Rongeurs

Soumises chaque mois à un test de coordination motrice de deux à huit mois, puis à un test de douleur exposant leur queue à une source de chaleur, à vingt-quatre heures d'isolement en cage d'observation et à un effort forcé sur tapis roulant, 42 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le muscle tibial antérieur étant disséqué sous anesthésie pour mesurer sa contraction. L'objectif déclaré est de vérifier qu'un gène candidat repéré chez des patients cause bien une myopathie, en reproduisant chez la souris mâle les douleurs musculaires à l'effort décrites par les malades. Un amendement indique que dix souris sur vingt-quatre ne se sont pas endormies après l'injection d'anesthésique lors de la mesure de contraction, qu'elles ont été tuées sans subir la procédure, et que celle-ci sera donc répétée sur vingt-quatre autres souris.

Objectifs

Notre travail est principalement axé sur l’étude de nouveaux gènes impliqués dans les myopathies congénitales. Après analyse de données de séquençage d’ADN de plus de 500 patients atteints de myopathies, trois mutations dans un même gène ont été identifiées. Néanmoins, nous ne savons pas si ces mutations sont la cause de la myopathie ou si elles sont là par hasard. Au cours de notre projet, des analyses moléculaires effectuées sur cellules humaines suggèrent que ces mutations mènent à la perte de fonction de la protéine et donc à un effet pathologique. La mesure de l’activité motrice et neuro-sensitive des souris présentant une invalidation du gène d’intérêt permettra éventuellement de confirmer la présence de symptômes associés aux myopathies, tels que retrouvés chez les patients, et cela à l’échelle d’un organisme entier. En dernier lieu, des analyses sur tissus prélevés chez les souris permettront de comprendre les mécanismes de la maladie liée à ce gène et ainsi d’ouvrir des perspectives thérapeutiques. Le gène étant sur le chromosome X, cette maladie concerne très rarement les femmes. Nous n'étudierons donc que les souris mâles. Nous utiliserons 12 mâles dont le gène d’intérêt est intact et 12 mâles dont le gène est invalidé que nous comparerons. Amendement : Seulement 10 souris sur les 24 prévues se sont endormies après injection d'anesthesiques lors de la procédure mesure des propritétés contractiles (Aurora). Les souris ne s'étant pas endormies ont été sacrifiées et n'ont pas pu subir la procédure. Afin de pouvoir obtenir des résultats pour au moins 10 souris par groupe, cette procédure sera répétée avec 24 autres souris dont 12 par groupe.

Bénéfices attendus

Les différents tests d’activité motrice et de neurosensibilité chez la souris permettront de rendre compte de symptômes similaire à ceux des patients atteints de myopathies et d’ainsi confirmer à l’échelle d’un organisme entier ce qui est observé au niveau moléculaire. Les souris analysées constitueront ainsi un modèle murin de myopathie. L’étude de l’activité des souris par test de coordination motrice chaque mois permettra d’observer ou non une différence d’activité en fonction de l’âge de la souris et ainsi de confirmer que nos études à l’âge de 8 mois sont appropriées. Les mesures de neurosensibilité et d’activité spontanée dans la cage sont réalisés avant et après effort sur tapis roulant. Cette décision a été prise car les patients ayant une mutation du gène présentent des douleurs et faiblesses à l’effort. Une fois que l’implication de ce gène dans les myopathies est confirmée, le diagnostic de patients présentant une mutation de ce gène sera facilité et leur prise en charge sera améliorée. Des études plus approfondies permettront de comprendre les mécanismes de la maladie et d’ainsi envisager des nouveaux traitements.

