Rongeurs

3 630 souris adultes sont tuées en fin d'expérimentation pour le prélèvement de leur cerveau, 1 700 souriceaux le sont aussi parce qu'ils ne peuvent pas être gardés sans leur mère, et 4 530 autres souriceaux sont proposés à d'autres équipes de l'établissement. 9 860 souris vont donc être utilisées au total, 3 630 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 6 230 un niveau léger. Les femelles adultes subissent jusqu'à deux chirurgies cérébrales de une à six heures, environ six injections, des tâches comportementales quotidiennes d'une heure pendant deux mois et jusqu'à une heure de tête maintenue fixe pour recevoir des odeurs. Les souriceaux, âgés de 1 à 10 jours, sont séparés brièvement de leur mère pour ces tests, parfois sédatés ou anesthésiés.

Objectifs

L’ocytocine est une molécule libérée par les neurones du cerveau, connue pour son rôle dans la lactation et lors de l’accouchement. Cependant, des études récentes montrent que l’ocytocine a aussi une action sur le cerveau lui-même, et que cette action favoriserait les comportements sociaux et maternels. Ainsi, l’ocytocine est considérée comme une hormone ayant un effet « pro-social » mais ses mécanismes d’action sont encore méconnus. L’objectif de cette étude est de comprendre comment l’ocytocine agit sur les neurones du cerveau lors des comportements maternels. Chez la plupart des mammifères, l’olfaction joue un rôle central pour les interactions entre individus et en particulier entre adultes et leurs progénitures. Chez la souris, le cortex olfactif présente une densité exceptionnelle de récepteurs à l’ocytocine par rapport à d’autres régions cérébrales, notamment chez les femelles, avec une densité accrue chez les mères par rapport à des femelles vierges. Aux vues de cette forte expression chez les mères, nous faisons l’hypothèse que l’ocytocine dans le cortex olfactif est impliquée dans les comportements maternels chez les souris femelles. Pour tester cette hypothèse, nous réaliserons des expériences de comportement en présence de souriceaux âgés de 1 à 10 jours ou de leurs odeurs, et nous manipulerons la transmission ocytocinergique dans le cortex olfactif pour tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements. Nous enregistrerons également l’activité des neurones du cortex olfactif en parallèle de la respiration lors de ces expériences. Nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Le grand nombre de neurones enregistrés via cette méthode nous permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des tests statistiques et des études pilotes pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à nos expériences. Pour tester le rôle de l’ocytocine, nous ciblerons les neurones qui libèrent de l’ocytocine ou bien ceux qui répondent à l’ocytocine. Pour cela, des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires et nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau grâce à des adénovirus injectés au préalable. Nous quantifierons l’expression des comportements maternels et l’activité des neurones tout en veillant au bien-être des souris et souriceaux.

