Rongeurs

Gavés chaque jour pendant vingt-deux jours, saignés cinq fois à l'état vigile puis soumis à des tests censés mesurer leur anxiété, 780 rats Wistar Han vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les tests comportementaux ne sont pas nommés, et le résumé signale pour l'un d'eux un risque de chute du dispositif. Le porteur écrit qu'aucune procédure n'engendrera de douleur, tout en précisant qu'aucun analgésique ni anti-inflammatoire ne sera administré, pour ne pas perturber les dosages. Les rats sont tués vingt-trois jours après le début des traitements, pour les analyses biochimiques qui doivent départager des ingrédients d'origine végétale.

Objectifs

Les troubles anxieux et les troubles liés au stress sont particulièrement fréquents dans les pays industrialisés. Il est estimé que 13 à 22% des habitants de ces pays développeront une pathologie anxieuse au cours de leur vie. Par ailleurs, le stress est impliqué dans l’apparition de pathologies d’ordre psychiatrique telle que la dépression, avec, au-delà de l’aspect individuel, un coût important pour la société. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la dépression concerne 300 millions de personnes dans le monde. Les traitements disponibles concernant l’anxiété et le stress présentent de nombreuses limites dues aux effets secondaires importants et/ou à l’efficacité limitée. En effet, différents traitements médicamenteux peuvent être prescrits mais l’indication de ces traitements n’est pas toujours prioritairement l’effet anti-stress et ils ne sont pas dénués d’effets secondaires. Dans ce contexte, la recherche de nouveaux produits plus efficaces représente un enjeu sociétal et économique majeur.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans la lutte contre le stress et l’anxiété qui pourront être développés pour une utilisation chez l’Homme.

Procédures

Dans chaque étude pour l’ensemble du projet, un traitement sera administré en 15 secondes sur l’ensemble des animaux vigiles par voie orale pendant 22 jours. Un prélèvement sanguin effectué en 1 minute environ sera réalisé sur ces animaux à l’état vigile à 5 reprises au cours de l’étude. Des tests comportementaux seront réalisés au cours et à l’issue de l’étude sur 3 jours, avec une durée maximale de ces tests de 5 à 20 minutes par jour pour évaluer les effets des traitements sur le stress et la dépression. Aucune procédure n’engendrera de douleur.

Impact sur les animaux

Les gestes effectués sur les animaux vigiles peuvent induire un stress de courte durée. Cependant, les traitements par voie orale s’effectuent sur animal vigile afin d’éviter les fausses routes et aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire ne sera utilisée. Les séries de prélèvements sanguins comme les tests comportementaux s’effectuent sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire pour ne pas perturber l’activité des animaux et les dosages qui seront réalisés. Lors de la réalisation d’un des tests comportementaux, un risque de chute du dispositif expérimental est possible.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort 23 jours après le début des traitements, c’est-à-dire à la fin de l'unique procédure expérimentale afin de réaliser un ensemble d’analyses biochimiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire ou d’évaluer les effets d’un traitement sur l’anxiété ou la dépression. Le modèle rat est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress et la dépression. La complexité des mécanismes mis en jeux ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont, et notre expérience du modèle, permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non des traitements testés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes à 3 par cage avec des feuilles de papier kraft et des briques en bois en guise d’enrichissement. Les animaux auront un accès non restreint à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5 jours sur 7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant les tests comportementaux. Un expérimentateur surveillera en permanence l’écran vidéo situé dans le couloir jouxtant la salle de test afin d’intervenir en cas de nécessité. Les traitements oraux et les prélèvements sanguins seront effectués par du personnel ayant les compétences requises et une observation régulière des animaux sera effectuée après réalisation de chaque traitement oral ou prélèvements, week-end et jours fériés inclus. Des points limites adaptés sont fixés, si nous constatons le dépassement d’un de ces points limites, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

Le modèle rat est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. De plus, ce modèle est déjà très utilisé dans les tests visant à étudier les comportements de type anxieux et dépressif. Dans cette étude et afin d’être le plus représentatif possible, nous utiliserons des rats des deux sexes. Les animaux utilisés seront des rats mâles (200-250g, 42 jours) et femelles Wistar Han (âge équivalent) à l’arrivée au laboratoire. Nous effectuerons notre modèle sur des rats adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles dans la littérature scientifique.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous la peau du crâne par semaine pendant quatre semaines, passe des tests cognitifs, puis subit une ponction du liquide céphalo-rachidien avant d'être tué par exsanguination. Une partie du protocole porte sur des souriceaux de sept jours, que la manipulation expose au rejet par leur mère, à la mort par hypothermie ou au cannibalisme, effets que le porteur qualifie de rares et sporadiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne capture la complexité d'un "organisme entier" et écarte la drosophile, C. elegans et le poisson zèbre, dont la barrière cérébrale diffère trop de celle des mammifères.

