Rongeurs

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  • Recherche fondamentale
    • Système nerveux
Souris : 2070
Souffrances
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▲ 1150
▲ 340
▲ 580
Devenir
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 2070

2 070 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever des tissus, et chacune passe d'abord par une biopsie de la queue à six jours, un génotypage que le porteur qualifie lui-même d'invasif. 1 150 sont soumises à des procédures d'un niveau de souffrance léger, 340 modéré, 580 sévère. Un groupe reçoit une injection dans les deux yeux sous anesthésie, avec un risque de lésions oculaires, un autre une injection intrapéritonéale par jour pendant quatre semaines, pouvant provoquer inflammations et lésions locales. Les souris atteintes de la maladie de Niemann-Pick perdent l'équilibre et la coordination, tremblent et maigrissent à partir de six semaines, et le porteur revendique d'avoir choisi la lignée aux symptômes les plus précoces pour que les animaux "souffrent moins" en étant gardés moins longtemps.

Objectifs

La maladie génétique rare étudiée se manifeste par des symptômes métaboliques et neurologiques très variés. Elle est difficile à diagnostiquer et d’évolution fatale. Actuellement, il n'y a pas de traitement curatif. Le but principal de ce projet est de mieux comprendre l'effet de molécules potentiellement thérapeutiques sur l'accumulation pathologique de cholestérol dans cette maladie en utilisant des souris comme modèle expérimental. Deuxièment, l'objectif est de décrire plus précisément les changements pathologiques de ce modèle murin, à l'âge de 10 semaine, stade tardif de la maladie.

Bénéfices attendus

Il s'agit de valider in vivo l'effet de candidat médicament dans un modèle murin de maladie génétique d'accumulations pathologiques de lipides, et à la fois d'obtenir des connaissances approfondies du modèle à 10 semaines.

Procédures

Un groupe d'animaux anesthésiés 10 minutes recevra une injection unique dans l'oeil qui permet de cibler et délivrer une molécule aux neurones de la rétine par une voie modérement invasive. Le deuxième groupe d'animaux vigiles recevra une injection une fois par jour d'une molécule thérapeutique pendant 4 semaines. Pour constituer les groupes expérimentaux, tous les animaux seront génotypés par un génotypage de type "invasif", en biopsiant la queue des souris vers l'âge de 6 jours.

Impact sur les animaux

Les injections intraoculaires bilatérales sous anesthésie générale peuvent générer un inconfort passager, et potentiellement un risque de lésions oculaires. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent stresser les souris et provoquer des inflammations ou des lésions locales qu'il faudra surveiller Quant aux souris âgées de 10 semaines, elles développent des symptômes neurologiques (pertes d'équilibre et coordination, tremblements) accompagnés d’un amaigrissement à partir de 6 semaines d'âge.

Devenir

Les souris sont mises à mort pour prélever des tissus.

Remplacement

Nous sommes obligés d'utiliser des animaux pour étudier les effets de molécules comme therapeutiques dans la maladie. Ces mécanismes dépendent d’interactions complexes entre une multitude de types cellulaires hautement spécialisés qui ne peuvent pas être imitées par des modèles alternatifs in vitro.

Réduction

Nous utilisons mâles et femelles pour réduire de moitié le nombre de souris. Et chaque souris est son propre contrôle et permet ainsi de réduire encore de moitié le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Les conditions d'hébergement des souris seront raffinées : les souris d'une même portée seront gardées ensemble après le sevrage jusqu’au moment de leur mise à mort et les cages sont enrichies avec du matériel de nidation et de barreaux à ronger. Elles seront nourries avec des bouchons ainsi qu’une forme gélifiée (pour faciliter la préhension) du même aliment, placés directement dans la litière pour faciliter l’accès aux souris si elles présentent des troubles locomoteurs. Les souris seront maniées à l'aide d'un tunnel de manipulation. Un suivi clinique quotidien sera assuré (ouverture de la cage pour l’examen du comportement locomoteur), ainsi que celui du poid. Une partie des injections sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Nous avons aussi établi des points-limites permettant de soustaire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris représente un modèle animal bien établi et reconnu pour étudier la rétine des mammifères et ses maladies. Il existe d’autres lignées murines et félines avec des mutations naturelles ou induites dans le même gène. Nous préférons utiliser la lignée choisie car elle développe les symptômes plus tôt et plus rapidement. Par conséquent, les souris souffrent moins que dans les autres modèles, qui ont besoin d'être maintenus plus longtemps. Dans l'étude de candidat médicament, les animaux seront utilisés à 4 semaines, soit après le sevrage et ne présenteront pas encore de symptôme de la maladie. Pour étudier et décrire les changements pathologiques très tardifs de la maladie, nous utiliserons des animaux âgés de 7 et 10 semaines.

