leucémiques à une thérapie ciblée identifiée récemment.
Bénéfices attendus
Les leucémies pédiatriques liées à une anomalie génétique spécifique touchent surtout les très jeunes patients, et malheureusement, il n'existe pas encore de traitement ciblé pour ces cas. Dans nos recherches précédentes, nous avons découvert que les cellules sanguines fœtales sont plus sensibles au développement de la leucémie que des cellules sanguines post-natales, et que l'environnement autour de ces cellules joue un rôle important dans ce processus. Cependant, de nombreuses questions sur la manière dont cette transformation se produit restent encore sans réponse. Le projet que nous souhaitons développer vise à mieux comprendre cette maladie. Les modèles que nous proposons sont essentiels pour découvrir comment la leucémie se développe à partir de cellules humaines et permettront de mieux refléter la complexité de cette maladie dans un organisme vivant, comme la souris. Dans le cas de la leucémie associée à l’anomalie génétique étudiée, notre projet pourrait également aider à mettre au point et tester de nouveaux traitements spécifiques qui doivent d'abord être validés sur des modèles précliniques avant de pouvoir être proposés aux patients. À plus long terme, ces modèles pourraient également être adaptés pour étudier d'autres maladies infantiles, notamment des leucémies liées à d'autres anomalies génétiques. Cela permettrait de proposer de nouveaux protocoles de traitement, essentiels pour ces différentes maladies infantiles.
Procédures
1 Irradiation en vigile : 2min, 960 animaux 1 Injection de cellules humaines sous anesthésie : 2min, 960 animaux 1 Prélèvement de moelle osseuse sous anesthésie : 5min, 480 animaux 1 Prélèvement de sang sous anesthésie : 3 min, 720 animaux 1 Injection de cellules humaines qui constitueront les mini-os humanisés sous anesthésie : 5min, 480 animaux 20 Injections de molécules sur animal vigil : 1min, 240 animaux 2x20 Traitements par la voie orale sur animal vigil : 2min, 240 animaux 15 Suivis du traitement sous anesthésie par bioluminescence : 10min, 240 animaux
Impact sur les animaux
-L'irradiation avant la transplantation provoque une anémie qui dure environ dix jours. - Les prélèvements de sang et de moelle osseuse à l’os du fémur peuvent causer des douleurs localisées, précocement après que le geste ait été fait. -Les mini-os humanisés implantés sous la peau des souris peuvent causer une gêne localisée. -le suivi de la progression de la maladie par bioluminescence peut entrainer un stress -les traitements par gavage ou injection sous-cutanée peuvent entrainer stress et inconfort/douleur localisé (point d’injection) -le développement de la leucémie entraine une paralysie du train-arrière.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédures. Les tissus/organes hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, colonne vertébrale, ossicules) seront prélevés et les cellules qui y sont contenues seront soumises à une caractérisation qui nous permettra d’identifier la quantité et la qualité des cellules leucémiques présentes dans les organes en question. Cela permettra de comparer les différents groupes de souris afin de pouvoir tirer les conclusions suite à nos observations.
Remplacement
Dans le cadre de l’étude des leucémies, l’expérimentation sur des animaux, comme les rongeurs, est essentielle pour comprendre comment la maladie se développe dans un patient. Les méthodes de culture cellulaires (in vitro) ne permettent pas de reproduire fidèlement tous les mécanismes qui se ont lieu dans un corps vivant. Les modèles animaux, et notamment les souris, sont les seuls à pouvoir imiter fidèlement les processus complexes comme la migration et le développement des cellules sanguines, qu’elles soient saines ou malades. Bien que nous utilisions des systèmes de culture en laboratoire aussi souvent que possible, ils ne reproduisent pas toutes les étapes du développement de la leucémie, que ce soit dans la moelle osseuse ou dans d'autres organes. En plus, ces modèles de culture ne démontrent pas le processus complet de transformation en leucémie, contrairement aux modèles vivants (in vivo). C'est pourquoi les expériences sur les rongeurs sont indispensables et complètent les stratégies de culture en laboratoire. En plus de cela, ce projet vise à proposer un traitement qui devra être testé sur ces modèles animaux avant de pouvoir être utilisé chez les patients.
Réduction
Nous avons à cœur de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Les groupes d’étude comprendront entre 8 et 10 souris par groupe. Chaque expérience sera réalisée 2 ou 3 fois de manière indépendante afin d’obtenir des résultats fiables d’un point de vue statistique. Si les résultats de deux expériences sont statistiquement significatifs, nous pourrons décider de ne pas réaliser une troisième expérience. Lorsque nous devons tester plusieurs traitements en suivant la même procédure, nous réaliserons les expériences en même temps pour comparer tous les groupes avec un seul groupe témoin. Cela permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’utilisation du modèle d’ossicules (mini-os humanisés) permet aussi de limiter le nombre d’animaux. Chaque souris portera 2 ossicules (un sur chaque flanc), ce qui nous permettra d’augmenter le nombre d’ossicules testés sans avoir besoin d’utiliser plus de souris.
Raffinement
Les animaux utilisés pour atteindre les objectifs du projet seront régulièrement surveillés par l’équipe et le personnel animalier afin de repérer tout changement de comportement et éviter autant que possible toute douleur, souffrance ou stress inutile. Afin d’améliorer le bien-être des souris vis-à-vis des potentiels souffrances et angoisses liées aux manipulations expérimentales, les souris affaiblies seront supplémentées avec de l’hydrogel et de la nourriture humidifiée déposée directement dans la cage en plus de leurs nids en coton et des tubes en cartons pour plus de confort. Un analgésique sera donné lors du prélèvement de sang et de moelle osseuse réalisé pour apprécier le développement leucémique. Les injections de cellules et les prélèvements sanguins et médullaires seront réalisés sous anesthésie générale. Des critères, appelés points limites, seront définis pour assurer le bien-être des animaux et limiter leurs souffrances en cas de progression irréversible de la maladie.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère facile à élever et à reproduire en captivité. Comme sa génétique et son comportement sont bien connus, il est facile de mesurer son bien-être, sa souffrance et son stress et d’y remédier rapidement. Cela en fait un excellent modèle pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. De plus, la souris partage 99% de ses gènes avec l’être humain, ce qui permet de transposer plus facilement les résultats obtenus chez la souris aux pathologies humaines, aidant ainsi à améliorer leur compréhension et leur traitement. Enfin, les souris reproduisent les étapes principales du développement des leucémies, ce qui en font de bons modèles d’étude, en particulier de traitements. Les souris que nous utiliserons dans ce projet sont des souris immunodéficientes (qui n’ont pas de système immunitaire fonctionnel), qui peuvent recevoir des greffes de cellules sanguines humaines, qu’elles soient normales ou leucémiques. Ces souris, élevées dans des conditions spécifiques, ne présentent pas les défauts associés à leur immunodéficience. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines, qui, selon les recherches de notre laboratoire, montrent une excellente capacité à accepter des greffes après injection, que ce soit pour des cellules normales ou malades.