Bénéfices attendus

Chez les Mammifères, la mise en place des comportements maternels est essentielle pour la survie des petits et de l’espèce en général. Chez l’Homme, il est notamment connu que le lien entre mère et enfant est facilité par la neurohormone nommée oxytocine, libérée dans la circulation sanguine de la mère lors de l’accouchement. Nous savons également que les odeurs jouent un rôle important et bénéfique dans le lien entre mère et enfant, un lien qui peut être affecté dans certaines situations, notamment lors de certains accouchements par césarienne (les taux d’oxytocine libérés sont alors plus limités). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau s’adapte lorsqu’il s’agit de mettre en place des comportements maternels et le rôle des odeurs dans ce processus. A terme, il pourrait permettre de mettre en place des stratégies pour faciliter l’établissement de ces comportements chez l’Homme dans des situations problématiques liées à la maternité. Cette perspective est d’autant plus réaliste que l’administration d’ocytocine par voie intranasale est déjà réalisée chez des enfants autistes pour améliorer leurs relations sociales.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence de souriceaux ou de leurs odeurs. Ces tâches de courte durée (1h environ) auront lieu quotidiennement pendant les phases d’expérimentation (durée maximum de 2 mois). Notre étude nécessitera de réaliser des injections (moins de 3min par injection/jour, environ 6 injections par souris espacées d’un minimum de 48h) chez les souris adultes. Avant les tâches, les souris seront progressivement habituées aux injections et à la contention associée. Dans une série d’expérience, afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir leur tête en position fixe au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. La durée de contention par maintien de la tête n'excédera pas 1h et sera réalisée après une habituation progressive. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau lors des tâches réalisées, certaines souris seront équipées d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies en amont des tâches (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). A la fin de l'expérimentation, les souris seront soumises à une perfusion afin de préserver les tissus cérébraux et d'effectuer des contrôles histologiques (durée de la procédure inférieure à 20min, réalisée sous traitement anesthésique et analgésique).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet seront mises en présence de souriceaux (ou d’odeurs de souriceaux) et nous observerons leur comportement pour quantifier leur capacité à en prendre soin. Les souriceaux pourront être brièvement séparés de leur mère le temps de réaliser ces tests, ce qui correspond à un stress modéré car réduit dans la durée. Pour limiter ce stress, il sera parfois possible de sédater ou anesthésier les souriceaux, ce qui nécessite d’injecter des substances médicamenteuses via des injections sous-cutanées réalisées à l’aide d’aiguilles très fines. Afin de pouvoir tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements, nous utiliserons des méthodes qui permettent de cibler les neurones capables de libérer de l’ocytocine ou bien les neurones qui répondent à l’ocytocine lorsqu’elle a été libérée. Pour cela, nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés au préalable et des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires. Ces injections représentent potentiellement une légère nuisance pour les animaux car elles nécessitent de les maintenir immobiles pendant la durée de l’injection (contention). Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Un hébergement en cage individuelle enrichie sera parfois nécessaire pour éviter que ces électrodes ne soient pas détruites par les congénères. Les souris pourront être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée.

Devenir

L’euthanasie des 3630 souris adultes en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette procédure sera réalisée par des expérimentateurs compétents et soucieux du bien-être animal, sous anesthésie profonde avec le degré d’analgésie recommandé par les services vétérinaires. La mise à mort sera ainsi indolore pour les animaux, avec une perte de conscience rapide. Les souriceaux seront aussi mis à mort à la fin des procédures si les mères ne peuvent pas être gardées en vie jusqu'au sevrage car ils ne peuvent être gardés en absence de leur mère (1700 souriceaux concernés). Il est possible de retarder l’euthanasie de la mère pour attendre le sevrage et ensuite les replacer au sein de la communauté des utilisateurs. Si la mère n’est pas utilisée pour des contrôles histologiques, les souriceaux seront gardés en sa présence et proposés à la communauté des utilisateurs pour une utilisation future potentielle, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans l’établissement (4530 souriceaux concernés).

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements maternels : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 9860 (3630 souris adultes et 6230 souriceaux) sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris dans des tests comportementaux différents, avec ou sans intervention sur le système ocytocinergique. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences et raffiner notre approche statistique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésie et analgésique permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Les femelles accouplées seront séparées des mâles et mises en compagnie des « accompagnantes » dès l’arrêt de l’accouplement. Si une accompagnante est agressive, elle sera immédiatement remplacée. Lors des tâches comportementales : si des comportements agressifs envers les petits sont détectés, l’expérience sera immédiatement interrompue. Les souriceaux seront maintenus sur tapis chauffant pour les courtes périodes inter-essais, dans les rares cas où ils ne pourraient pas être retournés à leur mère. Ils seront frottés avec le matériau de leur nid d’origine avant d’être rendus à leur mère afin de favoriser leur ré-intégration (suivi de leur bien-être et points limites définis au préalable).

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’effet positif de l’ocytocine sur les comportements sociaux a notamment été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme. Les odeurs jouent un rôle important dans le lien mère-progéniture, aussi bien chez l'Homme que chez la Souris. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Des souriceaux seront utilisés comme stimuli au cours des expérimentations car elles visent à comprendre les bases neurobiologiques des comportements maternels.