  • Maintien des lignées génétiquement modifiées
Souris : 2484
Souffrances
▲ -
▲ 72
▲ 2412
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Devenir
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 279
 2205

Ces souris portent, par construction génétique, une prédisposition au cancer du côlon, du poumon, du sein, des glandes salivaires ou au lymphome. 2 484 vont être utilisées pour maintenir cinq lignées, 72 dans des procédures au niveau de souffrance léger et 2 412 au niveau modéré. Le geste infligé se limite à une biopsie de queue de dix secondes sous contention avant le sevrage, le dommage venant du génome : pâleur des pattes et ventre gonflé pour la lignée colique, halètement et difficultés respiratoires pour la lignée pulmonaire, tumeurs salivaires gênant l'alimentation chez 11 % des mâles de la lignée mammaire, dont les femelles ne sont pas mises à la reproduction faute de pouvoir allaiter. 279 souris seront réutilisées dans d'autres procédures, et celles qui n'ont pas le génotype attendu sont gardées soit pour des prélèvements après leur mise à mort, soit pour l'entraînement à des gestes techniques.

Objectifs

Le cancer est la première cause de mortalité prématurée en France. Il n'existe pas de modèles cellulaires suffisamment complexes qui puissent mimer le développement d'un cancer. Aussi, dans le but d’étudier les cancers, les chercheurs ont développé, par des techniques de génie génétique, des modèles animaux qui reproduisent la pathologie humaine. Pour des raisons techniques, ces modèles ont été développés chez la souris. L’objectif est de maintenir 5 modèles murins transgéniques, sous forme respirante, qui sont des outils indispensables pour les études en oncologie. Ce maintien se fera par un élevage contrôlé afin d’éviter des naissances en grand nombre mais permettant de sélectionner les animaux possédant le gène d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet permet l'élevage a minima de 5 modèles murins transgéniques, qui sont des outils indispensables pour les études en oncologie en mettant au point les méthodes les moins invasives possibles pour les analyses génétiques.

Procédures

Un prélèvement sera fait à l’extrémité de la queue, à l’âge de 21 jours au plus tard (1 fois, 10 sec), si besoin. Pour cela, les animaux seront sous contention et le geste sera effectué par du personnel formé. Les souris transgéniques décrites dans ce projet sont des modèles de prédisposition à des cancers du côlon : développement de tumeurs à partir de 4 mois , du poumon : le premières lésions apparaissent entre 6 et 8 semaines, du sein : seuls les mâles sont mis en accouplement, des tumeurs salivaires peuvent apparaitrent à partir de 6 mois (les femelles ne peuvent pas être mise en accouplement car le phenotype apparait trop tôt et n'ont pas la possibilté d'allaiter leurs petits), du lymphome : la viabilité chez les souris hétérozygotes n'est pas affectée jusqu'à l'âge de 9 mois.

Impact sur les animaux

Biopsie de queue : saignement possible, douleur de courte durée. Les nuisances possibles et spécifiques sur les souris à phénotypes dommageables seraient les suivantes : -Souris prédisposant au cancer du côlon : pâleur des pattes, gonflement du ventre. -Souris prédisposant au cancer du poumon : difficultés respiratoires, halètement. -Souris prédisposant au cancer du sein, seuls les mâles sont mis en reproduction, dans 11% des cas : tumeurs au niveau des glandes salivaires : difficultés d’alimentation et abreuvement.

Devenir

Les animaux ayant le génotype d’intérêt seront conservés pour maintenir l’élevage des lignées de souris génétiquement modifiées ou seront utilisés pour des expérimentations futures. Les souris n'ayant pas le génotypage requis, tous élevage confongus, seront gardés pour des prélèvement post-mortem ou bien pour la formation à des gestes techniques.

Remplacement

Il n'existe pas de modèles in vitro suffisamment complexes qui puissent mimer le développement d'un cancer. Ce projet a pour but de maintenir sous forme respirante des souris développant des cancers qui miment les cancers chez l'Homme. Ces modèles permettent d'apporter des outils pour le traitement des cancers chez l'Homme. Ces modèles sont utilisés régulièrement par les chercheurs, c'est pourquoi il est proposé dans cette demande de les maintenir sous forme respirante.