Étude de l’impact des anticorps anticontactine 1 sur la fonction rénale chez le Hamster
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Un rein retiré chirurgicalement en début d'expérience pour concentrer l'effet des anticorps sur celui qui reste : 42 hamsters dorés vont être utilisés pendant 77 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent six injections d'anticorps humains dans le sang, subissent des prélèvements de sang et d'urine deux fois par semaine, et sont isolés quatre heures à chaque recueil urinaire. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer un syndrome néphrotique, avec œdèmes, perte de poids, troubles du rythme cardiaque, hypertension et perte de motricité. Le hamster a été retenu après le constat que souris, rats, lapins et cobayes n'expriment pas la protéine visée dans le rein, le porc l'exprimant aussi mais étant jugé moins facile à élever.
Objectifs
La polyneuropathie démyélinisante chronique (PIDC) est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux. Des recherches ont identifié plusieurs cibles d’anticorps auto-immuns, notamment des protéines présentes à la surface des neurones, comme la contactine 1. Chez certains patients, une PIDC survient en parallèle d’une maladie auto-immune rénale appelée glomérulopathie extramembraneuse (GEM), une pathologie dont l’évolution clinique peut être variable, allant parfois jusqu’à une perte totale de la fonction rénale. Bien que la co-occurrence de ces deux maladies ait été fréquemment observée, leur lien direct n’a jamais été formellement établi dans la littérature scientifique. Récemment, la contactine 1 a été détectée dans les petits amas de vaisseaux sanguins qui participent à la filtration rénale. Par ailleurs, des anticorps dirigés contre la contactine ont été identifiés simultanément dans le nerf et le rein, renforçant l’hypothèse d’un mécanisme commun. L’objectif principal de ce projet est de confirmer, à l’aide d’un modèle hamster, le rôle des anticorps anti-contactine 1 dans le développement de cette maladie rénale. Il s’agit également d’analyser les dysfonctionnements cliniques et tissulaires provoqués par ces anticorps afin de mieux comprendre cette pathologie. Les résultats de cette étude pourraient permettre d’améliorer les outils de diagnostic et de proposer des traitements adaptés pour les patients humains souffrant de cette maladie complexe.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de confirmer l'implication des anticorps anti-contactine et leur lien avec le développement d’une atteinte rénale induisant des modifications biochimiques et histologiques. Ce travail de recherche ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la glomérulopathie extramembraneuse ainsi que dans le développement de tests de dépistage et d’évaluation de la maladie si le rôle pathogène des anticorps est confirmé et si leur concentration a une valeur pronostique.
Procédures
Les animaux seront impliqués dans une seule procédure qui se déroulera en plusieurs étapes sur une durée de 77 jours. Des injections d'anticorps dans la circulation sanguine des animaux auront lieu 6 fois au cours des 77 jours pour induire une maladie rénale. Des prélèvements sanguins et urinaires auront également lieu deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'étude. Les injections et les prélèvements réalisés deux fois par semaine ne dureront pas plus de 10 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour chaque intervention afin d'éviter la douleur et diminuer leur angoisse. L'un des deux reins des animaux sera retiré en début d’expérimentation pour optimiser l’action des anticorps sur le rein restant. Cette chirurgie ne durera pas plus d'une heure et sera réalisée sous anesthésie générale avec une gestion rigoureuse de la douleur.
Impact sur les animaux
Les hamsters pourront ressentir un léger stress lors des injections de substances (anesthésiques, anticorps) ou des prélèvements. Les injections d'anticorps pourraient entrainer l'apparition d'un syndrome néphrotique . Ainsi, ces injections peuvent provoquer différents symptômes : fatigue, oedèmes, perte de poids, troubles du rythme cardiaque, hypertension artérielle ainsi que des atteintes neurologiques et une perte de la motricité des animaux. La chirurgie visant à réaliser une néphrectomie peut provoquer des douleurs post-opératoires, un risque d'infection, des anomalies de la coagulation, des troubles électrolytiques, une anorexie, une léthargie et une déshydratation. De plus, les animaux seront isolés en moyenne deux fois par semaines pendant 4 heures afin de prélever leurs urines, cela pouvant provoquer du stress et de l'angoisse chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure puisque leurs organes sont nécessaires à l'étude de la pathogénicité des anticorps anti-contactine1.
Remplacement
L’objectif principal de cette étude est de démontrer que l’injection des anticorps anti-contactine1 humains induit chez le Hamster des altérations neurologiques et de la fonction des reins similaires à celles observées chez l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif.
Réduction
Le modèle de Hamster visant à recréer une maladie rénale avec des injections d'anticorps étant unique, il est difficile de prévoir quels seront les changements sur les différents paramètres cliniques et anatomopathologiques testés. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum à 14 animaux par groupe en utilisant les données publiées chez l’homme.
Raffinement
Nous attachons une importance majeure sur les conditions d’hébergement et la qualité de vie des animaux. C’est pourquoi, une période d'acclimatation d'une semaine sera mise en place à l’arrivée des animaux. Ils seront hébergés en groupe afin de limiter leur stress. Pour les phases d'injections de substances et de prélèvements, une anesthésie sera réalisée afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal. Lors des quelques gestes possiblement douloureux, un antidouleur sera administré à l’animal. Dans le but de préserver le bien-être des animaux, nous avons prévu de mettre en place des critères d’interruption des interventions expérimentales basées sur des paramètres mesurables non invasifs.
Choix des espèces
Nous avons préalablement recherché in vitro la contactine dans les reins des animaux utilisés en routine dans les animaleries souris, rats, lapins et cochons d’Inde mais aucun d’entre eux n’exprime la contactine dans le rein. Seul le Hamster et le porc expriment cette protéine dans leur reins. Notre choix s'est ensuite porté sur le modèle hamster car plus facile à élever. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 10-14 semaines, pour des raisons techniques (poids entre 100-120g), permettant des groupes homogènes.