300 souris nude, dépourvues de défenses immunitaires pour accepter des cellules humaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer du sein triple négatif dans le tissu mammaire, au moins une injection de nanoparticules dans la veine de la queue, puis jusqu'à quatre séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie, certaines avec une phase d'hyperthermie locale. Le porteur ramène les effets indésirables attendus au stress des piqûres, comparable selon lui à celui d'un changement de cage. Il indique avoir déjà présélectionné les nanoparticules sur des modèles cellulaires, et juge le recours aux animaux "indispensable" parce que le devenir des nanomédicaments dépend de l'élimination par le foie et les reins.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme et le cancer du sein triple négatif, qui représente 10-20% des cas de cancer, est le plus agressif avec le pronostic le plus défavorable. Les options thérapeutiques actuelles ne sont pas encore optimales et nécessitent de proposer de nouvelles options thérapeutiques. Notre objectif est donc d’évaluer dans un modèle murin de tumeurs mammaires de nouveaux nanosystèmes permettant de (re)sensibiliser les cellules à la chimiothérapie. La présence d’un cœur d’oxyde de fer dans ces nanothérapies sera également exploitée pour induire une vectorisation magnétique et une hyperthermie locale dont nous évaluerons également l’effet thérapeutique.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est de documenter l’impact du guidage magnétique sur l’accumulation de nanovecteurs dans une tumeur mammaire implantée chez la souris et d’évaluer une thérapie innovante pour le traitement des cancers du sein triples négatif.

Procédures

Les animaux recevront une injection unique au niveau du tissu adipeux mammaire de cellules tumorales et d'au moins une injection de nanothérapie par la veine de la queue. Ces gestes seront réalisés sous anesthésie qui ne durera pas plus de 5 minutes. Concernant les imageries, elles seront également réalisées sous anesthésie et seront au nombre de 4 maximum et d'une durée maximale de 2heures.

Impact sur les animaux

L' effet indésirable attendu est lié au stress induit par les piqures. Le niveau de stress généré par ces gestes sera comparable à celui induit par les changes.

Devenir

A la fin de chacune des procédures les animaux sont euthanasiés pour prélèvements et dosages.

Remplacement

Il existe de nombreux tests d’évaluation de toxicité sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous ont permis de présélectionner les nanoparticules que nous allons évaluer. Les objectifs du projet étant d’évaluer l’accumulation tumorale des nanovecteurs, leur efficacité thérapeutique dans un contexte complexe ou le devenir des nanomédicaments peut être impacté par l'élimination hépatique, ou rénale de l’hôte, l’utilisation d’animaux est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. En effet, une simulation en utilisant G-power, montre que pour mettre en évidence une éventuelle différence d’accumulation/efficacité de nos nanovecteurs supérieure ou égale à 20%, nos groupes doivent être constitués de 12 individus, avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures - normothermie assurée un système de chauffage asservi à la température rectale aussi bien pendant les phases d’hyperthermie locale que lors des études d’accumulation. Pendant l’examen IRM un suivi du rythme respiratoire sera réalisé afin d’évaluer la qualité de l’anesthésie. Le suivi régulier des animaux sera réalisé afin de s'assurer que les points limites adaptés à l'étude ne sont pas atteints. Un arbre décisionnel est mis en place pour arrêter toute souffrance à laquelle les animaux pourraient être exposés. Afin de réduire l’inconfort de l’animal un dépôt de gel ophtalmique sur la cornée sera effectué à chaque phase des protocoles.

Choix des espèces

Les lignées tumorales de cancer du sein triple négatif étant des cellules humaines, des souris nude femelles seront utilisées, cette expèces est retenue car le modèle ainsi obtenu est le modèle de référence. Il s’agira d’animaux âgés de 8 à 10 semaines ayant atteint la maturité sexuelle.

Gavées au bisphénol A pendant les 21 jours de gestation puis les 21 jours d'allaitement, des rates transmettent à leur descendance une hypominéralisation de l'émail dentaire, et leurs petits sont gavés à leur tour pendant neuf jours. 234 rats vont être utilisés, 34 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 200 un niveau léger, tous tués pour récupérer leurs dents. Un vernis est appliqué au pinceau sur les dents sous quinze minutes d'anesthésie, une seule fois, puis deux séances d'imagerie aux rayons X vérifient la reminéralisation, l'objectif étant de comparer un nouveau produit fluoré et sa version sans fluor à trois produits déjà commercialisés. Le porteur qualifie de légères les nuisances attendues et écrit que l'administration de bisphénol A "ne devrait pas engendrer des effets secondaires au regard de la concentration administrée", alors que c'est précisément elle qui abîme l'émail des animaux.