Réduction

Aucune approche statistique ne sera mise en œuvre. Le nombre d’animaux pour le maintien d’un élevage de souris est maintenu au minimum. Il est important de noter que le croisement de lignées entraine la production d’animaux de génotype non utilisables dans les projets. Le nombre d’animaux prévu dans ce projet a été estimé de par l’expérience des années précédentes et des besoins prévisionnels des chercheurs.

Raffinement

La biopsie de la queue ne sera réalisée qu’en cas de nécessité avant l’ossification de la queue (28 jours) et avant le sevrage, ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. La taille de la biopsie est réduite à son minimum et représente au maximum 1mm. Un enrichissement avec maison et cotons sera fourni dans les cages d’accouplement afin de limiter le stress et permettant aux femelles gestantes de faire un nid caché pour la mise bas. Pour chaque lignée, des points limites prédictifs et précoces sont définis afin de limiter toute souffrance. Les animaux seront mis à mort avant l’apparition des signes cliniques spécifiques à chaque lignée. De l’aliment humidifié sera mis en fond de cage, si besoin.

Choix des espèces

Les souris ont été les premiers mammifères à permettre la manipulation du génome. Grâce à cette manipulation du génome, des modèles souris mimant les maladies humaines ont été créés en grand nombre. Parmi ces modèles figurent des modèles de prédisposition à des cancers. Les animaux sont utilisés pour des accouplements, ils doivent avoir atteint la maturité sexuelle c'est-à-dire à partir de 6 semaines.

  • Recherche fondamentale
    • Système nerveux
Rats : 30
Souffrances
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▲ 30
Devenir
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 30

Une canule est implantée à travers l'os du crâne, juste au-dessus des méninges, pour y déposer des substances inflammatoires douze fois en quatre semaines. 30 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le cerveau et d'autres organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque injection est suivie de l'application de filaments de von Frey sur la face toutes les quarante-cinq minutes pendant trois heures, et les rats vivent seuls en cage pendant six semaines parce qu'ils s'arrachent mutuellement les canules. Le porteur qualifie cette douleur de modérée et souligne que l'animal peut se soustraire à la stimulation, quand le projet est lui-même déclaré en gravité sévère.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine qui nous permettrait de tester sur plusieurs semaines différentes molécules pharmacologiques comme traitements de la migraine. Avant de pouvoir commencer une étude pharmacologique où de nouvelles molécules seront testées, nous devons être sûrs d’avoir un modèle stable à travers le temps. C’est pourquoi nous souhaitons réaliser une étude pilote qui nous permettra de tester le modèle et de s’assurer qu’il répond aux molécules couramment utilisées pour traiter la migraine, à savoir les triptans. Pour cela, nous souhaitons mimer la phase de « mal de tête » (céphalée), en injectant des substances inflammatoires à la surface des méninges. En effet, pendant cette phase, la douleur ne peut être déclenchée qu’au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. L’hypothèse actuelle est que cette douleur est la conséquence d’une inflammation provoquée par des molécules (histamine, bradykinine, sérotonine, prostaglandines…) libérées par les fibres nerveuses au niveau des méninges. Une fois cette phase réalisée, nous testerons l’efficacité des triptans dans ce modèle. Nous évaluerons les effets de cette molécule au niveau du comportement, mais également en utilisant des marqueurs d’activation neuronale chez le rat mâle.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote nous permettra d’étudier à plus long terme (sur 5 semaines au total) l’effet des injections répétées des substances inflammatoires. Notre hypothèse est que nous aurons une allodynie stable suite à la première semaine d’injection que nous entretiendrons par 1à 2 injections de substances inflammatoires par semaine, ce qui nous permettra de tester des substances pharmacologiques qui pourraient apporter une nouvelle réponse thérapeutique aux patients migraineux. Dans cette première étude, nous validerons notre modèle par l’étude de l’efficacité des triptans (traitement de référence des crises de migraine) au cours du temps.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale qui consiste à implanter une canule juste au-dessus des méninges en passant à travers l’os du crâne, pour appliquer à la surface des méninges des substances chimiques, ce qui permettra de mimer ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. L’injection de ces molécules sur les méninges permet de mimer les crises de migraine: 12 injections sur 4 semaines (au maximum) ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. La mesure de la sensibilité cutanée se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal sur la face toutes les 45 min pendant 3 h après l'injection des molécules sur la dure-mère (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.

Impact sur les animaux

Nous réalisons une procédure chirurgicale (implantation de la canule). La douleur est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments fins induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure 3 secondes maximum. Un dernier effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 6 semaines.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau ainsi que d'autres organes pouvant servir à d'autres études : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe. Pour réduire le nombre d’animaux, cette étude ne sera réalisée que chez les mâles puisque c’est une étude pilote pour valider le modèle. Par ailleurs des études antérieures nous ont montré que l’injection de ces substances induisaient le même effet chez les mâles et les femelles. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera de mettre à mort de nouveaux animaux pour ces autres études.

Raffinement

Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par la chirurgie, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement avec un antalgique est donné pendant 3 jours. Pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie, la cornée est protégée par de la vaseline pendant toute cette étape. Concernant la douleur générée par l’application des filaments de Von Frey, nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour améliorer le bien-être des animaux après la chirurgie, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux seront seuls dans une cage pour éviter de s’arracher les canules. Les rouleaux seront remplacés (risque d’arracher la canule) par des feuilles de sopalin blanc et des lanières de papier kraft pour permettre aux animaux de faire un nid.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

  • Recherche fondamentale
    • Système immunitaire
Souris : 500
Souffrances
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▲ 500
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Devenir
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 500

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections sous anesthésie et subissent trois prélèvements de sang, le porteur signalant qu'elles peuvent développer des ulcérations de la peau ou du muscle au point d'injection, ainsi que des décolorations de l'œil et des lésions de la cornée avant la prise de sang. Leur sang doit fournir des anticorps dirigés contre des fragments de protéines communs au virus d'Epstein-Barr et au SARS-CoV-2, anticorps qui serviront ensuite d'outils de laboratoire. Le porteur indique que ces anticorps ne peuvent être produits qu'à partir d'animaux vivants, et justifie la mise à mort par le fait qu'il ignore leurs effets sur l'organisme des souris et le risque de souffrance supplémentaire.

Objectifs

L'objectif de ce projet repose sur la production d'anticorps contre des séquences spécifiques de virus humains tels que Epstein-Barr (virus de l’herpès) et le SARS-CoV-2 (COVID-19). Ces anticorps sont un outil important pour étudier les maladies auto-immunes causées par ces virus.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra aux chercheurs de mieux connaître les effets du SARS-CoV-2 et de l'infection par le virus d'Epstein-Barr sur l'homme et leur relation avec le développement de maladies du système immunitaires, les maladies auto-immunes

Procédures

Trois injections sont réalisées sur animal anesthésié. Trois prélèvements sanguins sont effectués sur animal vigile. Temps : injections : 1 minute/souris Prélèvement sanguin : 2-5 minutes/souris

Impact sur les animaux

Les souris peuvent développer des lésions cutanées ou des ulcérations au niveau de la peau ou du muscle après l'injection, ainsi que des décolorations de l'œil et des lésions cornéennes avant le prélèvement de sang.

Devenir

Une fois l'immunisation terminée et le sang recueilli pour l'extraction des anticorps, les animaux ne pourront plus être utilisés à d'autres fins. À ce jour, nous ne connaissons pas encore les effets possibles de ces anticorps sur l'organisme ni s'ils pourront induire des altérations du système immunitaire susceptibles de provoquer des maladies chez la souris et donc d'entraîner une souffrance supplémentaire.

Remplacement

Notre récente étude a déjà identifié un groupe de peptides présents dans le protéome humain et partageant des séquences avec les virus Epstein-Barr et SARS-CoV-2. L'objectif du projet actuel est à présent de produire des anticorps contre les peptides caractérisés et de pouvoir étudier leur effet sur un organisme vivant complexe. Cela nécessite d’induire des anticorps contre ces peptides, ce qui ne peut être généré que chez -ou à partir- d'animaux vivants et de prélèvements de tissus à la fin de la procédure.

Réduction

Le nombre d'animaux employés est basé sur les travaux rapportés dans la littérature. Il a été établi pour nous permettre d’obtenir des anticorps en quantité suffisante pour poursuivre nos travaux.