Objectifs

Récemment, certaines zones barrières du cerveau, ont été identifiées comme des interfaces de communication active entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières. De plus, des découvertes récentes ont identifié des canaux ouverts dans l'os du crâne, les cellules immunitaires présentes dans la moelle osseuse peuvent accéder au cerveau en cas de maladie ou d'infection, tandis qu'en bonne santé elles atteignent le cerveau et de là libèrent des facteurs solubles qui peuvent façonner le cerveau à distance. Les troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont considérés comme neurodéveloppementaux. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Pour les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, certains traitements existent, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent unanimement que la dérégulation du système immunitaire est au centre de la pathologie. Les signaux inflammatoires dans le cerveau atteint de la maladie d’Alzheimer devraient donc influencer l’activité de la moelle osseuse. En effet, des travaux antérieurs et préliminaires ont montré que le processus de production de cellules immunitaires et d’autres propriétés du tissu de la moelle osseuse sont altérés dans la maladie d’Alzheimer, mais il n’est pas certain que cela soit vrai pour la moelle osseuse crânienne. De plus, nous savons que les signaux immunitaires dérivés de la moelle osseuse via le cerveau peuvent influencer l’activité cérébrale chez les adultes, mais on comprend moins bien si ces signaux contribuent au développement du cerveau. Notre objectif est d’étudier comment la moelle osseuse crânienne est altérée dans la maladie d’Alzheimer et au cours du développement, et si des changements dans dans la moelle osseuse pourraient modifier le développement cérébral ou la progression de la trajectoire de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra d’identifier des facteurs produits par la moelle osseuse du crâne et potentiellement impliqués dans la modulation du développement et du fonctionnement du cerveau dans les cerveaux sains et atteints de la Maladie d’Alzheimer (MA). À court terme, cette étude fournira des connaissances fondamentales sur un nouveau canal de communication cerveau-immunité. Explorer les frontières cérébrales dans cette direction est très important car l’accès des médicaments courants au cerveau est souvent altéré, car de nombreux médicaments ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique. Ces dernières années, nous avons observé d’énormes progrès dans le développement de médicaments pour les maladies cardiovasculaires, les maladies immunologiques et le cancer, mais peu de progrès ont été réalisés en neurologie, en partie à cause de cet obstacle. Par conséquent, la compréhension des voies alternatives vers le cerveau est un défi majeur en neurologie. Plus précisément, à long terme, ces recherches pourraient conduire au développement de nouvelles approches pharmacologiques qui réguleraient cette voie de communication cerveau-immunité pour lutter contre la Maladie d’Alzheimer (MA) ou prévenir le risque d’autisme.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse, une fois par semaine pendant 4 semaines. Ensuite, les souris seront testées pour leur capacité cognitive (sans stress ni douleur) pendant une semaine. Enfin, les souris recevront une injection intrapéritonéale 16h plus tard, une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien et seront mises à mort par exsanguination (élimination du sang). Dans la procédure 2, des souris âgées de 7 jours seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse. Suite à l’injection, les souris âgées de 15 ou 21 jours recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien. Les souris adultes après une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne seront testées pour leur comportement (pas de stress ni de douleur) dans un délai de deux semaines. Apres, les souris recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien.

Impact sur les animaux

Les injections et l'anesthésie peuvent provoquer une légère douleur et un stress temporaire. Nous ne prévoyons pas d'effets négatifs supplémentaires résultant de ces manipulations ou de la nature des substances injectées. Dans de rares cas, les souriceaux après manipulation sont rejetés par la mère et ils peuvent mourir d'hypothermie. Dans des cas sporadiques, une séparation temporaire peut provoquer un stress chez la mère entraînant un cannibalisme chez les souriceaux. De plus, la manipulation des animaux pendant les tests comportementaux peut provoquer un léger stress et un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition.

Remplacement

Notre objectif est d'étudier comment les cellules situées dans la moelle crânienne agissent sur le cerveau, dans le développement et dans un modèle de maladie d’alzheimer (MA). La niche de la moelle crânienne est un organe complexe composé de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu stromal englobant différents types de fibroblastes, d'adipocytes et de cellules immunitaires de l'ensemble de l'arbre hématopoïétique. Notre question est de savoir comment ces cellules et leurs produits atteignent le cerveau et modulent sa fonction. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui capture la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composants endothéliaux, stromaux, immunitaires et neuronaux. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. De plus, l'indicateur le plus fiable de la gravité de la maladie dans les modèles de MA (et les patients) est la mesure de leur capacité cognitive, et pour les modèles de troubles du spectre autistique (TSA) - comportement social, les paramètres ne peuvent pas être testés dans des modèles non animaux.