Procédures

Chacune des 24 souris seront soumises à une série de 5 tests au total. De 2 à 8 mois et de manière mensuelle, la coordination motrice des souris sera analysée une fois par mois pendant moins d'une heure sur animal vigile. A 8 mois, des tests de douleur avec exposition au chaud (~1h) et test de mesure d'activité spontanée dans une cage (~24h) seront réalisés avant et après effort sur tapis de course (~1h). Ces trois tests seront réalisés sur animal vigile. A la fin de ces tests, toutes les souris subiront une mesure d'activité contractile sur muscle tibial antérieur dissequé (~1h par souris). L'animal sera anesthésié au préalable. Les muscles seront conservés pour des tests histologiques et moléculaires. Une biopsie de phalanges des souris est effectuée autour du sixième jour de vie dans le but d’analyser l’ADN de l’animal et d’ainsi vérifier la présence ou non du gène d’intérêt. Cette même biopsie servira également à l'identification de l'animal.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à observer un phénotype dommageable après effort sur tapis, de manière similaire aux patients présentant les mutations du gène étudié. En effet, les patients présentent des douleurs musculaires après activité physique. D’anciens travaux préliminaires sur ce modèle animal n’ont relevé aucun phénotype dommageable avant 4 mois. Etant donné que nos tests débutent à 2 mois, nous nous attendons à potentiellement observer des nuisances dès l’âge de 2 mois. Une faiblesse physique et douleur chez la souris pourra mener à une difficulté à se déplacer dans les cages, une difficulté à manger et éventuellement à respirer et une diminution des comportements sociaux et d’exploration. Parmi les différents tests, nous nous attendons à observer des nuisances lors de l’activité sur tapis qui provoque une fatigue de l’animal. La locomotion de la souris après retour dans sa cage risque d’être impactée. Le test de mesure de la douleur qui expose la queue de la souris à une source de chaleur provoque une douleur de très courte durée, égal au temps de réaction de la souris. La mesure d’activité spontanée dans une cage implique un isolement social pendant 24h. La mesure des propriétés contractiles musculaires nécessite une injection d'anesthésique et d'antalgique au préalable. La biopsie des phalanges décrite en 5.6.1 provoque une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette étude afin de procéder à des analyses histologiques et/ou moléculaires.

Remplacement

Afin de limiter les tests sur animaux, des études de l’activité à l’échelle moléculaire et cellulaire sont réalisées sur cellules humaines. L'utilisation d’animaux est cependant indispensable car les symptômes observés chez les patients atteints de myopathies et mécanismes de la maladie ne peuvent être observés et confirmés que dans un organisme entier. En effet, l’ensemble du tissu musculaire en lien avec le système nerveux sont étudiés. Le produit du gène étudié est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire sur la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies.

Réduction

Etant donné que le suivi en fonction de l’âge par test de coordination n’est pas invasif, cela va permettre de réutiliser les souris pour les autres tests et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chacune des souris subira la totalité des tests au cours de sa vie. Etant donné que le test de force musculaire nécessite l’anesthésie puis la mise à mort de l’animal, les tissus d’intérêt pour analyses histologiques seront prélevés au même moment. Aucun autre animal ne sera donc sacrifié à cet effet. En ce qui concerne les tests avant et après efforts, ceux-ci n’ont de sens pour comparaison statistique que si un même animal effectue les tests avant et après l’effort. Cela réduit encore une fois le nombre d’animaux utilisés. Enfin, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum tout en permettant d'obtenir une puissance statistique suffisante. Nous pouvons affirmer d’après la littérature qu'au total 24 souris seront nécessaires pour conclure sur le projet : 12 souris modèles de myopathie et 12 souris contrôles saines.

