Rongeurs
Etude des mécanismes physiopathologiques de l’athérosclérose EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumises à un régime enrichi en graisses pendant quatre, huit ou vingt semaines, puis à des injections tous les deux jours, 4 560 souris subissent des procédures déclarées de niveau léger et seront toutes tuées, le jour même d'un prélèvement sanguin sur animal vigile et d'une perfusion intracardiaque. L'objectif est de suivre le dépôt de lipides dans la paroi des artères, du tout premier stade jusqu'aux plaques avancées, sur des souris de quatorze, dix-huit ou trente semaines. Le porteur ne retient comme nuisances que la piqûre de l'aiguille et le prélèvement sanguin, et ne dit rien du régime gras suivi pendant cinq mois ni des transports entre les deux établissements utilisateurs. Il indique par ailleurs avoir réduit l'effectif "en respectant les contraintes de publication".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde et sont en croissante progression dans les pays à revenus faibles ou modérés. La principale cause sous-jacente de ces maladies est l'athérosclérose, une pathologie complexe et multifactorielle qui touche principalement les artères de gros et moyens calibres. Cette pathologie consiste en un dépôt de lipide dans la paroi des artères. Elle se développe dès l'enfance mais la progression des lésions augmente avec l'âge et varie selon le mode de vie (alimentation, exrcice physique, stress, tabagisme...) et nos facteurs de risque (diabète, hypertension, obésité). La première étape du développement de la plaque d'athérome est la perte d'intégrité (ou dysfonction) de l'endothélium qui est une barriere entre le sang et paroi artérielle. Cette perte d'intégrité de la barrière endothéliale favorise l'infiltration des lipoprotéines de basses densité (LDL) circulantes dans l'espace sous-endothélial induisant des réponses cellulaires de type inflammatoires et fibroprolifératives à l'origine des lésions athéromateuses. Au cours du temps, cette plaque d'athérome vient obstruer la lumière de l'artère et sa rupture sera responsable des conséquences dramatiques de cette pathologie comme l'infarctus du myocarde ou l'accident vasculaire cérébral. L'objectif de ce projet est donc de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dès l'initiation de cette pathologie jusqu'aux stades tardifs pour évaluer la vulnérabilité de la plaque et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques dans ce contexte physiopathologique. Plusieurs travaux ont déjà identifié que des protéines de la famille des phosphoinositides 3-kinase (PI3K) pourraient être des cibles thérapeutiques intéressantes dans ce contexte et nous souhaitons valider leur implication au cours de ce travail. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques qui pourraient être utilisées pour prévenir ou ralentir le développement de l'athérosclérose et diminuer ses conséquences dramatiques sur les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Tout ou partie des animaux enrolés dans ce protocole seront soumis à: 1/un régime enrichi en gras pendant 4 semaines ou 8 semaines ou 20 semaines 2/des injections tous les 2 jours 3/un prélèvement sanguin une seule fois le jour de la mise à mort sur animal vigile (durée: 1 min) 4/une perfusion intracardiaque une seule fois le jour de la mise à mort (durée: 10min). Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs avec un transport des animaux encadré par une procédure de transport déclarée (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les interventions 1, 2 sont réalisés dans l'EU1/2 et les interventions 3, 4 sont réalisés dans l'EU2/2.
Impact sur les animaux
La piqure d'une aiguille pour injecter des inhibiteur des cibles pharmacologiques étudiées entraine une douleur légère de courte durée . Un prélèvement sanguin sur animal vigile placé en décubitus latéral entraine une douleur légère de courte durée.
Devenir
A l'issu de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort pour analyser par immunofluorescence l'endothélium (pour les étapes initiatrices du développement de l'athérosclérose) ou les dépôts lipidiques signant la présence de plaque d'athérome (pour les stades précoces à plus avancés).
Remplacement
Notre équipe développe des modèles in vitro en 2D et 3D des vaisseaux pour éviter à son maximum la nécessité d'avoir recours à des modèles animaux. Néanmoins, l'athérosclérose est une pathologie multifactorielle qui fait intervenir les cellules de paroi vasculaire mais également les cellules inflammatoires et plusieurs facteurs circulants. Il est encore prématuré de pouvoir complètement modéliser cette pathologie complexe in vitro. Les animaux vivants resprésentent le seul modèle intégré et restent indispensables pour obtenir des résultats fiables sur cette pathologie.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est réduit à son maximum en respectant les contraintes de publication, sans compromettre les objectifs de l'étude et pour permettre de bonnes analyses statistiques. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés en fonction du design de chaque expérience. Nos études antérieures ont montré que des groupes de 20 animaux sont requis pour obtenir une répartition normale des mesures et des résultats robustes dans notre contexte d'étude. Le choix du groupe témoin sera optimisé pour permettre sa comparaison avec plusieurs groupes expérimentaux et ainsi diminuer l'utilisation inutile d'animaux. Enfin, sur chaque animal le coeur et l'aorte seront simultanément prélevés et les autres tissus de l'animal mis à mort seront proposés aux autres membres de l'équipe et de notre institut de recherche pour permettre d'optimiser au maximum l'utilisation de chaque animal.
Raffinement
Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont hébergés en cages ventilées, selon les normes de la directive 2010/63/EU, avec un enrichissement dans chaque cage (igloo, batônnets de bois, coton, sizzle nest). Des méthodes alternatives à la préhension par la queue sont utilisées, les procédures de mise à mort sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Quelle que soit la procédure utilisée, une observation des animaux en expérimentation est réalisée quotidiennement par du personnel compétent ayant un livret de compétence à jour et formé aux approches de chirurgie. L’état général de l’animal est évalué : prise de nourriture, toilette et mouvements habituels sont considérés comme des signes de bonne santé. La douleur est évaluée par les signes de prostration, de perte d’appétit ou de poids et de mouvements pénibles. Toute altération du bien-être (prostration, perte de poids, piloerection, blessures) des animaux sera évalué en concertation avec la structure chargée du bien être des animaux et le vétérinaire référent pour déterminer les soins ou l'action à appliquer pour réduire le stress, l'angoisse ou la souffrance animale.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle expérimental pour lequel il existe des animaux génétiquement modifiés: 1/ pour les différentes cibles étudiées dans ce projet et 2/permettant de récapituler de façon induite par un régime ou spontanée le développement de l'athérosclérose. De plus cette espèce de rongeur a des propriétés zootechniques (petite taille, un cycle de reproduction court permettant rapidement d’obtenir des générations successives pour les études à long terme) autorisant une mise en œuvre des protocoles expérimentaux de recherche facilitée et maîtrisée par notre équipe de recherche. Cette espèce présente également des paramètres physiologiques proches de l’Homme, la plaçant comme un organisme-modèle de choix pour l'étude des pathologies cardiovasculaires. Pour évaluer l'impact de l'invalidation de nos différentes cibles moléculaires au cours du développement de l'athérosclérose, les animaux utilisés seront agés de 14 semaines (étape initiatrice de l'athérosclérose), 18 semaines (stade précoce du développement de cette pathologie artérielle) ou 30 semaines (stade tardif du développement de cette pathologie artérielle).
Etude de l’influence du cycle hormonal dans un modèle de douleur chronique inflammatoire de la face chez la ratte
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
200 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ovariectomie de trente minutes sous anesthésie générale, toutes reçoivent une injection de produit inflammatoire dans la face, puis passent chaque jour des tests censés mesurer leur douleur. Le porteur attend de l'injection une hypersensibilité douloureuse, et de l'ablation des ovaires une douleur post-opératoire, un risque d'infection, un risque d'hémorragie et des modifications de l'appétit et du comportement social. Les retombées annoncées se limitent à la recherche préclinique elle-même, au conditionnel, et les tests comportementaux quotidiens ne sont jamais nommés.
Objectifs
Ce projet comporte deux objectifs : 1) Évaluer l’influence du cycle hormonal dans le développement d’une hypersensiblité douloureuse lors d’une stimulation tactile normalement non-douloureuse 2) Évaluer l’influence du cycle hormonal dans l’inflammation faciale et la réactivité cellulaire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le dimorphisme sexuel dans l'inflammation et le développement de douleur chronique faciale. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s'intéressant aux douleurs chroniques.