Réduction

Nous souhaitons étudier les interactions entre le crâne, la moelle osseuse et le cerveau dans les maladies neurodégénératives et le développement. Les quantités d'animaux utilisées pour réaliser notre projet sont établies en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Seuls 10 microlitres du liquide à analyser ( liquide cephalo rachidien (LCR)) peuvent être collectés dans le cerveau d'une souris, ce qui ne permet qu'un seul type d'analyse. Un seul échantillon de crâne et des méninges uniques ne peuvent être utilisés que pour une seule analyse à la fois, mais le cerveau peut être conservé (de plusieurs façons) et utilisé pour plusieurs tests. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences seront réalisées en triples pour obtenir des résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 4 groupes comparés (sains vs. alzheimer et traités vs. contrôle) : les effectifs proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.

Raffinement

Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort. Des injections sous-cutanées (sous la peau) sur le dessus du crâne seront effectuées sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant sur lequel les animaux seront maintenus pendant la procédure et jusqu'à leur réveil pour minimiser l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives. De nombreux anticorps dirigés contre des épitopes murins et permettant l’analyse par imagerie et/ou la déplétion de certains types cellulaires sont également disponibles. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Au cours du développement typique de la maladie de type Alzheimer chez les souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques bêta-amyloïdes dans le cerveau, clairement visibles au microscope, qui se développent à 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, que nous mesurons dans des tests comportementaux. Cet âge peut varier légèrement en fonction de l'animal et du sexe (les femelles développent généralement la maladie plus lentement que les mâles dans ce modèle). Pour capturer ces fenêtres de progression de la pathologie, des injections sous-cutanées pour manipuler le crâne seront administrées aux animaux à l'âge de 3 à 6 ou de 6 à 9 mois et des échantillons seront prélevés à 4, 6 ou 9 mois. Nous injecterons aussi des souris le 7e jour postnatal (P.7) pour pouvoir capturer la fenêtre de développement de la croissance et du recâblage intenses du cerveau, qui se produit vers entre le 10eme et le 20eme jour postnatal. Nous analyserons les cerveaux aux âges entre le 15eme et le 21eme jour postnatal pour capturer tous les changements que la manipulation aurait pu imposer au cerveau et analyserons le comportement des souris adultes après la manipulation pour voir si cela a eu des effets à long terme.

480 souris et 80 rats vont servir à entraîner le personnel aux gestes techniques de l'expérimentation, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chaque animal peut recevoir jusqu'à quinze injections ou gavages et subir cinq prélèvements sanguins, à raison de deux gestes différents par jour. Les animaux mobilisés sont d'abord des surnuméraires et des réformés d'autres études, auxquels s'ajoutent des commandes spécifiques, y compris des souris immunodéprimées. La dernière étape de la formation porte sur la mise à mort elle-même, que le porteur qualifie d'"essentielle", et qui met fin au parcours de chaque animal.

Objectifs

Ce projet encadre l’utilisation d’animaux pour la formation et l’habilitation du personnel sur les différents gestes techniques, invasifs ou non, effectués sur rongeurs au sein de l’établissement et vise à réutiliser au maximum les animaux surnuméraires non-utilisés ou non-randomisés dans des études, dans un souci de réduction tout en tenant compte du bien être animal. L’objectif de ce projet est de fournir les connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Cette formation est obligatoire et permet d’acquérir les compétences nécessaires pour effectuer des gestes techniques auprès de personnes déjà formées (formation par des pairs) et permet de s’assurer que le geste est toujours acquis. Seules des personnes formées et évaluées compétentes pour réaliser les procédures et instructions expérimentales reçoivent l’habilitation pour effectuer ces gestes en autonomie. Pour chaque geste technique enseigné, une session de validation devra confirmer que le tutoré est apte à réaliser le geste technique en autonomie. La formation et les évaluations sont tracées dans le livret de compétence de la personne formée. Le personnel est régulièrement évalué pour s’assurer qu’il maitrise le geste technique. La fréquence des évaluations dépend de la complexité du geste. Ces formations et entraînements s’appliquent aussi bien à une technique existante qu’à une nouvelle technique. La bonne maîtrise des procédures expérimentales non-invasives et faiblement-invasives appliquées sur les rongeurs permettra d’améliorer le bien-être des animaux et d’obtenir des résultats scientifiques fiables et reproductibles. L’utilisation d’animaux n’est réalisée que s’il n’est pas possible d’effectuer la formation par des méthodes alternatives. Par exemple, les techniques d’administrations et de prélèvements, l’anesthésie et l’euthanasie. Ce projet vise à réutiliser au maximum les animaux surnuméraires non-utilisés ou non-randomisés ou réformés dans des études, dans un souci de réduction tout en tenant compte du bien être animal. Cependant, certains animaux pourront être commandés en fonction des besoins (par exemple, dans le cas de la mise au point de nouvelles techniques ou si différentes souches/espèces sont nécessaires à la formation et non présentes sur site…). Lorsque le geste technique est susceptible d’engendrer une douleur ou une souffrance, des anesthésiques et/ou des analgésiques seront administrés.

