Rongeurs
Induction de tumeurs de cancer du pancréas pour des études de compréhension ou d’évaluation de l’efficacité thérapeutique par imagerie in vivo.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Des tumeurs du pancréas sont induites à la demande de chercheurs extérieurs et de clients, par une chirurgie de vingt minutes ou par une injection sous la peau. 1 740 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, certaines immunodéficientes, d'autres transgéniques développant spontanément la tumeur. Pendant quinze semaines, elles subissent jusqu'à deux examens d'imagerie par semaine sous anesthésie, jusqu'à vingt administrations de composés, des mesures au pied à coulisse et des prélèvements de sang sous la mâchoire, avec un risque de métastases hépatiques ou pulmonaires. 480 souris sont tuées à l'issue de la première procédure et 960 à l'issue de la seconde, 30 sont utilisées pour prélever les fragments tumoraux greffés aux suivantes, et 300 souris porteuses de tumeurs sont livrées à des clients qui poursuivent les travaux dans leurs propres locaux.
Objectifs
Ce projet a pour but de mettre en oeuvre, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer du pancréas sur modèles souris et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments. Ces types de modèles suscitent un intérêt grandissant pour l'étude et la prise en charge du cancer du pancréas. En 2018, le cancer du pancréas était responsable de plus de 95 000 décès chaque année dans l’UE. La maladie est à présent la troisième cause de décès par cancer dans l’UE, derrière le cancer du poumon et le cancer colorectal. Seuls 3 % des patients diagnostiqués d’un cancer du pancréas survivent cinq années. Il s’agit du seul cancer pour lequel aucune amélioration n’a été constatée concernant la survie en 40 ans.
Bénéfices attendus
Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.
Procédures
Induction de cancer pancréatique : 1 acte par animal soit par chirurgie (20 minutes max d’intervention sous anesthésie gazeuse) soit sans chirurgie : injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie gazeuse). Suivi des animaux : Pesée 1 fois/semaine minimum (30 seconde /animal vigile) pendant 15 semaines maximum. Mesure au pied à coulisse pour le modèle sous-cutanée : 3 fois/semaine maximum (30 seconde /animal) pendant 15 semaines maximum sur souris anesthésiée (anesthésie gazeuse). Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 15 semaines sous anesthésie gazeuse. Injection d’antalgique et d’anti inflammatoire en sous cutané : 4 injections sur souris vigile en 24h max. Pour un traitement : au maximum 5 administrations par semaine ou 20 administrations sur 15 semaines sur souris vigile par voie orale ou, intrapéritonéale ou voie sous cutanée ou voie intraveineuse. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours.
Impact sur les animaux
Les dommages attendus sont liés en premier lieu à l‘induction des tumeurs soit en sous-cutanée (nuisance légère) soit en orthotopique par chirurgie (nuisance modérée). Puis ils sont dus au développement d'une tumeur cancéreuse soit en sous cutanée (Nuisance légère) soit au niveau du pancréas (nuisance modérée avec éventuellement à l'apparition de foyers tumoraux secondaires (métastases hépatiques ou pulmonaires)). La douleur lors de l’administration des réactifs pour l'imagerie et les traitements, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille (nuisance légère). Les potentiels effets indésirables d’une nouvelle molécule seront connus car elle doit être testée pour sa tolérance ou doit déjà être utilisée dans la littérature. Dans certains cas il sera nécessaire d'utiliser des souris immunodéficientes qui sont à phénotype dommageable. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entraineraient leur décès. Nous pourrons également être amené à utiliser des souris transgéniques à phénotype dommageable. (Nuisance légère car tumeur très petite au niveau du pancréas.
Devenir
Procédure 1 : 480 souris seront mise à mort à l'issue de cette procédure et 30 souris serviront de souris donneuses de tumeur pour la procédure 2: greffe de fragment. Les autres souris ne peuvent pas être réutilisées car les tumeurs et organes pourront être prélevés pour des analyses histologiques. Procédure 2 : 960 animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure, car elles ne peuvent pas être réutilisées pour une autre étude car les tumeurs et organes pourront être prélevés pour des analyses histologiques et 300 seront en utilisation continue car elles seront uniquement induites pour obtenir des tumeurs pancréatiques et hébergés dans nos locaux pendant 1 semaine minimum, le temps de leur récupération complète. Il n’y aura aucun acte d’imagerie pour ces 300 souris dans nos locaux. Elles seront ensuite être fournies à des clients demandeurs de ce modèle pour des travaux expérimentaux réalisés dans leurs locaux.
Remplacement
Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer pancréatique en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en oeuvre des techniques d’imagerie (bioluminescence, échographie, scanner, photoacoustique, imagerie radioisotopique, imagerie par résonnance magnétique, imagerie de fluorescence) qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour réaliser des tests statistiques pertinents.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et des points limites prédictifs (perte de poids, détérioration de l'aspect général, de la physiologie clinique ou de la locomotion) nous permettrons de prendre les mesures nécessaires afin de limiter la souffrance au maximum au cours de l’expérimentation. Durant l'induction des modèles tumoraux et durant les examens d'imagerie, les souris seront anesthésiées. La douleur liée à la chirurgie sera également prise en charge par l'utilisation d'analgésiques locaux et généraux avant la chirurgie, au réveil puis 24h après l'intervention. Les symptômes potentiels liés aux traitements sont principalement une légère perte de poids. Si une douleur apparaissait, elle serait prise en charge par l'administration d’antalgique pendant 72h et si, passé ce délai, aucune amélioration n’était visible, l’animal serait mis à mort. Enfin, les souris auront 1 semaine minimum d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Les cages seront en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Les cages sont enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid et des granulés pour ronger et jouer avec ses congénères. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture pendant toute la durée de l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Les animaux « receveurs » seront utilisés à l’age de 6 – 8 semaines sur la base de nos précédents travaux et publications. Sur des animaux plus âgés, de par notre expérience, nous avons observé une prise de greffe moindre. Les souris transgéniques développant spontanément un cancer du pancréas seront âgées de 6 à 16 semaines environs afin qu’elles aient une tumeur du pancréas suffisamment développée pour faire 10 fragments de 1mm3 qui seront utilisés dans le modèle orthotopique par greffe de tumeur.
Mise en place d’un modèle murin de sclérose en plaques (encéphalomyélite autoimmune expérimentale) et validation d’efficacité de molécules de références.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une paralysie des membres postérieurs, qui empêche les souris de se nourrir, est provoquée par l'injection d'adjuvant de Freund et d'une protéine de la myéline. 384 souris vont être utilisées, 360 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, avec des administrations quotidiennes de J-7 à J+35 et un score neurologique relevé chaque jour. Le porteur écrit que les animaux parvenus à ce stade restent capables de se déplacer librement dans leur environnement, tout en indiquant que la prise de nourriture leur devient impossible et que des croquettes sont déposées au sol de la cage. À J+35, une ouverture du thorax et de l'abdomen permet une ponction cardiaque puis le prélèvement du cerveau, l'objectif déclaré étant de valider ce modèle dans l'établissement pour y tester ensuite, pour le compte d'industriels financeurs, l'efficacité de traitements de la sclérose en plaques.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune démyélinisante du système nerveux central. Actuellement, les traitements disponibles sont peu nombreux. Malgré une prise en charge médicamenteuse et paramédicale qui permet un ralentissement de l’évolution de la pathologie chez certains patients et l’amélioration de leur qualité de vie, il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir la SEP. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes visant à traiter efficacement cette pathologie. L’objectif de ce projet et de mettre en place et valider un modèle murin d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE-MOG). Ce modèle est décrit comme reproduisant au mieux la physiopathologie de la forme progressive de la SEP, permettant ainsi une transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. Une fois ce modèle validé au sein de notre structure, nous l’éprouverons en validant l’efficacité des traitements actuellement disponibles.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune démyélinisa nte du système nerveux central. Actuellement, les traitements disponibles sont peu nombreux. Malgré une prise en charge médicamenteuse et paramédicale qui permet un ralentissement de l’évolution de la pathologie chez certains patients et l’amélioration de leur qualité de vie, il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir la SEP. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes visant à traiter efficacement cette pathologie. Les bénéfices attendus de ce projet et de mettre en place au sein de notre structure un modèle animal de SEP, permettant une transposabilité des resultats obtenus vers la clinique. A plus long terme, nous pourrons tester l’efficacité de nouveaux traitements et les comparer aux traitements de référence actuellement disponibles.