Développement d’un modèle murin induit de sclérodermie systémique (SSc) et de colonisation par la bactérie Porphyromonas gingivalis (Pg) pour évaluer l’impact de la parodontite expérimentale sur la physiopathologie de la SSc
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées de bléomycine cinq jours par semaine pour provoquer un durcissement de la peau, une inoculation quotidienne de Porphyromonas gingivalis dans la bouche, et pour une partie d'entre elles la pose de ligatures autour de quatre molaires trois fois par semaine sous anesthésie générale. Le porteur décrit la pose des ligatures comme non douloureuse et précise dans la même rubrique qu'aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré, ces médicaments risquant d'interférer avec les résultats. Sur le remplacement, il écrit que la règle "n'est pas applicable dans le cas de ce projet".
Objectifs
La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune rare qui touche près de 10000 personnes en France, principalement les femmes. Elle est caractérisée par une fibrose des tissus (la peau notamment), des anomalies des vaisseaux et une dérégulation du système immunitaire. La cause n’est pour le moment pas connue. Un dérèglement du microbiote, avec un déséquilibre entre les bactéries positives et négatives de notre flore microbienne (appelé dysbiose), a été impliqué dans le développement de nombreuses maladies autoimmunes, dont la sclérodermie systémique. La parodontite est une pathologie inflammatoire d’origine infectieuse très répandue dans la population mondiale, puisqu’elle touche plus de 50% de la population âgée de plus de 50 ans. Elle se caractérise par une infection et une inflammation des tissus de soutien des dents appelé parodonte, qui comprend la gencive, l’os alvéolaire et le ligament alvéolodentaire. La parodontite aboutit au déchaussement, voire à la perte des dents. Elle est la conséquence d’un déséquilibre du microbiote parodontal. La bactérie Porphyromonas gingivalis joue un rôle clé dans cette pathologie. Notre hypothèse est que la dysbiose du microbiote parodontal et en particulier la présence de la bactérie Porphyromonas gingivalis pourrait représenter un facteur de risque et avoir un impact sur le développement de la sclérodermie systémique. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de souris permettant d'étudier l'impact de la dysbiose du microbiote parodontal dans le développement de la sclérodermie systémique.
Bénéfices attendus
La cause de la sclérodermie systémique n’est pour le moment pas connue, mais les facteurs environnementaux, et notamment certains microorganismes, jouent un rôle dans le déclenchement de la maladie. La mise en évidence de l’implication d’une dysbiose du microbiote parodontal, et en particulier de la bactérie Porphyromonas gingivalis, dans le développement de cette maladie autoimmune rare permettra ainsi d’améliorer la compréhension de la sclérodermie systémique, ce qui nécessaire pour pouvoir développer de nouveaux traitements dans le futur. Il n’existe en effet pour le moment pas de traitement permettant de guérir cette pathologie, qui a un fort impact sur la qualité de vie et la survie des patients
Procédures
Les animaux sont soumis à une injection sous-cutanée de bléomycine (réalisée 5 jours par semaine), qui est une molécule ayant pour effet de provoquer une fibrose de la peau, afin de reproduire la sclérodermie systémique. La réalisation de ces injections est rapide (moins de 2 minutes). Pour induire la dysbiose du microbiote parodontal, une partie des souris sera soumise à une inoculation quotidienne avec une solution contenant la bactérie Porphyromonas gingivalis, qui sera appliquée uniquement au niveau de la bouche à l’aide d’une canule à bout mousse. Chez l'autre partie des souris, une pose de ligatures imbibées avec une solution contenant la bactérie Porphyromonas gingivalis sera en plus réalisée autour des molaires maxillaires 3 fois par semaine, afin de reproduire une parodontite. La pose des ligatures au niveau de 4 molaires est un geste nécessitant un temps d'une dizaine de minutes en tout. Les animaux seront également soumis à des prélèvements sanguins qui seront réalisés toutes les 2 semaines et qui nécessitent un temps inférieur à 5 minutes. La plupart de ces procédures (injections initiales de bléomycine, pose des ligatures, prélèvements sanguins) sera réalisée sous anesthésie générale, à l’exception de l’inoculation buccale de la bactérie Porphyromonas gingivalis, qui est une application rapide d’un petit volume de solution au niveau de la bouche de l’animal, et des injections de bléomycine après habituation de l’animal à une récompense.
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées de bléomycine initiales, le placement des ligatures imbibées de la bactérie Porphyromonas gingivalis, et les prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés sur animal anesthésié (anesthésie générale par injection de kétamine/xylazine ou anesthésie gazeuse à l'aide d'isoflurane). Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes a toute anesthésie. L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser les gestes à l'état vigile. La bléomycine est glycopeptide qui induit une inflammation et une fibrose cutanée progressive lorsqu’il est injecté par voie sous-cutanée. Les animaux vont donc développer une fibrose au niveau de la zone d’injection, c’est-à-dire au niveau du haut du dos. Porphyromonas gingivalis est une bactérie qui est impliquée dans le développement d’une inflammation gingivale. L’induction de la parodontite par Porphyromonas gingivalis n’est cependant pas assez longue pour obtenir une destruction complète de l'os qui soutient les dents et donc une mobilité ou une perte de dents chez les souris. La parodontite induite n’entravera pas l’alimentation des souris. Un suivi quotidien du bien être des animaux et de leur poids sera mis en place dès le début des procédures grâce à une grille de suivi comprenant des points limites.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans les procédures sera mis à mort à la fin des procédures (prélèvement post mortem de différents organes afin de réaliser les différentes analyses) ou en cas d'atteinte des points limites.
Remplacement
La règle du remplacement n'est pas applicable dans le cas de ce projet. En effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier l’impact de la bactérie Porphyromonas gingivalis sur la physiopathologie de la sclérodermie systémique. Nous étudions notamment les réponses immunitaires et la production d'autoanticorps, qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à l'utilisation de modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire ainsi que les mécanismes physiopathologiques parodontaux, car les connaissances et les outils d’analyse chez la souris sont très développés dans les domaines de l'immunité et de la parodontologie.
Réduction
Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. Nous nous basons sur des protocoles déjà bien établis dans la littérature. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques appropriés. Le nombre minimal d'animaux par groupe expérimental pour chaque question posée a été calculé et il est de 5 à 14 animaux par groupe. Toujours dans un souci de réduction, le nombre d’animaux exact nécessaire pour chaque procédure sera commandé auprès de fournisseurs agrées et nous ne réaliserons pas de croisements.