Objectifs

Les hypominéralisations de l’émail dentaire, observées au cours du développement telles que l'hypominéralisation molaires incisives, touchent aujourd’hui près d’un enfant sur cinq en France et à travers le monde. Elles engendrent des défauts inesthétiques, des douleurs impactant la vie quotidienne et les actes de soins particuliers. Elles sont associées à un risque accru de caries, conduisant à termes à la perte des dents. Une prise en charge adéquate dès le diagnostic posé s’impose et doit être suivie tout au long de la vie, engendrant des coûts personnels et sociétaux colossaux au regard du nombre de personnes touchées et de la nécessité d'un traitement sur des décennies. L’objectif de ce projet est d’évaluer la performance de reminéralisation de l’émail d’un nouveau produit fluoré ainsi que d’une autre formulation de ce même produit sans fluor. Puis de comparer leur performance avec celle d’autres produits déjà disponibles sur le marché. Pour cela, nous disposons d’un modèle de rat présentant des hypominéralisations de l‘émail dès la naissance après exposition chronique, dès la conception, au bisphénol A à des doses environnementales. Ces rats seront traités soit par le nouveau produit en développement, soit par un des trois produits déjà mis sur le marché. Il n’y a, à ce jour, aucune preuve scientifique d’éfficacité de ces produits sur le traitement et la prévention de ces lésions, d’où l’interêt de développer un nouveau produit permettant la prise en charge de cette pathologie. Ce projet permettra donc de proposer de nouvelles stratégies de reminéralisation des tissus dentaires fortement attendues par les patients et les dentistes, et plus généralement les enfants dans le cadre préventif des caries. Ce projet permettra également d’accroitre les connaissances sur 1/ l'étiologie et les caractéristiques des hypominéralisations de l’émail, 2/ les mécanismes chimiques de reminéralisation et 3/l’approche thérapeutique pour une meilleure prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Avec une prévalence française et mondiale moyenne des hypominéralisations développementales acquises (regroupées sous le terme de molaire incisive hypominéralisation) de 15%, soit près d’un enfant sur 5 atteint dans le monde, l‘enjeu est colossal. En effet, cette pathologie dentaire très répandue ayant des conséquences négatives dans la vie des patients : défauts esthétiques, douleurs, caries. Ces patients, jeunes au moment du diagnostic, requièrent des traitements et suivis tout au long de leur vie, engendrant des coûts économiques et sociaux importants. Mettre au point une solution de prévention ou, à défaut, un traitement clinique innovant permettrait de soigner des millions d’enfants à travers le monde et limiter les impacts négatifs de cette pathologie. Notre étude permettra d’apporter des preuves pré-cliniques démontrant que la démarche thérapeutique proposée permet une reminéralisation de l’émail dentaire plus efficace qu’avec les produits actuellement disponibles. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucune preuve pré-clinique ou clinique de l’efficacité des traitements dentaires déjà commercialisés sur la reminéralisation de l’émail des patients atteints de molaire incisive hypominéralisation.

Procédures

Les animaux seront soumis au gavage d'une solution de bisphénol A, ainsi qu'à l'application à l'aide d'un pinceau fin de vernis dentaire sous anesthésie pendant 15 minutes. Le gavage se deroulera chez la mère gestante pendant toute la durée de la gestation et du sevrage (21 jours + 21 jours, soit 42 jours), puis chez la descendance pendant 9 jours. Une seule application de 30 secondes des produits sera administrée, sur la surface des dents de la progéniture. Ils seront également anesthésiés pendant 15 minutes deux fois afin d'effectuer l'analyse imagerie aux rayons X et de contrôler la reminéralisation in vivo.

Impact sur les animaux

Les animaux seront gavés tous les jours par des expérimentateurs ayant l’habitude de ce geste qui reste néanmoins une source de stress. Dans la deuxième partie de l’expérience, les dents des rats (molaires et incisives) sont traitées par l’application au pinceau fin de produits d’intérêt nécessitant d'anesthésier les animaux. Les nuisances attendues principalement liées à l’anesthésie et à la contention sont légères. Une hypothermie pendant l’anesthésie peut avoir lieu. Les seuls actes invasifs pratiqués sont le gavage et les injections d’anesthésique (l’application du produit étant réalisée sous anesthésie), ainsi que l’administration orale de bisphénol A, qui ne devrait pas engendrer des effets secondaires au regard de la concentration administrée.

Devenir

Les animaux de tous les lots d'études seront mis à mort afin de pouvoir récupérer et caractériser leur dents.