Raffinement

Une vigilance accrue aux moindres signes de douleur pendant les tests ou dans la cage sera appliquée grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Les nuisances sur l’animal seront évitées autant que possible et le test arrêté si une des nuisances apparait. La mise à mort de l’animal sera appliquée si la douleur est trop élevée. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer et notamment après l’activité forcée sur tapis. A partir du sevrage, une perte de poids de 20% en moins de 2 semaines ou une immobilité prononcée conduira à la mise à mort. Le suivi du poids se fera une fois par semaine, voire 1 fois par jour si une baisse de poids est observée. Afin de réduire le stress des souris, celles-ci subiront une habituation à l’environnement du test un jour avant les tests et seront toujours manipulées à l’aide de tunnels. Lors de la mesure de force musculaire, les souris seront profondément anesthésiées à l’aide d’un anesthésique puissant. Afin d’éliminer toute forme d’inconfort et de douleur, une molécule à fort potentiel analgésique sera également administrée accompagnée d’un anxiolytique utilisé pour son fort pouvoir sédatif. L’animal est ensuite déposé sur une plaque chauffée afin d'éviter une hypothermie. Afin de protéger et humidifier l’œil, un gel sera appliqué. Avant de débuter l’opération, l’efficacité et la profondeur de l’anesthésie sont vérifiées par une pression exercée manuellement sur les pattes et la queue. Si le rongeur ne montre aucune réaction, l’opération chirurgicale et le test peuvent être réalisés.

Choix des espèces

La protéine issue de notre gène d’intérêt est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire propres à la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies. Les animaux subiront un test de coordination chaque mois de 2 à 8 mois afin d'obtenir un suivi de l'activité motrice selon l'âge. Cette gamme d’âges permettra d’avoir le plus de données possibles pour conclure, tout en maximisant le temps de repos des souris. Les autres tests moteurs et neurosensitifs seront effectués à l'âge de 8 mois, âge où la souris atteint ses capacités musculaires maximales. Les souris seront sexuellement matures lors de l’ensemble des tests. Elles seront adolescentes de 2 à 3 mois et adultes de 3 à 8 mois jusqu’à la fin des tests.

Greffées d'une tumeur dans le cerveau, gavées quinze fois en trois semaines, irradiées jusqu'à six fois et passées jusqu'à cinquante-deux fois sous imagerie en un an, 223 souris immunodéficientes subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce une ataxie, une perte d'appétit et de poids, de la prostration et des pertes d'équilibre à mesure que la tumeur grossit, et, plus rarement, une exorbitation des yeux ou une atteinte de l'oreille interne liées à la pression dans le crâne. Toutes seront tuées pour l'analyse de leur cerveau, dans un test d'efficacité d'une molécule sur un sous-type de gliome de la ligne médiane. Les actes se répartissent entre "certains animaux" sans que le nombre concerné par chacun soit jamais donné, et les effectifs par lot sont justifiés par la seule expérience antérieure de l'équipe.

Objectifs

Les gliomes diffus de la ligne médiane ou DMG sont un sous-groupe de gliome ayant une localisation spécifique (ligne médiane du cerveau), sont très infltrants et actuellement incurables. Ils sont divisés en sous-types présentent des altérations spécifiques qui pourraient représenter des vulnérabilités possibles pour identifier de nouveaux traitements. Récemment, nous avons accumulé des résultats démontrant qu'un sous type de gliomes portant 2 mutations spécifiques ont un meilleur pronostic. En nous appuyant sur ces résultats, nous souhaitons approfondir notre caractérisation de ces tumeurs pour mieux comprendre leur développement, leur évolution particulière et identifier d'éventuelles vulnérabilités ainsi que le mécanisme par lequel ces mutations améliore le pronostic des patients. Pour cela nous allons : (i) Comparer l’évolution des cellules de plusieurs modèles greffés chez la souris en inhibant ou non les effets liés à la mutation spécifique de ces gliomes. Nous chercherons de plus à savoir si cette inhibition à un effet sur la vitesse de croissance (ii) Tester l’efficacité d’une molécule activant la voie mutée dans ces gliomes seule ou en combinaison avec de l’irradiation (qui est le traitement classique actuel de ces tumeurs) dans les modèles de gliome dans lesquelles elle ne l'est pas à l'oigine pour savoir si l’on est capable de reproduire l’amélioration pronostic retrouvée dans ces tumeurs.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension du développement et comportement des gliomes diffus de la ligne médiane et une possible amélioration des traitements pour ces types spécifiques de gliome.