Raffinement
Nous porterons une attention particulière au bien-être animal notamment via le raffinement des conditions d’hébergement. Les groupes de souris utilisés pour les expériences seront placés dans les cages expérimentales à couvercle filtrant (6 maximum par cage) avec enrichissement (tubes en polycarbonate rouge translucides, nids, frisures de carton...) sur des portoirs ventilés deux semaines avant le début des procédures, afin de réduire au maximum le stress animal. Une habituation à la manipulation sera réalisée de façon quotidienne après la première semaine d’acclimatation, jusqu’au début de la procédure. Certaines procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront pesés et suivis quotidiennement à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décritz pour chaque procédure, afin de les soustraire à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites specifiques. Des soins péri- et post-opératoires seront également réalisés. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante (37°C) immédiatement après les anesthésies afin de maintenir leur température corporelle jusqu’à leur réveil de l'anesthésie. Une application de gel au niveau des yeux sera réalisée à intervalles réguliers jusqu’au réveil pour lubrifier la surface oculaire et de prévenir la déshydration, ainsi que l’apparition d’éventuelles lésions de la cornée. La pose des ligatures au niveau des molaires n'est pas une procédure douloureuse. Elle nécessite cependant d’être réalisée sous anesthésie générale car elle nécessite le maintien d'une ouverture buccale de la souris pendant quelques minutes. Nous ne pourrons cependant pas administrer d'anti-inflammatoires en cas de douleur, car ces médicaments pourraient interférer avec les expériences réalisées. Cependant, les gestes réalisés et notamment la pose de ligatures ne sont pas des gestes douloureux et ne nécessitent pas la mise en place d'un traitement antalgique.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé en immunologie, en particulier dans le domaine de l'auto-immunité, le système immunitaire des souris étant proche du système immunitaire humain. Nous disposons de nombreuses techniques d'analyse du système immunitaire chez la souris et de l'expérience requise pour le suivi des réponses immunitaires chez la souris, ce qui nous permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous utiliserons des souris âgées entre 8 et 12 semaines, qui sont des souris avec système immunitaire complètement mature et chez qui la croissance osseuse du maxillaire et la physiologie du parodonte sont établies.
Traitement des conséquences neuropathologiques de la déficience en méthionine synthase
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester un traitement pharmacologique contre les troubles neurologiques liés à une carence génétique en vitamine B12, 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré : 20 femelles reproductrices qui reçoivent le composé par voie orale et leurs 40 descendants. Chaque souriceau subit une biopsie de peau dès l'âge de six jours pour déterminer son génotype, puis six tests comportementaux étalés sur trente et un jours. Les 40 descendants seront tués à 36 jours pour prélèvement de tissus, les 20 mères étant gardées vivantes et proposées à d'autres projets. Le porteur qualifie ces six tests de standardisés et non invasifs sans jamais dire lesquels.
Objectifs
Une carence en vitamine B12 est associée à de nombreux troubles neurologiques et comportementaux. Cependant, les mécanismes mis en jeu sont encore mal connus, et les traitements souvent inefficaces. C’est pourquoi nous avons développé au laboratoire un modèle animal où la carence est reproduite par invalidation d’un gène qui correspond à la maladie humaine. Ce gène joue un rôle central en lien avec la vitamine B12 et des troubles neurologiques variés (retard développemental, atrophie cérébrale, hypotonie, crises d'épilepsie, ataxie). Nous proposons un nouveau traitement pharmacologique qui a déjà été testé avec succès sur cultures cellulaire. Ce traitement non toxique semble plus efficace que le traitement actuel basé sur une « simple » compensation en vitamine B12. Il est maintenant nécessaire de l’évaluer sur individu vivant.
Bénéfices attendus
Actuellement, le traitement de référence de la déficience génétique liée à la carence en vitamine B12 est représenté par des injections intra-musculaires de vitamine B12. Cependant les patients jeunes enfants « bons répondeurs » à ce traitement représentent un très faible pourcentage. Ainsi, les conséquences pour les enfants malades sont délétères à moyen terme et de nombreux décès sont constatés après quelques mois ou années tout au plus. La nouvelle approche via le nouveau traitement pharmacologique pourrait, d'après les résultats positifs sur cultures cellulaires, maintenir la survie cellulaire, et empêcher la dégradation de l’activité neuronale.
Procédures
Les souris femelles reproductrices seront traitées par administration orale d'un faible volume de solution pharmacologique. Les descendants seront testés dans 6 tests comportementaux standardisés non invasifs de 5 jours à 36 jours d'âge. L'objectif de ces tests est de quantifier l'activité générale, l'état de stress éventuel, les capacités de mémoire et l'état psychique. Les tests durent de 2 à 5 minutes maximum et seulement 1 test sera effectué par jour avec un étalement sur 31 de ces 6 tests (pas de cumul journalier).
Impact sur les animaux
La genèse d'animaux qui miment les effets génétiques humains n'engendre pas d'effet physique notable. La croissance des individus est identique entre les individus expérimentaux et témoins. L’administration pharmacologique chez les femelles adultes génitrices pourrait être considéré comme inconfortable, cependant réalisé par une personne habilitée et expérimenté dans ce geste, elle est de courte durée (quelques secondes) et la répétition correspondra à une habituation. Le fond génétique des souriceaux devant être connu, un prélèvement de peau dit biopsie est réalisé sur chaque individu à partir de 6 jours d’âge. Ce prélèvement peu générer une douleur légère de courte durée. Les tests comportementaux pourraient ponctuellement générer des effets, cependant ceux-ci ont déjà été proposés et validés dans de précédents projets. Ces tests sont standardisés en neurobiologie, sont observationnels plutôt que interventionnistes sur l’animal et ne génèrent pas ou très peu de stress ou inconfort. La forte caractéristique d'exploration des rongeurs permet de supposer un intérêt de ceux-ci pour la découverte de nouveau environnements (dispositifs expérimentaux), par rapport aux cages d'hébergement.
Devenir
Les 20 mères souris seront gardées en vie et soit retournées à l'animalerie, soit proposées pour d'autres projets. Les 40 descendants seront mis à mort à 36 jours d'âge pour prélèvement de tissus.
Remplacement
Ce projet est centré sur les mécanismes liés aux dysfonctionnements comportementaux ; aussi il n’est pas possible d’investiguer autrement qu’avec des individus vivants. Une étude sur animal entier est nécessaire pour évaluer l'effet du traitement pharmacologique. Une étude de non-toxicité a déjà été effectuée sur culture cellulaire de patients atteint de cette pathologie.