Remplacement

Concernant les recherches sur les dents, et sur l’émail dentaire en particulier, les modèles d’investigation in vitro ne sont pas satisfaisants actuellement car ils ne reproduisent pas la physiologie de la dent. En effet, des techniques in vitro de déminéralisation de l’émail existent, avec des cycles de pH, mais elles restent insuffisantes car elles ne permettent pas d’obtenir un émail déminéralisé comme en clinique. Seule la surface de l’émail est déminéralisée, ce qui reste très insuffisant pour mettre en place un traitement de réparation ou même de prévention. En effet, les lésions de type "molaire incisive hypominéralisation" sur dents extraites humaines sont difficilement accessibles car elles sont souvent trop sévères et très souvent associées à des caries profondes lors d'une extraction dentaire. L’utilisation du modèle de rat présenté ici permettra d’évaluer l’efficacité et l’utilisation du nouveau traitement dentaire dans des conditions se rapprochant de celles en clinique chez l’homme.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre nécessaire d’animaux dans cette étude, chaque échantillon collecté sera analysé par un maximum d‘approches techniques selon une séquence définie : les analyses non destructrices d'abord (µ-CT, fluorescence), puis les observations microscopiques et analyses chimiques in situ, puis nano- et micro-dureté. Les techniques nécessitant la destruction des échantillons (dosages quantitatifs des éléments ou analyses histologiques post-déminéralisation) seront effectuées en dernier. Le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir un test statistique significatif est de 6 par groupe, mais le nombre d'animaux prévu est de 10 par lot d’étude et par sexe, afin de parer à de petites portées deséquilibrées et de conserver néanmoins une puissance statistique en cas de perte inopinée d’animaux. Des analyses statistiques seront conduites sur l’ensemble des résultats obtenus dans cette étude avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Pendant toute la durée de l'étude, l'application des points limites stristes et spéciphiques au projet sera respecté. Par ailleurs, les rats seront anesthésiés lors de l’application du traitement dentaire pour éviter tout stress de l’animal, et leur phase de réveil sera encadrée sur un tapis chauffant pour éviter toute hypothermie. Chaque rat sera pesé avant toute acte (gavage de bisphénol A, application produit ou scan aux rayons X) afin d’avoir un suivi régulier de leur poids et ainsi identifier toute baisse de poids pouvant indiquer un stress important chez l’animal. Les animaux seront observés régulièrement par les expérimentateurs, pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites dont l’atteinte entraînera la mise à mort anticipée de l’animal. Une période d’acclimatation d’une semaine avant l’entrée dans le protocole est accordée aux animaux. Pendant l’application du traitement, les animaux seront monitorés de manière visuelle (fréquence respiratoire, hydratation par test du pli de la peau). Durant toute la durée de l'anesthésie et jusqu’à réveil complet, les rats seront maintenus sur tapis chauffant. Les animaux seront hébergés par groupe de 3 dans les conditions standards d’hébergement ; eau et nourriture contrôlé (ad libitum). De plus, chaque cage sera identifiée, et les rats initialement hébergés ensemble (3 rats/cage) le resteront du début à la fin du protocole.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale retenue dans le cadre de cette étude car un modèle utilisant cet espèce permet de mimer le ''molaire incisive hypominéralisation'' humain chez le rat. Bien que la denture du rat soit différente de l’humain, le processus de développement dentaire suit une séquence similaire à l’humain. Le modèle d’incisive à croissance continue est même un atout car il permet de récapituler toutes les étapes du développement des dents sur un même échantillon. De plus, la gestation ainsi que l’odontogenèse chez le rat est rapide (jeune adulte 30 jours après la naissance) et permet donc de raccourcir la durée de l’étude.

187 souris vont être utilisées, 42 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 145 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Des femelles gestantes reçoivent un traitement par voie orale puis une injection intrapéritonéale pour déclencher la suppression d'un gène, avant d'être tuées par dislocation cervicale, leurs embryons étant décapités aussitôt après. Les souris qui naissent et survivent sont pesées deux fois par semaine puis suivies jusqu'à six mois, âge auquel elles sont tuées après évaluation de leur phénotype dommageable, malformations ou dysfonctionnements de l'appareil urinaire. Le porteur affirme travailler dans une boîte de Pétri chaque fois qu'il le peut, et conclut que ce gène doit être étudié "dans sa globalité", donc dans un organisme vivant.