Bénéfices attendus

Le tutorat pour chaque compétence (instruction), et la validation du tutorat (habilitation), sont indispensables pour la bonne réalisation de procédures expérimentales. Ils permettent de diminuer le temps de manipulation des animaux, de diminuer le stress/souffrance de l’animal, d’éviter les dérives techniques dans le temps, de prendre connaissance des évolutions techniques, d’améliorer la fiabilité des résultats, d’éviter de recommencer des études suite à un biais initié par une mauvaise manipulation technique... Ce projet permet à notre établissement utilisateur de se conformer à la réglementation et de valider les compétences de son personnel impliqué en expérimentation animale tout en réutilisant au maximum les animaux surnuméraires non-utilisés ou non-randomisés dans des études (dans la mesure du possible). De plus, la formation continue des expérimentateurs nous permet de maintenir un niveau de qualité des gestes techniques et également la mise en place de nouvelles procédures/techniques dans le but d’un raffinement.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à des injections intrapéritonéales, intraveineuses, sous-cutanées, intradermiques, des gavages et des prélèvements sanguins sous anesthésie ou en vigile. Le nombre d’actions est limité à : • 2 gestes différents maximum par jour • 15 administrations ou utilisations autres (tonte, mesures physiologiques, poinçonnage auriculaire…) • 5 Prélèvements au maximum (quels que soient les volumes prélevés). Les animaux engagés dans le projet de formation seront euthanasiés après les limites d’utilisation ci-dessus ou en cas d’atteinte des points limites (grille de score détaillée). Les gestes d’administrations ou de prélèvements pourront durer jusqu’à une dizaine de minutes, induction de l’anesthésie exclue, chez une personne non expérimentée en début de tutorat. L’objectif est de pouvoir réaliser ces gestes le plus rapidement possible. Si la technique le permet, le tutoré commencera sa formation sur les animaux anesthésiés avant de passer sur animaux vigiles à l’appréciation de son tuteur.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, mesures tumorales, contention, anesthésie... # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors des injections (intraveineuses, sous-cutanées, intradermiques, intra-péritonéales), et des prélèvements sanguins (veine faciale ou caudale)... #La réalisation de procédures expérimentales en cours de formation peut induire une augmentation du stress, une angoisse et/ou une douleur.

Devenir

La formation à la mise à mort étant essentielle, cette dernière sera effectuée selon la méthode requise à l'issue de toutes les autres formations selon les conditions exposées en 5.10.3. Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, ainsi que l’ensemble des animaux à l’issue de la procédure, seront donc euthanasiés, soit dans le cadre du bien-être animal, soit dans celui de la formation tutorée.

Remplacement

Avant toute manipulation d’animaux, une formation théorique avec des modes opératoires et des vidéos, permettront de limiter l’utilisation des animaux. Pour certaines formations, des supports non vivants pourront être utilisés afin de mimer un animal (par exemple, modèles en silicone pour les voies d’injection ou animal précédament mis à mort pour s’entrainer aux gestes techniques…). L’utilisation de support non vivant dans les premières étapes d’apprentissage d’un geste technique permet d’étendre la période d’apprentissage tout en limitant le nombre d’animaux vivant utilisés et une éventuelle souffrance liée à l’application d’un geste encore mal maitrisé.