Procédures
Dans cette étude, 384 animaux seront soumis à une injection sous-cutannée de la solution permettant l’induction de l’EAE. Cette administration se fera sur des animaux anesthésiés par voie gazeuse, avec une couverture analgésique. Cette manipulation durera moins de 5 minutes. L’ensemble de ces animaux auront également une administration par voie intra-péritonéale à J0 et J2. Cette injection dure quelques secondes, sur un animal vigile contentionné. Certains animaux (288 animaux) pourront être soumis à une administration par voie intra-péritonéale ou sous-cutannée pour l’administration des traitements. Ces administrations seront réalisées sur des animaux vigiles contentionnés, et durera moins d’une minute par animal. Ces administrations seront réalisées au maximum une fois par jour, de J-7 à J+35. L’ensemble des animaux de cette étude (384 animaux) seront évalués par un score neurologique basé sur l’évaluation de la démbulation spontannée de l’animal dans sa cage. Cette évaluation ainsi que leur pesée seront faites quotidiennement à partir du lendemain de l’induction du modèle, jusqu’au jour de mise à mort. Enfin, à J+35, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets de la SEP à savoir : démyélinisation et dégérescence axonale entrainant des déficits moteurs. Pour induire ce modèle, une administration sous-cutannée d’adjuvent de Freund est réalisée. Ce composé peut induire des irritations cutannées temporaires. L’évolution du modèle peut aller jusqu’à une paralysie des membres postérieurs de l’animal pendant plusieurs jours (moins de 5 jours) avec une récupération partielle dans les jours suivants. Les animaux ayant atteint ce stade d’évolution de la pathologie sont toujours capables de se déplacer librement dans leur environnement. Cependant la prise de nourriture est impossible dans ces conditions, d’où l’ajout de croquettes directement au sol de la cage des animaux. De plus une attention particulière est portée sur l’évolution de leur poids et l’hydratation des animaux.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort permettant le prélèvement du cerveau et de la moelle épinière post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données (α=0.05 ; β=0.8) permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 20 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à de la mortalité ou l’atteinte des points limites, l’augmentation de l’effectif de 24 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 20 animaux par groupe. Ainsi, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (coton et demi-sphère de cellulose), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également pesés quotidiennement à partir du jour d’induction du modèle. Pendant l’induction du modèle, chaque animal sera sous anesthésie qui sera maintenue jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux bénéficieront d’une couverture analgésique. Lors de la phase de réveil, les animaux sont replacés dans leur cage. Un arbre décisionnel basé sur une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés permettra l’amélioration du bien-être animal par la réhydratation des animaux ou l’utilisation d’analgésiques. La mise en place de critères d’arrêts de la souffrance permettra de décider de la mise à mort d’un animal. Pour cela, une surveillance stricte des souris sera réalisée quotidiennement jusqu’à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Le nombre total d’animaux nécessaire sera de 384 souris. Conformément à la règle des 3Rs, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaire au projet. Ce nombre maximal d’animaux nous permettra de déceler des différences significatives entre nos groupes expérimentaux sur les différents paramètres étudiés. Ainsi, nous concilions le nombre d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique. Le nombre d’animaux pour cette étude a donc été défini à partir d’une analyse de puissance et des données existantes dans la littérature (voir 3.3.6.2. Réduction).
Effets de la stimulation transcrânienne sur l’activation du système nerveux central selon le sexe et le cycle hormonal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Huit heures d'enregistrement sous anesthésie profonde, après une trachéotomie, la canulation de la carotide et de la jugulaire et l'ouverture du crâne, sans réveil prévu. 144 rats vont être utilisés, 128 dans des procédures menées sous anesthésie et tués avant tout réveil, 16 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère dont une ovariectomie de dix minutes. L'objet est de comparer, selon le sexe et le stade du cycle hormonal, l'effet d'une stimulation électrique du crâne sur les neurones qui transmettent la douleur de la face et des méninges, le cycle des femelles étant vérifié par frottis sous anesthésie. Le porteur retient le rat Sprague Dawley parce que le laboratoire l'utilise depuis des années et parce que d'autres études sur le sujet ont employé la même souche.
Objectifs
La migraine, caractérisée par des céphalées récurrentes, touche environ 15 % de la population et principalement les femmes. Les approches de neurostimulation telle que la stimulation transcrânienne à courant continu du cortex moteur représente une stratégie thérapeutique prometteuse, mais peu de chose sont connu sur l'effet bénéfique de cette stimulation sur la migraine et sur les mécanismes sous-jacents à cet effet. Nous avons précédemment montré dans notre modèle animal de migraine (induite par une inflammation des méninges) que les mâles et les femelles à différent cycle hormonal i) avaient une douleur migraineuse d'intensité différente et ii) activaient différemment les neurones du complexe sensitif du trijumeau. Certains de ces neurones reçoivent les informations sensorielles issues de la face et des méninges et sont impliqués dans les voies de la douleur. L’objectif général du projet sera d’étudier l’hypothèse selon laquelle l’efficacité thérapeutique de la stimulation transcrânienne est différente selon le sexe et le cycle hormonal des femelles et de déterminer les mécanismes cellulaires associés. Ce projet comportera 3 objectifs. Tout d’abord, les études sur l’efficacité de la stimulation sont très peu comparables entre elles à cause des différents protocoles utilisés. Le premier objectif consistera donc à déterminer in vivo chez le rat mâle anesthésié les paramètres de stimulation les plus efficaces pour inhiber l'activité des neurones du complexe sensitif du trijumeau. Pour ce faire, des enregistrements des neurones chez les rats anesthésiés seront réalisés. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité de la stimulation chez les femelles à différent cycle hormonal et comparer avec les femelles ovariectomisées. Enfin, les mécanismes cellulaires liés à l’effet de la stimulation transcrânienne au niveau des neurones du complexe sensitif du trijumeau étant peu connus, le dernier objectif sera d’étudier ces mécanismes en réalisant des expériences ex vivo.
Bénéfices attendus
En plus de la mise au point d’un protocole de stimulation transcrânienne efficace, ce projet nous permettra de savoir si la stimulation a un effet différent selon le sexe et le cycle hormonal des femelles (à différentes phases du cycle hormonal et chez les femelles ovariectomisées) en condition physiologique. Cette étude nous permettra plus tard d'utiliser le protocole de stimulation dans différents modèles de douleur trigéminale et migraineuse et d’étudier leur efficacité en condition pathologique.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales. Un groupe d'animaux subiront une ovariectomie. L'opération durera 10 minutes sous anesthésie générale. Les expérimentations d’électrophysiologie in vivo sont prévues sur une durée maximale de 8 heures sous anethésie générale profonde sans réveil. La chirurgie inclut une trachéotomie, une canulation de la carotide, une canulation de la jugulaire, une craniotomie, et l’exposition de la région d'enregistrement.