Procédures

Lors des expériences préliminaires, certains animaux subiront un prélèvement de sang. Ce prélèvement unique prend environ une minute sur animal anesthésié (anesthésie générale). Certains animaux subiront une greffe de cellules tumorales dans le cerveau. La procédure dure entre 5 et 10 minutes par animal sur animal anesthésié (anesthésie générale avec analgésie adaptée). Les animaux qui seront traités par gavage le seront 15 fois (5 jours par semaines pendant 3 semaines). Gaver une souris dure quelques secondes sur animal vigile. Des animaux qui seront irradiés le seront maximum 6 fois à faible dose, étalé sur 2 semaines. Cela prend environ 2 minutes par irradiation sur animal anesthésié. Certains animaux auront des séances d'imagerie sous anesthésie générale, durée maximum 10 minutes, nombre maximum : 52 (séances hebdomadaires pendant un an au maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées à la greffe d'une tumeur dans le cerveau. La greffe, sous anesthésie générale occasionnera une petite plaie sur le dessus du crâne, qui entraînera une gêne légère et temporaire. Par la suite, on pourra éventuellement observer des symptômes neurologiques qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie), perte d'appétit et donc perte de poids, prostration des animaux, perte d’équilibre. L’augmentation de la pression intracrânienne peut exceptionnellement entraîner des symptômes tels que l'exorbitation des yeux, l'atteinte de l’oreille interne qui entraineraient l'arrêt immédiat de la procédure. L'irradiation et l'imagerie n'entraînent qu'un inconfort temporaire et léger dû à la préhension avant anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour analyses post-mortem sur les cerveaux.

Remplacement

Une singularité des gliomes pédiatriques de la ligne médiane (composée du thalamus, du pont et de la moelle épinière), résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures de la ligne médiane dans un premier temps, puis plus largement de tout le cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur environnement qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la barrière hématoencéphalique, qui isole le cerveau du reste de l’organisme, est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire de développer des modèles de greffes afin d’évaluer une nouvelle médication avant les phases cliniques. Les molécules utilisées ont été testées sur des modèles de cultures cellulaires afin de valider leur efficacité. Nous ne pouvons pas utiliser de modèles de substitution comme les organoïdes car ils ne représentent pas la réalité de la barrière hémato encéphalique et les difficultés de traitement qui y sont liés.

Réduction

Les animaux sont, tout au long des manipulations suivis par bioluminescence, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés (suivi longitudinaux, augmentation de la puissance statistique). Dans le projet nous utiliserons des Go/NoGo. En effet si aucun effet anti-tumoral n’est démontré sur la première lignée ou qu’aucun passage de la barrière hémato encéphalique des molécules ne peut être démontré nous ne poursuivrons pas les manipulations selon ce protocole. De plus les expériences d’escalade de doses permettent de réduire au maximum le nombre d’animaux en écartant les doses potentiellement inefficaces et toxiques. Les nombres d'animaux par lot ont été basés sur l'expérience antérieure que nous avons de ces modèles tumoraux sur ces souris. Ils minimalisés pour permettre des analyses statistiques pertinentes des différents paramètres étudiés au décours des procédures.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la chirurgie, les animaux recevront une injection d’analgésique avant la chirurgie, puis une autre injection par la suite si des signes de souffrance sont détectés. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale . La température de l’animal est maintenue grâce à une plaque chauffante durant la chirurgie et le réveil. Une injection de sérum physiologique à la température de l’animal est réalisée avant la chirurgie pour maintenir l’hydratation de l’animal. Un gel oculaire est également utilisé pour éviter la sécheresse oculaire et un désinfectant est appliqué au site d’incision pour éviter tout risque d’infection. Suite à la chirurgie, les animaux sont surveillés le temps de leur réveil complet (quelques minutes) et sont par la suite replacés en hébergement en groupe où ils reçoivent nourriture et boisson ad libitum. Les examens cliniques sont quotidiens. Les animaux sont hébergés en cage de 5 avec nourriture et eau ad libitum ainsi que deux enrichissements comme des maisonnettes ou tunnels en carton, des bâtons de bois à ronger ainsi que du papier pour nidification. Des pooints limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'espèce souris, et en particulier la souris immnodéficiente est un très bon modèle de référence pour l'étude des gliomes humains dans un organisme entier. Nous utilisons des souris adultes car le développement des tumeurs chez la souris étant de plusieurs mois, il n'est pas pertinent de prendre des souris très jeunes qui supporterait mal la chirurgie.