Réduction
Nos précédents résultats ne montrent pas d'effet du sexe, ainsi dans ce projet, nous ne considérons pas le sexe comme un paramètre de premier ordre pour évaluer les effectifs. Nous prévoyons 2 groupes de traitement (contrôle et médicament), et 2 génotypes (contrôle et muté), donc 4 sous-groupes à comparer entre eux. Grace à un logiciel prédictif, nous obtenons par calcul un effectif total de 40; d’où 10 souris par groupe. Pour obtenir cet effectif, et selon le génotype des animaux de croisement, il est difficile de prévoir strictement le nombre de descendants obtenu de chaque génotype. Nous prévoyons d'utiliser jusqu'à 20 femelles adultes pour la reproduction et réparties également selon les deux groupes expérimentaux : contrôles et traitées par médicament. Dès l'obtention de 10 descendants par groupe expérimental (40 descendants au total), nous cesserons les croisements. Les animaux géniteurs retournerons dans l’effectif d’animaux d'élevage ou seront proposés pour d'autres projets de recherche ou d'enseignement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés, en cycle de lumière 12:12h normal (non-inversé), dans une animalerie dotée d'un contrôle de tous les paramètres nécessaires à leur bien-être. Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu avec buchettes de bois et du papier absorbant propice à la construction de nids. Une procédure spécifique à l’estimation de l’inconfort et la douleur sera mise en place avec une surveillance quotidienne. Les points limites sont fixés selon une grille d'évaluation des signes de mal-être établie dans notre laboratoire et validée par notre vétérinaire référent.
Choix des espèces
La souris est particulièrement utilisée pour générer des animaux modèles de maladies génétiques humaines. Nous disposons déjà au laboratoire des géniteurs possédant les mutations nécessaires pour mimer la maladie telle qu'elle existe chez l'Homme. Nous envisageons d’étudier les effets d’un traitement avant la naissance, donc il nous faut prévoir des mères adultes en gestation qui seront traitées ou non et d’étudier les descendants.
Elevage et caractérisation génétique (par des prélèvements de tissus) de souris génétiquement modifiées utilisées dans l’étude du développement leucémique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 800 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit au sevrage, trois semaines après la naissance, une biopsie de la queue ou de l'oreille destinée à lire son génotype. Le projet ne produit pas de résultat par lui-même, il alimente d'autres travaux sur la leucémie en animaux porteurs des mutations recherchées, les souris étant décrites comme "prévues pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques". Sur le remplacement, le porteur indique que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité du microenvironnement tumoral, et il dit réfléchir à des méthodes moins invasives, par le poil, la salive ou les fèces, sans les avoir mises en place.
Objectifs
L'objectif du projet est d'identifier en fonction de leur génotype les souris génétiquement altérées modèles d'étude du développement leucémique
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension des différents stades et acteurs de la leucémogénèse.
Procédures
Prélèvement de queue, une seule fois. Prélèvement possible à l'oreille, une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont celles liées au prélèvement de biopsie de queue pour génotypage: douleur légère et stress lié à la contention. Ces nuisances sont passagères et n'entrainent pas de complication majeure. Par ailleurs, la biopsie est toujours effectuée par du personnel expérimenté maîtrisant le geste, assurant une limitation efficace de ces nuisances. Pour le modèle de développement leucémique, les symptomes peuvent être observés au delà de 12 semaines. Ces souris seront alors observées régulièrement afin de détecter l'apparition éventuelle de signes d'affaiblissement (perte de poids, léthargie, dos courbé...). Enfin, pour les modèles immunodéficients, les animaux sont fragilisés d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue ou d'oreille permet le génotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études.
Remplacement
La caractérisation des évènements géniques impliqués dans le développement leucémique ne peut être réalisée que partiellement in vitro puisque les modèles de culture ne nous permettent pas encore de reproduire la complexité du microenvironnement tumoral (présence de tous les acteurs cellulaires impliqués et complexité 3D) même si nous travaillons en parallèle à les développer afin d'avoir recours aux animaux uniquement sur les dernières étapes de notre projet.
Réduction
Le nombre d'animaux qui vont subir le prélèvement pour génotypage est réduit à son minimum: La production est lié aux besoins des projets scientifiques. Les schémas d'accouplement sont optimisés pour ne produire que des animaux "utiles" porteurs de modifications génétiques d'interet.
Raffinement
Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). Le prélèvement de tissu est réalisé par une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée (biopsie de queue) de façon à limiter les effets indésirables (stress et douleur). En cas de signes de stress ou de douleur, du Douxocalm pourra être appliqué. Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes alternatives moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de poils, de salive ou de fécès. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle soit applicable pour tous ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Les souris présentant une immunodéficience ont besoin d'un hébergement en portoirs ventilés sous un statut sanitaire SPF. Celles-ci, ainsi que l'ensemble des élevages de cette demande sont maintenus en portoirs ventilés.
Choix des espèces
Le modèle murin est le plus utilisé actuellement pour étudier le microenvironnement tumoral. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude des structures anatomiques, cellules, et gènes dans cette espèce (anticorps, séquence de référence…). De plus le modèle que nous utilisons mime de façon remarquable le développement leucémique humain avec une acquisition de mutations secondaires identiques ou avec des effets similaires que chez l'homme. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.
Exploration de l’homéostasie glucidique chez la souris : diagnostic du diabète
- Enseignement supérieur
100 souris vont être utilisées, chacune soumise à deux tests de tolérance au glucose de deux heures trente, avec six prélèvements de sang et deux prélèvements d'urine par test. Une partie reçoit deux injections abdominales d'un agent qui déclenche un diabète, avec la soif, l'émission d'urine accrue et la perte de poids qui l'accompagnent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La finalité est un enseignement : des travaux pratiques pour six étudiants par séance, chaque souris étant utilisée une deuxième fois pour un autre groupe. Le porteur qualifie l'induction du diabète de "strictement nécessaire", et toutes les souris sont tuées à l'issue.
Objectifs
Ce projet est destiné à des étudiants à l’Université et est dispensé sous la forme de séances de travaux pratiques. Cet enseignement vise à apprendre aux étudiants à diagnostiquer via l’analyse des paramètres sanguins et urinaires, le diabète dans un modèle de souris rendues diabétiques.
Bénéfices attendus
Ces séances de travaux pratiques sont organisées et encadrées par des personnels qui ont suivi une formation initiale et sont à jour de leur formation continue. Elles visent à familiariser les étudiants à l'analyse in vivo de l'homéostasie glucidique des souris et de les sensibiliser aux problèmes éthiques et méthodologiques de ce type d'expérimentation qui a pris une place centrale dans les stratégies d'élucidation de mécanismes physiopathologiques à la suite du développement de modèles animaux transgéniques. Plus globalement, ces séances de travaux pratiques permettent de familiariser les étudiants à la manipulation des animaux dans des conditions réglementaires et à l’utilisation raisonnée des animaux dans le cadre de la recherche (réduire au maximum le nombre, raffiner les expérimentations et remplacer l’utilisation d’animaux autant que cela est possible).