Impact sur les animaux
Certains animaux vont subir une ovariectomie sous anesthésie gazeuse. Nous nous attendons au développement d’une douleur suite à la chirurgie. Les animaux auront des injections d’antidouleur. Ces injections pourront induire un stress.
Devenir
La procédure d'électrophysiologie ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est fondamental de réaliser des études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. L’étude sur l’animal permet également de conserver son état hormonal physiologique. Il n'existe pas dans la littérature de méthode alternative pouvant répondre à l'efficacité d'une stratégie à potentiel thérapeutique anti douloureux. Un animal entier avec un système nerveux intégré, même sous anesthésie, est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Des études électrophysiologiques chez l’animal vivant sous anesthésie est un moyen de réduire la souffrance et de définir de façon reproductible, l'efficacité des différents protocoles de stimulation sur l’activité des neurones.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Pour les expériences in vivo, chaque animal sera son propre contrôle. Une analyse de variance à une voie suivie d'un test post-hoc seront réalisés. Dans le cas d'une distribution normale, un test paramétrique sera effectué et dans le cas d'une distribution non gaussienne un test non paramétrique de type Mann Whitney sera réalisé.
Raffinement
Les rats bénéficieront d’un enrichissement environnemental avec des rouleaux qui seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloérection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, perte de plus de 15% de son poids dans la semaine qui suit l’ovariectomie, s'il a de grosses difficultés à se déplacer, à relever pour se nourrir, si l'animal présente des tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue), nous mettrons fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Dans le cas des femelles, les cycles hormonaux seront vérifiés avant la procédure électrophysiologique par la réalisation de frottis chez l'animal anesthésié. Lors de l'enregistrement électrophysiologique in vivo chez l’animal anesthésié, tous les paramètres dits limitants seront évalués (température, pression artérielle, rythme respiratoire). Si une altération durable et irréversible de ces paramètres apparait, les expériences seront interrompues par une mise à mort.
Choix des espèces
Le rat, en particulier la souche Sprague Dawley, est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales et électrophysiologiques dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 8-12 semaines. Des animaux adultes sexuellement matures sont requis pour étudier l'influence du cycle hormonal.
Rôle du microenvironnement stromal dans les lésions musculaires-1/2
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Un infarctus du myocarde est provoqué chirurgicalement sur des souris adultes en trente minutes et sur des souriceaux en quinze, quand d'autres subissent la ligature ou l'excision d'un segment d'artère fémorale, une injection quotidienne de toxine ou une blessure du muscle par anse refroidie. 7 110 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées lors d'une chirurgie terminale pour prélever leurs organes. Le porteur annonce l'étude des mécanismes cellulaires des maladies du muscle squelettique et cardiaque, dont l'infarctus, les myopathies et le défaut d'irrigation des membres inférieurs. Les bénéfices attendus pour les patients ne sont énoncés nulle part, le porteur reprenant à leur place la liste des douleurs et des stress infligés aux souris.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs. Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies affectant le muscle squelettique et cardiaque, y compris les pathologies cardiovasculaires comme l’infarctus du myocarde, les myopathies et les blessures chroniques du muscle squelettique. Par ailleurs, le manque d’irrigation locale des membres inférieurs sont fréquentes dans différentes pathologies chroniques y compris le diabète. Malgré le succès de certains traitements, ces maladies chroniques restent encore aujourd’hui fréquentes et très peu soignables, elles ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de ces pathologies affectant le muscle et le traitement des patients.
Bénéfices attendus
Effets indésirables liés aux procédures: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur aux points d'injections. Effets de la chirurgie cardiaque : douleur modérée post-opératoire de quelques jours. Effets de la chirurgie des membres inférieurs : Douleur, inconfort léger de courte durée liés à la ligature de l’artère fémorale et au point d’injection. Stress lié au transport des souris vers le site n°2 pour les échocardiographies et la réalisation de l’imagerie (anesthésie et manipulation).
Procédures
- Infarctus du myocarde chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 30 minutes. Réalisé par EU1 - Infarctus du myocarde chez le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Échocardiographie chez la souris et le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes ainsi que le stress lié au transport vers le site n°2 pour l’échocardiographie. Réalisé par EU2 - Constriction puis excision d’un segment d’artère fémorale sur souris adulte anesthésiée = 15 minutes. Réalisé par EU1. - Ligature de l’artère fémorale chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Dans certaines expériences, injection de toxine: quotidien, 10 secondes. Réalisé par EU1 - Blessure localisée du muscle par anse refroidie (1x par souris) = 3x 15 secondes. Réalisé par EU1 - Ligature de l’artère fémorale et injection de toxine chez la souris adulte anesthésiée = 15minutes. Réalisé par EU1 - Chirurgie terminale sous anesthésie pour prélèvement d’organes. Réalisé par EU1.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : inconfort lié à la préhension des animaux, douleur aux points d'injections. Effets de la chirurgie cardiaque : douleur modérée post-opératoire de quelques jours. Effets de la chirurgie des membres inférieurs : Douleur, inconfort léger de courte durée liés à la ligature de l’artère fémorale et au point d’injection. Stress lié au transport des souris vers l'EU n°2 pour les échocardiographies. L’induction de l’anesthésie gazeuse pour la réalisation de l’échocardiographie est stressant pour l’animale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyse des organes.
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction de différents types de cellules du microenvironnement musculaire, y compris les cellules immunitaires, stromales et endothéliales. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire, inflammation, régimes), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui a un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation. Un grand nombre de données de transcriptomiques étant déjà disponible pour la communauté scientifique, des analyses informatiques pilotes ont déjà été performées pour étayer nos hypothèses.
Raffinement
La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales et la mise en place de points limites spécifiques et précoces. Pour l’ensemble des procédures chirurgicales, une supplémentation hydrique par injection sera effectuée en pré et post opératoire. Une analgésie pré et post opératoire sera réalisée le cas échéant. Pour la procédure d’infarctus du myocarde, le maintien au chaud de la cage sera effectué sur les 48h per-opératoire. Un renforcement de l’enrichissement par de la litière douce (cellulose) et du gel hydrique sera apporté. Le transport des animaux vers le site numéro 2 pour les échocardiographies sera effectué par un transporteur agrée. Les animaux seront dans des boites de transport contenant des croquettes, de l’hydrogel et du coton (ainsi que de la litière).
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies musculaires, car des modèles sont bien établis et récapitulent les pathologies chez l’homme. Le choix de l'espèce murine nous permet également d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés cruciaux dans l’étude précise des cellules d’intérêt de ce projet. La consanguinité des modèles utilisés permet une reproductibilité des résultats et une réduction du nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 1 jour à 30 semaines, car nous étudierons ces pathologies chez le souriceau et à l’âge adulte.
Etude de la composition lipidique membranaire et de son impact sur la diffusion et l’accumulation de la production de protéines amyloïdes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une canule est enfoncée dans le cerveau pour y injecter des fibrilles de protéines, au cours d'une intervention de trente minutes sous anesthésie, suivie d'injections répétées pendant soixante-douze heures. 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur en attend le rôle des lipides membranaires dans l'accumulation des protéines amyloïdes des maladies d'Alzheimer et de Parkinson, et décrit une activité locomotrice modifiée et un état d'anxiété altéré dont il affirme qu'ils n'ont aucun impact sur la santé des souris. Sept tests comportementaux sont annoncés, de trois à six minutes chacun, sans qu'aucun soit nommé.