Réduction

Pour former le personnel, les animaux de réforme des études de gravité légère ou modérée, ou des animaux surnuméraires seront prioritairement utilisés. Plusieurs procédures faiblement invasives, telles que injections et prélèvements, seront réalisées sur les mêmes animaux dans les limites éthiques prédéfinies (Voir 5.6.1). Le nombre d’animaux nécessaire à la formation est défini par le niveau de connaissance initial et par la technicité du geste à acquérir. Ce nombre est défini par le formateur / la Structure Bien-Etre Animal (SBEA) / le vétérinaire. Le formateur est une personne compétente maîtrisant le geste technique et ayant les capacités de transmettre ses connaissances. Afin de réduire le nombre d’animaux et la souffrance, dans un premier temps, la personne en formation pourra être amenée à observer son formateur et/ou à s’entraîner, si applicable, sur des animaux anesthésiés ou morts. Pour les gestes faiblement invasifs, le formateur / la SBEA / le véterinaire décidera de la possibilité de garder l’animal pour l’acquisition d’un autre geste. Aucune approche statistique n’a été réalisée mais les besoins ont été estimés sur la base de notre l'expérience.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux (cinq souris, deux rats), dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et enrichissement de l’environnement. Dans le cas de l’utilisation d’animaux dédiés, les animaux seront acclimatés pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Dans le cas d’utilisation d’animaux surnuméraires ou de réforme, seuls les animaux en bon état général seront utilisés. L’état des animaux sera régulièrement évalué par le vétérinaire, le formateur, les personnels formés, les zootechniciens. Les procédures réalisées sur chaque animal seront enregistrées. Le nombre de gestes techniques est limité à 15 injections et 5 prélèvements au total pour chaque animal, avec un temps de repos entre chaque acte invasif d’au moins 24h. Dans les heures qui suivent la formation, les animaux seront observés par le tutoré et/ou le tuteur préalablement formés à reconnaître les signes de souffrance d’un animal. En cas de procédure entraînant des effets indésirables inattendus ou une souffrance pouvant perdurer, le vétérinaire, le tuteur ou la Structure Bien-Etre Animal (SBEA), pourront prendre la décision d’euthanasier l’animal. Cet évènement sera alors tracé dans le fichier des déviations BEA et transmis au vétérinaire et la SBEA. Les administrations seront effectuées avec du sérum physiologique (éventuellement colorant). Les prélèvements sanguins respecteront la règlementation en vigueur. Pour les gestes réalisables sur animaux vigiles, une anesthésie gazeuse pourra être privilégiée lors de la réalisation des premiers gestes. Pour les procédures à réaliser sous anesthésie et analgésie, les documents de référence des précédentes demandes d’autorisation de projet seront appliqués. Des anesthésies générales seront pratiquées en fonction des gestes et des attentes et des analgésiques pourront être utilisés en fonction de la gravité du geste. Des grilles de score, spécifiques aux différentes formations, suffisamment prédictives et adaptées aux gestes de la formation, permettront d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Enfin, un système de surveillance est mis en place avec l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les jours suivants, y compris le week-end et jours fériés.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont des espèces couramment utilisées dans la recherche et pour la réalisation d’expériences précliniques. Il s’agit de modèles animaux utilisés au sein de notre établissement utilisateur d’animaux à des fins scientifiques. Ainsi, l’apprentissage des bonnes pratiques permettra aux utilisateurs de réduire la souffrance et les dommages subis par les animaux au cours de la réalisation de ces expériences, tout en permettant la bonne réalisation des procédures expérimentales pour obtenir un résultat fiable en utilisant le moins d’animaux possible. Animaux adultes, à partir de 7 à 8 semaines. L’objectif de formation est d’apprendre la réalisation de ces procédures sur des animaux adultes, les mêmes que ceux utilisés dans le cadre des expériences précliniques. Des animaux immunodéprimés (donc aux phénotypes dommageables) pourront être utilisés lors des formations. Une expérimentation dans un environnement approprié (sans pathogènes spécifiques ni opportunistes) et sous poste de sécurité microbiologique, permettra à ces phénotypes immunodéprimés de ne pas être dommageable dans ces conditions d’expérimentation.

Pour faire franchir à un anticorps anticancéreux la barrière qui protège le cerveau, 60 rats reçoivent un cathéter implanté dans le crâne. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et tous sont tués au bout de quatre semaines, pour l'analyse des tissus cérébraux. Chaque animal subit seize ponctions sous anesthésie générale, huit prélèvements de sang et huit de liquide céphalo-rachidien, étalées sur ces quatre semaines. Le porteur reconnaît que l'acte chirurgical peut léser le cerveau ou la moelle épinière au point d'empêcher l'animal de se nourrir et de boire, et renvoie à des points limites "préalablement définis" sans dire lesquels.

Objectifs

Le cancer du sein métastatique est une cause majeure de mortalité chez les femmes, en particulier un sous type apellé "HER2", est un gros pourvoyeur de métastases cérébrales incurables. Il existe pour ce sous type une thérapie ciblée par anticorps, le trastuzumab. Malheureusement ce traitement, administré ne pénètre pas dans le cerveau en raison d'une barrière protectrice appelée la barrière hémato- encéphalique. Pour la contourner, des injections peuvent être faites directement dans le système nerveux central (SNC) c'est à dire dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Le problème est qu'une fois dans le LCR, les anticorps fuient vers l'extérieur du SNC. Nous avons développé un nouvel anticorps, dont le design permettait d'éviter la fuite du SNC. L’objectif de cette expérience est l’étude pharmacologique de ce composé thérapeutique chez des rats cathéterisés au niveau cérébral, dans l'objectif final de traiter des patientes atteintes de métatastases cérébrales de cancers du sein.