Objectifs

Les anomalies congénitales du rein et le tractus urinaire (CAKUT) font partie des malformations les plus importantes à la naissance. Les maladies CAKUT peuvent être létales à la naissance ou pendant l’enfance ou l’adolescence. Chez les adultes, les maladies CAKUT prédisposent à des pathologies rénales chroniques, une maladie qui conduit souvent à une insuffisance rénale terminale. Malgré cet impact important de santé publique, dans 80% des maladies CAKUT, aucun gène n’a été à ce jour identifié. La mutation de gène de notre intérêt a été récemment identifiée chez les individus souffrants des maladies CAKUT. Pour autant les mécanismes d’action de ce gène et son rôle pendant l’embryogenèse et au cours de la vie d’adulte est totalement méconnu à ce jour. Dans ce projet, nous allons d’une part activer la délétion de ce gène sur les femelles gestantes pour analyser les embryons à des stades précoces de l’embryogenèse. D’autre part, si la délétion de ce gène n’est pas léthale pendant la grossesse, nous allons vérifier si les souris adultes présentent des problèmes de santé sur trois générations. Nous avons calculé que nous aurons besoin de 187 animaux au total.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale va permettre de comprendre comment le dysfonctionnement de notre gène d’intérêt altère la formation du rein conduisant à des malformations voire à l’absence totale des reins aboutissent à une mortalité précoce ou à des maladies rénales chroniques pour lesquels à ce jour, à part la dialyse ou la greffe d’organe, la médecine n’a aucun autre recours.

Procédures

Administration par voie orale sur les femelles gestantes d’un traitement pour activer la délétion du gène d’intérêt (40 secondes par animal) suivi, 48h plus tard, par 1 injection intrapéritonéale (20 secondes par injection). -A partir du sevrage, pesée 2 fois par semaine (20 seconds) jusqu’à l’âge de 2 mois puis 1fois/semaine jusqu’au 3ème mois puis 1 fois/mois jusqu’au 6ème mois.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient développer des malformations et/ou dysfonctionnement des organes uro-génital. La contention cause du stress et la piqure cause une légère douleur.

Devenir

Procédure 1: Mise à mort avant la naissance. Procédure 2 : Procédure de suivie du phénotype de la naissance jusqu'à 6 mois. Notre étude porte sur l'analyse du rein en development donc nous avons besoin d'avoir des embryons que nous obtenons à partir des femelles gestantes qui sont mises à mort par dislocation cervicale. Les embryons sont décapités rapidement après la mise à mort de la mère. Tous les animaux qui survivent après la naissance seront mis à mort à l'âge de 6 mois à l'issue d'évaluation du phénotype dommageable. En effet, à 6 mois d’âge, nous pouvons analyser de manière exhaustive les effets du phénotype sur le développement du rein et la fonction rénale. Des analyses antérieures seraient incomplètes, car certaines anomalies pourraient ne pas être visibles avant que le développement ne soit entièrement achevé. S’il y a phénotype dommageable cela pourrait apparaître progressivement et devenir pleinement visible à l’âge adulte, soit vers 6 mois. Attendre cet âge nous permet d’évaluer pleinement l’expression du phénotype et ses répercussions sur l’organisme, garantissant ainsi que toutes les manifestations du phénotype ont été correctement observées et documentées.

Remplacement

Nous avons les outils et l’expertise d’étudier notre gène d’intérêt dans une boîte de Pétri et nous le réalisons à chaque étape que nous le pouvons. Toutefois, ce gène a un rôle important dans la formation de plusieurs organes pendant la formation de l’embryon. Par conséquent pour mieux comprendre le fonctionnement de ce gène, il est nécessaire de l’étudier dans sa globalité en occurrence dans un organisme vivant.

Réduction

Afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs nous avons besoin de 20 embryons par expérience (histologie et analyses quantitatives) et par génotype. Toutefois pour réduire le nombre de souris utilisées si nous obtenons des résultats statistiquement significatifs avant l’utilisation de 20 embryons, nous ne ferons pas des accouplements supplémentaires. En ce qui concerne évaluation des problèmes de santé sur les animaux adultes : En nous appuyant sur la littérature et notre propre expérience, nous prévoyons l’analyse de 4 portées issus de 4 couples indépendants au cours de 3 générations (en suivant la législation en cours) pour évaluer le phénotype de la lignée générée dans ce projet. Le nombre minimum d’animaux nécessaire pour l’analyse de la prolifération cellulaire, les paramètres histologiques et physiologiques que nous envisageons d’analyser a été déterminé par des calculs statistiques basé sur un calcul de puissance associé à l’utilisation de tests de significativité statistiques.