Objectifs
Les maladies d'Alzheimer et de Parkinson se caractérisent par l'accumulation d'agrégats protéiques dans le cerveau. Dans des conditions normales, les protéines qui composent les agrégats sont fortement associées à la membrane cellulaire pour remplir leurs fonctions. Nous visons ici à comprendre le rôle des lipides – principaux composants membranaires – dans le traitement, la propagation et l’accumulation des protéines amyloïdes dans le cerveau. Nous émettons l'hypothèse qu'une composition altérée de la membrane lipidique pourrait favoriser ou arrêter la génération et la propagation des protéines amyloïdes.
Bénéfices attendus
La recherche dans le domaine neurodégénératif s'est concentrée sur la biologie des protéines au cours des 30 dernières années, et pourtant de nombreuses informations manquent. Récemment, les lipides et les enzymes impliqués dans le métabolisme lipidique ont été mis à l'honneur dans la recherche sur la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Ainsi, avec ce projet, nous créerons de nouvelles connaissances dans ce domaine encore peu étudié, améliorant ainsi notre compréhension de la pathogenèse de la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux ne subiront qu'une seule intervention chirurgicale. L'intervention chirurgicale unique dure au maximum 30 minutes sous anesthésie et analgésie précédée et suivie d'injections intrapéritonéales et sous-cutanées répétées sur 72 heures. Durant l'intervention chirurgicale l'injection intracérébrale durera 5 minutes (3 minutes d'injection et 2 minutes en laissant la canule en place pour permettre la pénétration de la solution injectée). Sept tests comportementaux seront réalisés (durée de 3-6 minutes pour chaque test).
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à la chirurgie sous anesthésie générale et analgésie. Les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur modérée et de l’inconfort. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies. Les animaux peuvent présenter également des changements subtils dans leur comportement, tels qu'une activité locomotrice différente et un état d'anxiété modifié. Ces changements n’ont aucun impact sur leur santé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Pour étudier les maladies neurodégénératives nous avons encore besoin d’utiliser un modèle vivant assez proche de l’être humain et utilisable facilement en laboratoire. Les meilleurs modèles de maladies neurodégénératives qui ont été caractérisés restent des lignées transgéniques de souris. Pour étudier le métabolisme des lipides, les modèles génétiques ont également été établis chez la souris. La combinaison de ces 2 conditions représente le modèle idéal pour étudier ces maladies neurodégénératives.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques. En effet, une recherche antérieure sur la maladie de Parkinson utilisant certaines souris nous a permis d'effectuer une analyse et d'estimer la taille minimale des cohortes à analyser. La même recherche nous a permis de détecter un taux d'échec maximum de 10 % suite à des interventions chirurgicales. Pour les collectes de tissus, sur la base d'une comparaison de 2 groupes indépendants, et en prenant en compte cette perte potentielle de 10% ainsi que des effets techniques pouvant représenter jusqu'à 10% de la variabilité, nous avons déterminé qu'un effet différentiel pourra être détecté avec un effectif de 16 animaux par groupe (8 mâles et 8 femelles). Après les tests comportementaux, les individus seront considérés pour la collecte de tissus, pour détecter aussi un effet.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis et mis en place. Selon les signes cliniques présentés par les animaux, nous pourrons notamment avoir recours à : un complément alimentaire hautement calorique, chauffage des cages, réhydratation sous cutanée renforcement d’enrichissement des cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Si le point limites sont atteint les animaux sont mis a mort. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats.
Choix des espèces
Nos questions biologiques nécessitent d’induire des modifications génétiques. De nombreux outils de manipulation génétique sont disponibles chez la souris, ce qui en fait un modèle animal de choix pour notre projet. De plus, l’organisation du cerveau de souris présente des similarités avec le cerveau humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier les maladies neurodégénératives. Des travaux ont notamment démontré que la souris est un modèle d’étude valide pour étudier les maladies neurodégénératives. Dans ce projet, nous utiliserons des souris non modifiées et des souris transgéniques permettant de vérifier le rôle des lipides dans la biogenèse, l’accumulation et la propagation des protéines à l’origine de maladies neurodégénératives. Étant donné que les maladies neurodégénératives affectent le cerveau adulte, nous utiliserons des souris adultes tout au long de l’étude. Le groupe expérimental de souris sera donc composé de compagnons de portée âgés de 8 à 12 semaines. Cet âge permettra le double objectif d'analyser le cerveau adulte, mais permettra en même temps l'analyse des stades avancés de la pathologie (3 mois post-opératoires) sans aucun effet secondaire lié à l'âge, qui pourrait perturber les résultats obtenus. En effet, même si certains groupes seront évalués des mois après l'administration des fibrilles, les analyses seront réalisées à un stade où les souris ne sont pas encore trop âgées. Celui-ci vise à prévenir les décès naturels liés au vieillissement avant la conclusion de leur suivi expérimental.
Evaluation de l’efficacité de traitements par radiothérapie interne vectorisée chez la souris porteuse de tumeur EU 1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Une partie des souris de ce projet est immunodéficiente, et d'autres reçoivent une irradiation du corps entier qui élimine leurs défenses immunitaires. 5 490 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, porteuses de tumeurs implantées sous la peau ou dans la graisse mammaire. Chacune peut recevoir jusqu'à six examens d'imagerie sous anesthésie de près d'une heure, jusqu'à deux injections intraveineuses par semaine pendant trois semaines et des trajets de deux heures entre deux établissements, celles mises sous estradiol pouvant développer des calculs rénaux et la progression tumorale une cachexie. Toutes sont tuées en fin d'étude, les mesures de radioactivité étant faites sur les organes prélevés après la mort.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies utilisant la radiothérapie interne vectorisée (RIV). Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. Pour la thérapie, on utilise de la radioactivité Beta- ou Alpha qui est très vite arrêtée par la matière mais possède une grande énergie. Elle va ainsi détruire les cellules à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique (qui fait l’objet d’une autre DAP). Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas se fixer et endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc doubles : * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * Evaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme lors de travaux nommés études dosimétriques afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser précisément des nouveaux composés de RIV pour proposer un traitement parfaitement personnalisé aux patients en utilisant la radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.
Procédures
*Induction tumorale : Sous anesthésie
Impact sur les animaux
- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée ou dans la graisse mammaire de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - Pour les études sur modèles hormonodépendants, les animaux pourront être mis sous estradiol qui peut induire des calculs rénaux. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.
Devenir
Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée.
Réduction
Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=10 souris sont suffisamment robustes pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.
Raffinement
La majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA (Structure chargée du Bien Être des Animaux) de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dry ou tubes en polycarbonate ou bâton de bois). La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’implantation nécessite l’incision de la peau (cas de l’implantation des fragments de tumeurs ou dans la graisse mammaire), la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprénorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Le transport vers la plateforme d’irradiation sera réalisé par un transporteur agréé, et le trajet ne dépassera pas 2h. Les animaux seront irradiés directement dans leur cage et leur environnement (cage, litière, enrichissement et nourriture) ne sera pas modifié. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur retour dans l’animalerie, les animaux seront changés de cages. Les animaux seront transportés par un transporteur agréé de l’EU1 vers l’EU2 (environ 1km de trajet) dans des cages avec litière, enrichissement et nourriture. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur arrivée dans l’animalerie de l’EU2, les animaux seront changés de cages.