750 souris et 1 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans le canal biliaire, parfois complétée d'un cathéter dans le duodénum et d'un autre dans la veine fémorale, jusqu'à deux heures d'opération, puis vingt-quatre heures d'isolement en cage à métabolisme avec privation d'eau ou de nourriture. Le porteur indique que certains animaux sont tués parce que l'isolement de vingt-quatre heures rend difficile leur retour dans un groupe social. Il présente comme bénéfice pour les rats et les souris eux-mêmes une "amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée", et l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'humain.

Objectifs

L'évaluation de l'élimination et de la toxicité sont des étapes obligatoires au cours du développement d'un nouveau candidat médicament. Chaque étude de ce projet a pour but d’évaluer les différentes voies d'élimination (hépatique, rénale, gastro-intestinale, sanguine) d'un candidat médicament et sa toxicité sur les principales voies métaboliques de l'organisme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (rat et souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris de ce projet pourront subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats de ce projet pourront subir une chirurgie pour l’implantation d’un cathéter dans le canal biliaire (30 min à 1h) . Cette chirurgie pourra comprendre l’implantation d’un ou deux cathéters supplémentaires un dans le duodénum et/ou un dans la veine fémorale (1h30-2h). Les rats de ce projet pourront également subir une administration (moins de 2 min) suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte de bile et/ou d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). Les rats avec les 2 ou 3 cathéters pourront être mis à 2 reprises en cage à métabolisme séparées d’environ 1 semaine. Les animaux de ce projet pourront subir une chirurgie pour l'implantation d'une minipompe servant à la délivrance en sous cutané, intraveineux ou intrapéritonéal d'une substance (20 à 45 min), suivie d'une mise en cage à métabolisme (24h maximum) pour la collecte d’urine et/ou de fèces avec ou non des prélèvements sanguins (moins de 2 min). La mesure de la diurèse sur 24h pourra être effectuée au maximum 1 fois/semaine sur un maximum de 3 semaines après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation). La mesure de la diurèse sur 16h pourra être répétée au maximum 2 fois/semaine sur un maximum de 3 semaines après contrôle de l’état de santé de l’animal (poids et hydratation).

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme (24h) pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la mise à jeun. Les rats de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie gazeuse, un stress postopératoire (une légère douleur/inconfort est possible malgré les analgésiques), un stress lié à la contrainte du bouton dermique lié au cathéter pour le recueil de la bile et/ou du duodénum et/ou de la veine fémorale, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié à l'isolement en cage à métabolisme pour la collecte d’urine et/ou de fèces, avec ou non une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins, un stress lié à la privation d'eau et/ou de nourriture.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure du fait soit des prélèvements nécessaires à l'étude soit de leur isolement pendant 24h et de la difficulté à les remettre en groupes sociaux ensuite qui sera vérifiée au cours de la mise au point du modèle de rat avec les cathéters bilaires, duodénal (et/ou fémoral ou carotide) maintenu en vie 8-10 jours.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme hépatique, intestinal et/ou rénal. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat ou la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 4 à 8 / par groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Les souris et les rats font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale et les études de médecine comparative en raison de leur similarité anatomique, physiologique et génétique avec l'homme (les rats, les souris et les humains partagent environ 95% de gènes). Les rongeurs sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. Le rat et la souris sont donc les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer le métabolisme d'un produit et sa toxicité sur les voies d'élimination de ce produit. Animaux adultes, à partir de 7 semaines. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Une injection dans l'abdomen chaque jour pendant deux, cinq ou quatorze jours, puis une anesthésie gazeuse sans réveil : 990 souris transgéniques de cinq semaines vont être utilisées dans des procédures déclarées de niveau modéré. Elles seront toutes tuées pour prélèvement d'organes destinés à des analyses de biologie moléculaire sur le syndrome de détresse respiratoire aiguë. Le porteur ne décrit pourtant qu'une douleur légère de courte durée au point d'injection et un stress bref lié à la contention, et il annonce sept animaux par groupe sans jamais rapprocher ce chiffre du total de 990. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ne peut remplacer l'animal parce que le métabolisme et la réponse immunitaire forment des "systèmes intégrés".

