Rongeurs
Immunothérapie préventive dans le développement d’adénocarcinome intestinale de type MSI (Instabilité des MicroSatellites) chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées ici sont génétiquement construites pour développer d'elles-mêmes des lymphomes et des tumeurs intestinales dès leur première année de vie. Elles sont 1 614, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et des occlusions intestinales sont possibles. Un régime riche en gras alterné deux semaines par mois accélère l'apparition des adénocarcinomes, ce qui permet de ramener les groupes de trente à vingt souris, auxquelles s'ajoutent jusqu'à seize injections intraveineuses sous anesthésie sur huit mois. Toutes sont tuées, et une partie ne sera jamais analysée : ces souris-là meurent dans le cadre de l'entretien de la lignée.
Objectifs
Les cancers MSI (pour microsatellites instables) sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées de l’ADN appelées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par l’inactivation du système de réparation de l’ADN appelé MMR (pour MisMatch Repair). Il existe un syndrome héréditaire appelé syndrome de Lynch, dû à une mutation sur un des gènes impliqués dans ce système de réparation et qui cause le développement de tumeurs MSI chez les patients atteints de ce syndrome, entre 20 et 50 ans. L’objectif de ce projet est d’étudier les conséquences d’un traitement d’immunothérapie sur l’initiation et la progression tumorale de type MSI. En effet, il s’avère que les cellules tumorales utilisent un système de contrôle en charge de réguler la réponse immunitaire (appelé ICK), normalement prévu pour éviter des inflammations trop importantes ou des maladies auto-immunes, afin d’échapper à la réponse immunitaire antitumorale. Ce type de tumeurs répondent généralement bien aux traitements d’immunothérapie anti ICK et ce type de traitement est proposé aux patients atteints de cancer colique MSI au stade métastatique. Avec ce projet nous voulons démontrer qu’un traitement d’immunothérapie anti ICK préventive induit une augmentation de la réponse immunitaire antitumorale en ralentissant le développement des cancers MSI. Avec ce projet nous proposons de tester plusieurs nouvelles monothérapies/bithérapies et d’évaluer les mutations des cellules tumorales qui échappent au traitement en espérant à termes ouvrir des nouvelles pistes thérapeutiques pour les malades de cancers coliques de type MSI.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’élucider dans un point de vue fondamentale l’expression des protéines exprimées par les cellules tumorales lui permettant d’échapper au système immunitaire ICK et d’un point de vue clinique et thérapeutique de valider l’intérêt d’un traitement préventif utilisant une immunothérapie anti ICK afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer colique MSI (pour Microsatellites instables) notamment d’origine héréditaire. Ce projet pourra ouvrir à termes de nouvelles perspectives thérapeutiques innovantes pour les patients avec un cancer MSI résistant aux chimiothérapies standards.
Procédures
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. D’autres modèles développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables après induction par injection d’une solution en intrapéritonéale sur animal vigile (5 fois à raison de quelques secondes par animal). Le modèle de greffes de cellules tumorales impliquera une anesthésie et une injection sous-cutanée unique de cellules effectuées (7-8 minutes par animal). Une partie des animaux recevront un régime riche en gras à raison de 2 semaines par mois et retrouveront un régime classique les 2 semaines suivantes tout au long du projet. Tous les animaux recevront différents traitements par injections intraveineuse sur animal anesthésiés à raison toutes les 2 semaines pendant maximum 8 mois (environ 1 minutes temps par animal, 16 fois maximum).
Impact sur les animaux
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome/tumeur intestinale). Les effets indésirables sont donc principalement liés à ce développement tumoral. Les principaux symptômes du lymphome sont une augmentation de la taille des organes lymphoïdes comme la rate, le thymus et le foie ainsi que dans certains cas des ganglions. Pour l’adénocarcinome/tumeur intestinale, il s’agit d’une tumeur qui reste localisé et n’envahi pas les tissus/organes à distance (pas de métastase). Les souris dans ce contexte peuvent faire des occlusions intestinales. Un autre modèle murin utilisé au cours de ce projet impliquera l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée dans des souris commerciales et effectué sous anesthésie de courte durée pouvant induire un léger stress thermique, un risque d’arrêt cardiorespiratoire (très rare). Le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. L’alternance entre régime standard et régime riche en gras pourra induire un léger stress en raison du changement d’alimentation (néophobie de la souris). Les injections nécessaires à l’induction de certains modèles par injection intrapéritonéale pourront induire un stress et une douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille. L’administration des différents traitements par injection intraveineuse seront effectuées sous anesthésie de courte durée pouvant induire un léger stress thermique, un risque d’arrêt cardiorespiratoire (très rare) et également un risque de lésion/infection au site d’injection. Les traitements devraient réduire les effets liés au développement tumorale avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.
Remplacement
Un organisme vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement tumoral qui est au cœur de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Dans le cas d’un projet qui vise à étudier l’effet d’une nouvelle immunothérapie, il est nécessaire travailler sur un modèle in vivo car mieux adaptés à l'observation des effets globaux sur un sujet vivant et en particulier pour ce qui concerne l’initiation et la progression tumoral ainsi que les effets autres qui pourraient se manifester sur l’organisme.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1614 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures d’élevage et expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Par exemple, pour les modèles génétiquement modifiés l’utilisation de la stratégie du régime riche en gras alterné permet d’accroitre la fréquence du développement des adénocarcinomes qui sont nécessaires dans ce projet, ce qui permet de réduire la taille des groupes à 20 souris (contre 30 sous régime standard). Il apparait nécessaire de mettre en observation 20 souris par groupe pour espérer mettre en évidence un impact significatif du traitement dans le cadre de notre expérience en restant respectueux de la règle des 3R. Pour les expériences impliquantes des greffes de cellules tumorales, les groupes seront réduits à 10-15 souris. Ces cohortes devraient nous permettre de mettre en évidence l'impact des traitements par immunothérapie simple ou combiné en respectant la règle des 3R. Si l'impact est significatif, ce que nous espérons, il ne sera pas utile de répéter l'expérience.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite). Les contraintes induites par le manipulateur dans ce protocole sont faibles (uniquement l’injection des traitements). Elles sont réalisées par du personnel formé et compétent et avec du matériel adapté en condition stérile. Durant les phases de traitement la surveillance sera augmentée afin de mettre en évidence toute intolérance liée au traitement. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle perte/prise de poids. Pour le modèle de xénogreffe sous-cutanée, nous mettrons également en place un suivi bi-hebdomadaire de la croissance tumorale avec des points limites associés. La principale douleur pouvant être subit par les animaux concerne surtout le développement naturel des tumeurs. Ainsi, grâce au suivi et à la très bonne connaissance des modèles murins utilisés, nous pouvons détecter les premiers signes d’un développement tumoral. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : Les souris sont des animaux modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation des modèles murins est la seule approche permettant d'intégrer le développement tumoral MSI et la complexité de la réponse aux traitements de chimiothérapie. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Les modèles animaux qui développent des tumeurs spontanément seront à partir d’environs 8-10 semaines. Les souris auront alors atteint un poids et une taille favorable pour réaliser les gestes techniques. De plus, la mise en œuvre d’un traitement à partir de 8-10 semaines nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement préventif. Pour le modèle de greffe sous-cutanée de cellules tumorales, les souris seront traitées par immunothérapie dès 6 semaines et la greffe sera réalisée à 9 semaines de vie. Cela nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement préventif.
Cibler les macrophages dans un modèle murin de Sclérose Latéral Amyotrophique (SLA) pour ralentir la progression de la maladie.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
165 souris atteintes d'un modèle de sclérose latérale amyotrophique reçoivent chacune jusqu'à 45 injections intrapéritonéales en neuf semaines, auxquelles s'ajoutent trois prélèvements sanguins et onze mesures de force musculaire. Cent cinquante-cinq d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever tissus nerveux, muscles et cellules sanguines. La maladie leur fait perdre leur force musculaire puis les paralyse progressivement, et le critère de jugement principal retenu est leur durée de vie, en moyenne 165 jours sans traitement. Le passage en essai clinique chez l'humain reste envisagé "à plus long terme" et "en cas d'efficacité".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative grave, caractérisée par la mort des motoneurones (cellules nerveuses qui contrôlent la contraction des muscles) entrainant une paralysie et le décès des patients en 2 à 5 ans. Le seul traitement utilisé en clinique, le Riluzole, ne permet de prolonger la survie que de 3 mois en moyenne. Etant donné que les macrophages (cellules immunitaires présentes dans les tissus) sont impliqués dans la progression de la maladie, l’objectif de notre projet est de moduler l’activation des macrophages périphériques grâce à 2 molécules qui ciblent une voie activée spécifiquement dans les macrophages et les cellules microgliales (cellules immunitaires du système nerveux) et qui peuvent ainsi réduire leur réactivité. Cette approche a une visée thérapeutique directe si nous montrons qu’elle peut ralentir la progression de la maladie. Ces molécules ont déjà été utilisées dans d’autres modèles de maladies neurologiques et ont montré des résultats encourageants avec une diminution de l’activation des cellules microgliales. Notre hypothèse est que cette voie pourrait être impliquée dans la progression de la SLA et la cibler par l'intermédiaire de ces 2 molécules pourrait ralentir de façon importante la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative actuellement incurable entrainant une paralysie progressive et la mort des patients en moyenne en 2 à 5 ans. La SLA touche 8000 personnes en France avec une prévalence de 4/100000 personnes. L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie dans un modèle de souris de SLA, en modulant une voie du système immunitaire présente dans les macrophages, cellules immunitaires des tissus, par l’injection de 2 molécules régulant cette voie. Un bénéfice du remplacement des macrophages des souris SLA par des macrophages moins toxiques a été montré dans ce modèle. L’utilisation de molécules pharmacologiques pour moduler la réponse toxique des macrophages pourrait donc être bénéfique et rapidement transférable en clinique. Ces molécules ont déjà été utilisées dans des modèles de souris d’autres maladies neurologiques et ont montré un bénéfice. Notre hypothèse est que ces molécules pourront permettre de ralentir la progression de la maladie en ciblant les macrophages chez les souris SLA. Le critère de jugement principal (et communément reconnu dans la littérature) sera ainsi la durée de vie des souris, sachant que les souris SLA vivent en moyenne 165 jours sans traitement (5,5 mois). Les critères de jugements secondaires seront la détection, par des marquages dans les tissus nerveux, de la survie des motoneurones (cellules qui meurent au cours de la maladie) et de la réponse des cellules immunitaires (macrophages) du système nerveux et du sang en fonction du traitement par les 2 molécules testées. Ces molécules ont des propriétés capables de réduire l’activation des macrophages ce qui pourrait leur conférer des propriétés remarquables pour la SLA. A plus long terme, en cas d’efficacité, un passage en essai clinique chez l’humain est envisagé pour cette maladie sans traitement curatif.
Procédures
Les animaux modèles de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et leurs contrôles seront soumis à des traitements par injections intra-péritonéales (animal vigil, 45 fois sur 9 semaines, 1 minute), des prélèvements sanguins (animal vigil, 3 fois en 11 semaines , 1 minute) et des mesures de force musculaire (animal vigil, 11 fois sur 11 semaines , 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris auront : 1) un phénotype dommageable entrainant la perte de force musculaire et la paralysie progressive de l'animal, 2) des injections répétées intrapéritonéales qui pourront induire une douleur légère de courte durée au site d'injection et une inflammation au niveau du péritoine (rare), 3) des prélèvements sanguins pouvant induire une douleur légère de courte durée au point de prélèvement et dans de rare cas un hématome, puis 4) un léger stress lors du test comportemental de force musculaire.
Devenir
L’euthanasie est nécessaire afin de collecter les tissus nerveux, les muscles et les cellules sanguines affectés par la maladie afin de les étudier au laboratoire.Tous les animaux seront utilisés à la fin des procédures pour des études d’histologie ou de leurs ARN et protéines et seront donc euthanasiés.
Remplacement
Nous avons déjà mis en œuvre des expériences utilisant des cultures cellulaires pour montrer l’intérêt des molécules que nous souhaitons tester avant de passer à l’expérimentation sur le modèle de souris. Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine. Ils sont aussi le seul modèle permettant d’étudier un effet sur la progression de la maladie, raisons pour lesquelles notre projet nécessite l’utilisation de souris modèle de la pathologie.
Réduction
Nous utiliserons le nombre d’animaux maximal de 165 souris nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif et afin de pouvoir obtenir une conclusion scientifique à l’ensemble de nos travaux. Nous utiliserons le même groupe d’animaux témoins pour toutes les concentrations des molécules à tester afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Pour la stimulation environnementale, un programme d’enrichissement sera suivi, nous utilisons toujours des petites maisons en carton « Mouse house » et des fibres en carton ou carrés de coton permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles seront hébergées ensemble à 5 souris par cage. Si la maladie des souris n’est pas synchrone d’une souris à l’autre, les souris ayant du mal à se déplacer (pour cause de paralysie engendrée par la maladie SLA) seront séparées pour éviter que les souris plus vives ne les piétinent. Elles seront dans ce cas hébergées avec les autres souris paralysées (2 à 5 souris par cage sauf cas exceptionnel et peu probable où il n’y aurait qu’une souris dans cet état). Un mélange de poudre de nourriture et d'eau (bouillie) sera proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une déshydratation et une dénutrition. Une attention particulière sera portée aux yeux des souris qui seront fréquemment nettoyés (à l’eau stérile) en cas de suintement, pour éviter toute infection. De la solution antiseptique sera utilisée si les yeux paraissent trop souillés comme désinfectant. Proche de la fin du projet, les souris seront surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours de la semaine (week-ends inclus). Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées et nous avons, pour chaque procédure, défini des points limites.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique ou SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat; C’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Les souris SLA seront utilisées à l’âge adulte, de 7 semaines à 24 semaines maximum.
Mise en place de xénogreffes d’origine humaine chez la souris pour tester de nouvelles thérapies contre les lymphomes à cellules B
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées avec des cellules de lymphome humain, 581 souris reçoivent ensuite jusqu'à vingt gavages, vingt injections et cinq séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie l'implantation de la tumeur d'intervention chirurgicale "légère" et décrit les traitements comme sources d'une douleur "légère à court terme", tout en prévoyant de peser et d'observer les souris deux fois par semaine pour les mettre à mort avant leur mort "naturelle". La mise à mort sert à récupérer les organes et les tumeurs.
Objectifs
Le lymphome est le cancer du sang le plus répandu et le sixième cancer le plus répandu dans le monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B consiste en une chimiothérapie ou une greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (maladie récidivante) ou ne répondent pas au traitement (maladie réfractaire), généralement avec des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. Les analyses génomiques des lymphomes diffus à grandes cellules B ont montré des altérations de l'épigénome (modifications des histones et méthylation de l'ADN), ainsi que des mutations fréquentes dans les gènes ayant un rôle épigénétique. Ces connaissances ont conduit au développement de médicaments inhibant les protéines épigénétiques. Cependant, les résultats des essais cliniques testant des médicaments épigénétiques pour traiter le lymphome n’ont pas été aussi prometteurs que prévu. Nous émettons l'hypothèse que les médicaments épigénétiques ont montré une faible efficacité jusqu'à présent car ils ont été utilisés en monothérapie, ce qui plaide en faveur de l'utilisation de thérapies combinatoires. L'objectif de ce projet est d'étudier l'efficacité des thérapies épigénétiques combinatoires dans le lymphome dans le but de concevoir de nouveaux traitements prometteurs qui peuvent être testés plus avant dans des essais cliniques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier de nouveaux traitements contre le lymphome diffus à grandes cellules B . Bien qu’il existe un traitement standard pour ce type de lymphome, il n’est efficace que chez 60 % des patients et repose sur la chimiothérapie, qui est associée à des effets secondaires toxiques. Par conséquent, la découverte de thérapies plus efficaces et ciblées constituerait une avancée significative dans le traitement des patients atteints de lymphome diffus à grandes cellules B .
Procédures
Les souris qui développeront des lymphomes seront surveillées. Nous manipulerons (contention) les animaux une ou deux fois par semaine pour les peser et les observer à la recherche de signes de formation de tumeurs : perte de poids, réduction des mouvements, posture voûtée, fourrure ébouriffée, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Certaines souris subiront une intervention chirurgicale légère pour recevoir la tumeur (une fois), ce qui implique l’utilisation d’anesthésie ; certaines souris recevront une injection pendant 1 minute pour transférer les cellules tumorales (une fois) ou détecter les cellules tumorales (une fois par semaine) ; et certaines souris recevront le traitement par injection ou par voie orale quotidiennement pendant 4 semaines maximum. Types d’interventions : - Contentions pour pesées et mesures : durée = 5 secondes / nombre = 12 - Intervention chirurgicale sous anesthésie/analgésie : durée = 10 minutes / nombre = 1 - Administration par gavage sur animal vigile : durée = 1 minute / nombre = 20 - Administration par injection sur animal vigile : durée = 30 secondes / nombre = 20 - Administration par injection sur animal anesthésié : 30 secondes / nombre = 1 - Imagerie corporelle non invasive sous anesthésie : durée = 5 minutes / nombre = 5
Impact sur les animaux
Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou de mouvements lents. En outre, la manipulation des souris pendant la surveillance du développement du lymphome peut induire du stress. Et il peut y avoir une inflammation au site d’injection. Les souris qui reçoivent des lymphomes diffus à grandes cellules B primaires subiront une intervention chirurgicale, qui implique l'utilisation d'anesthésie. Le traitement par injection ou par voie orale peut également provoquer du stress et des douleurs légères à court terme.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des tumeurs pour leur étude ultérieure.
Remplacement
Compte tenu de la complexité des mécanismes impliqués dans le lymphome, aborder ce problème uniquement par des analyses in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour étudier cette maladie humaine. Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cellules de lymphome et les concentrations toxiques déterminées pour chaque composé contre les cellules tumorales mais pas contre les cellules saines. Il faut maintenant vérifier que cet effet se produit également in vivo en utilisant différents modèles de lymphome humain. Aucune méthode alternative n’est donc pour l’instant apte à remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expériences in vivo permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux.
Réduction
Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes, ce qui permettra de calculer le nombre d'animaux strictement nécessaires à ce projet. Par ailleurs l’utilisation de l’imagerie permettant une étude sur la durée des mêmes animaux est un élément de réduction.
Raffinement
Nous avons établi une grille d’évaluation avec des seuils de coupure précoces adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant la rigueur scientifique, notamment en augmentant la surveillance lors de l’observation des changements de poids, de mouvement, d’apparence physique et de comportement ; et en ajoutant de l’eau gélifiée et de la nourriture à l’intérieur de la cage lorsque des symptômes de lymphome apparaissent. D’autre part, après le transfert des cellules de lymphome et le traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement, permettant de détecter toute apparition de signes durables de souffrance. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone. Concernant les souris immunodéficientes, elles seront hébergées à raison de 5 maximum par cages, sur des portoirs ventilés où les paramètres environnementaux sont contrôlés, nourries à volonté avec de l'eau stérilisée par filtration et des aliments adaptés, dans un milieu enrichi (neslets et igloo dans chaque cage). Un suivi journalier est effectué par le personnel animalier. L'ensemble des manipulations se fera en conditions stériles avec des gants et du matériel stérile pour éviter toute contamination des souris qui sont immunodéficientes.
Choix des espèces
Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules tumorales dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Les conditions optimales de réalisation des xénogreffes nécessitent d’implanter de jeunes adultes, soit des souris âgées de 6-8 semaines.
Évaluation du comportement PICA chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Détecter le potentiel nauséeux d'un candidat médicament avant son premier passage chez des volontaires humains : 1 500 rats vont être utilisés pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous seront tués à l'issue. Le comportement dit pica, la consommation d'une substance non nutritive, sert d'indicateur des nausées chez une espèce qui ne vomit pas. Chaque rat est hébergé seul sur grille, reçoit jusqu'à trois administrations par jour d'une substance émétisante ou du produit testé, jeûne jusqu'à seize heures en fin de procédure et peut subir jusqu'à douze prélèvements de sang. Le porteur justifie la mise à mort par la sévérité de la procédure et par le stress lié à l'hébergement, et conclut que les tests in vitro déjà réalisés ne reflètent pas la complexité du système digestif humain, ce qui rend selon lui les modèles animaux "indispensables".
Objectifs
Les nausées sont des sensations désagréables souvent accompagnées de vomissements (expulsion orale forcée du contenu du tractus gastro-intestinal supérieur), et sont couramment rencontrées dans la pratique clinique. Ces symptômes sont associés à diverses pathologies, notamment les troubles gastro-intestinaux, les infections virales ou bactériennes, les maladies métaboliques comme le diabète etc. D’autre part, les nausées sont l'un des effets secondaires les plus fréquemment signalés des médicaments prescrits et sont particulièrement redoutés des patients sous chimiothérapie. Ces symptômes sont également les plus rencontrés lorsqu’une nouvelle entité chimique est administrée pour la première fois à des volontaires sains. Une méthode de reconnaissance précoce des nausées et des vomissements est donc nécessaire avant qu'un nouveau médicament potentiel n'entre sur le marché et ne fasse l'objet d'essais chez l'homme. Enfin, l'identification des mécanismes et cibles impliqués nauséeux et émétique donneront également des indications importantes sur les nouvelles approches en matière de potentiel médicaments contre la nausée et les vomissements.
Bénéfices attendus
Ces études ont pour objectifs d’une part d’évaluer l’efficacité d’un traitement contre les nausées et les vomissements induit par une substance de référence ou d’autre part d’identifier les potentiels effets secondaires nauséeux causées par l’administration d’un candidat médicament.
Procédures
Les substances d'essais peuvent être administrées par bolus (durée de quelques secondes) ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent, 1 administration par jour pendant la durée du test avec au maximum 3 adminsitration par jours), et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux sont acclimatés aux conditions d’hébergement du test pendant 3 jours. Le comportement PICA des animaux est évalué sur en mesurant la consommation individuelle d'une substance non nutritive sur une période de 4 jours au maximum (soit uen durée maximale du test de 7 jours incluant la periode d'habituation). Par ailleurs, les animaux peuvent recevoir au préalable du test une substance réactive (administration unique ou répétée , 2 fois par jours maximum) pour évaluer l’effet l’efficacité anti-émétique des candidats médicament. Enfin, si nécessaire et selon l’objectif de l’étude des prélèvements sanguins (durée de quelques secondes, 6 maximum par jours avec un maxium de 12 prélévements au total) pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
Un stress lié à l'hébergement individuel sur grille et à la répétition de cet hébergement tout au long de la procedure ( i.e. acclimatation et sessions test) ainsi qu'a une mise à jeun (n’excédant pas 16 h) en fin de procedure peut être ressenti. Par ailleurs, certaines substances testées peuvent provoquer une gêne ou un inconfort liés à la sensation de nausée.
Devenir
La procédure est sévere, de plus les animaux sont soumis à un stress lié à la modification des condition d'hebergement durant la procédure ils seront donc euthanasiés à l'issue de la procédure.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 8-10 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le comportement pica chez le rat est médié par les même mécanismes de vomissement chez l’Homme. Par ailleurs, le comportement pica est assimilable aux vomissements observables chez d’autres espèces. Tous les animaux seront utilisés après 4 semaines de développement (après sevrage) et jusqu'a 5 mois. En effet, les données de la littérature montrent qu'à partir de 5 mois d'age les animaux deviennent plus anxieux, ce qui peut interférer avce le test.
Test de stratégies expérimentales permettant de prévenir les troubles moteurs et cognitifs dans un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Nées dans l'élevage de l'équipe, d'une lignée génétiquement modifiée porteuse d'une mutation responsable d'une paraplégie spastique héréditaire, et croisée toutes les dix générations avec des souris d'un élevage extérieur, 3 086 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après une coupe du bout de la queue pour le génotypage, elles reçoivent selon les groupes un médicament mêlé aux croquettes pendant sept mois, ou une dose unique par gavage de leur mère gestante. Une partie passe trois séries d'un test de mémoire et d'un test de coordination motrice, que le porteur ne nomme pas, chacune suivie d'une prise de sang sous anesthésie, et un groupe subit jusqu'à 14 prises de sang, une toutes les deux semaines. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus ou des embryons, comme les couples reproducteurs quand leur fécondité diminue. Le porteur juge "indispensable" le recours aux souris, tout en disant utiliser des méthodes in vitro "dès que possible".
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale.
Bénéfices attendus
Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.
Choix des espèces
Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 8 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.
Elevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude de l’impact des cellules immunitaires sur le foie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Baguées à l'oreille, amputées d'un bout de queue pour lire leur ADN, sexées et séparées de leur mère à trois ou quatre semaines, 1 090 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans ce projet d'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles retenues passent en accouplement vers six semaines, les autres entrent en expérience à partir de dix semaines. Le porteur affirme que les souris porteuses de la mutation ne développent aucune maladie et ne diffèrent pas des autres, l'élevage servant à alimenter des projets sur les maladies des petits vaisseaux du foie. Celles qui ne portent pas les bonnes modifications de gènes sont tuées dès réception du génotype, les reproductrices deux mois après leur dernière portée, et celles gardées en réserve passé 20 semaines pour les femelles et 30 pour les mâles.
Objectifs
Notre projet est d'étudier le rôle de certaines cellules de défense de l'organisme dans le développement des maladies des petits vaisseaux du foie. Nous allons pour cela utiliser des souris possédant une mutation à l'origine d'une diminution de leurs cellules de défense de l'organisme. Pour ce projet, nous avons tout d'abord besoin d’identifier ces souris (par une bague à l’oreille) et d'étudier l'ADN de ces souris (prélèvement d'un petit bout de leur queue) pour s'assurer de la présence de la mutation qui permet la diminution des cellules de défense avant de pouvoir réaliser des accouplements des souris ou de réaliser des expérimentations.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre l'élevage des lignées de souris nécessaires pour étudier la maladie des petits vaisseaux du foie qui est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Ce projet consiste en l’élevage de souris génétiquement modifiées. Pour s’assurer que les souris ont bien la mutation d’intérêt, nous réaliserons le prélèvement d’un petit bout de queue à 3-4 semaines dans la vie de la souris. Ce geste nécessitera le maintien de l’animal pendant une trentaine de secondes. Ce petit bout de queue permettra d’obtenir l’ADN de la souris et ainsi de s’assurer de la présence de la mutation génétique d’intérêt. Les souris nées des accouplements seront sexées (identification et séparation des mâles et des femelles) et sevrées (séparation d’avec leur mère) à l’âge de 3-4 semaines.
Impact sur les animaux
Lors du prélèvement du petit bout de queue, une contention de courte durée est nécessaire, pouvant entrainer un stress et une légère douleur à la queue, de très courte durée. Un léger saignement est également possible. Les animaux qui ont la mutation d’intérêt ne développent pas spontanément de maladie particulière et ne sont pas différents des animaux non mutés.
Devenir
Les souris produites au cours de ce projet seront soit incluses dans d’autres protocoles expérimentaux, soit utilisées ou stockées pour générer de nouveaux accouplements. Les souris ne présentant pas les bonnes modifications de gènes seront immédiatement euthanasiées. Les souris utilisées pour des accouplements seront euthanasiées lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois. Les souris stockées pour de futurs accouplements seront euthanasiées lorsqu’elles seront âgées de plus de 20 semaines pour les femelles et de plus de 30 semaines pour les mâles (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement).
Remplacement
Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la maladie des petits vaisseaux et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur.
Réduction
Nous adapterons l’élevage au besoin de souris pour réalisation des expériences permettant l’étude de l’effet d’une variation du nombre de cellules de défenses sur le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous connaissons bien l’ensemble de ces lignées de souris génétiquement modifiées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d’abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d’éviter qu’elles soient contaminées par des agents pathogènes. Elles sont maintenues en groupe dans un environnement enrichi (présence de tunnels, coton pour faire des nids et buchettes en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures).
Choix des espèces
Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier le génome, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le sevrage, le sexage, l’identification (mise de la bague à l’oreille) et l’analyse de l’ADN des souris pour rechercher la mutation d’intérêt seront réalisés entre 3 et 4 semaines de vie. Nous choisissons cet âge pour déterminer tôt les souris portant la mutation qui pourront être utilisées pour une mise en accouplement (vers 6 semaines de vie) ou une utilisation dans les expériences prévues à partir de 10 semaines de vie.
Impact d’une exposition alimentaire aux pesticides sur un modèle murin génétiquement prédisposé à la MASLD
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une perte de poids supérieure à 20 % vaut le score maximal sur la grille de suivi et retire la souris de l'expérimentation. 112 souris, dont le récepteur CAR a été rendu non fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées après un prélèvement de sang aux veines porte et cave. Elles mangent pendant soixante semaines une nourriture additionnée de glyphosate ou d'un mélange de boscalid et de lambda-cyhalothrine, subissent une glycémie à jeun tous les deux mois, deux prélèvements de sang à la joue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec sept mesures sur deux heures chacun, un gavage qui peut irriter l'œsophage et 23 heures seules en cage à métabolisme. Le porteur revendique des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde, sur des paramètres que les études toxicologiques réglementaires explorent peu.
Objectifs
La maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) et les maladies chroniques inflammatoires de l’intestin (MICI) sont en constante augmentation. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation), l’exposition aux pesticides peut être un facteur de risque au développement de ces pathologies. Des études montrent que le microbiote intestinal est aussi impliqué. Le glyphosate est l’herbicide le plus utilisé dans le monde et on le retrouve dans les aliments. Il agit sur une enzyme présente chez les champignons, les végétaux et certaines bactéries du microbiote intestinal avec comme conséquence un blocage de la synthèse des protéines. L’exposition au glyphosate change la composition du microbiote et modifie l’expression de gènes du foie parmi lesquels le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor). Le boscalid (fongicide) et le λ-cyhalothrine (insecticide) sont également retrouvés dans l’alimentation. Des résultats préliminaires obtenus sur une lignée de cellules de foie montrent qu’un mélange de boscalid et de λ-cyhalothrine agit sur le récepteur CAR. Par ailleurs, ce récepteur CAR est impliqué dans le développement des MASLD, associées à des perturbations du microbiote intestinal et à une inflammation intestinale. Dans ce projet nous voulons tester l’hypothèse que ces pesticides seuls ou en mélange, dans un contexte où les capacités de détoxification de l’organisme sont altérées via l’inactivation du récepteur CAR, favorisent le développement de la MASLD et des MICI. Nous étudierons donc l’impact d’une exposition alimentaire chronique au glyphosate et à un mélange boscalid/ lambda-cyhalothrine en utilisant des souris mâles et femelles dont le gène CAR a été inactivé.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire au glyphosate et à un mélange de pesticides dans un contexte de prédisposition génétique à la maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et à l’inflammation intestinale. Le projet fournira des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde mais également sur l’effet d’un mélange de pesticides retrouvés dans l’alimentation. Il permettra d’étudier aussi certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal et l'inflammation intestinale.
Procédures
Ces souris seront nourries pendant 60 semaines (14 mois) avec un régime standard, et exposées via l’alimentation au glyphosate ou au mélange du Boscalid/Lambda-Cyhalothrine à des doses toxicologiques de référence (dose journalière admissible ou dose sans effet nocif observable). Tous les 2 mois, la glycémie à jeun sera réalisée par dosage du glucose dans une goutte de sang prélevée à la veine de la queue, ainsi qu’un dosage de lipocaline (marqueur de l’inflammation intestinale) en récupérant les fécès des animaux. Durant les 60 semaines, du sang sera prélevé à la joue (maximum 100 μl/prélèvement), à deux moments, afin de doser des marqueurs de dommages hépatiques. Les souris subiront également : - un test de tolérance au glucose, qui sera administré par gavage (moins d'1 minute par animal) et à la suite duquel la glycémie sera mesurée à intervalle régulier sur 2h (7 fois) comme décrit précédemment. - un test de tolérance à l’insuline par une injection intrapéritonéale avec une seringue adaptée (insuline), suivi d’une mesure de glycémie à intervalle régulier sur 2h (7fois), comme décrit précédemment. - un test de perméabilité intestinale qui nécessitera un gavage oral avec une sonde de gavage adaptée (moins d'1 minute par animal), suivi de deux prélèvement d’1 goutte de sang (10µl) à la queue - enfin, afin de récupérer les urines et fèces, les animaux seront placés en cages à métabolisme 1 fois au cours de l’expérimentation durant 23 h maximum. Selon les résultats obtenus, les animaux recevront un régime enrichi en gras et en sucre (Western Diet) pendant les 8 dernières semaines ou seront exposés au Dextran Sulfate Sodium dans l’eau de boisson destiné à provoquer une inflammation intestinale. A la fin de l’essai, un prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale sera réalisé.
Impact sur les animaux
Le prélèvement sanguin à la veine maxillaire et le gavage oral de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, une douleur possible au point d’injection. De plus, le prélèvement à la joue peut induire un épanchement au niveau de la joue chez les individus et le gavage oral au glucose peut induire une irritation de l’œsophage. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. Le challenge au Dextran Sulfate Sodium, visant à provoquer une inflammation intestinale de faible intensité pourrait entraîner une baisse de poids et une colite plus importante chez les animaux exposés aux pesticides comparés aux animaux contrôles. Le régime Western Diet induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité : intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation suite aux prélèvements de sang à la veine porte et cave (entrée et sortie du sang dans le foie), et différents organes seront récupérés pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies métaboliques impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur nos résultats préliminaires. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 12.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages de 4 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 4 aspects de l'état de l'animal : (i) variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; (ii) apparence physique externe ; (iii) changement dans les comportements non provoqués et (iv) réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacun de ces aspects indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 ou plus après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint, l'animal sera retiré de l'expérimentation. Par exemple, une perte de poids supérieure à 20% entrainera un score de 3 pour cet aspect de l’état de l’animal, et constituera un critère d’arrêt. Ce score sera calculé sur chaque animal, de façon hebdomadaire. Lors du séjour en cage à métabolisme, les animaux bénéficieront d'un abri inox et les contacst olfactif et visuel avec leurs congénères seront maintenus.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la toxicité des pesticides grâce à un modèle murin dont le gène CAR est non fonctionnel. Ce modèle existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines (au sevrage). En effet, c’est au moment du sevrage que le microbiote intestinal de l’animal se met en place avec le changement d’alimentation. Les animaux recevront donc les régimes expérimentaux dès le sevrage et jusqu’à l’âge de 64 semaines. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme des différences entre sexes dans le développement des maladies hépatiques mais également dans l'expression du récepteur CAR.
Circuits neuronaux des biais émotionnels dans un modèle murin de dépression.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Chirurgie du cerveau sous anesthésie générale jusqu'à deux heures, deux interventions possibles par animal, implants portés jusqu'à deux mois, dix tests comportementaux à raison d'un par jour : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un phénotype qu'il qualifie de dit-dépressif et annonce une détresse "induite et attendue", tout en écrivant que les procédures du projet sont "relativement bien tolérées par les animaux". Les dix tests comportementaux ne sont pas nommés, alors qu'ils servent à mesurer l'approche et l'évitement de stimuli plaisants ou déplaisants. Toutes seront tuées, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que des études histologiques sur leurs tissus sont prévues.
Objectifs
La dépression représente une cause majeure d’incapacité à l’échelle mondiale, affectant environ 300 millions de personnes dont 50% davantage de femmes. Or, la physiopathologie des troubles dépressifs est encore assez méconnue, tout comme les mécanismes par lesquels agissent les traitements antidépresseurs existants, dont l’efficacité est d’ailleurs limitée puisqu’environ un tiers des patients ne répondent pas aux thérapies classiques et plusieurs semaines sont nécessaires pour pouvoir observer ces effets. En outre, la dépression est accompagnée d’altérations sensorielles : les patients dépressifs percevraient les stimuli sensoriels comme étant moins plaisants, ou davantage déplaisants que des sujets sains. On parle ainsi d’un biais de valence négatif, qui est cependant peu considéré dans les critères diagnostiques. Or, ces biais émotionnels sont particulièrement intéressants à étudier d’un point de vue translationnel. D’une part, la réponse émotionnelle est assez facilement mesurable chez la souris, notamment à travers le comportement d’approche (stimuli plaisants) ou d’évitement (stimuli déplaisants), contrairement à d’autres symptômes plus classiques de la dépression comme l’humeur dépressive ou les idées suicidaires qui sont difficilement évaluables chez l’animal. D’autre part, ces biais perceptifs seraient rapidement restaurés après l’administration d’un traitement antidépresseur, c’est pourquoi la prise en compte de la réponse émotionnelle en clinique pourrait permettre de déterminer beaucoup plus rapidement si un patient répond efficacement ou non à la thérapie proposée et donc améliorer la prise en charge thérapeutique. Puisque l’amygdale basolatérale est une région du cerveau jouant un rôle majeur dans la régulation émotionnelle et l’attribution de la valence, et que l’activité de certaines voies neuronales de l’amygdale basolatérale serait modifiée dans des modèles de dépression, l’objectif de ce projet est ainsi (1) d’étudier la réponse émotionnelle dans des modèles de dépression de souris mâles et femelles en nous concentrant sur des stimuli olfactifs, (2) de comprendre quels circuits neuronaux sont impliqués dans ces biais émotionnels, et enfin (3) de chercher comment des traitements antidépresseurs à la fois classiques et innovants modulent l’état émotionnel ainsi que la réponse neuronale associée dans notre modèle murin de dépression.
Bénéfices attendus
En cherchant à comprendre quels sont les mécanismes sous-jacents au biais émotionnel négatif associé à un état dit-dépressif à l’échelle des circuits neuronaux, cette étude permettra d’améliorer notre connaissance et notre compréhension de la physiopathologie de la dépression. De plus, les diagnostics en psychiatrie reposent actuellement sur une approche catégorielle qui consiste à classer les patients selon la présence ou l’absence d’un certain nombre de symptômes discrets. Cependant, cette approche fait face à un nombre grandissant de limitations. En réponse à ces critiques, l’approche RDoC (Research Domain Criteria) propose de changer de paradigme diagnostique pour se fonder sur un continuum de symptômes et de biomarqueurs. De façon notable, les systèmes de valence positive et négative constituent deux des six domaines fonctionnels majeurs d’intérêt relevés par cette approche. Ainsi, en s’inscrivant dans cette approche alternative, notre étude des biais émotionnels négatifs dans une perspective translationnelle chez la souris pourrait non seulement permettre d’élucider de façon fondamentale certains mécanismes physiopathologiques de la maladie (bénéfices à court terme du projet), mais également d’ouvrir la voie au développement de nouveaux outils diagnostiques et de détection de réponse aux traitements antidépresseurs (bénéfices à long terme du projet). En particulier, la restauration de la réponse émotionnelle par un antidépresseur serait obtenue de façon très précoce après administration du traitement, bien avant des effets sur l’amélioration de l’humeur, c’est pourquoi ces biais sont particulièrement intéressants à étudier et pourquoi une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents serait cruciale d’un point de vue thérapeutique. Enfin, la dépression est une maladie qui touche 50% davantage de femmes que d’hommes. Toutefois, les mécanismes neuronaux à l’origine de cette différence sont encore largement méconnus. Ainsi, en comparant systématiquement des souris mâles et femelles tout au long de notre étude, nous pourrons également mettre en lumière l’existence ou non de mécanismes spécifiques au sexe à la fois dans l’installation du phénotype dit-dépressif et du biais de valence négatif, mais aussi dans l’efficacité de la réponse à un traitement antidépresseur.
Procédures
Dans ce projet, les souris pourront être soumises à différents types d’interventions : - Induction d’un phénotype dit-dépressif. Chaque souris ne pourra subir qu’une seule fois un des modèles de dépression. - Tests de comportement non-invasifs pour tester le phénotype dit-dépressif. Les souris devront réaliser au maximum 10 tests comportementaux différents (1 test/jour). - Administration chronique d’un antidépresseur (3 semaines), par voie orale ou par injection intrapéritonéale (1 injection tous les 3 jours) - Procédures chirurgicales sur le cerveau sous anesthésie générale. Ces interventions ne durent pas plus de deux heures par souris et chaque souris sera soumise à un maximum de deux interventions séparées par un minimum de 30 jours. - Ponction sanguine (environ 1 min par souris). Chaque animal subira un maximum de deux prélèvements sanguins, séparés au minimum de quatre semaines.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : 1) détresse induit et attendu pour les modèles de dépression. Cependant, notre stratégie expérimentale par rapport a des travaux précédents (durée réduite à 4 semaines de traitement, hébergement groupé) est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux et en réduisant la détresse et l’inconfort de l’animal. 2) les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort de courte durée (2-3 jours) liés à la chirurgie. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies. Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les souris. 3) La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (durée maximale de l’expérience : deux mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans le phénotype dit-dépressif et les biais émotionnels. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal non-nécessaire à l’induction du modèle expérimental de dépression.
Réduction
L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour comparer les groupes. De plus, nous nous attacherons à décrire au mieux le phénotype des animaux utilisés à l’aide d’une grande batterie de mesures comportementales et physiologiques. Cela nous permettra de réduire la variabilité intra-individuelle de chacun des tests, et ainsi de nécessiter d’un moins grand nombre d’individus pour évaluer l’effet de nos modèles et des traitements. Enfin, lorsque cela s’y prête, nous aurons recours à une étude longitudinale de l’état phénotypique et de la réponse neuronale des individus, ce qui nous permettra également d’augmenter notre puissance statistique et d’avoir besoin de moins d’animaux par groupe.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis et mis en place. Selon les signes cliniques présentés par les animaux, nous pourrons notamment avec recours à : - un complément alimentaire hautement calorique (gel hydrique) - chauffage des cages - réhydratation sous cutanée - renforcement d’enrichissement des cages De plus, la durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats des tests comportementaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle animal est justifié par le fait que les circuits impliqués dans l’attribution de valence aux stimuli sensoriels sont très bien conservés entre l’homme et les rongeurs. Par conséquent notre travail permet de délimiter de nouvelles approches pour le diagnostic et les thérapeutiques des troubles de l’humeur chez l’homme tout en travaillant sur une espèce mammifère mais phylogénétiquement éloignée de l’homme. De plus, en dehors de l’induction du phénotype dit-dépressif souhaité pour l’étude, le type de procédures effectuées dans ce projet sont relativement bien tolérées par les animaux et des traitements anesthésiques et antidouleurs très efficaces existent pour cette espèce et seront appliqués pour ce projet. Nous utiliserons tout au long du projet des jeunes souris adultes, âgées de 8 semaines, car nous étudions des modèles de dépression chez le sujet adulte.
Modulation par l’exercice des effets vasculaire du diabète ou d’une stimulation spécifique de la O-GlcNAcylation
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tous tués à l'issue pour prélever leur aorte et d'autres tissus, 270 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils courent sur un tapis motorisé quarante-cinq minutes par séance, une fois pour le protocole aigu, cinq fois par semaine pendant cinq semaines pour le protocole chronique, et reçoivent une à cinq injections dans le ventre. Le porteur mentionne des lésions aux pattes liées à la course, qu'il dit peu fréquentes et concentrées sur la phase d'apprentissage, ainsi qu'une augmentation de la fréquence des urines liée à la hausse du sucre dans le sang. Des expériences sur cellules portent déjà sur les mêmes mécanismes vasculaires, mais le porteur conclut que l'évaluation de l'effet de l'exercice rend l'expérimentation animale "nécessaire".
Objectifs
Ce projet vise à investiguer l'influence de l'exercice sur les mécanismes de régulation au niveau des vaisseaux dans un contexte d'augmentation du taux de sucre dans le sang. Un postulat de ce travail est que cette hausse du sucre dans le sang, telle qu’observer dans le cadre du diabète, perturbe l'équilibre entre différentes mécanismes favorisant ainsi une altération de la fonction des vaisseaux. L’objectif principal sera de déterminer si l’exercice, via une action directe sur ces mécanismes permet de contrer les effets néfastes de l’augmentation du sucre dans le sang. Pour cela nous étudierons donc les effets de l’exercice aigu (réalisé une seule fois) ou chronique (réalisé plusieurs fois) dans des modèles ne présentant pas de pathologies mais soumis à une augmentation du sucre dan sle sang ou induisant une hausse de certains mécanismes spécifiques ou dans un modèle pathologique de type diabétique.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche s'avère crucial pour comprendre comment l'exercice, à la fois aigu et chronique, peut influencer les mécanismes régulant la fonction des vaisseaux sanguins, particulièrement sous l'effet de l'augmentation du sucre dans le sang, souvent rencontrée dans le diabète. Ce projet est d'autant plus pertinent qu'il explore ces effets dans différents contextes, y compris des modèles sans pathologies mais exposés à une augmentation du sucre dans le sang, ainsi que dans un modèle pathologique de diabète. Les implications de cette recherche sont significatives, offrant des perspectives pour de nouvelles stratégies thérapeutiques en vue de traiter les troubles vasculaires liés au diabète et d'améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à de l'exercice sur tapis (1 exercice unique pour les animaux du protocole aigu et 5 fois par semaine pendant 5 semaines pour les animaux du groupe chronique) de course ainsi qu' à une ou plusieurs injections (1 injection intrapéritonéale durant approximativement 3 secondes pour une partie des animaux et 5 injections intrapéritonéales durant approximativement 3 secondes/injection pour l'autre partie). Concernant l'exercice, chaque session durera 45 minutes et se déroulera sur un tapis motorisé adapté aux animaux.
Impact sur les animaux
Les injections intra-péritonéales peuvent entraîner des douleurs faibles au site d'injection. L'augmentation de la glycémie peut entraîner une augmentation de la fréquence des urines. La course sur tapis peut engendrer des légères lésions aux pattes des animaux, néanmoins ces dernières restent peu fréquentes et arrivent généralement en début de protocole pendant la phase d'apprentissage. Pour éviter ce problème une phase d'apprentissage avec augmentation progressive de la vitesse de course est systématiquement prévue.
Devenir
Le prélèvement des tissus pour les différentes analyses nécessite la mise à mort de 270 rats à l'issu de la procédure.
Remplacement
Des expérimentations sur cellules sont actuellement conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des vaisseaux. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet de l’exercice nécessite l’utilisation de modèle animaux vivants afin d’évaluer l’influence de ces différentes conditions. L’intégration d’expérimentations animales apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes. Pour la partie réactivité vasculaire, plusieurs morceaux d'aorte sont récupérés sur chaque animaux ce qui permet d'augmenter notre nombre de mesure et ainsi de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à n’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale (injections et exercice physique), les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue.
Choix des espèces
Le rat est un modèle pertinent pour l’étude du système cardiovasculaire. En effet, la description anatomique de cette espèce réalisée par le passé a pu démontrer une similitude forte notamment au niveau du coeur et des vaisseaux. De plus son utilisation permet d’obtenir des quantités de tissu suffisantes pour la réalisation de plusieurs dosages biochimiques permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux nécessaires. En effet, l'aorte du rat permet de récupérer une quantité importante qui permet de réaliser plusieurs expérimentations sur organes isolés mais aussi une plus grande quantité de tissu pour les analyses biochimiques ce qui permet d'utiliser un nombre minimal d'animaux. Les animaux seront des animaux de quelques semaines pour éviter de confondre les effets de l'exercice et des traitements avec ceux de la maturation et du vieillissement).
Etude du rôle des lymphocytes T gamma delta dans la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour établir chez la souris ce que des études humaines ne font que suggérer, le rôle protecteur de certains lymphocytes T contre le cytomégalovirus, 568 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées en fin d'expérience pour récupérer leurs lymphocytes. Elles reçoivent une à quatre infections virales dans le péritoine à raison d'une par semaine, certaines une injection de lymphocytes par voie intraveineuse, d'autres des anticorps, et cinq prélèvements de sang hebdomadaires sur 42 jours. Le porteur indique qu'après dix jours d'infection les souris peuvent présenter piloérection, dos arrondi, perte de poids et isolement, et qu'avec des souris immunodéficientes les points limites sont fixés de manière à ne pas laisser s'exprimer le caractère délétère de la mutation.
Objectifs
Notre projet a pour but une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre un herpès virus nommé Cytomégalovirus (CMV). Nous nous intéressons plus particulièrement au rôle de cellules immunitaires particulières ( lymphocytes T) dans ce contexte. Il comprend une étude chez la souris pour répondre à des questions innaccessibles chez l'Homme. L'étude chez la souris permet d'établir la preuve de l'implication de cellules ou facteurs immunitaires dans la protection antivirale en modélisant une thérapie cellulaire. le modèle murin d'infection par le MCMV est utilisé depuis 20 ans par notre équipe et bien maîtrisé.
Bénéfices attendus
L'objectif final est une prise en charge plus efficace des patients à risque (immunodéprimés), en évitant notamment l'utilisation de traitements anti-viraux à effets secondaires.
Procédures
Les animaux vigiles sont soumis à une ou 4 infections virales (1/semaine) en intrapéritonéal sur une durée de un mois. Un deuxième lot de souris sont anesthésiées et soumises à une injection intraveineuse de lymphocytes à J0. Le lendement les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de virus. Les souris sont soumises à des prélèvements de sang une fois par semaine sous anesthésie courte pendant 42j (5 prélèvements). Un 3ème lot de souris reçoit deux injections intrapéritonéales (une de virus et une d'anticorps) à 24h ou 7 jours d'intervalle pendant 3 semaines.
Impact sur les animaux
Après 10 jours suite à l'infection à CMV, les souris peuvent montrer des signes de souffrance classique tels que la piloérection, le dos arrondi, perte de poids et isolement s'accompagnant d'une augmentation des transaminases hépatiques et de la charge virale.
Devenir
Les animaux sont tous infectés par du cytomégalovirus et sont donc mis à mort en fin d'expérience. Cette mise à mort est nécessaire pour récupérer les lymphocytes.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet. Le modèle murin de l'infection à CMV est largement utilisé car il récapitule ce qui est observé chez l'homme. L'utilisation de souris immunodéficientes permet de se rapprocher du contexte d'immunosuppression thérapeutique appliquée aux receveurs de greffes, et de tester l'impact d'une thérapie cellulaire par transfert adoptif. L'utilisation de souris et/ou l'injection d'anticorps permettent de conclure sur l'importance des facteurs étudiés dans la protection. Ces conclusions ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo qui ne permettent pas de modéliser la complexité d’un organisme pour l’étude du système immunitaire .
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé pour obtenir des résultats statistiques interprétables et les expériences seront répétées à deux reprises. Par souci de réduction nous utilisons dans nos expériences aussi bien des souris mâles que des souris femelles.
Raffinement
1.Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Du fait de l'utilisation de souris immunodéficientes, les points limites sont adaptés de manière à ne pas laisser s'exprimer le caractère délétère. Les conditions d'hébergement permettent d'éviter les contaminations par des pathogènes opportunistes (portoirs ventilés, filtration entré et sortie) Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: les prises de sang sous mandibulaires, les injections intraveineuses et sous-cutanées sont réalisées sur des animaux anesthésiés afin de réduire inconfort et douleur.
Choix des espèces
Le modèle d'infection par le CMV chez la souris est très bien étudié. Nous utilisons des souris adultes, entre 8 et 12 semaines d'age. Les CMV murins et humains ont un même tropisme et la réponse immunitaire anti-CMV chez la souris est très proche de celle de l'Homme. Cependant le suivi de cette réponse chez les patients ne donne qu'une réponse partielle puisqu'il ne peut se faire qu'au niveau du compartiment sanguin. L'étude chez la souris permet une étude spatio-temporelle de la dissémination du virus et de la réponse immunitaire. Le rôle protecteur des cellules/facteurs que nous étudions est suggéré chez l'homme par des études corrélatives mais impossible à prouver. Le transfert adoptif de sous-populations de cellules immunitaires chez des souris immunodéficientes est le seul moyen de tester leur caractère protecteur. L'utilisation de souris invalidées pour un facteur mis en évidence en amont par des études in vitro chez l'Homme est indispensable pour étudier l'importance de ce facteur dans la protection. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro.
Evaluation de nouveaux candidats médicaments sur l’addiction et la pharmacodépendance
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1410
Cathéter veineux posé sous anesthésie jusqu'à une heure, deux injections par jour pendant environ un mois, séances de conditionnement de vingt minutes à deux heures par jour pendant jusqu'à quatre mois : 2 510 souris et rats vont être utilisés pour tester des candidats médicaments contre l'addiction. 1 910 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 600 d'un niveau léger, et 120 pourront être réutilisés après accord du vétérinaire, les autres étant tués lors d'un prélèvement terminal de sang ou de cerveau. Les tests comportementaux sont nommés, visites de compartiments et appuis sur leviers, et les animaux non-humains y sont rationnés en nourriture. Le porteur décrit les symptômes de sevrage attendus, hypothermie, tremblements, baisse d'activité, perte d'appétit pendant environ sept jours, et qualifie la restriction alimentaire de légère au motif qu'elle n'empêche pas la croissance pondérale.
Objectifs
La pharmacodépendance (dépendance aux substances psychoactives) représente une préoccupation majeure de santé publique. La plupart du temps, les drogues provoquent dans un premier temps des sensations de plaisir qui induisent un désir de renouveler l’expérience et conduisent certains sujets à ne plus pouvoir contrôler leur consommation. La pharmacodépendance réfère à un comportement pathologique de consommation, ayant des conséquences physiologiques, psychologiques et/ou sociales néfastes pour la personne et son entourage. La pharmacodépendance représente un problème majeur de Santé publique également de par le nombre très élevé de patients atteints ; à titre indicatif, selon les chiffres de 2022 publiés par l'Observatoire français des drogues et des tendances addictives (OFDT), 25,5% des adultes fument tous les jours et 10% boivent quotidiennement de l’alcool. Toujours selon l'OFDT, concernant les médicaments psychotropes (anxiolytiques, antidépresseurs, hypnotiques), 21% de la population de plus de 15 ans a bénéficié d'un remboursement de psychotrope au moins une fois dans l'année en 2017 en France ; or, ces médicaments peuvent être associés à un risque de mésusage ou d'abus. Enfin, les drogues illégales sont également expérimentées ou consommées de manière abusive par des millions de personnes en France. Or, les conduites addictives ont de multiples conséquences sanitaires et sociales (maladies, handicaps, suicides, violence, isolement, précarité...) et entraînent une mortalité évitable. Tout ceci souligne l'importance, outre les campagnes de prévention, de développer des traitements permettant de réduire la dépendance aux drogues (licites, illicites ou médicamenteuses) ainsi que les symptômes liés à l'arrêt de leur consommation (sevrage). L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité anti abus/dependance de candidats médicaments dans des modèles mimant l'abus, la dépendance, ou le sevrage de drogues.
Bénéfices attendus
La prise en charge de la pharmacodépendance repose généralement sur l’association d’un traitement médicamenteux, d’un suivi psychologique et d’un accompagnement social, mais il n'existe actuellement pas de traitement efficcae à 100% contre les problématiques liées à l'addiction ou au sevrage de drogues. Les procédures décrites dans ce projet permettent d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans des modèles mimant l'abus, la dépendance, ou le sevrage de drogues. Ces traitements seront évalués contre la dépendance induite par différentes drogues, en fonction de leurs spécificités et objectifs cliniques (par exemple contre la morphine ou le remifentanyl pour évaluer l'effet d'un traitement potentiel contre l'addiction aux opiacés/opioïdes, ou contre la nicotine pour évaluer l'effet de traitement anti-tabagisme...).
Procédures
Les substances à évaluer, les contrôles positifs et les contrôles négatifs sont administrées par bolus (environ 1 seconde) ou infusion intraveineuse d’une durée de quelques secondes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou semaines (minimum 1 injection à maximum 2 injections par jour pendant environ 1 mois), selon le traitement étudié. Les procédures peuvent également nécessiter une ’implantation sur animal vigile ou sous anesthésie (durée de quelques secondes à quelques minutes selon le site d’implantation) et/ou la pose d’un cathéter veineux ou d'un dispositif pour infusion lente sous anesthésie (durée maximum d'1 heure). Par ailleurs, des prélèvements de sang (durée de quelques secondes à 3 minutes) pourront être réalisés selon une fréquence déterminée dans la limite des considérations éthiques (de manière standard, un prélèvement par jour et pas plus de 10% du volume sanguin au cours de l’étude). Les phases de test comportemental surviennent le plus souvent quotidiennement durant toute la durée de la procédure et peuvent consister en une simple observation de l'animal sans manipulation ou en des phases de conditionnement et de tests (visites de compartiments ou appuis sur leviers) dans des dispositifs spécifiques (minimum de 20 minutes par jour pendant 10 jours à maximum 2 heures par jour pendant environ 4 mois, selon la procédure). De plus, pour certaines procédures, les animaux sont rationnés en nourriture pendant toute la durée de l’expérience soit environ 4 mois.
Impact sur les animaux
Les administrations, les phases chirurgicales (implantation sur animal vigile ou sous anesthésie) ou les prélèvements sanguins peuvent entrainer un stress ou une douleur légère. Dans le test de sevrage, l'animal peut ressentir des symptômes associés au sevrage pharmacologique (tels que l’hypothermie, des tremblements, une diminution de l’activité locomotrice, une perte d’appétit, etc…). Ces symptômes apparaissent généralement dans les 24 heures suivants l’arrêt du traitement et peuvent persister pendant toute la durée suivant la phase d'administration (en général 7 jours). Dans les autres tests, les animaux sont placés dans des dispositifs spécifiques (boites de conditionnement) pour une durée de 10-20 minutes à 2 heures, ce qui peut induire un stress lors de la première exposition du fait de la nouveauté de l'environnement (auquel les animaux s'habituent rapidement). Dans les procédures de conditionnement opérant, les animaux sont soumis à une légère restriction alimentaire qui peut augmenter la sensation de faim, mais n'empêche pas leur croissance pondérale.
Devenir
Pour les procédures légères et modérées, les animaux peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire. Les animaux soumis à un prélèvement terminal seront ethanasiés car le prélèvement d'une grande quantité de sang ou d'organes vitaux (tel que le cerveau) affecte le maintien en vie dans de bonnes conditions.
Remplacement
Ces tests ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils nécessitent l'étude de traitements expérimentaux dans un système complexe (interaction avec et entre les différents organes et systèmes physiologiques, que ce soit dans la phase de consommation ou de sevrage de drogues) et permettent l’étude des potentiels effets secondaires. Cependant, il existe des tests in vitro et in silico permettant de sélectionner en amont des molécules efficaces et dont la toxicité n’est pas avérée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites spécifiques aux procédures et clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pour toute procédure nécessitant une phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. En cas de prélèvements de sang, une anesthésie légère sera appliquée afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Aujourd'hui encore, Les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer l'efficacité des nouveaux candidats médicaments sur l'addiction et la pharmacodépendance. En effet, les rongeurs présentent des mécanismes neurobiologiques similaires à ceux rencontrés chez l'Homme, et il a été démontré leur capacité à s'auto-administrer plusieurs drogues de classes différentes, parfois jusqu'à cumuler les 3 principaux critères diagnostiques du Manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux (DSM) symptomatiques d'une recherche compulsive et d'une perte de contrôle sur la prise de drogue. Principalement rongeurs (rats, souris) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historique et à la littérature scientifique. Ceci afin d'étudier les traitements potentiels aussi bien chez le jeune que chez l'adulte.