Bénéfices attendus

Notre projet se positionne dans une démarche translationnelle (objectif d'application clinique). Le cancer du sein métastatique est la cause majeure de mortalité chez les femmes. Les métastases cérébrales sont les localisations les plus graves, survenant dans 15 à 40 pourcent des cancers du sein métastatique, avec une survie très faible. Ces expérimentations vont nous permettre de faire une étude de l’efficacité d’une nouvelle molécule thérapeutique avec différents vehicules (des billes d’alginate de différentes taille) afin d’améliorer la formulation de ce traitement. Cette molécule sera par la suite testée lors d’un essai clinique

Procédures

Pour chaque animal, un premier acte de pose de cathéter au niveau cérébral, suivi d’une injection d’un agent thérapeutique se fait sous anesthésie générale (durée de l’opération : 20 minutes). Une analgésie 30 minutes avant opération est effectué ainsi que post-opératoire pendant 24 heures (jusqu’à 72h si nécéssaire). Les prélèvements sanguins et de liquide céphalo-rachidien (durée : 5 minutes) qui vont suivre cette opération se feront en même temps et sous anésthésie générale, à différents temps après l’injection de l’agent thérapeutique pour un total de 8 prélèvements sanguins et 8 prélèvements de liquide céphalo-rachidien espacés sur 4 semaines. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Durant la pose du cathéter, un stress thermique peut être observé pendant l’anesthésie de l’animal. L’acte chirugical peut entrainer des douleurs ou lésions au niveau cérébral et/ou de la moelle épinière. Ces lésions peuvent notament entrainer un problème pour l’animal à se nourrir et à s’hydrater. A cela s'ajoute des nuisances possibles durant les prélèvements (sanguin et de liquide céphalo-rachidien) à type de stress ou douleur lors du prélèvement sanguin.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés au terme des 4 semaines de traitement pour analyses tissulaires du cerveau ou en amont en cas d’atteinte d’un point limite préalablement défini

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'étudier la pharmacologie d’un anticorps encapsulé dans des billes d’alginate après leur injection intra-cérébrale sur des modèles de rats. Des modèles in-vitro existent pour modéliser la barrière hémato-encéphalique. Il est également possible d'évaluer la dégradation des billes d’alginate contenant l'anticorps dans des modèles in vitro. Ces méthodologies permettent de répondre à des problématiques précises mais donnent des informations limitées et peu transférables à l'homme. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaires (et nous avons par ailleurs fait des expériences in-vitro pour ce sujet), mais ne permettent pas de s’affranchir totalement de l’expérimentation animale, en vue d'un essai clinique chez l'homme.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaires pour ce travail selon plusieurs critères: 1) Un calcul statistique de puissance pour une interprétation fiable des résultats. 2) La prise en compte d'un taux de décès per opératoire (tenant compte de notre expérience passée, ce taux d'échec est grandement limité mais dois toutefois être pris en considération) Nous avons donc fixé à 10 le nombre de rats par bras de traitement. Ce projet prévoit 60 rats.

Raffinement

Une période d'acclimatation de 7 jours sera observée à réception des animaux. Un enrichissement des cages sera systématiquement proposé (un abri en plastique rouge translucide). Cette procédure expérimentale sera réalisée par une équipe maitrisant parfaitement le geste chirurgical et les mesures d'asepsie règlementaires. Le geste sera réalisé en conditions stériles, dans une pièce opératoire dédiée. Les mesures d'anesthésie/analgésies seront assurées tout au long de la procédure. Avant la réalisation de la chirurgie (pose de cathéter intrathécal) les animaux recevront une injection d'anesthésique et d'analgésique. L'analgésie sera prolongée systématiquement pendant 24h après le geste, et ultérieurement selon le besoin de l'animal. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs. Si les points limites sont atteints avant la fin de l’expérimentation l’animal sera euthanasié. Les injections et ponctions de liquide céphalo-rachidien et de sang seront réalisées sur animal anesthésié afin de limiter le stress lié à l’acte.