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation préalable des traceurs eux-mêmes très proches des appareillages humains d’imagerie, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine
Production de souris bigéniques SOD1*VGLUT1-Venus
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Croiser deux lignées pour faire naître des souris qui développent une sclérose latérale amyotrophique et dont certains neurones sont fluorescents conduit à utiliser 1 052 souris, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées. 1 004 d'entre elles atteignent un stade précoce de la maladie et 48 un stade avancé, avec un déficit moteur des pattes arrière puis des pattes avant. Les mises à mort sont fixées à 50, 75 et 110 jours d'âge, selon l'étape de la maladie visée pour le prélèvement de tissus. Aucune analgésie n'est prévue, le porteur affirmant que la dégénérescence des motoneurones ne provoque pas de douleur mais une paralysie, alors que sa propre grille déclenche l'apport de nourriture humidifiée dès les tremblements des pattes postérieures.
Objectifs
Dans le cadre d’un projet de collaboration entre laboratoire, trois équipes collaborent afin d’explorer les caractéristiques de certaines altérations présentent à des stades précoces de trois maladies neurodégénératives (Alzheimer - AD, Parkinson - PD, sclérose latérale amyotrophique - SLA), afin de découvrir de nouveaux biomarqueurs communs. Pour la maladie SLA, il existe un modèle murin dont les symptômes sont similaires à ceux des humains : la souris SOD. Nous prévoyons donc de croiser ces souris avec d’autres ayant la capacité de marquer certains types de neurones du cerveau. Grâce à ce croisement, nous serons à même de pouvoir faire des prélèvements de tissu des structure cible et ainsi espérer identifier ces biomarqueurs.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'obtenir afin de découvrir de nouveaux biomarqueurs précoces communs aux maladies neurodégénératives sclérose latérale amyotrophique (SLA), Alzheimer (AD) et Parkinson (PD).
Procédures
205 animaux (P1) et 799 animaux (P2) développeront un stade précoce de la maladie SLA (sclérose latérale amyotrophique), soit 1004 animaux. 48 développeront des symptômes plus avancés de la maladie : déficit moteur des pattes arrière puis avant de l'animal.
Impact sur les animaux
La moitié des animaux produit porteront le trangène SOD. Cette mutation portée par les animaux est similaire à celle décrite chez certains patients atteints de la maladie SLA. Ces animaux vont présenter des altérations motrices à partir d'environ 4 mois d'âge.
Devenir
La maladie est incurable tant pour les humains que pour les animaux. Il n'est donc pas possible de les maintenir en vie. Les animaux seront donc euthanasiés.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur l’évolution de la sclérose latérale amyotrophique. Les mécanismes de cette maladie ne sont pas encore suffissamment connus pour permettre une modelisation in silico.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés à chaque temps a été déterminé selon des travaux antérieurs déjà publié. Ce nombre a été réduit au minimum afin de pouvoir produire suffissamment de tissus ex vivo pour la suite de l'expérimentation.
Raffinement
La lignée murine élevée dans ce projet est bien connue et dispose d’une feuille de scoring adaptée afin d’éviter toute souffrance aux animaux. Dès le score 1 (Tremblement des pattes postérieures lors de la suspension. Faiblesse dans l’extension des pattes arrière), de la nourriture humidifiée et des tétines longues seront proposées pour pallier au déficit moteur que peuvent rencontrer les animaux. La grosse majorité des animaux sera utilisée avant tous développement de la maladie. Aucune analgésie n’est utilisée lors du développement de la maladie car celle-ci n'engendre pas de douleur mais une paralysie liée à la dégénérescence des motoneurones, et car aucun acte invasif ne sera réalisé sur ces animaux. Pour un meilleur bien-être des animaux, les cages seront enrichies de matériel de nidification et de dispositif leur permettant de se cacher de leurs congénères.
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. Cette connaissance a conduit à la création de nombre de modèle murin obtenu à l'aide d'outil génétique. Le choix de l'espèce est lié au fait que le modèle murin de la Sclérose Latérale Amyotrophique n'existe que chez la souris, tout comme le modèle de souris aux neurones glutamate fluorescents. Enfin, le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Les âges d'euthanasies des animaux sont fixés selon les étapes de developpement de la maladie ALS : 50 jours d'âge, 75 jours et 110 jours.
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la douleur cancéreuse
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
152 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 104 d'entre elles passant sur la table d'opération pour qu'on leur implante des cellules cancéreuses, puis sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines pour mesurer la bioluminescence de leurs tumeurs. Une neuropathie douloureuse leur est provoquée par injection d'un anticancéreux, puis évaluée en appliquant des filaments sur la patte de l'animal vigile. Le porteur écrit que la neuropathie et les métastases osseuses constituent des atteintes irréversibles, mais "indispensable" à la conduite de l'étude, et toutes les souris sont mises à mort pour cette raison. Il annonce un antalgique et antitumoral à breveter, sur un marché qu'il désigne comme principalement celui des cancers du sein triple négatif.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif présente un taux de survie à 5 ans de 77% qui chute à 11% si métastases. Les douleurs associées à ce type de cancer sont de deux types : les douleurs neuropathiques périphériques induites par la chimiothérapie et les douleurs métastatiques. Nous avons montré que le récepteur GPER (pour G protein-coupled estrogen receptor), était impliqué dans le cancer et la douleur. Sur la base de ces résultats, nous émettons l’hypothèse que des molécules modulant le récepteur GPER pourraient améliorer le cancer triple négatif et les douleurs associées. Pour ceci, de telles molécules seront synthétisées. Après plusieurs étapes de screening in vitro, les meilleurs ligands (10 molécules maximum) seront alors évalués par nos soins (objet de cette procédure APAFIS) sur la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies grâce à l’utilisation d’un modèle murin. Le ligand présentant la meilleure efficacité sera alors évalué sur : (1) le développement de la tumeur, (2) la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies et (3) la douleur métastasique grâce à l’utilisation de modèles murins. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant de lutter contre la progression tumorale ainsi que les symptômes neuropathiques, tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies, mais aussi prévenant (lorsqu’il sera co-administré avec les chimiothérapies) l’apparition de neuropathies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, tumeur, dissémination sanguine et système immunitaire. Ces travaux compileront les bases nécessaires au dépôt de brevet de molécule dans le but de passer ensuite à des études chez l’Homme. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’anticancéreux responsable de la mise en place du modèle et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée en quelque secondes sur animal vigil. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile pendant quelques secondes sera réalisée afin d’évaluer la douleur. *104 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation des cellules cancéreuses qui durera environ 5 minutes par animal. *La mesure de la bioluminescence (durée : 5 min par animal) sera réalisée 2 fois par semaines pendant 3 semaines sous anesthésie générale. *Toutes les interventions sont réalisées à l’établissement utilisateur EU1 à l’exception de la mesure de la bioluminescence qui sera effectuée à l’EU2.
Impact sur les animaux
L’induction de la neuropathie chimio-induite (CIPN) ainsi que de tumeur chez l’animal seront des nuisances à part entière et irréversibles, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN ainsi que les métastases osseuses seront associées à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Une application de quelques secondes de filament au cours du test de von Frey est susceptible d’induire chez l’animal une douleur légère.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.