Raffinement

Nous pratiquons un élevage sans phénotype dommageable grâce à un modèle de délétion conditionnelle où nous délétons le gène au moment voulu et uniquement dans certains tissus. Quant aux animaux susceptibles de développer un phénotype dommageable, outre de leur fournir un environnement enrichi pour satisfaire leur besoin de rongeur et leur instinct de nidification, de les héberger en permanence avec leur congénère de même portée, de les surveiller au quotidien, nous avons établis 2 grilles d’observation selon lesquels, les personnels formés et compétents noteront la moindre anomalie susceptible de compromettre leur état de santé, leur comportement et leur bien-être et prévoyant des points limites précoces et adaptés. Pour les injections, nous prenons la précaution de chauffer la solution au préalable à 37°C. Lors de mis à mort des animaux, nous les anesthésions au gaz isoflurane à 4% dans la chambre d’induction pendant 2 à 3 min (temps nécessaire pour une anesthésie profonde) aussitôt après la souris est mis à mort par la dislocation cervicale. Les accouplements seront programmés afin d’éviter les mises-bas le week-end permettant d’assurer une meilleure surveillance des animaux autour de cette phase critique au cours de laquelle des points limites pourraient être atteints (avortement spontané, risques de dystocie). Un vétérinaire dédié de manière permanente à notre animalerie est disponible à toutes nos requêtes sur l’état de santé de nos animaux et plus particulièrement de ceux sous la procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme. Le modèle de souris mutante pour le gène étudié dans ce projet mime fidèlement la pathologie humaine résultant du dysfonctionnement de gènes humains homologues. Les stades du développement : Depuis la naissance jusqu’ à l’âge de 6 mois, période nécessaire et suffisante pour évaluer le bien-être de la lignée génétiquement modifiée créée dans ce projet. Les femelles âgées de 8 semaines à l’optimum de leur maturité sexuelle pour la production d’embryons objets de l’étude.

Anesthésiées au gaz, les souris reçoivent six injections dans l'oreille en deux semaines, parfois une injection intraveineuse et une injection intradermique supplémentaire dans chaque oreille. Certaines passent ensuite une à deux séances de bioluminescence par semaine, chacune sous vingt minutes d'anesthésie avec injection intrapéritonéale. 1 125 souris vont être utilisées, 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 005 un niveau léger, pour suivre la façon dont un mélanome de la peau prépare le ganglion lymphatique à recevoir ses métastases. Le porteur prévoit une possible gêne à la déglutition quand les métastases se développent dans les ganglions du cou, une gêne respiratoire quand elles gagnent les poumons, et la mise à mort de toutes les souris pour analyser ces organes.

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau très agressif dont l’incidence est en augmentation en France. La moitié des patients atteints de mélanomes métastatiques sont en échec thérapeutique et nécessitent de nouveaux traitements. Les premières métastases apparaissent en général dans le ganglion lymphatique avant de se disséminer vers les organes vitaux. Le ganglion sain est un tissu immunitaire qui n’est normalement pas propice au développement tumoral. Notre projet consiste à mieux comprendre (1) comment les facteurs sécrétés par le mélanome cutané modifient à distance le ganglion pour en faire un environnement favorable au développement métastatique du mélanome, et (2) comment le microenvironnement du ganglion influence la capacité du mélanome à métastaser dans les organes secondaires. Dans ce but, nous voulons caractériser les modifications des cellules immunitaires et des fibroblastes dans des ganglions reprogrammés par les facteurs sécrétés par mélanome et étudier le potentiel métastatique dans le poumon de cellules de mélanome adaptées au microenvironnement ganglionnaire. A terme, notre projet vise à identifier des marqueurs métastatiques précoces et de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles de cibler le dialogue entre les cellules tumorales et le microenvironnement de la niche ganglionnaire pour détecter précocement les rechutes des patients, voire et éviter les rechutes des patients.