Choix des espèces

Choix des espèces: Notre choix des rats est basé sur la faisabilité technique. En effet, compte tenu de la complexité technique à réaliser la cathéterisation intratécale, il n’est pas possible de réaliser ce projet chez la souris (modèle trop petit). Par ailleurs, pour l'analyse des prélèvements, nous avons besoin d’un volume minimum de liquide céphalo-rachidien (LCR) qui est incompatible avec le volume de LCR chez la souris. Stade de développement: Pour le stade de développement de l'animal, deux critères sont pris en compte: 1) D'une part le taux de réussite de l'anesthésie générale. Cette dernière doit être complète tout au long de la procédure chirugicale. L'efficacité des produits anesthésiques, injectés par voie intra péritonéale, est maximale sur de jeunes animaux avec de faibles réserves en graisses (les anesthésiques s'accumulant dans la graisse avec relarguage continu, nous avons identifié que sur des animaux plus vieux, ayant accumulé d'avantage de graisse, l'anesthésie est moins efficace et le reveil plus long à obtenir en fin de procédure) 2) D'autre part une réserve suffisante de liquide céphalo-rachidien pour les prélèvements répétés. Cette réserve étant directement liée au poids et au stade de développement de l'animal En ce sens, nous avons retenus un stade de développement de 6 semaines, meilleur compromis entre les deux critères.

400 souris vont être utilisées dans le second volet d'un même projet, chacune passant par une ou deux neurochirurgies de deux heures à deux heures trente, puis par vingt jours de contrôle alimentaire et soixante essais comportementaux quotidiens. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau. Le premier volet mobilise 400 autres souris dans les mêmes conditions, ce qui porte l'ensemble à 800 animaux pour une même question. Les retombées cliniques évoquées, l'éclairage de troubles moteurs et perceptifs, restent au conditionnel, quand les lésions cérébrales et la restriction alimentaire, elles, sont programmées.

Objectifs

La prise de décision perceptuelle est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration sensori-motrice fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à un contrôle alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébérgés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Des points limites spécifiques suffisamment précoces seront définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Deux heures trente de neurochirurgie sous anesthésie, puis vingt jours de restriction alimentaire ramenant le poids à 85 % de sa valeur initiale : 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Cent d'entre elles subissent deux opérations, une lésion cérébrale puis l'implantation de sondes, espacées de dix jours, avant d'être hébergées seules pour éviter que les implants ne s'arrachent. L'objectif tient à comprendre comment deux zones du cerveau dialoguent quand une souris décide d'agir après avoir exploré son environnement avec ses moustaches. Le porteur justifie le choix de la souris par une organisation du système nerveux "assez similaire" à celle de l'humain et par une taille de cerveau homogène qui garantit la reproductibilité des sites d'injection.

Objectifs

La prise de décision perceptuelle est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration sensori-motrice fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à un contrôle alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. : ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation quotidienne permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Pour respecter le rythme de vie des animaux et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, les animaux seront hébergés avec un cycle de lumière jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Grâce à un système de programmation de l’éclairage, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit ils seront hébergés avec de la lumière. Les tests comportementaux seront ainsi réalisés lors de l’éveil des souris et elles ne seront pas dérangées lors de leurs phases de sommeil. Les résultats avec ce cycle de lumière inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables et robustes. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture médicamenteuse qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Un client pharmaceutique fait tester son candidat médicament anti-obésité à un stade précoce de développement. 48 souris mâles rendues obèses par un régime dont 60 % des calories viennent des graisses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 95 administrations sous-cutanées et 19 injections intrapéritonéales, subit 45 pesées, cinq prélèvements sanguins précédés d'un jeûne de quatre heures et deux séjours de 72 heures en mesure de dépenses énergétiques, le tout en cage individuelle. L'étude est limitée aux mâles pour ne pas doubler les effectifs, une seconde étude sur des femelles n'étant envisagée que si une efficacité est observée chez les mâles.

Objectifs

Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse, en administration seule ou combinée avec un autre composé anti-obésité déjà autorisé sur le marché. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament seul sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité. Dans le cadre des administrations combinées avec le sémaglutide, l'objectif est d'observer un additivité des effets et, ainsi, une amélioration des effets de la combinaison comparativement au sémaglutide seul.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (45 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou du candidat médicament par voie intrapéritonéale (19 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Administrations de véhicule ou de composé de référence par voie sous-cutanée (95 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (5 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 72h); 7) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 20 semaines (35 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 14 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.