Procédures
Groupe 1: 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (1 fois par jour) Groupe 2: 1 ovariectomie (30 min) sous anesthésie générale + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (1 fois par jour) Groupe 3: 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale tests de mesure de l’inflammation(1 fois par jour) + stimulation (10min) sous anesthésie générale Groupe 4: 1 ovariectomie (30 min) sous anesthésie générale + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de l’inflammation(1 fois par jour) + stimulation (10min) sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
Les opérations chirurgicales d'ovariectomie chez la rate peuvent entraîner plusieurs nuisances : - douleur et inconfort (modéré): Comme pour toute intervention chirurgicale, l'ovariectomie peut provoquer une douleur post-opératoire. Les animaux peuvent montrer des signes d'inconfort, tels que des vocalisations, une agitation ou une diminution de l'activité. -infection (modéré) : Il existe un risque d'infection au site chirurgical, ce qui peut entraîner des complications supplémentaires. Les signes d'infection incluent une rougeur, un gonflement, une chaleur ou un écoulement au niveau de l'incision. -hémorragie (modéré) : Des saignements peuvent survenir pendant ou après l'opération, ce qui peut nécessiter des interventions supplémentaires pour contrôler l'hémorragie. -changements hormonaux (modéré) : L'ovariectomie entraîne une diminution des hormones sexuelles, ce qui peut affecter le comportement et le métabolisme de l'animal. Cela peut se traduire par des changements d'appétit, de comportement social ou d'activité. Suite à l’injection du produit inflammatoire (sujet de l'étude), nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse (modéré).
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales. Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections, comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.
Raffinement
Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats sont préalablement anesthésiés. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.
Elevage de deux lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des complications cardiovasculaires liées à la maladie rénale chronique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune amputée de deux millimètres de l'extrémité de la queue au sevrage, à quatre semaines, pour lire son génotype. Une des deux lignées élevées développe spontanément une maladie rénale chronique, avec une dégradation de la fonction rénale à partir de dix semaines, une perte de poids, des poils hérissés et une posture anormale. Le projet ne produit aucun résultat par lui-même, il fournit des souris adultes à un second projet mené dans un autre établissement. Le porteur qualifie le maintien de ces deux lignées d'"indispensable" et annonce que les hétérozygotes non utilisés seront proposés à d'autres équipes ou transférés vers d'autres centres.
Objectifs
La maladie rénale chronique (MRC) conduit à la rétention de toxines urémiques qui s’accumulent dans le sang et les tissus au lieu d'être excrétées par les reins. Certaines de ces toxines agissent grâce à un récepteur et sont associées à la mortalité cardiovasculaire. Notre but est de comprendre le rôle de l'activation du récepteur aux toxines in vivo dans les maladies touchant les vaisseaux et nécessite la gestion et l’utilisation de modèles animaux. Nous utiliserons un modèle génétique de MRC qui développe spontanément la maladie et un autre modèle génétique pour l’étude du récepteur aux toxines. Ces 2 lignées de souris sont disponibles commercialement et nous avons pour objectifs dans ce projet d’élever ces deux lignées. Ce projet d'élevage et de maintien de souris génétiquement modifiées permettra de mettre en œuvre des modèles in vivo pour l'étude du rôle des toxines urémiques au cours de la maladie rénale chronique. Les souris de ce projet d’élevage seront utilisées dans un projet déjà expertisé et validé (projet n°2) pour un autre établissement utilisateur.
Bénéfices attendus
le maintien de ces deux lignées est indispensable car elles apporterons de nouvelles connaissances dans la compréhension du rôle des toxines urémiques et de leur récepteur dans les complications liées à la maladie rénale chronique conduisant potentiellement à de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Au moment du sevrage des souris, un seul prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) au niveau de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Les souris seront attrapées en les saisissant près de la base de la queue avec une main et en saisissant la peau de la nuque avec la main opposée. Pour sécuriser et contrôler l’animal, la queue sera placée entre les doigts. Afin d'identifier les animaux, un prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) à l'extrémité de la queue à l'aide de ciseaux. Cette biopsie sera conservée dans un tube à -80°C pour le génotypage ultérieur des souris par PCR. Cette intervention durera quelques secondes afin de limiter le stress et la douler des animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées à la biopsie pour le génotypage qui nécessite de couper l'extrémité de la queue (codectomie) au moment du sevrage à 4 semaines (douleur et stress), ainsi qu'à la détérioration de la fonction rénale à partir de 10 semaines dans le modèle génétique de maladie rénale chronique. Chez ces souris, nous nous attendons à observer une perte de poids qui est un des premiers signes de la maladie, et à une apparition plus précoce des points limites par rapport à l’apparence physique (poils hérissés, dos courbé ou posture anormale), aux signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire par exemple) et aux comportements non provoqués (attitude prostrée par exemple).
Devenir
Tous les animaux seront en utilisation continue et seront gardés en vie dans ce projet qui concerne l'élevage et le maintien de lignées pour l'étude du rôle d'un récepteur aux toxines urémiques dans la maladie rénale chronique.
Remplacement
Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés car il n'y a pas de remplacemment possible sur le projet de prélèvement de tissu. De plus, Il n'existe pas de modèles in vitro suceptibles d'apporter le même niveau d'information pour létude de la maladie rénale chronique ainsi que des ses conséquences cardiovasulaires. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux génétiquement altérès à phénotype dommageable afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.
Réduction
Dans ce projet, nous génotyperons tous les animaux. La production de tous les animaux, y compris ceux avec un phénotype dommageable (KO col4a3), sera adapté et réduit au minimum nécessaire sans compromettre la puissance statistique dans les procédures du projet n°2. Des accouplememts homozygotes seront mis en place afin de réduire le nombre d'animaux hétérozygotes produits. Les animaux hétérozygotes non utilisés seront mis à disposition d'autres équipes et pourront également etre transférés dans d'autres centres de recherche s'intéressant à la maladie rénale chronique (modèle Col4a3) et/ou à AhR.
Raffinement
La procédure °1 qui correspond à un prélèvement invasif au niveau de la queue est un méthode précise et standardisée qui dure quelques secondes ce qui limite les effets indésirables liées au stress et à la douleur. En ce qui concerne la procédure n°2, les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux ayant une maladie rénale chronique (modèle MRC). Ces animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. La douleur ou la détresse de l’animal constitueront des points limites. Par exemple, une perte importante de poids constituera un point limite et nécessitera l’euthanasie de l'animal. La douleur ou la détresse de l'animal sera évaluée sur différents paramètres : poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Des scores seront établis en fonction de ces observations et grâce à une grille d’évaluation de la douleur (cf annexe), un score sera déterminé. Selon le score, nous agirons en conséquence en fournissant à l’animal une analgésie (cf annexe). L’euthanasie de l’animal sera envisagée (scores 10 à 14) voire immédiate (score supérieur à 14). Pour les souris MRC, nous serons particulièrement attentifs à la perte de poids qui est un symptôme lié à la détérioration de la fonction rénale ainsi qu’à leur apparence physique et les mesures citées précédemment seront mises en œuvre en fonction du score d’évaluation de la douleur.
Choix des espèces
Les modèles animaux de maladie rénale chronique sont essentiels pour l’étude des évènements pathophysiologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant une maladie rénale chronique. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le mieux maitrisé pour la modification d'un gène dans le but de l'étudier dans un contexte physiopathologique. De plus les lignées de souris utilisées dans ce projet sont disponibles commercialement. Les prélèvements de tissu en vue du génotypage auront lieu entre 3 et 4 semaines de vie, au moment du sevrage. Les animaux obtenus dans ce projet seront élevés jusqu'à 8-10 semaines avant d'être utilisés dans les procédures du projet n°2 pour lequel des souris adultes sont nécessaires. En effet, la maladie rénale chronique est une pathologie qui touche principalement les sujets humains adultes et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle murin au même stade.
Étude de la rythmicité circadienne du plexus choroïde et de sa contribution à la maladie d’Alzheimer et au vieillissement prématuré du cerveau.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une partie des 2 040 souris est uniquement anesthésiée profondément puis vidée de son sang, sans jamais se réveiller, l'opération durant une trentaine de minutes. Les autres subissent une injection dans le cerveau au cours d'une chirurgie de trente minutes à une heure, puis quatre semaines plus tard des tests comportementaux, cinq injections quotidiennes et un prélèvement de liquide céphalorachidien avant d'être tuées à leur tour, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que leur génotype leur donne, à partir de six mois, un comportement dépressif, une sociabilité réduite et de l'anxiété. Il écrit avoir envisagé les organoïdes mais conclut qu'ils ne développent pas les signatures cellulaires observées, et écarte la drosophile, le nématode et le poisson zèbre au motif que leur barrière cérébrale diffère de celle des mammifères.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Certains traitements existent pour les maladies neurodégénératives, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent qu'une dérégulation circadienne augmente les probabilités de développer la maladie, et les zones d’interface entre sang et cerveau sont connus pour être fortement régulés par le rythme circadien. Les zones d’interface entre sang et cerveau constitue l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Elles sont situées dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacentes aux zones impliquées dans la production des neurones. Structurellement, les zones d’interface entre sang et cerveau sont composés d’un réseau de vaisseaux sanguins fenêtrés entourés d’une variétés de cellules. Les principaux rôles physiologiques des zones d’interface entre sang et cerveau sont la production de liquide céphalo-rachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, et la production et le passage contrôlé du sang vers le cerveau de diverses molécules de signalisation, dont des hormones et des facteurs qui ciblent les neurones. Les molécules sécrétées par ces zones façonnent l’activité cérébrale, par exemple en modulant la production de neurones, ce qui les rend cruciales pour l’équilibre du cerveau. Des travaux préliminaires sur l’expression des gènes circadiens de ces zones ont révélé que les oscillations rythmiques sont clé dans l’organisation de son activité, qui est encore modifiée par le sexe, le vieillissement et le contexte pathologique (en particulier la maladie d’Alzheimer). Ces recherches ont également suggéré la présence d'une signature cellulaire. Notre objectif est d'étudier comment la régulation circadienne et, en particulier, un certain programme façonnent la trajectoire du vieillissement cérébral et le cours du développement de la maladie d’alzheimer dans des modèles murins.