Procédures
Une partie des animaux recevra un agent induisant un diabète par deux injections intrapéritonéales sur 2 jours sur animal vigile (quelques secondes par animal) effectuée après une mise à jeun de courte durée (4h). L’autre partie des animaux recevra deux injections intrapéritonéales d’un placebo sur 2 jours sur animal vigile. Un prélèvement sanguin de faible volume (une goutte) effectué 3 jours après la dernière injection permettra de confirmer l’induction du diabète. Ce prélèvement sera effectué sur animal vigile et durera 5 secondes par animal. A la fin des traitements, les souris seront soumises à un test pour évaluer la tolérance au glucose. Pour cela, après une mise à jeun de courte durée (6h), du glucose sera administré par voie orale (quelques gorgées, 10 secondes par animal vigiles). 6 prélèvements sanguins de faible volume (une goutte/prélèvement sanguin, 5 secondes par animal vigile) et 2 prélèvements urinaires (une goutte/prélèvement, 5 secondes/animal vigile) seront réalisés pour mesurer l’évolution des concentrations en glucose sanguin et urinaire au cours du temps (2h30 maximum pour chaque test effectué, 2 tests par souris à 2 jours d’intervalle). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus sur les souris concernent principalement l’induction d’un diabète. Le diabète est associé à une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et une perte de poids. L’induction de cette pathologie est malheureusement strictement nécessaire pour étudier les méthodes de diagnostic du diabète. Le traitement repose sur deux injections intrapéritonéales réalisées 2 jours successifs sur animaux à jeun, pouvant ainsi induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection. Le traitement pourrait induire une production accrue d’insuline, entrainant des épisodes d’hypoglycémies modérées chez les souris non diabétiques. D’autres effets secondaires pourraient être observés mais sont difficiles à prévoir et une surveillance accrue des souris sera réalisée quotidiennement. Lors de l’expérience, les animaux pourraient subir un inconfort lié à la mise à jeun, un stress dû à la préhension, une douleur (ou au minima un inconfort) causée par les prélèvements de sang et d’urine.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. Les animaux ne pourront pas être réutilisés par la suite à des fins de recherche.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (études de films, analyses d'articles scientifiques, méthodes in vitro, ...) est préféré. Toutefois, l'un des objectifs des travaux pratiques est notamment de former les étudiants à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent les différentes fonctions physiologiques et pathologiques chez les animaux ou l’humain. De ce fait, l'utilisation de rongeurs reste nécessaire : l'étude de l'homéostasie glucidique et l'évaluation de l'efficacité des méthodes utilisées pour diagnostiquer le diabète ne peut se faire que sur un animal. Durant les expérimentations, une attention particulière sera portée pour sensibiliser les étudiants au principe de remplacement. Cette sensibilisation éthique et réglementaire est essentielle pour la poursuite de leur activité et leur choix carrière.
Réduction
Le projet impliquera un total de 100 animaux. Chaque année, l'effectif est volontairement limité à très peu d’étudiants afin de réserver cet enseignement uniquement aux étudiants qui désirent faire de la recherche en physiologie et par conséquent, limiter le nombre d'animaux. Afin de réduire encore ce nombre, chaque souris sera utilisée une deuxième fois pour des groupes d’étudiants. De plus, nous diminuons au maximum le nombre d’animaux par groupe expérimental, tout en conservant un nombre suffisant permettant l’obtention de résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (changement de cages 1 à 2 fois par semaine si nécessaire lié à la polyurie, etc.). Les animaux fragiles identifiés après injection de l’agent induisant un diabète seront soumis à une vigilance accrue, notamment via l’établissement de points limites, qui entraineraient l’euthanasie de l’animal. Les séances seront sous l’encadrement d’une enseignante possédant une formation réglementaire à jour et une expertise de plus de 20 ans dans la manipulation des animaux. De plus, le nombre des étudiants est extrêmement réduit (6 étudiants par séance) pour limiter le stress des animaux et augmenter la disponibilité et le contrôle de l’encadrement de chaque étudiant.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris en raison de l'existence de nombreuses données publiées dans la littérature concernant les effets d’un agent inducteur de diabète sur l'homéostasie glucidique. De plus, la maitrise de l’utilisation d’un modèle tel que la souris sera un atout supplémentaire pour le futur des étudiants. En effet, le modèle souris est le plus couramment utilisé dans les laboratoires de recherche. Des souris seront rendues diabétiques à l’âge adulte et des tests métaboliques sont réalisés 1 semaine après l’induction du diabète. Nous avons choisi de travailler sur des animaux adultes car c’est un stade de développement qui montre des résultats tranchés en termes d'homéostasie glucidique.
Effet de molécules naturels (extrait de bois de châtaignier) et de composés de synthèse sur la réponse inflammatoire dans un modèle de colite chimio induite par DSS chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Choisies pour leur système immunitaire fonctionnel et âgées de trois à quatre mois, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles reçoivent du dextran sulfate de sodium à 2 % dans leur boisson pendant quatorze jours pour déclencher une colite, un gavage quotidien avec un extrait de bois de châtaignier ou des molécules de synthèse, et sont isolées chaque jour le temps qu'on récupère leurs fèces. Le porteur affirme n'attendre aucun effet délétère des composés testés et décrit une baisse de poids seulement modérée, alors que le projet déclare des procédures de niveau sévère. Toutes seront tuées à J14, ou plus tôt si un point limite est atteint, pour prélever le côlon et le sang.