Pesées puis numérotées par poinçonnement de l'oreille sur animal vigile, 600 souris reçoivent une injection dans la veine de la queue, suivie de prélèvements sanguins à dix minutes, six heures, un jour, trois jours et sept jours, puis deux fois par semaine pendant quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Une partie subit en fin d'étude un prélèvement de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil, qui peut provoquer un arrêt cardiaque, suivi d'une dislocation cervicale. L'objet est de mesurer le passage dans le sang de candidats médicaments anticancéreux, en vue de fixer les doses des premiers essais chez l'être humain. Les souris qui n'entrent pas en protocole, et celles qui n'ont pas atteint les points limites, sont "reformées" pour l'entraînement du personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer les données de pharmacocinétiques, c’est à dire le devenir du médicament dans le sang, au cours du temps. Ces données pharmacocinétiques sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront d’évaluer au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité antitumorale et de tolérance qui seront également effectuées sur des modèles souris. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de pharmacocinétique (projet actuel), d’efficacité et de tolérance seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, de définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Une méthode de micro-échantillonage (prélèvement d’un échantillon de volume faible par le biais d’un dispositif adapté) sera utilisée afin d’améliorer la significativité de ces études, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires en prélevant beaucoup moins de volume sanguin et à des fréquences adéquates.

Bénéfices attendus

La pharmacocinétique de composés thérapeutiques est un élément essentiel pour analyser le comportement des candidats médicaments dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et de tolérance et permettront, à terme de déterminer les doses et fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

1/ Après une semaine de stabulation, les souris seront pesées (maximum 1 min) et numérotées vigiles par poinçonnement auriculaire (maximum 3 min). 2/ Une contention suivie d'une injection/prélèvement sur animal vigile sont prévues sur chaque animal (1 à 3min) : - lors de l’injection par intraveineuse dans le veine caudale des candidats médicaments (t-0). - Lors de chacun des prélèvements dans la veine caudale et échantillonnage par microcapillaire. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin terminal de grand volume (3 min), pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil (maximum 3 min), suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale (maximum 1 minute).

Impact sur les animaux

1/ La contention et les injections/prélèvements induisent un stress de l’animal durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte - de 1 à 5 minutes). 2/ les injections/prélèvements induisent un stress et une douleur de type modérée durant plusieurs secondes (pendant l’acte - de 1 à 5 minutes). Note : Les composés de cette classe thérapeutique, injectés à cette dose sont parfaitement tolérés dans la littérature et n'induisent pas d’évènements indésirables à la dose utilisée. Ces derniers seront néanmoins surveillés lors de chaque manipulation. 3/ En fonction des expériences, un prélèvement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil, suivi d'une mise à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les animaux ayant atteint un point limite par rapport à la grille de score, seront euthanasiés. En fonction des besoins de l'expériences et de l'avis vétérinaire, les animaux inclus en expérience n'ayant pas atteint les points limites seront soit euthanasiés en fin de procédure pour un prélèvement terminal sans réveil suivi d'une nécropsie, soit reformées pour entrainement aux geste techniques sur avis vétérinaire. Les souris non entrées en protocole seront reformées pour entrainement aux geste techniques.

Remplacement

S’agissant d’analyses pharmacocinétiques, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs et robustes. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet se comportant de façon identique dans la souris comme chez l’humain (cible exprimée de la même façon et sans mutation entre les deux espèces), aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus sont également mieux maitrisées. Ainsi, seuls 4 à 5 animaux par groupe seront nécessaires pour ces expériences. Une majoration de 20% sur ce nombre d’animaux est appliquée en cas de problèmes à l’injection ou en cas de manque d’homogénéité entre les différents animaux au moment de l’entrée en expérimentation (pouvant mettre en péril les résultats de cette expérience).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu'un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Afin de de mettre en évidence tout signe de souffrance ou d’évènements indésirables pouvant provenir du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement et avant chacun des prélèvements (10 min, 6h, 1 jour, 3 jours, 7 jours) puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront également pesés avant le traitement, puis 1 jour, 3 jours, 7 jours post-traitement, puis deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Les animaux seront euthanasiés à la fin du dernier prélèvement (à 28 jours post-traitement). Une grille de score suffisamment prédictive et adaptée à l’étude, permettra d'éviter la souffrance des animaux avec une surveillance physiologique et comportementale. Un système de surveillance sera mis en place avec l’Etablissement Utilisateur (EU) pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue les autres jours, y compris le WE. Un prélèvement sanguin final de grand volume (par piqure dans le coeur) pourra être effectué sous anesthésie/antalgie générale sans réveil suivi d’une mise à mort par dislocation cervicales. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

Les études pharmacocinétiques nécessitent d’être effectuées dans un organisme vivant. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études (permettant de transposer ces données chez l’Homme). En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de tolérances seront également générées sur cette espèce animale afin de déterminer au mieux les doses cliniques à injecter de ces candidats médicaments. Des souris de souche CD-1 seront utilisées car plus massive et bien adaptée à ces expériences nécessitant des prélèvements répétés. Ces animaux seront inclus en expérience à des âges de 8-9 semaines. A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une pharmacocinétique pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.