Remplacement
Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectués afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des molécules designées ou synthétisées subiront : - un screening in silico des dérivés (seules les molécules se fixant sur le GPER seront retenues) - un screening in vitro des dérivés (seules les molécules présentant une action agoniste inverse sur le GPER et une action antiproliférative sur cellules TNBC seront retenues). S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN et de métastases osseuses n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. S'agissant d'étude sur la croissance tumorale, un screening des composés et une étude de l’interaction de ces composés avec le paclitaxel in vitro sera réalisé préalablement au passage chez l’animal. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie. Ce type d'étude sur modèle animal de métastases osseuses est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
*Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. *Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. *De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. *La PROCEDURE 1 est une étape de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celle-ci sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. *Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule ou une chirurgie factice), et menées en aveugle. *L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Le transport des animaux entre l’animalerie (EU1) et le centre d’imagerie (EU2), s’effectuera en voiture. Les animaux seront hébergés dans des boites opaques avec couvercle filtrant. Un document de transport (avis/accord du vétérinaire) accompagnera les animaux. Le transport sera conditionné à l’état des animaux et les conditions climatiques.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN et la croissance tumorale. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie et le développement tumoral. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Etude de la sensibilité à l’Acide rétinoïque de blastes leucémiques surexprimant RARA
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une injection intraveineuse de chimiothérapie, cinq jours d'attente, puis la mise à mort et le prélèvement de la moelle osseuse. 240 souris vont être utilisées ainsi sur cinq ans, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet ne les utilise que pour disposer de moelle fraîche, l'étude se poursuivant hors de l'organisme, le porteur indiquant que les tentatives d'établir un modèle murin de cette leucémie ont échoué jusqu'ici. Le chiffre de 240 ne repose sur aucun calcul présenté, mais sur ce que le porteur appelle une longue expérience du nombre minimum de souris nécessaires.
Objectifs
La protéine RARA (Récepteur à l'Acide RétinoÏque Alpha) est retrouvée surexprimée dans certains cancers de la moelle osseuse, appelés "leucémies". Ces leucémies montrent une certaine sensibilité au traitement par l'Acide Rétinoïque (AR, dérivé de la virtamine A), y compris dans des essais cliniques. Ex vivo, la surexpression seule de RARA dans des cellules de moelle osseuse de souris conduit à leur transformation en cellules cancéreuses. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels la protéine RARA est capable de rendre ces cellules immortelles lorsqu'elle y est surexprimée restent méconnus, empêchant l'identification de biomarqueurs cliniquement relevants et l'élaboration de traitements plus efficaces. Afin d'étudier ces mécanismes et de définir les effets exacts de l'AR sur des cellules de moelle osseuse surexprimant RARA, nous mènerons des expériences ex vivo sur des cellules issues de souris. En effet, les tentatives d'établissement d'un modèle souris de leucémies due à la surexpression de RARA ayant jusqu'ici échoué, nous ferons ici appel à l'utilisation d'animaux en tant que donneurs de cellules de moelle osseuse pour mener ensuite l'étude ex vivo. Seule une injection intra-veineuse d'un agent de chimiothérapie sera effectuée pour enrichir la moelle en cellules immatures, ressemblant à celles retrouvées dans les leucémies surexprimant RARA. Nous introduirons ensuite artificiellement le gène RARA dans ces cellules, que nous cultiverons en laboratoire afin d'obtenir un modèle adapté à notre étude. Cinq jours après l'injection intra-veineuse de cet agent chimiothérapeutique, les animaux seront tous euthanasiés afin de prélever leur moelle osseuse.
Bénéfices attendus
Nous espérons pouvoir identifier les cibles de RARA sur l'ADN dans les leucémies dans lesquelles il est surexprimé. Nous voulons également mieux comprendre les effets de l'AR dans ce cadre. Grâce à ces nouvelles données, nous pourrons identifier des candidats pertinents de molécules médicaments pour élaborer des thérapies combinatoires associant l'AR à d'autres drogues ciblant les mécanismes clés identifiés par notre étude
Procédures
Une seule injection intraveineuse d'un agent de chimiothérapie utilisé chez l'Homme sera effectuée. Celle-ci durera moins de deux minutes
Impact sur les animaux
La seule nuisance attendue est le léger stress et l'inconfort liés à une injection intraveineuse
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure
Remplacement
La nécessité de travailler dans les conditions les plus proches possibles des cellules leucémiques retrouvées chez les patients nous obligent à utiliser des cellules de moelle osseuse issues directement de l'animal. Les réponses au traitement et les caractéristiques de ces cellules ne peuvent être entièrement récapitulées par des cellules se cultivant à long terme ex vivo, plus éloignées de l'état physiologique de cellules fraîchement isolées de la moelle osseuse. Une première partie de l'étude a déjà été menée sur de telles cellules. Nous avons désormais besoin d'avoir accès à des cellules fraîchement prélevées pour se rapprocher des conditions observées chez les patients, puisque nous nous intéressons à un effet thérapeutique.
Réduction
Le nombre de progéniteurs hématopoïétiques récoltés après injection de l'agent de chimiothérapie peut être sujette à de légères variations. Néanmoins, nous avons une longue expérience du nombre de souris minimum nécessaires pour obtenir les cellules en quantité suffisante pour une expérience donnée. Nous prévoyons d'avoir besoin de 240 souris au total sur cinq ans.
Raffinement
La douleur infligée par une injection est le seuil de douleur minimal justifiant la nécessité d'une demande d'autorisation de projet utilisant des animaux à des fins scientifiques. Nous l'effectuerons dans les meilleures conditions possibles. Le produit injecté est largement utilisé en clinique chez l'Homme et nous n'avons jamais observé d'effet adverse chez la souris dans les cinq jours qui suivent l'injection, délai que nous observerons avant l'euthanasie de ces animaux pour prélèvement.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère suffisamment proche de l’Homme pour les expériences menées dans ce projet, qui nécessitent a minima un système hématologique proche de celui de l’être humain. Le gène étudié possède son homologue sauvage chez la souris chez qui il régule les mêmes fonctions biologiques. La molécule utilisée est administrée par voie IV, disponible sur l’espèce animale choisie. Les études passées et présentes menées dans ce domaine par la communauté scientifique sont réalisées essentiellement sur ce modèle. De plus, les modifications de comportement en cas de souffrance/douleur sont aussi bien connues chez la souris et permettent une prise en charge rapide et adaptée. La composition de la moelle osseuse change avec l’âge des individus, notamment la quantité de progéniteurs. Ainsi nous utilisons des souris jeunes adultes de 6 à 8 semaines pour nos expérimentations. Nos études précédentes et celles faites dans les autres laboratoires travaillant dans ce domaine sont couramment réalisées à ce stade de développement.
Cancer des voies biliaires du foie– une étude d’invalidation de gène d’une cible thérapeutique potentielle et l’efficacité d’une approche thérapeutique par combinaison dans un modèle de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules cancéreuses sous la peau leur fait développer une tumeur des voies biliaires, puis elles reçoivent un anticorps par injection chaque semaine et un composé par gavage chaque jour pendant six semaines. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, ce qui entraîne une douleur moyenne au long terme, et que le gavage irrite l'œsophage au point de gêner la prise de nourriture. Il écrit que l'approche a déjà été validée in vitro et sur des tissus de patients, et qu'elle exige maintenant une validation sur "animal entier", au nom d'un "besoin urgent" de traitements contre ce cancer.