Objectifs

Le syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA) est une forme gravissime d'insuffisance respiratoire avec une mortalité élevée (30-40%) sans traitement curatif disponible. Les patients atteints de SDRA présentent une altération des réponses immunitaires qui participent à la gravité de ce syndrome et donc au taux de mortalité. Nous avons pu mettre en évidence chez ces patients que l’altération de leur réponse immunitaire pourrait être liée à des anomalies métaboliques. Nos objectifs sont donc de préciser le rôle du métabolisme dans l’altération des réponses immunitaires afin d’identifier des cibles thérapeutiques pertinentes visant à corriger ces anomalies. Ce syndrome complexe et sévère fait intervenir plusieurs types cellulaires et seule l'expérimentation animale nous permettra de retrouver l'ensemble des acteurs au sein d'un même modèle.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme pourrait influencer la dysimmunité dans le SDRA pourrait aider à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou permettre de développer des outils pour la prise en charge et le suivi de l'évolution clinique des patients.

Procédures

Interventions: - 1 injection intra-péritonéale/jour, sous anesthésie locale, pendant 2, 5 ou 14 jours en fonction de la molécule injectée (donc

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'un anesthésique local. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée.

Devenir

Euthanasies pour prélèvement d'organes à l'issue de la procédure pour des études de biologie moléculaire.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans l’étude du syndrome de détresse respiratoire aigüe est nécessaire pour reproduire au mieux ce syndrome. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive qui permette un remplacement in vitro car le métabolisme et la réponse inflammatoire et immunitaire représentent des systèmes intégrés qui ne peuvent être étudiés qu’in vivo. En effet, l’utilisation d’animaux permettra d’étudier de manière simultanée les interactions de plusieurs organes et types cellulaires : d’un côté le poumon, en particulier les cellules endothéliales pulmonaires, le parenchyme pulmonaire, les cellules immunes résidentes au niveau du poumon; de l’autre côté, les facteurs circulants, les médiateurs inflammatoires, les adipokines, les hormones et les cellules immunes circulantes ; enfin, le tissu adipeux.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en utilisant un test statistique de puissance qui permet de garantir l’observation de résultats exploitables. Grâce à ce test, nous obtenons n = 7 animaux par groupe.

Raffinement

Les souris bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois, raffinant ainsi leurs conditions de vie. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Les injections seront précédées d'une anesthésie locale afin de diminuer au maximum la douleur pouvant être engendrée. Pour la réalisation de la procédure, des points limites précoces ont été établis au moyen d'un score et seront appliqués si nécessaire, comme défini dans la description de la procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de veiller à leur bien-être.

Choix des espèces

En ce qui concerne le modèle, nous avons choisi avec attention le modèle le plus pertinent pour notre projet parmi les 10 modèles qui miment le syndrome de détresse respiratoire aigu chez l’Homme. En ce qui concerne l’espèce, nous avons choisi la souris car nous prévoyons d’utiliser des animaux transgéniques. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des souris âgées de 5 semaines et pesant 20 grammes chacune seront utilisées.

Toutes tuées pour prélèvement d'organes et de tissus, 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales par injection, jusqu'à soixante injections de traitement, une par jour tant que la tumeur ne régresse pas, et deux séances d'irradiation sous anesthésie générale. Le porteur attend une baisse d'appétit, une réduction de l'activité, des signes de fatigue et des altérations du comportement social liés à la progression des tumeurs et aux effets secondaires. Les bénéfices annoncés, surmonter les limites des thérapies conventionnelles et réduire les effets secondaires chez les patients, restent au conditionnel, et le porteur affirme que suivre les cellules immunitaires dans la tumeur exige un "modèle animal vivant entier".