Objectifs
Diverses pistes de travail ont mené aux développements de traitements contre les Maladies Inflammatoires Chronique de l’Intestin (MICI). Tout d’abord, nous avons travaillé depuis plusieurs années dans le criblage de molécules biosourcées et synthétiques anti-inflammatoires dans le contexte des MICI. En particulier, deux familles de molécules (Famille A : biosourcée et Famille B : synthétique) ont été analysées et ont démontrées divers effets anti-inflammatoires et anti-oxydants in vitro intestinaux et leucocytaires. D’autre part, nous étudions l’effet des Extrait de Bois de Châtaignier (EBCs) sur la modulation de la réponse inflammatoire chez l’hôte. Nos travaux sur les EBCs nous ont permis de démontrer la capacité des EBCs à réduire la réponse inflammatoire au sein de cellules leucocytaires et intestinales humaines. L’objectif de ce projet est d’analyser l’effet anti-inflammatoire dans un modèle de colite chimio-induite par le dextran sulfate de sodium (DSS) chez la souris de ces trois séries de traitements potentiels dans les cas pathologiques de MICI. Grâce à cette étude, nous pourrons valider les effets modulateurs de ces différentes familles de composés anti-inflammatoires sur la réponse inflammatoire. De plus, nous pourrions analyser dans ce projet l’effet de ces trois séries de traitements potentiels dans les cas pathologiques de MICI avec une série commune de contrôles et une même série de références pour comparer les effets de traitement issus de produits naturels, biosourcés ou synthétiques. Ainsi, nous respectons au mieux la règle des 3R en réduisant le nombre de souris nécessaires pour nos recherches. Nous pourrons ainsi comparer l’intérêt de produits naturels vis-à-vis de molécules synthétiques et en extraire des données sur les avantages et inconvénients suivants les effets observés des composés étudiés. De plus, cela nous permettra de valoriser plus tard, parmi les 3 séries de molécules, la série avec le plus fort potentiel thérapeutique pour les patients atteints de MICI.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples, aux profits de la santé humaine et animale. D’après la littérature, ce projet nous permettra de mettre en évidence l'effet anti-inflammatoire de ces composés anti-inflammatoires. De plus, les résultats de ce projet seront disponibles à moyen et long terme en fonction du temps nécessaire pour traiter la densité des données acquises lors de ce projet, pour structurer et publier ces résultats auprès d’un éditeur. Ce projet pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients, avec des traitements moins agressifs et moins contraignants, tout en renforçant l’arsenal thérapeutique. Pour la santé humaine, cela permettrait d'offrir des traitements plus diversifiés et pouvant servir d’alternatives dans les traitements de poussées modérées chez les patients MICI. Ces traitements ne se limitent pas à la pathologie des MICI, mais aussi à d’autres pathologies liées à une réponse inflammatoire dérégulée ou à des pathologies présentant des dérégulations du micro-environnement intestinal. Concernant la santé animale, l’EBC pourrait permettre d’améliorer le bien-être animal dans les phases précoces de son développement jusqu’au stade adulte. Ce traitement d’origine naturelle permettrait de protéger le microbiote intestinal et d'atténuer un potentiel état inflammatoire dérégulé par une infection microbienne chez l’animal.
Procédures
Les souris seront observées et pesées tout au long du projet, du J0 au J14. Avant le début de l’expérience, les souris seront mises à isolement pendant 7 jours. Les souris contrôles ne recevront aucun traitement durant l’expérience. Les souris contrôles DSS ainsi que les souris traitées recevront dans leur boisson à 2% de DSS et resteront en contact de ce produit tout au long de l’expérience (J14). Les souris traitées se verront administrer par voie orale (gavage / per os) quotidiennement soit 50mg/kg d’urolithine B (métabolite naturelle de polyphénol), soit une dose de 5mg/kg de l’extrait de bois de châtaignier (KT), soit 100mg/kg des molécules de la famille A ou B. Durant la pesée des souris, nous isolerons les souris le temps de pouvoir récupérer des fèces pour chaque souris et chaque jour composant notre étude. Au 14ème jour, si les souris n’ont pas subi d’euthanasie précoce due aux différents points limites cités précédemment, nous euthanasierons les souris à J14 afin de récupérer les organes et du sang.
Impact sur les animaux
En raison de son aspect naturel et son utilisation dans l’alimentation animale, nous n’attendons aucun effet délétère ou négatif de l'extrait de bois de châtaignier sur nos souris aux concentrations décrites dans notre protocole expérimental. Concernant les deux familles A et B, nous n’attendons aucun effet délétère ou négatif de ces deux familles A et B sur nos souris aux concentrations décrites dans notre protocole expérimental. En ce qui concerne le modèle murin de colite chimio-induite par DSS, le traitement des souris par DSS à 2% peut entrainer une baisse modérée de la masse corporelle au cours du temps. La concentration de DSS utilisée dans ce projet n’entraine pas une baisse de la masse corporelle brutale chez les souris. Il est possible d’observer dans ce modèle une altération du comportement de la souris accompagnée d’isolement ou d’une mobilité réduite.
Devenir
L’intégralité des souris de cette étude seront mises à mort. Nous récupérerons le colon des souris de chaque condition ainsi que du sang afin de réaliser des études histologiques et de quantifier par PCR divers médiateurs moléculaires impliqués dans le processus inflammatoire.
Remplacement
Nos études ont démontré un effet anti-inflammatoire et anti-oxydant de trois familles de composés dans des cellules leucocytaires et intestinales humaines : une famille de produits naturels avec les EBCs, une famille de composés biosourcés (A) et une série de composés synthétiques (B). Nous nous sommes ensuite rapprochés de l’Homme avec le modèle de nématode C. elegans infecté par Candida albicans. Ce modèle nous a permis d’aller plus loin sur la toxicité de nos composés dans un organisme plus complexe que le modèle cellulaire intestinal ou de macrophage. Cependant, l’étude de l’effet de ces composés sur la réponse inflammatoire dans un modèle murin est une étape nécessaire. Le modèle murin étant proche de l’Homme, nous pourrons conclure sur l’effets des EBCs et des composés des familles A et B sur la réponse inflammatoire chez l’hôte. Ce projet nous permettra de mieux comprendre leur effet sur le microenvironnement intestinal dans un organisme plus complexe que les nématodes. Cette étude nous permettra d’analyser l’effet de divers traitements issus de produits naturels ou synthétiques sur l’expression de récepteurs du système immunitaire innée ainsi que de médiateurs pro-inflammatoires. Nous pourrons mieux comprendre l’impact de ces traitements sur la modulation de la composition du microbiote intestinal ainsi que leur effet sur la perméabilité intestinale lors d’un processus inflammatoire. Nous pourrons ainsi comparer les variabilités ou non de ces traitements tout en ayant les mêmes contrôles, les mêmes référentiels et les mêmes individus afin de pouvoir valoriser la famille de composés démontrant le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Nous souhaitons réaliser l’expérience de traitement par les trois familles de composés dans le modèle murin de colite chimio induite sur deux lots de 100 souris. Les souris seront réparties en 10 groupes de 10 souris en fonction des traitements effectués (contrôles, molécules d’origine naturelle ou molécules synthétiques). Un lot est constitué de 100 souris et l’expérience sera réalisée deux fois (100 x 2 = 200 souris) sur une période de 14 jours. L’effet de ces diverses familles de composés sur la modulation de la réponse inflammatoire pourront ainsi être comparés avec les mêmes contrôles et les mêmes références afin de sélectionner la famille de composés présentant le meilleur potentiel en termes de transfert de technologies et de valorisation. Les paramètres expérimentaux étudiés seront les variations de masse corporelle chez les souris, le score clinique des souris, le taux de médiateurs pro-inflammatoires dans le colon, et les modifications de la composition de la flore intestinale suite à l’inflammation et/ou aux traitements par rapport à la condition physiologique. Le test statistique utilisé lors de ce projet permettra de comparer deux échantillons indépendants de petite taille entre eux.