Objectifs
Ce projet vise trois objectifs principaux. Le premier est de comprendre le rôle d'une protéine particulière dans un cancer du foie appelé cholangiocarcinome (CCA), un cancer agressif qui se développe à partir des cellules des voies biliaires. Le deuxième objectif est d'étudier comment un anticorps, spécialement conçu pour cibler cette protéine, agit contre ce cancer. Enfin, le troisième objectif est de voir si cet anticorps, utilisé en combinaison avec d'autres traitements, peut améliorer les résultats chez les patients atteints de ce cancer. Le cholangiocarcinome est un cancer très agressif avec peu d'options de traitement efficaces, ce qui rend la recherche de nouvelles thérapies cruciale. Notre protéine d'intérêt, située à la surface des cellules, est impliquée dans plusieurs types de cancers, dont celui du foie. Des études chez la souris ont montré que lorsque cette protéine est surexprimée, elle favorise la croissance des tumeurs et réduit la survie, ce qui indique qu'elle joue un rôle important dans le développement du CCA. Nous avons également mis au point un anticorps capable de reconnaître spécifiquement cette protéine et de ralentir la croissance des cellules cancéreuses humaines transplantées chez des souris. Le but du projet est de confirmer l'importance de cette protéine en observant si sa présence ou absence dans des lignées cellulaires affecte la croissance des tumeurs. Nous allons aussi étudier comment cet anticorps fonctionne en suivant l'effet du traitement sur la croissance tumorale à différents stades. De plus, nous testerons si la combinaison de cet anticorps avec d'autres traitements, ciblant des voies de signalisation spécifiques, offre de meilleurs résultats que l'anticorps seul. Ces études seront menées sur des souris pour créer des modèles de cancer réalistes et évaluer les différentes approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à valider le rôle pro-tumorigène d’une protéine dans le contexte du cholangiocarcinome. Elle vise aussi à étudier le mécanisme d’action d’anticorps ciblant cette protéine, ainsi que l’efficacité d’une combinaison de cet anticorps avec des inhibiteurs ciblant des voies de signalisation fortement activées dans le contexte du CCA. Certains anticorps ciblant la protéine d’intérêt sont déjà admis par le Food and Drug Administration (FDA) pour un essai clinique de phase I en cours de réalisation dans le cadre du traitement des cancer de la tête et du cou. Nous sommes convaincus que le ciblage de cette protéine par cet anticorps peut avoir un intérêt thérapeutique pour le traitement du cholangiocarcinome. A noter qu’il existe un besoin urgent de nouveaux traitements novateurs contre le CCA vu que le taux de survie est bas et les options de traitement offertes sont très limitées. De plus, dans la plupart des cas, le cancer des voies biliaires est généralement diagnostiqué au stade 4, lorsqu’une intervention chirurgicale n’est plus une option et qu’une chimiothérapie peut prolonger la durée de la vie, mais en réduisant beaucoup la qualité de celle-ci. Cette étude doit permettre de faire un nouveau pas vers le développement clinique de nouvelles thérapies et ainsi contribuer à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux recevront des traitements 1 fois par semaine pendant 6 semaines maximum par injection réalisée sur animaux anesthésies (par suite de la mesure des tumeurs) et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux recevront également un traitement oral par un composé quotidiennement pendant 6 semaines (gavage). Les traitements sont réalisés sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisé. Les animaux de ce projet seront soumis à des mesures de tumeurs à l’aide d’un pied de coulisse qui seraient réalisées en environ 1 minute. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Pour les procédures 2-6, la manipulation et la contention peut engendrer un stress physique de courte durée lors de la manipulation. Pour les procédures 2-6, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée, ce qui peut engendrer une douleur moyenne au long terme. Pour les procédures 5 et 6, le gavage peut entrainer principalement une irritation/inflammation de l’œsophage avec pour conséquence un inconfort de la souris pour se nourrir au moyen terme et donc une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. L’anesthésie va être utilisée pour les gestes invasifs.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.
Cardiomyopathie dilatée d’origine génétique liée à l’invalidation du gène Lmna chez la souris adulte – Identification de cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Cinq échocardiographies de trente minutes sous anesthésie générale, des injections rétro-orbitaires et deux prélèvements sanguins sont pratiqués sur des souris chez qui l'invalidation d'un gène provoque une insuffisance cardiaque. 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour collecter leurs organes. Le porteur décrit des œdèmes pulmonaires, des difficultés respiratoires, une fatigabilité, des troubles du rythme et des morts subites possibles, l'objectif étant d'évaluer des cibles thérapeutiques pour la régénération cardiaque. Il présente l'anesthésie des échographies comme un moyen de limiter le stress des souris, tout en reconnaissant que le risque de mort qu'elle comporte augmente chez des animaux dont la fonction cardiaque est dégradée.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires constituent la première cause de mortalité dans les pays industrialisés. Les cardiomyopathies dilatées (CMD) sont la forme la plus courante de cardiomyopathies. Les CMD sont principalement d’origine génétique. Le gène LMNA est le deuxième gène le plus fréquemment muté chez l’Homme, représentant 10% des cas de CMD. Les mutations du gène LMNA sont à l’origine de CMD à progression rapide avec des défauts cardiaques sévères. Ainsi, notre projet a pour objectif d’évaluer la pertinence de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles sur la progression de la pathologie cardiaque liée à l’invalidation du gène Lmna.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait d’identifier et de valider des cibles thérapeutiques cliniques pertinentes pour induire la régénération et réparation cardiaque chez l’Homme dans le contexte de cardiomyopathies dilatées (CMD) d’origine génétique. Le gène LMNA est le deuxième gène le plus fréquemment muté dans les CMD d’origine génétique, représentant 10% des cas de CMD et démontrant ainsi le fort impact thérapeutique de ce projet. Ainsi, notre projet permettrait également d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les autres types de CMD augmentant ainsi le potentiel thérapeutique du projet. Ce projet s’inscrit dans un contexte translationnel vers le développement d’un traitement clinique grâce à l’étroite collaboration avec les cliniciens. Ce projet va permettre d’augmenter nos connaissances sur la régulation de la prolifération des cardiomyocytes et la régénération cardiaque afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre les pathologies cardiovasculaires telles que les CMD qui constituent un problème majeur en santé publique.
Procédures
Les animaux seront soumis à: - une biopsie à l'oreille permettant d'identifier les animaux et de les génotyper - une injection intrapéritonéale (30s à 1 minute) - une injection intraveineuse ou une injection rétro orbitaire sous anesthésie (30s à 1 minute) - 5 échocardiographies sous anesthésie générale gazeuse (30 minutes) - 2 prélèvements sanguins
Impact sur les animaux
Les animaux non traités sont susceptibles de développer une insuffisance cardiaque. . Si les souris développent des symptômes proches de ceux identifiés chez l’homme, elles pourraient développer une insuffisance cardiaque (avec des oedèmes dont des oedèmes pulmonaires associés à des difficultés respiratoires, une fatigabilité et des difficultés à se déplacer) , des troubles du rythme et des morts subites. Au cours du projet, certains animaux recevront une injection unique de tamoxifène par voie intra péritonéale. La principale nuisance attendue est le stress de l'animal lié à la contention. Des injections intraveineuse ou rétro orbitaires seront également réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Les échographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure afin de collecter les organes et faire des analyses histologies et de biologie moléculaire
Remplacement
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux. Malgré les stratégies de remplacement développées, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique. Ainsi, l’expérimentation animale utilisant des souris contrôles et génétiquement modifiées est indispensable à l’étude intégrée des phénomènes physio-pathologiques et à la réalisation de notre projet.
Réduction
Afin de limiter ou d’éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal, tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions reliées à l'étude, des stratégies ont été mises en place. L’élaboration précise des protocoles et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques couplée à notre expérience permettent d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires. Le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Ainsi, le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence des anomalies de la fonction cardiaque. De plus, cette étude de type longitudinale permet de suivre les animaux au cours du temps ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Des stratégies d’optimisation sont mises en place au cours du projet afin de réduire voire de supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse chez l’animal : - Modifications apportées à l'élevage afin d'améliorer le bien-être des animaux : enrichissement des cages. - La planification des procédures expérimentales (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) diminue le stress des animaux et favorise la validité de l'expérience. - Établir des points limites les plus précoces possibles en fonction de l'objectif de l'expérimentation. - L’ensemble des actes nécessitant une contention seront réalisé par des expérimentateurs aguerris avec plusieurs années de pratique pour ces gestes, limitant ainsi le stress ressenti par les souris. - Les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie afin de limiter le stress de l’animal. - Afin de prévenir toute souffrance, les animaux seront examinés quotidiennement. Une grille d'évaluation des scores sera mise en place (Annexe 2) et permettra selon des critères précis, le déploiement d’actions spécifiques permettant de soulager la souffrance..
Choix des espèces
Chez la souris, le développement et le fonctionnement physiologique du cœur sont similaires à ceux décrits chez l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation de souris génétiquement modifiées représente le modèle le plus pertinent en ce qui concerne la compréhension des maladies humaines. Pour cette étude les animaux adultes âgés de plus de 8 semaines seront utilisés. Cet âge permettra d'étudier les cibles thérapeutiques potentielles identifiées pour la régénération cardiaque dans les cardiomyopathies dilatées d’origine génétique.
Evaluation de l’effet thérapeutique de la surexpression de la cavéoline-3 dans deux modèles murins de myopathie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une course d'endurance sur tapis, des tests de force chaque semaine pendant un mois, des mesures cardiaques et musculaires sous anesthésie : selon les groupes, 672 souris de deux lignées atteintes de myopathie vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une thérapie génique destinée à augmenter la production de cavéoline-3 dans leurs muscles, soit dans la première semaine de vie, soit après l'apparition des symptômes. Le porteur cite parmi les nuisances "l'angoisse et la douleur durant la course", le stress de l'isolement pendant douze heures de mesure d'activité et une fatigue due aux anesthésies répétées. Les souris testées sont tuées à l'issue pour prélever muscles et organes. La moitié des souriceaux nés des croisements n'auront pas le génotype recherché et seront tués, sauf ceux gardés pour de nouveaux croisements.
Objectifs
Ce projet s'intéresse à deux maladies rares du muscle associées à de la faiblesse, des crampes et des douleurs musculaires chez les patients. A ce jour, il n'existe aucun traitement pour ces myopathies. Le but de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'une potentielle thérapie commune pour ces deux maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait fournir une preuve de concept commune pour soigner deux myopathies. En outre, cette étude nous permettra de mieux comprendre ces maladies et les acteurs impliqués.
Procédures
Dans ce projet, il y aura 4 groupes d’animaux : les groupes 1 et 3 (Myopathie 1) et les groupes 2 et 4 (Myopathie 2), qui seront soumis à différents tests musculaires et cardiaques. Groupes 1 et 2 : Les animaux recevront la thérapie génique durant la première semaine après la naissance avant l'arrivée des symptômes (prévention de la maladie). Les tests seront réalisés à l’âge attendu d’arrivée des symptômes. Groupe 1 : Les capacités cardiaques seront évaluées par deux tests cardiaques effectués consécutivement au cours de la même anesthésie (30 mins) une fois durant la vie de la souris. Les capacités sportives seront testées une fois par test d’endurance sur tapis de course (moins d’une heure). L’activité spontanée sera également surveillée sur 12h. Groupe 2 : Les capacités sportives seront testées une fois par semaine pendant 1 mois par deux tests de force (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs sous anesthésie générale) durant chacun moins d'une heure. L’activité spontanée sera surveillée sur 12h, une fois durant la vie de la souris. La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin de la caractérisation sous anesthésie générale. Groupes 3 et 4 : Les animaux recevront la thérapie génique après l’apparition du phénotype (réversion de la maladie). Groupe 3 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, mesure de force des membres postérieurs et endurance sur tapis de course) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (activité spontanée et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement. Groupe 4 : Avant traitement, les capacités motrices (activité spontanée, test de suspension et mesure de force des membres postérieurs) seront mesurées une fois afin de pouvoir comparer le phénotype avant et après traitement. Un suivi des capacités motrices sera réalisé une fois par semaine pendant 1 mois (test de suspension et mesure de force des membres postérieurs). La mesure contractile du muscle sera réalisée à la fin des 1 mois de traitement.
Impact sur les animaux
Il est attendu que les animaux n’aient pas de symptômes cliniques sévères. Les nuisances causées par les différents tests sont le stress dû à l'isolement durant la mesure d'activité spontanée, l'angoisse et la douleur durant la course, ainsi que la douleur lors des injections de traitement ou d'anesthésiants. Il est possible que les animaux ressentent une fatigue physique due aux anesthésies répétées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu des tests afin de récolter les muscles et organes nécessaires aux analyses moléculaires, et d'évaluer à une échelle plus petite les effets potentiellement bénéfiques des thérapies. La moitié des animaux issus des croisements ne possèderont pas les génotypes d'intérêt et seront euthanasiés s'ils ne sont pas nécessaires pour renouveller des croisements.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer l'effet bénéfique d'une thérapie sur le muscle et la fonction cardiaque. Malheureusement, l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni sur l’ensemble de l’organisme. Evaluer les fonctions motrices et la force musculaire in vivo est indispensable pour déterminer l'efficacité d'un traitement contre des myopathies. Le modèle murin est suffisamment proche physiologiquement et structurellement pour étudier la physiopathologie ainsi qu'une potentielle amélioration des symptômes dans le cadre d'une thérapie.
Réduction
La grande majorité des tests étant peu invasifs, il est possible de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Les tests histologiques et moléculaires seront effectués sur les mêmes animaux après euthanasie. Ces deux points nous permettent de réduire drastiquement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été choisi à partir des données présentes dans la littérature, ainsi que de façon à pouvoir détecter une différence statistiquement significative entre les animaux malades, sains et traités.
Raffinement
Chaque cage sera enrichie avec des nids de chanvre et un tube pour permettre la préhension des animaux avec un minimum de stress. En cas de fatigue ou difficultés locomotrices des animaux, la nourriture sera placée dans la cage. Les animaux seront pesés une fois par semaine et observés. Avant chaque test phénotypique, l'animal sera familiarisé avec le matériel pour limiter son stress. Lors des tests sous anesthésie une crème ophtalmique sera appliquée pour éviter l’assèchement des cornées et la phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères. Le bien-être global des animaux sera surveillé quotidiennement après injection du traitement pendant une semaine. Pour les nouveau-nés, la poche de lait sera observée, car une diminution de l'alimentation peut indiquer un mal-être, et les animaux seront pesés. Des analgésiques pourront être administrés sur avis du vétérinaire si les animaux montrent des signes de douleur persistante. La zone d'injection du traitement sera surveillée et dès l'apparition de rougeurs, elle sera nettoyée avec une solution antiseptique douce. En cas d'infection importante, l'animal pourra recevoir des antibiotiques ou être euthanasié sur avis vétérinaire.
Choix des espèces
Les deux modèles de souris récapitulent le phénotype locomoteur et histologique présent chez les patients, et permettent donc d'évaluer correctement l'efficacité des traitements. Les défauts locomoteurs du premier modèle sont établis à 12 semaines après un exercice forcé et le phénotype cardiaque léger peut être détecté à 7 semaines. Pour les souris injectées avec le traitement dans les premiers jours de vie, les tests seront réalisés entre 7 et 12 semaines. Pour les souris injectées à 12 semaines, les tests seront réalisés de 11 à 16 semaines. Le deuxième modèle est plus précoce, bien que toujours léger, les tests seront donc effectués de 6 à 8 semaines ou de 6 à 12 semaines en fonction de l'injection du traitement (en prévention ou après l'apparition des symptômes).