Bénéfices attendus
Le cerveau flotte dans le Liquide céphalo rachidien (LCR), un liquide qui joue un rôle clé dans son entretien). Des recherches antérieures ont démontré que les changements liés au vieillissement dans la composition et le flux du LCR favorisent le vieillissement cérébral et la neurodégénérescence et que leur inversion peut inverser certaines caractéristiques du vieillissement cérébral et les propriétés et le flux du LCR sont étroitement contrôlés par l’épithélium du plexus choroïde. Des travaux antérieurs et nos données préliminaires ont montré que la fonction du plexus choroïde dépend de manière critique du rythme circadien, du sexe, de l’âge et de l’état de la maladie (en particulier de la MA). Plus précisément, en utilisant la transcriptomique, nous avons constaté que chez les jeunes souris, nous avons observé une signature neuroépithéliale dépendante du rythme circadien et nos analyses informatiques ont prédit sa dépendance à deux facteurs de transcription compétitifs. Donc, nous visons à étudier les facteurs possibles responsables de l'induction de la signature et l'impact de la modification des programmes circadiens au niveau du plexus choroïde sur le plexus choroïde,
Procédures
Certaines souris subiront uniquement une exsanguination sous anesthésie profonde et analgésie.Certaines souris subiront uniquement une exsanguination sous anesthésie profonde et analgésie; de l'injection de l'analgésie à l'exanguination complète, cette procédure prend environ 30 minutes. D’autres souris seront soumises à une injection dans le cerveau (une procédure chirurgicale) sous anesthésie générale et analgésie (durée de la procédure : 30 min à 1h sur adulte), suivie deux mois plus tard de 5 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une injection dans le cerveau (une procédure chirurgicale) sous anesthésie générale et analgésie (durée de la procédure : 30 min à 1h sur adulte). Quatre semaines après chirurgie, les animaux seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs (trois tests d'une durée de 1 à 3 jours, avec un jour de repos entre les tests.). Après, les souris recevront 5 injections (une par jour pendant 5 jours). Le jour de la mise à mort, les souris recevront 4 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Certaines souris recevront une injection supplémentaire. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes. Certaines souris recevront cinq gavages (un tous les deux jour). Quatre semaines après chirurgie, les animaux seront impliqués dans des tests de comportement non invasifs (trois tests d'une durée de 1 à 3 jours, avec un jour de repos entre les tests). Après, les souris recevront 5 injections (une par jour pendant 5 jours). Le jour de la mise à mort, les souris recevront 4 injections et un échantillonnage du liquide céphalorachidien sous anesthésié avant l'exsanguination. Certaines souris recevront une injection supplémentaire. Les injections réalisées ne prennent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort de courte durée (2-3 jours). Les injections par voie-intrapéritonéale pourront générer une douleur légère de courte durée. Peu de stress à l’animal. Les souris étudiées peuvent présenter un comportement dépressif, un comportement social diminué et des comportements anxieux à partir de 6 mois en raison de leur génotype.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition
Remplacement
Notre objectif est d'étudier comment les cellules du programme circadien de certaines zones d’interface sang/cerveau agissent sur le cerveau dans des conditions physiologiques et dans la maladie d'Alzheimer. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui rende compte de la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composantes tissulaires et focntionnelles. Des animaux plus simples comme la drosophile, Caenorhabditis elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des organoïdes, mais à notre connaissance, ils ne développent pas les signatures cellulaires que nous avons observées in vivo et dans des explants.
Réduction
Nous souhaitons étudier les interactions entre les programmes circadiens au niveau des zones d’interface sang/cerveau et du cerveau. Les quantités d'animaux (2040 au total) utilisés pour mener à bien notre projet sont établis en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Toutes les souris seront utilisées pour mesurer plusieurs résultats d'étude. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences en triple seront réalisées pour obtenir des résultats robustes. Selon le nombre de groupes comparés : 4 groupes comparés (par exemple sains vs. Maladie d’alzheimer et traités vs. contrôle) : les nombres proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Les procédures décrites visent à réduire au maximum l'inconfort des animaux. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie sur un tapis chauffant sur lequel ils seront maintenus pendant et quelques heures après le réveil. Les interventions sur les adultes peuvent provoquer des douleurs modérées pendant la cicatrisation qui seront prévenues par une injection d’analgésique, 30 min avant l'intervention, 6 heures après, puis toutes les 12 heures pendant 48 heures en cas de douleur. Un analgésique sera aussi appliqué sur les zones à inciser et un autre sera également ajouté après l'intervention dans l'eau de boisson pendant la cicatrisation. Pour améliorer la prise alimentaire, un gel alimentaire sera ajouté dans les cages en post chirurgie ainsi que le renforcement de l’enrichissement. La récupération des animaux après leur chirurgie sera surveillée régulièrement et nous suivrons les signes et les points limite définis. Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. De plus, les modifications génétiques peuvent être associés à une anxiété accrue chez la souris, pour limiter l’inconfort de ces animaux, leur suivi sera assuré selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l'étude de la physiologie des mammifères. De nombreuses souris transgéniques et outils de modifications génétiques sont disponibles, permettant d'étudier les fonctions précises de gènes et de voies sélectionnés. De plus, la souris permet l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. Les souris permettent de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la pathologie humaine. Nous avons donc choisi ce modèle pour mener notre étude de certains facteurs agissant sur le cerveau, en condition physiologique et au cours du vieillissement. Nous utiliserons des souris jeunes adultes (8-12 semaines) pour étudier la physiologie de l'activité circadienne du plexus choroïde. Dans certaines procédures, nous ferons vieillir les souris jusqu'à 12 mois pour étudier l'interaction des voies circadiennes avec la neurodégénérescence. Au cours du développement typique de la maladie d’alzheimer chez la souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques dans le cerveau, à partir de 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, qui sont évidentes entre 6 et 11 mois chez les souris. Cet âge peut varier en fonction du microbiote et du sexe. Pour capturer ces fenêtres de progression de la maladie, nous induirons la modification génétique chez les souris à l'âge de 2 mois et surveillerons la progression de la maladie en termes de capacité cognitive à 6, 8, 10 et 12 mois. Nous nous attendons à ce que les modifications génétiques accélèrent ou ralentissent la courbe du déclin cognitif chez ces souris.
Etude de l’effet d’un signal 5G sur la thermorégulation et sur la peau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
Pour savoir si un signal 5G à 3,5 gigahertz modifie la régulation de la température du corps et abîme la peau, 160 souris sans poil vont être utilisées dans des procédures classées comme légères, toutes tuées à l'issue. Elles restent dans leur cage, placée au centre d'une chambre réverbérante, exposées aux radiofréquences pendant quatre semaines, ou reçoivent une minute d'ultraviolets B connus pour provoquer rougeur et inflammation locale. Leur peau et leur tissu adipeux brun sont prélevés après la mise à mort. Sur les 160 souris, 64 sont prévues en réserve, mobilisables seulement si une expérience s'interrompt pour un problème technique.
Objectifs
La 5G, ou cinquième génération de réseau mobile, est en cours de déploiement afin de répondre à l’augmentation des besoins en connectivité et en services numériques. Toutefois, comme pour les générations précédentes, des interrogations subsistent quant à ses effets potentiels sur la santé. En 2020, une nouvelle bande de fréquence autour de 3,5 GHz a été attribuée à la 5G. Cette fréquence, bien que proche de celles déjà utilisées, a la particularité de pénétrer légèrement dans les tissus biologiques, sur quelques centimètres. Notre étude vise à explorer si une exposition à cette fréquence pourrait influencer la régulation de la température corporelle, en particulier chez les rongeurs. Nous nous intéresserons aux récepteurs impliqués dans la perception du froid afin de mieux comprendre leur rôle dans cette réponse. Par ailleurs, nous examinerons si la 5G pourrait avoir un impact sur la peau en favorisant un déséquilibre entre la production et l’élimination de certaines molécules agressives pour les cellules, appelées radicaux libres. Pour cela, nous analyserons plusieurs indicateurs de dommages cellulaires, notamment des modifications dans les lipides et le matériel génétique des cellules, ainsi que les mécanismes naturels de protection mis en place par l’organisme.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet est de déterminer l'impact des radiofréquences sur la thermorégulation et sur la peau. Il existe encore peu de données publiées sur les effets toxicologiques des bandes de fréquence utilisées dans la 5G. Ceci ne permet pas à ce jour d'avoir une réponse claire sur leurs effets. Les résultats obtenus permettront de compléter les données pour l’évaluation des risques des radiofréquences.