Bénéfices attendus

Nos recherches visent à caractériser le rôle joué par les facteurs sécrétés par le mélanome cutané dans la mise en place d’un microenvironnement pré-métastatique inflammatoire et immunodéprimé favorable à l’invasion, la survie et la prolifération des cellules de mélanome métastatiques dans le ganglion. Nos travaux permettront de mieux comprendre les processus précoces d’établissement de la niche métastatique dans le ganglion, et notamment l’implication du dialogue entre les cellules tumorales, les fibroblastes et les lymphocytes T dans les étapes précoces de métastase du mélanome. A terme, nos travaux visent à identifier des biomarqueurs ganglionnaires ou de potentielles cibles thérapeutiques dans le dialogue entre le mélanome, les fibroblastes et les lymphocytes T, pour potentialiser l’effet des immunothérapies actuelles dans le mélanome, mais également dans d’autres cancers qui métastasent vers le ganglion lymphatique, comme le cancer du sein ou de la prostate.

Procédures

Les animaux seront soumis à 6 injections intradermiques par oreille en 2 semaines. Selon les lots d'animaux, pourront s'ajouter 1 injection intraveineuse et/ou 1 injection intradermique dans chaque oreille. Les injections durent quelques secondes et sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Certains animaux seront ensuite suivis par Bioluminescence 1 à 2 fois par semaine. Cette procédure comprend une anesthésie gazeuse de 20 min et une injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Possibilité de douleur minime et d'inflammation au niveau des sites d'injection au réveil de l'anesthésie. Possibilité de gène à la déglutition suite au développement de métastases dans les ganglions du cou. Possibilité de gène respiratoire suite au développement de métastases pulmonaires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour analyser les organes (ganglions lymphatiques ou poumons).

Remplacement

Dans un souci de remplacement, nous avons débuté nos recherches par des expériences in vitro pour identifier l'impact de la co-culture de cellules de ganglions lymphatiques humains sur les cellules de mélanome et les cellules immunitaires. Les résultats très prometteurs que nous avons obtenus doivent maintenant être validés chez les animaux. En effet, l'étude de la mise en place de la niche pré-métastatique avec le dialogue à distance entre plusieurs organes (tumeur cutanée et ganglion lymphatique) et l'étude de la modification de la réponse immunitaire systémique n'est à ce jour pas compatible avec des approches in vitro et nécessite une validation chez l'animal.

Réduction

Nous avons utilisé la méthode statistique de référence pour déterminer les effectifs de nos groupes d'animaux de façon à Réduire au maximum le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la fiabilité de nos conclusions. Notre expertise et des recherches bibliographiques nous ont permis de déterminer le nombre adéquat de cellules injectées pour obtenir une réponse chez l’animal, permettant de réduire le nombre de lots nécessaires à la réalisation du projet. Nous utiliserons également l'imagerie non invasive par bioluminescence qui permet un suivi longitudinal des animaux pendant la durée des expérimentations, au lieu de multiples lots d'animaux à différents temps. Les ganglions lymphatiques ou les poumons seront systématiquement prélevés et analysés à la fin des expériences pour valoriser chaque expérience de façon optimale.

Raffinement

Pour limiter le stress, les expérimentateurs manipulent les animaux par préhension au creux de la main. Les injections (intradermiques, intrapéritonéales ou intraveineuses) sont faites sur des animaux sous anesthésie gazeuse, ce qui leur permet de ne pas stresser, tout en retrouvant toutes leurs facultés en quelques minutes. L'injection dans l'oreille est un geste très technique, mais bien maîtrisé, qui est moins invalidant pour les animaux que les injections plus classiques dans le coussinet de la patte (analyse du ganglion poplité drainant). Les animaux n'ont pas de difficulté de déplacement. La croissance des métastases dans les ganglions ou les poumons est suivie par des techniques d'imagerie non invasives, ce qui permet de détecter très précocément les métastases et de les limiter à un stade précoce. Les points limites prévus sont précoces et prédictifs. Ils sont associés à des actions correctives permettant d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, qui est systématiquement utilisée dans les études précliniques visant à étudier l'efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. De plus, la souris est un animal petit, avec un cycle de vie relativement court et une natalité importante qui nous permet d’avoir des conditions d’hébergement et d’expérimentation appropriées. Nos procédures seront réalisées sur des animaux de 7 à 12 semaines, un âge auquel le système immunitaire est mature et la prise tumorale efficace d'après les données de la littérature et notre expérience.