Objectifs

Nous allons étudier une nouvelle stratégie thérapeutique qui combine une radiothérapie à faible dose (LDRT), un traitement immunologique (inhibiteur de PD-L1) et des traitements qui favorisent ou bloquent un type spécifique de mort cellulaire appelé ferroptose. Le but principal de ce projet est de comprendre si cette combinaison peut être plus efficace pour traiter les tumeurs et déclencher des effets à distance, appelés effets abscopaux, provoqués par la radiothérapie. La LDRT, qui utilise de très faibles doses de rayons (entre 0,5 et 2 Gy par séance), aide à stimuler les défenses immunitaires du corps et à réduire l’inflammation, tout en limitant les effets secondaires sur les tissus sains. Des études récentes montrent que la ferroptose, une forme de mort cellulaire contrôlée qui dépend du fer, peut rendre les cellules tumorales plus sensibles à la radiothérapie et renforcer la réponse immunitaire du corps contre les tumeurs. En combinant cette approche avec un traitement immunologique, nous espérons améliorer les effets bénéfiques, augmenter la survie des souris et comprendre les mécanismes derrière ces résultats.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer les avantages et les effets synergiques possibles de la combinaison de la radiothérapie, de l’immunothérapie et des agents modulant la mort cellulaire programmée (comme des inhibiteurs ou des inducteurs). Cette approche intégrative, appliquée dans un cadre préclinique de traitement multimodal, permettrait de surmonter les limites des thérapies conventionnelles et d’améliorer l’efficacité thérapeutique globale. En modulant les réponses immunitaires dans le microenvironnement tumoral et les mécanismes de mort cellulaire des tumeurs, cette stratégie pourrait augmenter significativement la réponse tumorale globale et offrir des bénéfices supplémentaires, notamment par l’optimisation des effets abscopaux. En outre, cette méthode à multiples facettes promet de générer des approches plus efficaces pour le traitement antitumoral, tout en réduisant les effets secondaires souvent associés aux thérapies actuelles.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (tous les jours jusqu’á régression de la tumeur ou fin de la procédure , durée 25 secondes), sous anesthésie locale, au maximum 60 injections. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=2, durée 12 minutes en tout).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir un stress léger dû à leur manipulation fréquente par l’expérimentateur, notamment lors des interventions telles que les injections ou l’administration de traitements. Ils peuvent également ressentir de la douleur et un inconfort légers à modérés, provoqués par des injections pour l’implantation des tumeurs, des traitements de radiothérapie ou l’administration de médicaments par injection. Par ailleurs, en raison de la progression des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements comportementaux légers ou modérés comme une diminution de l’appétit, une réduction de l’activité physique, des signes de fatigue ou des altérations du comportement social.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique du ciblage de la ferroptose combinés à la radiothérapie et à des immunomofulateurs sur la réponse tumorale. Ceci exige donc un système immunitaire dynamique complet (composé de toutes les cellules immunitaires) en interaction direct avec le stroma tumoral. L’étude du recrutement et de la réponse des cellules immunitaires dans la tumeur ainsi que leurs interactions complexes nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être réalisé in vitro ni in silico.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale. La randomisation est réalisée de façon à avoir la même moyenne taille tumorale dans chaque groupe de traitement. Nos calculs de puissance statistique nous ont permis de minimiser le nombre d’animaux tout en obtenant des différences significatives.Ces calculs visent à optimiser le nombre d’animaux requis tout en garantissant la pertinence des résultats expérimentaux.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux normes les plus élevées pour minimiser la douleur et le stress chez les animaux. Une anesthésie générale ou locale adéquate sera utilisée pendant les expériences pour soulager ou éliminer la douleur en particulier lors des injections . Les conditions d'hébérgement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaires. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limite précoces seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. De plus, pour des raisons de taille, de prix et de temps nous avons choisi cette espèce. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures.