Rongeurs

Le ventre rasé et badigeonné d'un produit allergisant et irritant sur animal vigile, puis les oreilles traitées sous une anesthésie profonde d'environ quarante minutes, 1 470 souris vont être utilisées dans un modèle d'eczéma de contact. 1 380 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 90 d'un niveau léger, et toutes seront tuées pour prélever oreilles, ganglions, rate et sang. S'y ajoutent jusqu'à quinze applications cutanées, des mesures d'oreille cinq fois par semaine sous anesthésie gazeuse, sept injections dans l'abdomen et une injection dans le sinus de l'œil. Le porteur écarte tout anti-inflammatoire, qui perturberait la réponse étudiée, et prévoit de tuer immédiatement les souris qui se grattent trop, sans préciser combien d'entre elles seront gardées jusqu'à six mois après l'induction de l'allergie.

Objectifs

Les eczémas allergiques tels que l’eczéma de contact (colorants, produits chimiques, nickel…) ou l’eczéma atopique (acariens, moisissures, poils de chien/chat…) se caractérisent par des lésions cutanées et sont dues à une réaction allergique. Ces eczémas touchent plus de 15% de la population. La cause des eczémas est complexe et reste mal comprise à ce jour. Ces dernières années, une population de cellules immunitaires (appelées Trm), ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans les tissus a été mise en évidence. Ces cellules particulières patrouillent dans la peau à l’interface entre l’organisme et l’environnement. Il a été montré que ces cellules sont impliquées dans la récidive et la sévérité de l’eczéma. En effet, une des caractéristiques cliniques de l’eczéma est qu’il se développe sous forme de poussées, entrecoupées de périodes de rémission. Lors des poussées, dont la sévérité augmente généralement au cours du temps, les lésions reviennent préférentiellement sur les sites antérieurement atteints. Cette étude vise à mieux comprendre les mécanismes permettant aux Trm de s’établir et de persister à très long terme dans la peau. Deux stratégies seront utilisées pour moduler ces mécanismes dans un modèle d’eczéma de contact allergique : 1. l’application cutanée de molécules modulant le cycle de vie des Trm, 2. l’utilisation de souris portant des Trm génétiquement modifiés. Cette étude vise également à mieux comprendre le devenir des Trm dans l'organisme grâce à l'utilisation de souris portant des Trm fluorescents permettant de les localiser dans l'organisme. Puisqu’il a été montré que les Trm sont impliqués dans la récidive et la sévérité de l’eczéma, nous espérons que mieux connaitre ces cellules nous permettra à terme de développer de nouvelles solutions thérapeutiques permettant de les éliminer et donc de traiter cette pathologie à sa source. En effet, les traitements actuels préconisés dans ces eczémas (notamment les dermocorticoïdes (anti-inflammatoires)), bien que permettant de soulager les symptômes de l’eczéma, ne permettent pas d’empêcher les récidives de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension du cycle de vie des Trm. Il pourra servir en outre de preuve de concept de l’intérêt de cibler les Trm pour traiter l'eczéma ou d'autres maladies inflammatoires chroniques. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes permettant de stopper la récurrence des poussées d’eczémas.

Procédures

Dans la plupart des procédures, les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les mêmes animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie profonde (durée de l'anesthésie : environ 40 minutes), induite après injection d'un produit anesthésiant (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Dans la plupart des procédures, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines. Ces mesures seront effectuées sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes). Dans certaines procédures, les animaux recevront une application cutanée au niveau des oreilles (15 applications maximum - durée de la procédure d'application : 30 secondes), sur une durée maximale de 5 semaines. Ce traitement sera réalisé sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes). Dans certaines procédures, les animaux seront pesés 2 fois (durée de la pesée : 30 secondes). Dans la plupart des procédures, les animaux recevront des injections à l'abdomen (7 injections maximum) . Ce traitement sera réalisé sur animal vigile (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Dans l'une des procédures, les animaux recevront une injection dans le sinus de l'oeil (durée de l'injection : 30 secondes). Cette procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes), après application d'un anesthésiant local (durée de l'application de l'anesthésiant : 30 secondes). Dans cette procédure, les animaux seront également soumis à un prélèvement sanguin (durée du prélevement : 30 secondes), après application d'un anesthésiant local (durée de l'application de l'anesthésiant : 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur au point d’injection lors des injections intra-péritonéales et intraveineuses ; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou l'application d'un produit par voie épicutanée ; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang et les injections intraveineuses ; iv) une légère inflammation au niveau de l'oeil suite à l'injection intra-veineuse ; v) une légère inflammation (pouvant induire un grattage léger) au niveau des oreilles ou du ventre, après application du produit allergisant.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs oreilles, leurs ganglions (et éventuellement leur rate et leur sang). Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire.

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. En effet, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal et recirculent ensuite progressivement dans l'organisme.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe expérimental et 5 animaux par groupe contrôle est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. Par exemple, certaines procédures ne seront réalisées qu'en cas de succès d'autres procédures.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux. Nous attacherons ainsi une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés (anesthésie générale ou locale) pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes et en raison de l’existence d’une grande variété de lignées transgéniques. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie ne sont disponibles que chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de molécules inflammatoires ou l’induction de différentes populations de cellules mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules étudiées dans ce projet sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter nos résultats à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable à notre étude. Idéalement, nous utiliserons des animaux adultes de 6 à 12 semaines: le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature au moment de l’induction de la réponse immunitaire. Toutefois, des animaux d’un âge maximum de 1 an au moment du début des procédures pourront être utilisés (en particulier lorsqu’il s’agit des lignées d’animaux transgéniques), afin d’utiliser au mieux les animaux disponibles. En effet, selon nos expériences antérieures, les cellules étudiées dans ce projet ont un comportement similaire chez des souris d’1 an et chez des animaux plus jeunes. Dans certaines procédures, une partie des animaux seront gardés jusqu’à 6 mois après induction de la réponse allergique.

90 souris femelles vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 60 d'entre elles reçoivent deux injections d'hormones pour produire davantage d'embryons, et 40 seront tuées pour récupérer ces embryons. 30 autres subissent une chirurgie de réimplantation d'une quinzaine de minutes, avec une agrafe dans le dos, puis seront tuées après la naissance des petits, tandis que 20 femelles sans bouchon vaginal repartent en zone d'élevage. Le porteur annonce comme bénéfice une amélioration des conditions d'hébergement des lignées et écrit qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation d'animal" puisque le projet consiste précisément à décontaminer des lignées de souris.

Objectifs

Cette technique de décontamination, permet à des lignées hébergées en animalerie conventionnelle (zone exempt de pathogènes responsables de maladie qui peut se transmettre de l'animal à l'homme ou de l'homme à l'animal) d'être transférées en animalerie protégée EOPS (zone exempte d'organismes pathogènes spécifiques) et donc d'être étudiées au niveau immunitaire sans interférence des stimulis du milieu environnant. Tous les éléments entrant en contact avec les animaux sont ainsi contrôlés: air filtré, nourriture irradiée, eau de boisson filtrée, litière autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes fréquentant l'animalerie. Les lignées ainsi décontaminées sont ensuite récupérées par les chercheurs afin de poursuivre leurs études phénotypiques dans le cadre de leurs projets. La décontamination de lignées se fait par transfert d'embryons et est basée sur le principe que l'embryon est protégé par sa membrane pellucide de tout contaminant présent chez la mère. Les lavages successifs des embryons permettent d'éliminer tout contaminant éventuellement présent autour de l'embryon lors de sa collecte.

Bénéfices attendus

La décontamination de lignées de souris par transfert d'embryons permet de modifier le statut sanitaire des lignées et donc leurs conditions d'hébergement, qui sont ainsi améliorées, sans perdre le génotype des animaux. Des souris hébergées dans des conditions d'animalerie conventionnelle sont exposées en permanence à des stimulations de leur système immunitaire par l'environnement (air, litière, nourriture, eau de boisson, personnes fréquentant l'animalerie). Ces stimulations ont forcément un impact sur les réponses immunitaires des animaux. Les études scientifiques qui portent sur des modèles de souris et qui s'intéressent à l'effet de mutation génétique sur les réponses immunes doivent s'affranchir des stimulations non contrôlées des animaux par leur environnement. La décontamination de ces lignées permet leur hébergement en animalerie protégée dans des conditions extrêmement contrôlées (air filtré, eau de boisson filtrée, nourriture irradiée, litière autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes en contact avec les animaux).

Procédures

Au cours de ce projet, les différents femelles utilisées seront soumises à: - 2 injections intrapéritonéales lors du parcours de superovulation pour les 60 femelles fertiles des lignées à décontaminer - 1 chirurgie de réimplantion d'embryons lors du transfert d'embryon d'une durée de 15 minutes maximum et 3 administrations sous-cutanées sous anesthésie gazeuse pour les 30 femelles pseudo-gestantes.

Impact sur les animaux

La piqûre d'aiguille pour l'injection des hormones aux femelles recevant le protocole de superovulation entraine une douleur légère et de courte durée et un stress physique de courte duré. La piqûre d'aiguille pour l'injection de la buprénorphine aux femelles recevant les embryons entraine une douleur légère et de courte durée et stress physique de courte duré. L'intervention chirurgicale des femelles recevant les embryons entraine un stress physique ainsi qu'une gêne liée à la présence de l'agrafe sur le dos.

Devenir

A la fin de la procédure "Superovulation et prélèvement d'embryon": 20 animaux seront replacés en zone d'élevage (20 femelles des lignées à décontaminer non bouchées). Au cours de ce projet, 70 animaux seront euthanasiés (40 femelles fertiles des lignées à décontaminer seront euthanasiées pour recupérer les embryons + 30 femelles réimplantées aprés naissance des petits)

Remplacement

Ce projet consiste à décontaminer des lignées de souris. Il n'est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animal. La décontamination des lignées intervient dans le contexte de recherches fondamentales visant à comprendre, dans sa globalité et sa complexité, le contrôle de la réponse immune et les lymphoproliférations. Ces études ne peuvent s'effectuer que sur des modèles animaux car les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas pour l'étude des systèmes complexes et multi-localisés tel que le système immunitaire. La décontamination des lignées permet de contrôler l'impact du milieu environnant sur les animaux et limiter les stimulations du système immunitaire car tous les éléments entrant en contact avec les souris sont contrôlées (air filtré, nourriture irradiée, eau de boisson filtrée, litère autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes fréquentant l'animalerie).

Réduction

Les femelles utilisées pour la production d'embryons vont recevoir un traitement hormonal afin d'augmenter le nombre d'embryons récoltés, ceci permet de limiter le nombre de femelles utilisés. Le nombre de 6 femelles par expérimentation de décontamination a été determiné en prenant en compte les expérimentations passées. Ce nombre permet d'avoir un nombre suffisant de femelles bouchées et par conséquent un nombre suffisant d'embryons nous permettant d'avoir des résultats dès la première expérimentation. Les femelles ne présentant pas de bouchon vaginal seront remises dans leur zone d'hebergement afin d'être utilisées pour d'autres expérimentations du laboratoire.

Raffinement

Les animaux bénéficient d'enrichissement dans les cages conformes aux recomandations de la structure bien être de l'établissement. Le personnel est formé à l'expérimentation (manipulation, injection) ainsi qu'à la chirurgie sur le petit animal et maintien ses compétences au cours du temps. Ainsi, toutes les précautions sont prises pour induire un minimum de douleur chez l'animal. La surveillance des animaux en expérimentation est renforcée les jours suivants afin de s'assurer du bien être animal. Un protocole de gestion de la douleur est établi et mis en place dès que le score de douleur établi lors des surveillances quotidiennes le prévoit. Aprés la chirurgie, des croquettes humides sont placés dns la cage afin que l'animal puisse avoir accés à l'eau et à la nourriture le temps de recouvrer une mobilité normal (moins de 24h).

Choix des espèces

L'utilisation des souris est justifiée dans les projets du laboratoire les utilisant et faisant l'objet d'autres demandes d'autorisation de projets. De fait, le présent projet visant à décontaminer des lignées de souris pour les soumettre à un environnement microbien plus strict ne peut se faire que sur l'espèce Mus musculus. Les animaux seront utilisés entre 2 et 12 mois qui correspond, chez la souris, à l'âge correct à optimal de fertilité. De plus, à cet âge, les femelles receveuses d'embryon supportent bien la chirurgie.

Endormies au masque, implantées une fois avec des cellules tumorales sous la peau, dans le péritoine ou dans la bouche, puis attrapées trois fois par semaine pour le suivi, 2 520 souris vont être utilisées dans ce projet sur le microenvironnement immunitaire des tumeurs. Suivent douze injections de substrat pour l'imagerie par bioluminescence, trois injections d'immunothérapie et deux administrations nasales d'un vaccin expérimental. 1 376 souris relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 144 d'un niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever les tumeurs et un grand nombre d'organes associés, le porteur indiquant que 70 % des expériences s'arrêtent au dixième jour, avant les premiers signes de douleur.

Objectifs

Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes liés aux cellules immunitaires se trouvant à l’intérieur des tumeurs et en particulier aux lymphocytes qui sont les cellules immunitaires tueuses de tumeurs. A l'intérieur des tumeurs, la capacité tueuse des lymphocytes est inhibée par l'expression de molécules, appelées "checkpoints", à la surface des lymphocytes. Nous cherchons à comprendre les mécanismes menant à l'expression des "checkpoints" sur les lymphocytes. Nous cherchons à tester dans nos modèles précliniques l’efficacité de traitements bloqueurs de chekpoints (dont certains sont déjà utilisés en clinique) ainsi que d’un vaccin anti-cancer et comprendre ce que leur utilisation déclenche dans l’organisme. Nous planifions d’utiliser des modèles précliniques tumoraux permettant d’étudier 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d'oncologie préclinique), 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopique (c’est-à-dire dans l’organe duquel les cellules tumorales sont issues, comme par exemple intra-oral pour les tumeurs de cancers oraux).

Bénéfices attendus

En utilisant ces modèles précliniques de cancer, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires caractéristiques des lymphocytes "tueurs de tumeurs". Nous comprendrons comment les tumeurs contournent leur activité cytotoxique en induisant l'expression des checkpoints. Pour cela, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans leur organe d'origine. D'où l'utilisation des modèles d'implantations orhtotopiques, qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d'origine. Ainsi, en ciblant, de façon appropriée à chaque type tumoral, les checkpoints exprimés par les lymphocytes, et en développant des vaccins permettant d'activer ces mêmes lymphocytes, nous pourrons proposer une amélioration des stratégies thérapeutiques déjà en place. Cela pourrait permettre, à terme, de faire évoluer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancers oraux, du col de l'utérus, des ovaires.

Procédures

Les animaux sont soumis: 1) à des procédures d'implantations de cellules tumorales (implantation sous-cutanée (SC), implantation orthotopique intra-péritonéale (IP), implantation intra-orale (IO), 2) à des procédures d'injection intra-péritonéale de composants de type: anesthésiant, substrat de l'enzyme exprimée par les cellules tumorales, immunothérapies (anticorps inhibiteurs de checkpoints), et 3) à une procédure d'administration intra-nasale de vaccin - Les procédures d’implantation de cellules tumorales ne seront effectuées qu'1 seule fois par animal, chacune dure environ 5 min par animal. - Les procédures d’ injection d'anesthésiant IP seront effectuées 2 fois par animal (1 fois à l'implantation du cancer), elles durent 2 min par animal. L’injection de substrat sera effectuée 12 fois par animal (à chaque mesure lors du suivi par caméra bioluminescente), sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal. 2): l'immunothérapie sera injectée 3 fois par animal, elle dure 2 min par animal. – L’administration du vaccin sera effectuée 2 fois par animal, sur animal anesthésié, elle prendra 5 min par animal.

Impact sur les animaux

L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés juste après l'euthanasie.

Remplacement

Notre étude vise à explorer les mécanismes immunitaires dans les tumeurs épithéliales de plusieurs origines afin de développer des immunothérapies (anticorps et vaccin) et de comprendre la résistance des tumeurs aux immunothérapies actuelles. Le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi-cellulaire d'une tumeur avec son microenvironnement. Nous ne pouvons pas in vitro (ni dans des organoïdes, ni dans une flasque de culture in vitro) reconstituer un microenvironnement complet autour des cellules tumorales, qui contiendrait un réseau complexe multicellulaire et reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.

Réduction

Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature actuelle concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer à 2, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous désignons également nos manips afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le groupe témoin sera utilisé pour comparaison avec plusieurs lots d’animaux afin de diminuer l’utilisation inutile d’animaux.

Raffinement

Pour optimiser le raffinement, notre long recul (>18ans) sur ces modèles permettra un suivi et une évaluation au plus juste de l’inconfort et de l’éventuelle apparition de souffrance. En effet, 70% des expériences seront arrêtées à J10, bien avant les 1ers signes de douleur. Dans les 30% d’expériences de suivi longitudinal, aucune nécessité de maintenir les animaux en souffrance, ainsi les animaux seront euthanasiés avant d’atteindre le point limite. Les procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés à l’expérimentation animale et au bien-être animal. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie, pour éviter le stress et la douleur. La préhension des animaux se fera en dirigeant doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de la poser sur une grille et d’effectuer la contention. Puis une fois endormis, les animaux seront posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Du gel oculaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs : les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien réveillés afin d’éviter une baisse de température liée à la ventilation dans les cages. Egalement en post-opératoire, les souris recevront une alimentation enrichie dans des contenants déposés au sol afin qu’elles n’aient pas à se redresser pour se nourrir. Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations européennes, dans des cages collectives. Des objets appropriés (tubes cartons, lanières papier kraft, papier absorbant.) seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress, de faciliter leur thermorégulation et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques des souris. Même si les points limites ne devraient pas être atteints pour nos procédures, nous veillerons à éviter toute souffrance ou détresse chez les animaux. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise et aucun animal ne sera maintenu en souffrance.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme modèle d’étude selon plusieurs critères : -La litérature scientifique, définissant le système immunitaire murin comme pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille qui facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie). -la biodisponibilité des souris transgéniques permettant d’étudier des mécanismes immunitaires en détail. Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet, nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.

Anesthésiées 90 minutes, exposées à Candida albicans, puis injectées avec des substances ciblant certaines cellules, 1 310 souris vont être utilisées pour étudier les macrophages de la langue. 1 190 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance modéré, les 120 autres d'un niveau léger. Le porteur qualifie le champignon d'inoffensif et annonce qu'aucun effet notable n'a été observé, hors de légères réactions inflammatoires temporaires, ce qui cadre mal avec la gravité modérée déclarée pour la quasi-totalité de l'effectif. Toutes seront tuées pour prélever les organes à analyser, et le porteur compte parmi ses mesures de réduction le fait d'utiliser toutes les souris nées des accouplements selon leur profil génétique.

Objectifs

Ce projet vise à examiner le rôle immunitaire des macrophages dans la langue. Il comporte plusieurs objectifs spécifiques. Tout d’abord, une cartographie de la réponse immunitaire : cette étape implique l'identification et la localisation des macrophages et autres cellules immunitaires dans la langue après infection par un champignon commensal (un micro-organisme qui vit en équilibre avec son hôte sans lui causer de dommages). Nous étudierons également l'origine et le comportement dynamique des macrophages nouvellement formés lors de la colonisation par ce champignon commensal.

Bénéfices attendus

La langue est un organe complexe qui remplit des fonctions vitales pour l'hôte, comme la détection des saveurs, la mastication et la parole. En raison de sa position anatomique, la langue est l'un des premiers organes exposés aux microorganismes présents dans la nourriture ou en suspension dans l'air. Malgré cela, l'immunité de la langue reste mal comprise. Les macrophages sont des cellules immunitaires multifonctionnelles qui ont récemment retenu l'attention des chercheurs en raison de leur capacité à réguler la réponse immunitaire. Les macrophages de la langue, en particulier, sont encore largement méconnus. Ce projet vise à 1) élucider le rôle spécifique des macrophages de la langue dans la défense immunitaire contre Candida albicans, un champignon naturellement présent dans le corps humain, mais qui peut provoquer des infections sous certaines conditions. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer la réponse immunitaire locale et prévenir les infections fongiques ; 2) comprendre pourquoi les macrophages de la langue sont générés en l'absence de leurs facteurs nutritifs (comme l'IL-34) et comment ce champignon commensal influence ce processus. Ces informations cruciales sur la régulation de cette population immunitaire pourraient conduire à de nouvelles connaissances fondamentales sur l’origine de ces cellules. Les résultats de ce projet pourraient avoir des implications cliniques significatives, notamment pour les populations vulnérables telles que les nourrissons, les personnes âgées et les individus immunodéprimés. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires locaux pourrait aboutir à des interventions préventives ou thérapeutiques plus efficaces, réduisant ainsi la morbidité associée aux infections fongiques orales.

Procédures

Les souris subiront plusieurs interventions selon les protocoles. Tout d'abord, elles recevront une injection d’anesthésique dans le ventre, suivie d'une exposition à un champignon inoffensif, pour une durée d'environ 90 minutes. Certaines souris recevront une injection d'une substance qui cible certaines cellules spécifiques, tandis que d'autres recevront un médicament contre le champignon par injection et dans l'eau qu'elles boivent. Enfin, chez les souris nouveau-nées, un petit tatouage sera réalisé et un morceau de queue sera prélevé. Chaque intervention, sauf celles impliquant le champignon, sera courte (quelques minutes), et les souris seront surveillées après chaque procédure pour s'assurer de leur bien-être.

Impact sur les animaux

L’évaluation de l’action des macrophages contre les champignons inclut l’utilisation de Ca101, une souche de champignon inoffensif. L’utilisation de cette souche est relativement récente, mais nos partenaires de recherche l’utilisent régulièrement. Ils ont observé que ce champignon colonise de manière durable les souris, sans causer de problèmes majeurs ni de perte de poids. En ce qui concerne les effets indésirables attendus, aucun effet notable n'a été observé chez les souris, à l'exception de légères réactions inflammatoires temporaires, qui devraient se résorber rapidement sans impact à long terme.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt pour analyse.

Remplacement

L´utilisation du modèle animal est indispensable ici, car il n´est pas possible de reproduire la complexité des interactions entre les cellules immunitaires et le champignon au niveau lingual en culture cellulaire. Par ailleurs, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l´utilisation de souris génétiquement modifiées.

Réduction

Nous avons soigneusement calculé le nombre de souris nécessaires pour cette étude afin de garantir des résultats fiables tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés. Pour cela, nous utilisons des méthodes adaptées qui permettent d’obtenir des conclusions précises avec le moins de souris possible. De plus, toutes les souris nées lors de l’accouplement seront utilisées selon leur profil génétique, ce qui contribue à réduire le nombre total d’animaux impliqués dans l’étude. Cet engagement envers le principe de réduction souligne notre responsabilité éthique envers le bien-être animal.

Raffinement

Notre animalerie possède le statut EOPS (Élevage et Optimisation des Souris Pathogènes Spécifiques), ce qui nous aide à réduire les variations causées par les infections. Les souris sont logées dans des cages de 530 cm², accueillant jusqu'à 5 souris adultes, ce qui favorise leur vie sociale et leurs comportements naturels. Nous utilisons du coton ou des cartons pour leur permettre de faire des nids. Les conditions de vie sont optimales, avec une température de 21 °C et un environnement calme. Lors des procédures 1, 3, 4 et 5, les souris seront anesthésiées pendant 90 minutes sur un coussin chauffant, avec un gel oculaire pour protéger leurs yeux. La souche de Candida albicans que nous utilisons permet une colonisation durable sans effets indésirables significatifs. Des mesures strictes, comme une surveillance accrue et une alimentation hydratée, sont mises en place pour garantir le bien-être animal. En cas de signes de souffrance, une mise à mort précoce pourra être envisagée pour éviter des douleurs prolongées. Les injections sur les animaux éveillés seront réalisées par un personnel expérimenté pour réduire le stress. Les souriceaux seront génotypés par un prélèvement de tissu dans la queue, effectué sur des animaux âgés de 7 à 10 jours.

Choix des espèces

Le modèle murin, Mus musculus, est un mammifère dont 99 % des gènes sont orthologues à ceux de l’homme. Les techniques de mutagénèse conditionnelle sont exclusivement disponibles chez la souris et validées pour l’étude physiopathologique des gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour offrir des enseignements précieux sur le fonctionnement du système immunitaire des deux espèces, avec des applications cliniques potentielles. De plus, la taille, la rapidité du cycle reproductif et la génétique de la souris en font le modèle idéal pour les études envisagées. Dans ce cadre, seuls des souris adultes seront utilisées afin d’étudier les mécanismes spécifiques au système immunitaire adulte.