Procédures
Les souris seront exposées libres de leurs mouvements aux radiofréquences pendant 4 semaines ou aux ultraviolets pendant 1 min maximum.
Impact sur les animaux
L’exposition aux radiofréquences peut induire des modifications physiologiques subtiles et un certain inconfort chez les animaux. L’exposition aux rayonnement ultraviolets B est connue pour induire des réactions telles que l’érythème, une augmentation des radicaux libres et une amplification de l’inflammation locale.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à l'issue de chaque procédure avant le prélèvement des tissus adipeux bruns et de la peau.
Remplacement
Il est impossible de remplacer le modèle animal dans ce projet, car il étudie des processus dynamiques de thermorégulation et de la peau qui ne peuvent être reproduits par des modèles in vitro. Par conséquent, nos expérimentations ne peuvent en aucun cas être remplacées par d'autres méthodes alternatives.
Réduction
Nous utiliserons le nombre d'animaux nécessaire pour réaliser l'ensemble des tests, avec des groupes de 8 souris par sexe et par condition d'exposition. Quatre niveaux d'exposition sont prévus ainsi qu'un groupe dit contrôle qui restera à l'animalerie. Un groupe supplémentaire servira à valider nos techniques de prélèvements et d’analyses. Nous utiliserons la même souris pour l’étude sur la régulation de la température du corps et sur les effets de l’exposition sur la peau. Un total de 160 souris sera utilisé, incluant 64 souris supplémentaires réservées uniquement en cas d'interruption d'une expérimentation en cours due à un problème technique. Ces souris supplémentaires seront utilisées uniquement si cela s'avère nécessaire.
Raffinement
À leur arrivée, les souris seront placées dans des cages en plexiglas utilisées dans l’animalerie, avec un maximum de 8 souris par cage, et y resteront pendant une semaine. Elles seront ensuite exposées aux ondes en restant dans leur cage d’hébergement, qui sera placée au centre d’une chambre réverbérante, sans manipulation supplémentaire, ce qui permettra de réduire leur stress. La salle d’exposition des animaux et les chambres réverbérantes bénéficient d’un environnement contrôlé quotidiennement, incluant une vérification des températures. Une surveillance quotidienne sera effectuée par le personnel de l’équipe pour vérifier l'apparence physique et des changements de comportement. Une fiche de suivi permettra d’évaluer les points limites en cas de signes de souffrance et de mettre en place les mesures appropriées.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. C'est un modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain. L'utilisation de souris sans poil est particulièrement pertinente pour notre étude car leur absence permet une meilleure exposition de leur peau aux stimuli externes tels que les radiofréquences ou les ultraviolets de type B et facilite le prélèvement d’échantillons. Les souris seront inclues dans le protocole expérimental à l'âge de 5 semaines. A cet âge, elles sont considérées comme de jeunes adultes ayant atteint un stade de développement où leur peau est pleinement formée et fonctionnelle .
Maintien d’une ligné de rats Stargardt.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Une biopsie de la queue est pratiquée sur chaque raton âgé de huit à dix jours, sous anesthésie locale, pour lire son génotype. 1 250 rats issus de ce programme de reproduction vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 250 étant gardés comme reproducteurs et les autres tués dès les résultats connus s'ils n'entrent dans aucun projet. Maintenir cette lignée porteuse de la mutation de la maladie de Stargardt, qu'aucun fournisseur ne propose, permet de la mettre à disposition d'équipes académiques et privées. Le porteur qualifie la biopsie d'indolore à cet âge, tout en décrivant des vocalisations possibles, un défaut de reptation, un isolement du reste de la portée et un retard à la tétée dans les jours qui suivent.
Objectifs
La maladie de Stargardt (STGD1) est une maladie des yeux qui touche environ 1 personne sur 8 000 à 10 000, affectant surtout la macula, la partie de l'œil responsable de la vision de jour. La perte des cellules visuelles appelées cônes dans cette région peut mener à la cécité. Les photopigments, formés par la vitamine A et une protéine appelée opsine, rendent les photorécepteurs sensibles à la lumière. Cependant, le processus de détection de la lumière crée des sous-produits toxiques. La protéine ABCA4 aide à transporter ces toxines pour qu'elles soient éliminées. Des mutations dans le gène ABCA4 empêchent ce transport, causant l'accumulation de toxines et la mort des photorécepteurs et d'autres cellules oculaires. Actuellement, il n'existe pas de traitement pour cette maladie. Les modèles animaux actuels pour la STGD1 sont principalement des souris modifiées génétiquement, mais elles ne montrent que peu de symptômes de la maladie. Pour cette raison, nous avons décidé de créer un rat transgénique portant la mutation la plus fréquente dans la maladie de Stargardt. Utiliser des rats présente plusieurs avantages par rapport aux souris. Lors des injections dans l'œil des souris, il est difficile de contrôler la quantité de liquide injecté sans qu'il s’échappe vers d'autres parties de l'œil. Les rats ont des membranes oculaires plus robustes, ce qui permet un meilleur contrôle des injections et réduit le risque de fuite. De plus, lors de longues anesthésies, les souris peuvent développer une opacité du cristallin (semblable à une cataracte) qui complique les examens oculaires. Ce problème est beaucoup moins fréquent chez les rats. Le modèle de rat que nous avons créé reflète bien la maladie humaine sans affecter significativement le rat lui-même. Les changements observés chez ces rats sont similaires à ceux de la maladie STGD1 chez l'humain. Notre projet consiste à maintenir une colonie de rats STGD en utilisant des mâles et des femelles porteurs de la mutation (hétérozygotes, HE, ou homozygotes, KO). Les rats STGD et les rats sains issus de la même portée (appelés WT) seront utilisés pour de futures études de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologique. Certains rats HE et KO seront également utilisés pour la reproduction.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de ce projet est la caractérisation génétique, par une méthode invasive, d’animaux génétiquement modifiés représentant un modèle de la dégénérescence maculaire ou de la maladie de Stargardt (rats STGD) dont la physiopathologie est similaire à celle observée en humaine. Cette caractérisation permettra d’optimiser la gestion d’élevage de cette colonie. Ce projet assurera ainsi le maintien de cette lignée, qui n’est proposée par aucun fournisseur à ce jour, et mettra à la disposition des équipes de recherche, tant académiques que privées, ce modèle animal pertinent de la STGD1. Ce modèle animal servira de support pour les futures études et projets scientifiques associées.
Procédures
Une biopsie de queue sera réalisée sur les ratons de toutes les portées issues des reproductions. L'acte sera réalisé une seule fois, précocement au cours de la vie de l’animal, afin de déterminer son génotypage, c'est à dire identifier si l'animal est atteint de la maladie de Stargardt (STGD) ou bien s'il s'agit d'un animal sain. Le prélèvement se fera sous anesthésie locale.
Impact sur les animaux
Un génotypage sera effectué par biopsie de la queue chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, une procédure considérée comme modérée. Une anesthésie locale est prévue lors de l'intervention. Bien que peu fréquents, certains signes de douleur pourraient apparaître dans les heures ou jours suivants, tels qu'un défaut de reptation, des vocalisations, un isolement du reste de la portée ou un retard dans la reprise de la tétée après le retour au nid.
Devenir
Suite au génotypage, le devenir des animaux générés lors de notre programme de reproduction sera fonction des besoins des projets dans lesquels ils seront inclus : (i)Les rats KO et WT seront inclus dans les études futures de thérapie génique, cellulaire ou pharmacologiques au fil de l’eau en fonction du dynamisme de la colonie implantée. (ii)Une partie des rats (environ un à deux par portée) obtenus seront conservés en vue d'intégrer le pool des reproducteurs. (iii) Les autres animaux issus des portées et ne pouvant pas être intégrés dans un projet seront euthanasiés dès le rendu des résultats des génotypages.
Remplacement
L'utilisation de modèles animaux constitue, à ce jour, l'unique approche pour étudier la physiopathologie et le transfert de gènes dans la rétine, une structure complexe formée de multiples couches de neurones et de cellules nourricières, avant de passer à des études précliniques ou cliniques chez l’homme. Cette lignée de rats permettra, dans le cadre de futurs projets, d’évaluer l’effet d’un traitement à la fois dans un contexte malade (rats KO) et dans un contexte sain (rats WT), justifiant ainsi la nécessité du génotypage. Actuellement, le génotypage invasif reste une méthode simple, rapide, bien maîtrisée et capable de fournir des résultats fiables pour la caractérisation génétique des rats. Réalisée chez des ratons âgés de 8 à 10 jours, cette technique est indolore. À l’inverse, le génotypage par prélèvement salivaire, bien que moins invasif, n’est pas recommandé en raison de la complexité de sa mise en œuvre (taille inadaptée des swabs par rapport à la petite bouche des ratons à cet âge) et de la faible fiabilité des résultats obtenus. Un génotypage basé sur la collecte de bulbes pileux est actuellement en cours de validation. Cette méthode, non invasive, sera adoptée au sein de notre centre une fois sa mise en œuvre finalisée, incluant la formation du personnel à cette technique et la mise au point du génotypage à partir de bulbes de poils dans notre laboratoire.
Réduction
La détermination du nombre total d’animaux à inclure dans ce programme de reproduction a été réalisée sur la base de l'expérience de précédentes reproductions menées pour des projets de thérapie génique chez le rat STGD. Dans ce projet, afin de générer au maximum 200 rats STGD KO et 50 rats WT par an, nous estimons qu'il sera nécessaire de mettre à la reproduction environ 50 couples par an, soit un total de 250 animaux reproducteurs utilisés sur 5 ans afin de générer environ 1250 rats STGD et WT. Ce nombre est estimé en fonction de nos connaissances actuelles sur les particularités de reproduction sur ce modèle et en considérant que la lignée génèrera des portées de taille standard (Cf. schéma d’accouplement en Annexe). Les accouplements seront optimisés afin de maximiser le nombre de rats KO et d'éviter les portées de rats WT uniquement. Cette optimisation privilégiera les reproductions suivantes : KO x KOet HE x HE. Une reproduction KO x KO nous permettra d’obtenir 100% d’animaux KO, une reproduction HE x HE nous permettra d’obtenir théoriquement 50% d’animaux HE, 25% d’animaux KO et 25% d’animaux WT. Il est important de noter que cette lignée a déjà été cryopréservée. Elle est conservée tant que des projets sont en cours de planification, mais son maintien sera interrompu en l'absence de nouveaux projets.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1. De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation et un suivi régulier des animaux, assuré par les techniciens animaliers (observations quotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). 2. Les biopsies de la queue destinées au génotypage seront effectuées par des techniciens compétents et spécialement formés à ces procédures rigoureuses. Cette méthode de génotypage, bien établie, rapide et standardisée dans notre centre, permet de minimiser le stress des animaux. Une analgésie sera assurée à l'aide d'un anesthésique local (comme le TRONOTHANE ou l'EMLA). La cicatrisation sera également surveillée dans les jours suivant l'intervention afin de garantir une bonne cicatrisation. En cas de besoin, une injection sous-cutanée de Buprénorphine peut être administrée à une raison de 0.05 mg/kg. 3. Afin d’améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates (Cf. annexe de la saisine).
Choix des espèces
Le rat est un bon modèle pour tester les traitements de thérapie génique des yeux. Son œil est assez grand pour permettre une distribution uniforme des fluides sous la rétine, avec moins de risque de fuite par rapport à la souris. De plus, lors de longues anesthésies, les rats ont moins de problèmes d'opacité du cristallin, qui peut compliquer les examens oculaires. Ce problème, qui ressemble à une cataracte, est courant chez les souris et est causé par le dessèchement de la cornée. La lignée de rats que nous avons développée imite bien la maladie de Stargardt chez l'humain sans nuire aux rats eux-mêmes. Les changements observés chez ces rats reflètent fidèlement ceux de la maladie humaine. Pour nos expériences, nous aurons besoin de jeunes rats adultes âgés de 2.5 mois pour la reproduction, ainsi que de rats adultes. Les rats modifiés génétiquement (KO) et les rats normaux (WT) seront généralement utilisés dans les expériences dès le sevrage. Selon les projets, les rats seront utilisés à différents âges, avec des justifications spécifiques pour chaque étude.
Exploration du métabolisme du pyrophosphate dans un syndrome métabolique avec calcifications vasculaires associées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La moitié reçoit un régime riche en graisse jusqu'à l'âge de vingt ou trente semaines, avec deux prises de sang sous anesthésie précédées chacune de quatre heures sans nourriture. Le porteur qualifie le projet d'"indispensable" et renvoie ses retombées pour les patients, un outil de pronostic et de nouveaux traitements, au long terme. Sur le remplacement, il indique que la culture cellulaire reste utile pour comprendre les calcifications mais ne reproduit pas les relations entre le foie, le cœur et les vaisseaux.
Objectifs
Les personnes atteintes d’un syndrome métabolique, en particulier celles atteintes d’athérosclérose, de diabète de type 2 et/ou d’une maladie hépatique sont confrontées à un risque élevé de mortalité cardiovasculaire, possiblement à cause du développement de calcifications vasculaires. Il n’existe pas actuellement de traitement pour empêcher ces calcifications. Comme dans la minéralisation physiologique, la minéralisation pathologique, qui inclut les calcifications vasculaires, implique quelques facteurs sanguins circulants. Dans la circulation sanguine, le régulateur le plus puissant de la minéralisation connu est le pyrophosphate, qui est libéré dans la circulation sanguine par le foie. Chez les patients atteints d'une maladie hépatique, l’augmentation des calcifications vasculaires peut être le résultat d'une diminution de la production hépatique de pyrophosphate et/ou d'une augmentation de la dégradation de ce composé dans le foie, dans la circulation sanguine ou dans les artères. L'objectif global de ce projet est de découvrir les mécanismes d'action du pyrophosphate en lien avec le développement des calcifications vasculaires dans le contexte d’un syndrome métabolique. Une meilleure compréhension du mode d’action du pyrophosphate pourrait permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles capables de contrecarrer ses effets.
Bénéfices attendus
Ce projet est indispensable pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires d’action du pyrophosphate dans les calcifications vasculaires dans un syndrome métabolique hépatique, les calcifications vasculaires étant un facteur de mortalité important dans ce syndrome. Les bénéfices à court terme de cette étude seront, autant pour les scientifiques que pour les médecins, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la formation des calcifications artérielles dans le syndrome métabolique et l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques visant à limiter le développement des calcifications. A plus long terme, l’ensemble de ces résultats pourraient conduire à la détermination d’un outil de pronostic pour identifier les patients atteints de syndrome métabolique et à risque de mortalité cardiovasculaire, ainsi qu’au développement de nouveaux traitements bénéfiques pour les patients.
Procédures
Les animaux impliqués dans cette étude, âgés de 10 semaines, seront alimentés avec un régime normal pour moitié et par un régime riche en graisse pour l’autre moitié des animaux pour des durées variables (jusqu’à l’âge de 20 ou 30 semaines), pour étudier l’impact du régime sur l’apparition de la maladie hépatique et des calcifications vasculaires. Pendant cette période, toutes les souris auront 2 prises de sang (prélèvements effectués sous anesthésie en 5 min par un manipulateur expérimenté) afin de mesurer différents composés sanguins et de suivre l’évolution de la pathologie. Ces prélèvements auront lieu à l’âge de 10 et 15 semaines, pour moitié des animaux et à l’âge de 20 et 25 semaines pour l’autre moitié. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie à l’âge de 20 ou 30 semaines, afin de permettre le dernier prélèvement de sang et le prélèvement de tous les organes nécessaires pour réaliser les analyses histologiques et complémentaires requises pour le projet.
Impact sur les animaux
Les animaux sont exposés, pour la moitié des groupes, à un régime riche en graisse. Ce régime, en soi, n’entraine pas de douleurs mais en induisant les désordres métaboliques pourrait générer un inconfort pour ces animaux. L’état général des animaux n’est pas altéré (locomotion et vivacité non modifiées, prises de boisson et de nourriture normales, prise de poids équivalente à celle des souris en régime normal). Le développement de la maladie reste modéré, est bien toléré chez la souris, et ne compromet pas la survie des animaux qui ne seront pas conservés à des stades très avancés de la maladie (euthanasie au plus tard à un âge de 30 semaines, sachant que la pathologie peut évoluer jusqu’à l’âge de 60-70 semaines chez la souris). Un épisode passager de dermatite peut être observé chez certains animaux, dû au régime riche en gras. Lors de la prise de sang, une gêne au point de prélèvement peut être ressentie. La nature des analyses sanguines réalisées le nécessitant, les animaux seront mis à jeun 4 heures avant les prélèvements sanguins (2 fois pour chaque souris au cours de la procédure, en plus du prélèvement terminal), qui sont sources de stress transitoire.
Devenir
Les souris nécessaires aux expériences prévues dans ce projet seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de prélever les échantillons sanguins et tissulaires. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser les analyses biologiques du sang et les examens au microscope des tissus qui permettront de repérer le début et d’analyser le développement de la maladie, et par la suite de comprendre les mécanismes de formation des calcifications dans le cadre du syndrome métabolique hépatique.
Remplacement
La culture cellulaire in vitro est très utile pour déterminer les mécanismes impliqués dans la formation des calcifications, mais elle est inadaptée pour reproduire les mécanismes de syndrome métabolique complexe in vivo impliquant des facteurs sanguins. Les relations entre les organes (foie-cœur, foie-vaisseaux sanguins…) et entre les cellules à l’intérieur des organes, dans ce contexte, sont très complexes. Le développement de la maladie faisant intervenir différents organes ne peut donc être étudié que grâce à un modèle animal in vivo.
Réduction
Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Le nombre d’animaux réduit au juste nécessaire à cette étude a été calculé afin d’obtenir néanmoins la puissance statistique maximum. En utilisant un outil statistique adapté, un nombre de 10 souris par groupe a été jugé suffisant pour obtenir des valeurs exploitables en fin d’expérimentation. De nombreux échantillons (sang et organes) seront prélevés sur chaque animal, afin d’assurer qu’un maximum de données seront obtenues en une seule procédure.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été défini dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de deux semaines d’acclimatation sera réalisée afin que les souris s’habituent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les animaux sont dans une salle d’hébergement avec un passage quotidien, ils disposent d’enrichissement physique et social (cage transparente 3-4 souris par cage, copeaux de bois, tunnel en carton, frisottis pour se fabriquer un nid, igloo …). Les croquettes du régime riche en gras sont bien tolérées par les animaux mais sont néanmoins un peu plus humides que les croquettes du régime normal. Un enrichissement supplémentaire en copeaux de bois et en bâtonnets durs à ronger sera apporté aux animaux. Les animaux qui pourraient être incommodés par une dermatite recevront les soins appropriés (crème apaisante tous les jours). Les actes qui pourront produire un stress chez les animaux (prélèvements de sang) seront réalisés dans des salles dédiées et par un expérimentateur habilité, sous anesthésie et analgésie. La mise à jeun de 4 heures, nécessaire avant les prélèvements sanguins, peut également être source de stress. Elle sera réalisée en tout début de journée (à l’allumage de la lumière), les souris étant des animaux nocturnes, le jeûne devrait moins les affecter à cette période. L’état général des animaux chez qui la pathologie est induite sera suivi sur une grille de score permettant de s’assurer que l’état des animaux n’est pas altéré. Si un des points limites retenus est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront euthanasiés.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de déterminer les conditions qui permettent de déclencher un syndrome hépatique en présence d’une athérosclérose, provoquant par la suite des calcifications vasculaires. Le recours à des souris se justifie par la disponibilité des modèles spécifiques qui présentent des caractéristiques de la maladie équivalentes à celles observées chez l’Homme. L’étude est menée sur des animaux âgés de 20 à 30 semaines, ce qui correspond à des adultes matures, chez qui l’athérosclérose et/ou l’atteinte hépatique est induite par un régime riche en gras. Ces souris présentent alors des concentrations en cholestérol et en LDL dans le sang plus élevées, ainsi que des plaques athérosclérotiques dans les artères, en cohérence avec ce qui est observé chez l’Homme. A cet âge chez la souris, la maladie est suffisamment établie pour obtenir des résultats représentatifs de la pathologie, sans compromettre grandement le bien-être des animaux.
Évaluation de nouveaux traitements candidats pour le cancer du foie chez un modèle murin transgénique développant spontanément des carcinomes hépatocellulaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Sous anesthésie, les souris passent jusqu'à un examen aux rayons X par semaine et cinq séances d'imagerie de 30 minutes au plus en 21 jours, et une partie reçoit des candidats médicaments par injection ou par voie orale jusqu'à deux fois par jour pendant 21 jours, éveillée et en contention. 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques développent d'elles-mêmes des tumeurs du foie, parfois des métastases pulmonaires, à partir de 30 à 40 semaines selon leur génotype, et le projet teste sur elles de nouvelles combinaisons de traitements. Le porteur prévoit que les tumeurs peuvent causer une perte d'appétit et de poids, les anesthésies répétées des difficultés respiratoires, et la voie orale une irritation de l'œsophage. Les souris qui vont au bout des procédures sont tuées pour récupérer leurs tissus. Celles qui, sans tumeur, sortent du projet en bonne santé pourront être réutilisées dans un autre projet, et 80 sont déclarées réutilisées.
Objectifs
Le cancer du foie est le troisième cancer le plus mortel au monde. Sa prise en charge tardive et l’efficacité limitée de l’oncothérapie actuelle rendent inévitable l'acquisition d'une résistance aux médicaments et la formation de métastases, responsables du taux élevé de morbidité et de mortalité du cancer du foie. Il est donc urgent d'identifier des cibles et des combinaisons médicamenteuses puissantes et efficaces. Un modèle de souris unique génère spontanément un cancer du foie similaire au cancer humain en termes d’hétérogénéité des tumeurs, de résistance aux médicaments actuellement utilisés et d’interaction entre cellules cancéreuses et cellules immunitaires. Le modèle est également croisé avec d’autres souris, ce qui permet 1) d’avoir un modèle murin ayant les mêmes caractéristiques que les patients atteints de tumeurs du foie avec un type de mutation génétique spécifique ; 2) d’avoir un modèle où la fréquence et/ou le début de la formation des tumeurs est augmentée et/ou accélérée. Ainsi, ces modèles de souris de cancer du foie sont adaptés pour le criblage de nouvelles thérapies combinatoires dans un contexte de résistance aux médicaments actuellement utilisés. Le but de ce projet est d’évaluer de nouveaux candidats médicaments qui permettraient une meilleure réponse au traitement des tumeurs.
Bénéfices attendus
La détection et le traitement précoce du cancer du foie, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à augmenter l’efficacité des traitements. L’évaluation de nouveaux candidats-médicaments permet d’augmenter les taux de réponses et de cibler un maximum de la population atteinte du cancer du foie et ainsi de réduire le nombre de décès par an provoqués par ce cancer.
Procédures
Les animaux auront des imageries à rayons X (durée 4 minutes, sous anesthésie) une fois par semaine au maximum et des imageries fonctionnelles permettant de suivre le métabolisme ou la vascularisation(5 fois sur 21 jours, durée maximum de 30 minutes par imagerie, sous anesthésie). Une partie des animaux aura des administrations de candidats médicaments soit par injections soit par voie orale (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours, durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min).
Impact sur les animaux
Au cours du projet, les animaux sont susceptibles d’expérimenter ce qui suit : (1) Douleur et inconfort : l’apparition spontanée de tumeurs du foie peut engendrer une diminution de l’appétit chez l’animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entraîner des petites plaies cutanées. (2) Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps. (3) l’administration des traitements par voie orale peut entrainer du stress dû à la contention de l’animale et une irritation de l’œsophage.
Devenir
Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations biologiques, biochimiques et moléculaires. Les animaux qui n'auront pas généré de tumeurs qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisés dans un autre projet.
Remplacement
Des stratégies sont mises en place pour limiter l’utilisation des animaux : (1) Les études préliminaires sont réalisées sur des cellules et des mini-tumeurs en culture pour identifier les mécanismes clés et les cibles. (2) Seuls les traitements prometteurs sont ensuite testés sur des organismes vivants pour confirmer leur efficacité dans un contexte physiologique. Ce projet final nécessite un organisme entier : des souris génétiquement modifiées, qui est le modèle le plus adapté pour étudier les effets des traitements sur les tumeurs du foie.
Réduction
Dans cette étude, nous utiliserons des appareils d'imagerie adaptés à la taille des rongeurs, comme des scanners ou des caméras spécialisées, similaires à ceux utilisés chez les patients. Ces outils permettent de suivre l'évolution des animaux, notamment la croissance des tumeurs, sur plusieurs semaines et de recueillir différentes mesures. Cela réduit le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. Pour limiter davantage le nombre d'animaux, nous avons calculé qu’un maximum de 10 par groupe suffira pour garantir des données exploitables. Enfin, chaque animal sera étudié au maximum en réalisant des analyses supplémentaires sur leurs tissus (foie, tumeurs) après l’étude.
Raffinement
Les injections intraveineuses et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse pour minimiser le stress des animaux et permettre un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter l’hypothermie. Avant les traitements, une semaine d’habituation à la contention sera réalisée pour réduire leur stress. Les traitements nécessitant un gavage seront effectués avec une sonde vétérinaire adaptée, à embout arrondi, pour protéger l’œsophage et l’estomac. La technique « d’administration de médicament guidée par micropipette » sera utilisée si possible : les souris apprendront à boire du lait concentré, puis le médicament y sera mélangé, évitant ainsi le stress de la contention. Les souris, qui développent spontanément des tumeurs hépatiques et parfois des métastases pulmonaires, seront suivies par scanner et imagerie spécialisée. Une fois les tumeurs détectées, leur évolution sera surveillée chaque semaine. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié. En cas de signe de souffrance (difficulté à respirer, isolement, perte de poids), des compléments alimentaires ou des soins adaptés seront apportés. Si la situation ne s’améliore pas ou si la perte de poids dépasse 20 %, l’animal sera retiré du protocole et euthanasié rapidement pour éviter toute souffrance inutile. Les souris seront hébergées en groupes (5 maximum par cage), avec accès libre à la nourriture et à l’eau, dans des conditions enrichies (dômes, tubes, bâtons à ronger, matériaux pour faire un nid) et un cycle jour/nuit de 12 heures. Cela permet de limiter les comportements répétitifs et de favoriser leur bien-être.
Choix des espèces
Les modèles de souris transgéniques générés et étudiés : 1) récapitulent l’hétérogénéité du cancer du foie chez les patients ; 2) permettent de tester de nouvelles thérapies. Il représente par conséquent un modèle d’une grande valeur d’un point de vue expérimental pour mieux comprendre le cancer du foie et ainsi évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie humaine. Pour étudier la formation et l'évolution de tumeurs dans le foie et des tumeurs secondaires dans le poumon, les souris seront utilisées au stade adulte. Les premières tumeurs apparaissent entre 30 ou 40 semaines en fonction du génotype de souris utilisé. Elles sont donc utilisées à partir de ces stades.
Test d’efficacité d’une molécule pharmacologique sur un modèle murin de la Maladie de Niemann-Pick type C (NPC)
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une partie d'entre elles porte une mutation qui reproduit la maladie de Niemann-Pick de type C1, avec perte de poids, perte de coordination motrice et une durée de vie moyenne de 125 jours. Selon les procédures, les souris reçoivent à partir de 10 jours de vie trois injections sous la peau puis une injection dans l'abdomen chaque semaine pendant 6 ou 12 semaines, et subissent des prises de sang sous anesthésie ainsi que des tests de coordination motrice, de marche, d'activité locomotrice et d'anxiété, et d'inhibition de la préimpulsion. Le traitement espéré pour les patients passe encore par un développement thérapeutique puis une preuve clinique chez l'humain. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de "modèles non-animaux" capables de reproduire une neurodégénérescence fatale. La molécule testée a été choisie au préalable sur des cellules.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de maladie de Niemann-Pick de type C1 (NPC1), qui récapitule le tableau clinique de la pathologie humaine.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet nous permettra d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine. À plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir la preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de NPC1.
Procédures
Injections sous-cutanées (3/animal, 1 x par semaine, 1 min par injection) puis injections intrapéritonéales (1 x par semaine pendant 12 semaines, 1 min par injection), prélèvements sanguins (intracardiaque, 5 min par prélèvement sous anesthésie générale ; 3 fois à la veine temporale sous anesthésie gazeuse, 3 minutes par prélèvement). Tests comportementaux : Observations cliniques et évaluation des fonctions sensori-motrices 15 minutes chaque semaine (7 à 16 semaines d'âge), mesure de l'activité locomotrice et anxiété 5 fois 30 min, mesure des troubles de la marche (5 sessions de 3 jours, 5 minutes par jour), test de coordination motrice 4 fois 20 minutes, mesure de l'inhibition de la préimpulsion 3 fois 45 min. Amendements : injections intrapéritonéales : 1 x par semaine pendant 6 semaines pour l'étude précose ou 12 semaines pour l'étude tardive, 1 min par injection.
Impact sur les animaux
Les souris mutés présentent un phénotype dommageable ; ce modèle animal présente une perte de poids, une diminution de la coordination motrice, une mortalité prématurée avec une durée de vie moyenne de 125 jours. Pour la première procédure, ces animaux seront mis à mort suite à une anesthésie (nuisance légère). Pour la procédure deuxième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées indusiant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines). Pour la troisième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 12 semaines induisant une nuisance modérée. Les souris subiront 3 prélèvements sanguins d’environ 3 minutes induisant une nuisance modérée. Amendements : Pour l'étude précose, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées induisant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 6 semaines induisant une nuisance modérée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem, excepté pour l'étude pilote ou seul le sang sera prélevé.
Remplacement
L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que les maladies neurodégénératives ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexes à l'œuvre dans la mise en place d'une neurodégénérescence fatale, comme dans la maladie de Niemann-Pick de type C1. Cependant, le choix de la molécule optimale testée dans cette étude a préalablement été réalisé sur un modèle cellulaire.
Réduction
Ce projet implique des souris homozygotes présentant la mutation induisant la maladie de NPC1 et des souris non mutés qui seront considérées comme des contrôles ne présentant pas la maladie de NPC1. Dans l’étude précoce, les groupes expérimentaux seront constitués comme suit : 5 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 5 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la caractérisation préliminaire du modèle dans le laboratoire. Dix souris homozygotes mutées traitées avec le composé, 10 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 10 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la vérification des caractéristiques décrites dans le papier princeps. Le nombre de souris défini dans l’étude précoce repose sur les conditions nécessaires optimales à l’analyse des biomarqueurs. Il intègre à la fois la taille des effets attendus (diminution de 80 % de la protéine NPC1 chez les souris mutés, effet du traitement 40-45 % espéré) et la variabilité technique connue (30 %). À chaque étape, la variabilité réelle obtenue sera calculée. Dans le cas où l’étude précoce mettrait en évidence une « surestimation » par rapport à la variabilité technique théorique, une réduction du nombre d’animaux lors de l’étude d’efficacité tardive sera envisagée. Pour l’étude d’efficacité tardive afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons décidé de ne pas réaliser de groupe contrôle non muté. Le groupe muté non traité permet d’évaluer les caractéristiques liées à la pathologie. Les résultats du groupe muté traité seront préférentiellement rapportés aux souris du groupe muté (point de départ de la pathologie). En cas de « situation optimale », les souris mutés sous traitement auront des niveaux de protéine NPC1 équivalents aux souris WT. Le choix de 16 animaux par groupe a été défini en fonction de la haute variabilité des tests comportementaux.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une étude toxicologique préliminaire a été réalisée afin de déterminer la dose maximale non toxique de la molécule à administrer aux animaux. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant, pouvant entraîner l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, de boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Si un animal présente un trouble locomoteur, de la nourriture mouillée et un biberon à longue tétine seront ajoutés à la cage. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique.
Choix des espèces
La souris est l’animal de choix pour la création et l’étude de modèles avec une perte de fonction d’un gène (mutation). De plus, la souris est un modèle animal adapté à l’étude de la locomotion, phénotype d’une dégénérescence neuronale. Enfin, il n’existe pas de modèles in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier un phénotype locomoteur et/ou la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. Le traitement avec la molécule médicament débutera à 10 jours post-natal et sera donné 1 fois par semaine. Dans la littérature, l'ensemble des études ayant testé l'efficacité de notre molécule dans différentes pathologies ont commencé le traitement avant le sevrage des animaux, c'est pourquoi nous allons suivre ce même schéma expérimental.
Efficacité et toxicité de candidats médicaments impliqués dans le traitement du cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées à l'aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux, 30 128 souris vont être utilisées sur quatre ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des greffes de fragments tumoraux ou des injections de cellules cancéreuses, subissent des chirurgies du fémur, du foie, du poumon ou une castration de cinq à trente minutes, des prises de sang quotidiennes pendant cinq jours au minimum et parfois plusieurs semaines, ainsi que des prélèvements vaginaux. Le chiffre de 30 128 est établi sur le nombre d'études des années antérieures et sur l'anticipation d'une croissance annuelle, "en accord avec le plan commercial". Toutes seront tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines implantés sur des souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme), immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection) ou humanisées à l’aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux humains ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique (PBMC). Différentes stratégies d’implantations des tumeurs pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité d’un candidat médicament dans un modèle se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.
Procédures
Injection par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Chirurgie avec implantation de fragments de tumeurs : moins de 5 minutes. Injection de cellules tumorales : moins de 5 minutes. Autres chirurgies (castration, fémur, foie, poumon, …) : entre 5 à 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie d’une durée comprise entre 10 et 45 minutes. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …) ou bien par palpation (ou autre geste technique). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude. Des prélèvements vaginaux pourront également être effectués. La fréquence des prélèvements est quotidienne, pendant au minimum 5 jours de suite, pouvant aller jusqu'à plusieurs semaines de suite si nécessaire pour bien caractériser le cycle en entier, surtout si les souris ne sont pas synchronisées. Le geste durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par les injections, les chirurgies, le développement de tumeurs et des éventuelles métastases, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques injectés et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer. Le prélèvement vaginal pourrait entraîner une légère irritation locale transitoire, une inflammation minime ou un stress temporaire.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils auront été implantés avec des cellules tumorales ou des fragments de tumeurs dérivées de patients ou auront développé une tumeur. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 30128 souris seront utilisées, couvrant une période de 4 ans et permettant de réaliser environ 600 études précliniques de 50 souris et 2 études précliniques de 64 souris chacune pour la castration. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction du type d’étude. Des études pilotes pourront être réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir un résultat interprétable.
Raffinement
En début d’étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles dans le but de synchroniser le cycle œstral de la souris. En plus de ces conditions minimums légales, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées régulièrement à la présence humaine. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, de la perte de poids, et le cas échéant du volume tumoral ou de l’apparition d’une ulcération tumorale.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Etude des mécanismes pathogènes et des facteurs environnementaux dans un modèle de sclérodermie chez la souris 1/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Vingt-quatre injections dans l'abdomen, quarante gavages, deux instillations dans la gorge et une chirurgie de quinze minutes s'enchaînent sur deux mois pour chaque souris concernée. 1 214 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, dont une partie du seul fait qu'elles n'ont pas le génotype recherché. Le modèle repose sur une lignée génétiquement modifiée qui développe une fibrose de la peau et des poumons, à laquelle le projet ajoute des contaminants de l'environnement comme la silice, pour tester des molécules bloquant l'activation immunitaire. Les souris circulent entre trois établissements, et le porteur ne précise ni en quoi consiste l'acte chirurgical ni comment il arrive à 1 214 animaux.
Objectifs
La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.
Devenir
Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.
Etude fonctionnelle des vésicules extracellulaires dans la cachexie associée au cancer colorectal EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
544 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Une partie reçoit sous la peau une greffe de cellules cancéreuses colorectales connues pour provoquer une cachexie en deux semaines, avec fonte musculaire, perte de poids, gonflements de la muqueuse intestinale et saignements sur la fin. Elles passent tous les deux à trois jours sur un appareil de résonance magnétique qui mesure leur masse maigre, et subissent des tests comportementaux. Le porteur écrit vouloir tout mettre en œuvre pour assurer leur bien-être, et précise dans la même phrase qu'aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne pourra leur être administré, ces produits risquant d'altérer les marqueurs du cancer.
Objectifs
Le cancer colorectal prend naissance dans les cellules du côlon ou du rectum. La tumeur cancéreuse (maligne) est un groupe de cellules cancéreuses qui peuvent envahir les tissus voisins et les détruire. Avec près de 45 000 nouveaux cas et 18 000 décès par an, le cancer colorectal reste le 2e cancer le plus meurtrier en France. La cachexie est un affaiblissement profond de l'organisme (perte de poids, fatigue, atrophie musculaire, etc. ) lié à une dénutrition très importante. Dans le cas du cancer colorectal avancé, jusqu'à 60 % des patients souffrent de cachexie qui est fortement associée à un mauvais pronostic de survie. L’impact dévastateur de la cachexie sur le patient et ses proches souligne l'urgence de ce besoin médical non satisfait. La fonction musculaire est également profondément altérée au cours de la cachexie cancéreuse, avec une forte réduction de la force musculaire squelettique. Cependant, les mécanismes impliqués dans le développement de la cachexie liée au cancer colorectal restent incompris. Il a été décrit que des vésicules étaient produites par les tumeurs, assurant une communication entre la tumeur et des organes. Démêler la communication entre le muscle squelettique, le tissu adipeux et la tumeur constitue un enjeu capital pour mieux comprendre les origines de la cachexie cancéreuse. Trouver des biomarqueurs capables d’être détectés avant l’apparition de la cachexie devient primordial pour améliorer la prise en charge et le bien-être des patients. Notre équipe étudie les fonctions d’une protéine régulatrice qui pourrait jouer un rôle dans le développement de la cachexie associée au cancer colorectal en influençant les tissus musculaires distants. Le but de ce projet, qui se déroulera dans deux établissements différents, est de démontrer le rôle de notre protéine dans le développement de la cachexie associée au cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Cette étude s’appuie sur des résultats précédents obtenus sur des lignées cellulaires en culture. Cependant l’étude du phénomène cachectique n’est possible que grâce à l’utilisation de modèles murins qui ont fait leur preuve dans la littérature. Ces modèles modifiés permettront d’aller voir plus en avant les effets de la protéine d’intérêt
Procédures
Une pesée de tous les animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 à 3 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent moins de 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant toute la durée des procédures (2 semaines, ou 4 semaines selon les animaux). Ils auront à disposition une roue d’activité spontanée pendant la durée des procédures et seront libres de courir ou non. Ils réaliseront des tests comportementaux (3 fois 5 minutes et 3 fois 10 secondes / deux sessions pour tous les animaux). 432 animaux vigiles recevront une injection unique (5 secondes). En fin d’expérience, tous les animaux du projet (544) recevront une injection d’anesthésique et d’analgésique (5 secondes) avant d’être euthanasiés.
Impact sur les animaux
Le développement tumoral induit un état de cachexie progressif s'accompagnant d'une réduction de masse maigre et d'une perte de poids corporel. Les tumeurs colorectales peuvent provoquer des gonflements de la muqueuse intestinale et des saignements qui apparaîtront les deux dernières semaines de l’étude. Les animaux pourront être stressés lors des mesures de poids et de la taille de la tumeur (mesure hebdomadaire pendant 15 jours), lors de l’évaluation de la composition corporelle (tous les 2 jours pendant 2 ou 4 semaines) et lors des tests comportementaux. Les mesures de tumeur et les injections peuvent également générer une légère douleur pour l'animal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés. Cette mise à mort limite la souffrance des animaux. Nous prélèverons le sang et différents tissus afin d’analyser les marqueurs et l’avancement de l’état cancéreux.
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études sur des cultures de cellules adipeuses et musculaires, la cachexie liée au cancer est un syndrome global qui implique des échanges complexes entre les organes. Les vésicules extracellulaires font partie des messagers qui permettent cette communication. Afin de tester l'effet de différentes vésicules sur la physiologie et le métabolisme, nous ne pouvons pas nous passer de tests chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum après calcul à l’aide d’un logiciel pour études statistiques. De plus, nous mutualiserons les données issues d’une étude d’une autre équipe qui sera réalisée en même temps, ce qui nous évite d’inclure deux groupes contrôles de 14 animaux.
Raffinement
Le syndrome cachexique cancéreux induisant un affaiblissement de l'organisme (perte de poids, fonte musculaire, etc.) nous effectuerons un suivi quotidien des animaux grâce à une grille de score et appliquerons des points limites définis. L’alimentation sera déposée directement dans la cage pour faciliter l’accès et permettra de contrôler la perte de poids. Nous utiliserons des tapis anti-escarres lors des examens des animaux et au fond des barquettes de pesées ce qui apporte confort et chaleur le temps de la mesure (pesée dynamique, 5s). Les animaux seront préalablement habitués aux tests comportementaux. Pour le change et les tests, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués (enrichissement présent dans les cages). Ce tunnel permet aussi l’habituation à la mesure de composition corporelle où l’animal est maintenu dans un système équivalent le temps de la mesure (moins de deux minutes). Tout sera mis en œuvre pour assurer le bien-être des animaux même si aucun médicament anti-douleur ou anti-inflammatoire ne pourra être administré aux animaux car susceptible d’altérer les biomarqueurs du cancer.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur trois modèles murins. Le premier modèle consiste à injecter des vésicules chez des souris âgées de 10 semaines. Le deuxième modèle consiste à greffer des cellules murines colorectales cancéreuses sous la peau de souris âgées de 10 semaines. Les cellules cancéreuses utilisées, une fois greffées, sont connues dans la littérature pour induire la cachexie dans les deux semaines suivant la greffe. Nous prenons des jeunes adultes car les animaux auront atteint un poids suffisant qui permet d’observer une cachexie sans entraîner une perte de poids trop rapide. Le troisième modèle est constitué de souris génétiquement modifées répondant spécifiquement à nos besoins en terme d’expression des protéines d’intérêt. La mutation de notre protéine d’intérêt dans ce modèle permettra d’évaluer son rôle dans l’apparition de la cachexie. Ce modèle génère lui aussi la cachexie à partir de l’âge de 16 semaines, âge que nous avons choisi pour débuter nos observations.