Raffinement
Notre protocole expérimental a pour but d’étudier et d’évaluer l’effet anti-inflammatoire de trois familles de composés sur un modèle murin dans un contexte inflammatoire induit par DSS. L’utilisation d’anesthésiques, d’analgésiques et/ou d’anti-inflammatoires altérerait le suivi de notre étude. Par conséquent, divers points limites ont été établies afin d’observer et de gérer quotidiennement l’apparition de toute forme de souffrance chez ces souris jusqu’à la fin de notre étude. L’intégralité des souris seront mises à mort à la fin de notre étude.
Choix des espèces
Notre équipe possède des compétences et des savoirs-faires sur le modèle murin de colite chimio induite par DSS. Ce modèle nous permet d’observer et d’étudier l’effet des EBCs, de la famille A et B sur la modulation de la réponse inflammatoire dans un contexte d’inflammation intestinale mimant ce qui se passe chez les patients atteints de MICI. La souris étant le modèle le plus utilisé et le plus proche de l’Homme pour étudier l’efficacité d’un traitement, ce modèle nous semble approprié à la vue de nos résultats et de la continuité de nos travaux in vitro et sur le modèle de nématode. Notre projet concerne la réponse inflammatoire chez l’hôte. Les souris devront avoir un système immunitaire fonctionnel. Par conséquent, les souris seront âgées entre 3 et 4 mois.
Impact de la perte de fonction d’un gène sur la longévité chez des souris transgéniques immunocompétentes
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour mesurer combien de temps vivent des souris privées d'un gène soupçonné d'intervenir dans le vieillissement, 480 d'entre elles sont maintenues en cage jusqu'à leur mort, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Aucune intervention n'est prévue au-delà d'un examen de cinq minutes toutes les six semaines à partir de dix-huit mois, jusqu'à la fin de vie. Elles développent les atteintes propres au grand âge, tumeurs, dermatites, difficultés à se déplacer, sans médication sauf avis vétérinaire. Certaines meurent dans leur cage, les autres sont tuées quand une grille de fragilité indique qu'un point limite est franchi, et leurs organes sont ensuite prélevés.
Objectifs
Le vieillissement et les pathologies liées à l’âge deviennent des thématiques prioritaires en recherche car ils ont un fort impact sur la santé publique. Réduire le vieillissement et étendre l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu économique majeur. Ce projet de recherche s’inscrit dans cette thématique. Nous avons mis en évidence, via des études in vitro, que notre gène d’intérêt est impliqué dans le vieillissement. L’objectif de ce projet est de valider in vivo cette hypothèse via une étude de longévité qui évaluera la mesure de l’espérance de vie des animaux transgéniques déficientes pour ce gène. Les expériences in vivo réalisées sur un modèle rongeur permettront de démontrer l’impact de notre gène d’intérêt sur la santé des animaux vieillissant.
Bénéfices attendus
L’étude de la longévité est un enjeu actuel majeur. Cette étude: i) mettra en évidence le rôle clef joué par notre gène d’intérêt dans le vieillissement physiopathologique chez les souris mâles et femelles ; ii) avancera la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires du vieillissement via l’identification des acteurs de la sénescence. Cela nous permettra de développer des nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter certaines pathologies liées à l’âge comme la neuro-dégénération ou le cancer et ainsi étendre l’espérance de vie en bonne santé.
Procédures
Étude de longévité incluant uniquement le maintien des animaux à long terme en conformité avec la réglementation et incluant un suivi avec établissement d’un score (5 min par animal - 1x toute les 6 semaines à partir de 18 mois et jusqu’à la fin de vie).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une contrainte liée à la contention lors de leur évaluation et, également, les effets indésirables inhérent au vieillissement (éventuelle possible apparition de tumeurs, dermatite, difficulté à se déplacer).
Devenir
Dans le cadre de cette étude de vieillissement, certains animaux seront susceptibles de décéder naturellement au cours de cette procédure de longévité ou seront euthanasiés en cas d’atteinte des points limites définis. Des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.
Remplacement
Notre projet vise à définir les conséquences de la modification avec l’âge de la signalisation moléculaire et cellulaire. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors du vieillissement. L’utilisation d’un modèle petit rongeur, comme la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).
Réduction
Le projet impliquera un total de 480 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous appliquerons un test statistique approprié pour comparer la survie des animaux. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Il est prévu de réaliser une veille bibliographique attentive et continue afin de vérifier que les expériences planifiées n'ont pas déjà été rapportées dans la littérature scientifique existante.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et bâtons à ronger). L’aliment sera mis dans les cages pour les animaux fatigués ou avec des problèmes d’accessibilité à la nourriture. En collaboration avec la cellule du bien être animale de la structure, un changement d’aliment sera envisagé pour les animaux très vieux. Toutes les interventions seront effectuées par des personnes expérimentées et éloignées des animaux hébergés. Nous avons inclus dans le protocole de longévité des grilles d’évaluation de la fragilité des animaux, incluant des observations cliniques et le suivi de poids des animaux. Les animaux fragiles identifiés seront soumis à une vigilance accrue, notamment via l’établissement de points limites, des signes de souffrance, qui entraineraient l’euthanasie de l’animal. Les critères définis pour atteindre un point limite seront strictement appliqués, et les souris seront euthanasiées en cas d’atteinte des points limites préétablis. Il n’y aura pas de médication utilisée dans le cadre de cette étude de longévité sauf avis vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix d’utiliser la souris dans cette étude est justifié par des considérations scientifiques et éthiques. Tout d’abord, la souris est un organisme complet et fonctionnel dont le système immunitaire peut être comparé à celui de l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent. De plus, sa génétique est bien caractérisée, ce qui facilite les études génétiques et moléculaires. La souris est largement reconnue et utilisée comme modèle animal standard dans la recherche scientifique, notamment dans les études précliniques. Sa large utilisation au sein de la communauté scientifique internationale permet une meilleure comparabilité des résultats et une meilleure validation des observations entre différentes études. Nous disposons d’installations adaptées pour les souris, ainsi que d’une expertise solide en matière de techniques d’expérimentation animale et de suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Les animaux seront suivis pendant toute leur vie afin d’évaluer l’espérance de vie maximale des individus.