Évaluation de l’efficacité de la buprénorphine par administration orale guidée par micropipette chez des souris C57BL/6 et des souris Balb/c : étude comparative de la pharmacocinétique par rapport à la technique d’administration par voie sous cutanée
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
132 souris BALB/c et C57BL/6 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour comparer deux façons d'administrer un analgésique. La moitié reçoit la buprénorphine en injection sous la peau, l'autre à la micropipette par la bouche, avec neuf microprélèvements de sang, quatre administrations et trois anesthésies à l'isoflurane. Le porteur présente la voie orale comme un progrès pour le bien-être des souris de laboratoire, susceptible de devenir une technique de référence, ce qui suppose d'en passer par ces 132 souris. 68 pourront être réutilisées si le microprélèvement suffit aux dosages, les autres seront tuées, les volumes de sang nécessaires étant alors incompatibles avec leur maintien en vie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de l’administration orale de buprénorphine, un analgésique (médicament utilisé pour diminuer la douleur) classiquement utilisé chez les animaux de laboratoire chez des souris par rapport à la voie sous-cutanée classiquement utilisée dans nos laboratoires, afin de réduire le stress associé aux injections sous-cutanées et de prolonger la durée d’analgésie par cette voie alternative d’administration. L’hypothèse, basée sur des études chez le rat, permettrait à cette voie d’administration d’offrir des concentrations dans le sang plus efficaces de buprénorphine par rapport à la voie sous-cutanée avec une réduction des manipulations. Des médias comme le Nutella® ou des gels médicamenteux ont également été testés pour l’ingestion volontaire de buprénorphine chez la souris, évitant le stress du gavage mais demandant de l’entrainement et l’isolement des animaux pendant la durée d’administration. Cette étude vise donc à tester des véhicules ne perturbant pas le métabolisme et d’utiliser l’administration guidée par micropipette afin de ne pas isoler les animaux pour leur faire ingérer la buprénorphine, de travailler en coopération avec eux et d'avoir une quantité fiable et définie de buprénorphine administrée. Des prélèvements sanguins réguliers seront effectués pendant les 6 premières heures, puis à 12 h et 24 h, voire 36h et 48h pour tracer un profil de distribution sanguine de la buprénorphine qui nous permettra de savoir si la buprénorphine est suffisament présente dans le sang des souris pour apporter un effet analgésique optimal. Ce projet vise donc à optimiser la délivrance de l’analgésie tout en minimisant les manipulations invasives et en améliorant le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Un premier bénéfice attendu sera d'évaluer l'efficacité d'une méthode d'administration orale de buprénorphine via micropipette guidée (MDA) chez les souris BALB/c et C57BL/6. Cette approche non invasive offre une alternative aux injections sous-cutanées, connues pour provoquer du stress chez l’animal et pour avoir une durée d’efficacité assez brève dans cette espèce. L'habituation des souris à cette méthode permettra de valider la faisabilité et la reproductibilité de l'administration orale pour obtenir une analgésie efficace sur une période plus longue (au-delà des 4 à 6 heures actuellement observées avec les injections répétées en SC). La mise en place de prélèvements sanguins permettra de tracer un profil pharmacocinétique complet, validant ainsi les concentrations sériques optimales et efficaces telles que décrites dans la littérature. Ces données permettront d'ajuster les doses administrées et de prolonger l'effet analgésique. À plus long terme, les résultats de ce projet pourraient avoir des retombées significatives sur les pratiques courantes en recherche animale. La méthode d'administration MDA pourrait devenir une technique de référence, non seulement pour la buprénorphine, mais aussi pour d'autres analgésiques ou médicaments administrés de manière répétée par voie orale. Une technique d'administration fiable et efficace, permettant un effet prolongé sans nécessiter de manipulations fréquentes, améliorerait considérablement le bien-être des animaux, réduisant ainsi les biais expérimentaux associés au stress. En conclusion, ce projet a pour objectif immédiat d’améliorer l'administration d'analgésiques chez les souris, et à long terme, de fournir une méthode fiable et éthique d'administration non invasive, applicable à la recherche biomédicale et à la gestion de la douleur animale. Ces avancées bénéficieront aux scientifiques, aux animaux de laboratoire et à l’ensemble du domaine de la recherche, garantissant des conditions plus respectueuses du bien-être animal et des résultats plus fiables.
Procédures
Stress et douleur légères dûs à l'Injection sous-cutanée (15 secondes ; 1 fois) pour la moitié des animaux; Stress léger dû à l'administration médiée par micropipette (30 secondes ; 4 fois) pour la moitié des animaux; Stress et douleur légères dûs aux microprélèvements de sang (30 secondes ; 9 fois) pour la moitié des animaux; Stress léger dû à l'anesthésie générale à l'isoflurane (1 minutes ; 3 fois) pour la moitié des animaux
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sur les souris BALB/c et C57BL/6 peuvent être anticipés. Ces effets sont principalement liés à la procédure de l'anesthésie, aux prélèvements sanguins réguliers, et à la manipulation des animaux pour les diverses procédures expérimentales. L'anesthésie, nécessaire pour certains prélèvements sanguins est une source de stress pour les souris. Cependant, cette période de stress sera limitée à la durée de l'anesthésie et les souris devraient retrouver un comportement normal peu après leur réveil, généralement en quelques minutes. Les prélèvements sanguins par ponction de la veine de la queue, peuvent entraîner une douleur légère au site de ponction, ainsi qu'une gêne temporaire limitée étant donné l’utilisation d’un analgésique local. La douleur et la gêne devraient disparaître rapidement après l'intervention, et aucune conséquence à long terme n'est attendue. Même si l'administration de buprénorphine est réalisée par voie orale, limitant ainsi les injections stressantes, les manipulations nécessaires pour l'habituation à la méthode de micropipette (MDA) et les prélèvements peuvent générer du stress. Afin de minimiser ce stress, les manipulations seront réalisées avec précaution, en suivant des protocoles établis pour réduire au maximum l'impact sur les animaux. La durée des effets de stress devrait être limitée à la période de manipulation, avec un retour à un comportement normal dans les minutes qui suivent.
Devenir
En cas d'utilisation du microsampling pour le suivi de la buprénorphine dans le sang des souris, tous les animaux pourront être réutilisés. Si la technique du microsampling n'est pas utilisable car les volumes de sang obtenus seraient insuffisants pour effectuer les dosages, les souris seraient mises à mort à la fin de la procédure car les volumes de sang ne seraient pas compatibles avec leur maientien en vie. cette décision a été prise dans le but d'utiliser moins d'animaux. Dans ce cas, seuls les animaux utilisés dans la procédure de mise au point du dosage de la buprénorphine pourront être réutilisés, soit 4 animaux.
Remplacement
Les souris ne peuvent être remplacées dans ce projet, car l’objectif est de déterminer l’efficacité de l’administration orale de buprénorphine spécifiquement chez ces deux souches. Aucune méthode alternative in vitro ou sur un autre modèle animal ne permettrait de fournir des données équivalentes pour ces deux souches largement utilisées en recherche biomédicale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire, en se basant sur les recommandations issues de la littérature scientifique. Le calcul du nombre d'animaux tiendra compte de la variabilité génétique entre mâles et femelles, afin de permettre une analyse statistique tout en limitant l’utilisation excessive d'animaux. Le n a été calculé en se basant sur la littérature, grâce à un logiciel et est de 8 animaux par lot.
Raffinement
Des techniques de raffinement seront appliquées pour réduire la douleur et le stress infligés aux animaux. Le microsampling sera utilisé autant que possible pour minimiser les volumes sanguins prélevés, associé à un analgésique local lors des prélèvements. Cette approche évitera le prélèvement rétro-orbitaire plus invasif. De plus, l’utilisation de la méthode de micropipette guidée (MDA) pour l’administration orale de la buprénorphine limitera le recours au gavage, réduisant ainsi le stress et l'inconfort associés à cette méthode. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 2 animaux minimum dans des cages enrichis et seront visités quotidiennement afin de déceler au plus tôt toute forme de souffrance, de douleur ou d’angoisse si elles devaient apparaître. Enfin des points limites précoces et précis seront mis en place et vérifiés lors des expériences afin d'éviter toute forme de souffrance de douleur ou d'angoisse.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris dans ce projet car elles sont l'espèce la plus couramment utilisée en recherche. Il existe déjà une étude sur l’administration de buprénorphine par gavage oral chez le rat mais rien en ce qui concerne la souris avec la technique de MDA. Ce projet vise donc à combler ce manque de données et à mieux comprendre comment ces traitements fonctionnent spécifiquement chez les souris. De plus, l’utilisation de 2 souches distinctes et de 2 sexes différents permettra de les comparer et de déceler d’éventuelles différences intra spécifiques Les souris utilisées dans ce projet auront 8 semaines, car à cet âge, leur système immunitaire est considéré comme mature. C’est aussi l’âge de début de la plupart des projets de notre laboratoire.