Raffinement

À leur arrivée dans l'établissement, les animaux seront répartis en groupes sociaux dans des cages contenant l'enrichissement approprié (matériel de nidification, tubes, bâton à ronger). Ils y resteront pendant 2 semaines pour favoriser un bon acclimatement. L'injection et le prélèvement de sang seront effectués sous anesthésie gazeuse. Une solution saline sera injectée pour prévenir la déshydratation, et une goutte d'anesthésique sera appliquée sur l'œil. En cas de douleur musculaire, un analgésique sera administré. Nous avons défini les points limites pour déterminer le degré de souffrance que l'animal peut rencontrer après la procédure, incluant : perte de poids, lésions cutanées, température, expressions faciales et lésions oculaires.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme, et leur système physiologique mime les observations faites chez l'homme. Aujourd'hui, la souris représente le meilleur modèle pour induire des anticorps comme outils. Des souris âgées de 6 à 8 semaines seront incluses. À cet âge, les souris sont considérées comme des adultes et leur système immunitaire est pleinement développé.

  • Maintien des lignées génétiquement modifiées
  • Recherche fondamentale
    • Autre recherche fondamentale
    • Oncologie
Souris : 10000
Souffrances
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▲ 10000
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Devenir
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 10000

10 000 souris génétiquement modifiées vont être triées selon leur génotype, entre celles qui serviront aux protocoles ou à l'élevage et celles dont personne n'aura l'usage. À vingt et un jours, chacune se fait couper moins d'un millimètre du bout de l'oreille, sur animal vigile et sans anesthésie, dans une procédure classée au niveau de souffrance léger. Le porteur écrit qu'anesthésier les petits "ajouterait une nuisance non nécessaire", et que cette méthode restera en usage jusqu'à la validation d'un génotypage sur des poils. Les souris jugées non utiles sont mises à mort et proposées aux membres du laboratoire pour des prélèvements d'organes, le chiffre de 10 000 sur cinq ans n'étant rattaché à aucun besoin chiffré.

Objectifs

Ce projet vise à assurer la conservation des lignées de souris modifiées génétiquement présentes dans notre laboratoire et que nous utilisons dans nos différents projets de recherche. Avant de les utiliser pour des expériences ou pour créer de nouvelles générations, il est important de les caractériser précisément. Pour cela, nous devons identifier et prélever un échantillon sur chaque souris dans notre animalerie en utilisant une méthode qui nous permet de connaître très précisement les mutations dont ils sont porteurs.

Bénéfices attendus

La caractérisation génétique permet d’optimiser la gestion de l’élevage et de produire les animaux d’intérêt, c’est-à-dire nécessaire au maintien de la lignée et/ou aux protocoles expérimentaux.

Procédures

Pour chaque animal vigile (21 jours +/- 1 jour), 1 prélèvement de bout d’oreille inférieur à 1 mm sans anesthésie. Extrêmement rarement, pour vérifier des résultats ou en cas d'échec du génotypage, un prélèvement de bout d'oreille (

Impact sur les animaux

Le prélèvement d’un bout de l’oreille sur animal vigile est réalisé sur moins de 1mm et et par un personnel expérimenté pour limiter la douleur et le stress. En cas d’un deuxième prélèvement en dehors de l’âge limite (>21 jours +/- 1 jour) en cas d'échec du génotypage, l’individu est anesthésié profondément à l’isoflurane.

Devenir

Dés résultat de génotypage, les animaux non utiles seront mis à mort. Les animaux utiles pour les projets ou l'élevage seront maintenus en vie et seront en utilisation continue pour des expériences qui seront décrites dans des DAP spécifiques. Dans la mesure du possible, les animaux génotypés non utilisables sont proposés aux membres du laboratoire pour prélèvements d’organes.

Remplacement

Pas de remplacement possible sur le projet de prélèvement de tissus pour génotypage tant que la méthode de génotypage par prélèvement de poils n'est pas validée sur nos lignées. L’approche de remplacement est prise en charge dans chaque DAP expérimentale.

Réduction

La reproduction n’est utilisée que pour produire le nombre d’animaux prévue dans la DAP d’expérimentation considérée ou la DAP d’élevage nécessaire au maintien de la lignée. Les caractéristiques de reproduction propres à chaque lignée (nombre de petits par portée, nombre de modifications génétiques, ratio homozygote/hétérozygote…) sont prises en compte pour planifier la fréquence et le type de croisements.

Raffinement

Les gestes invasifs tel que la pose d’une bague et la biopsie sont réalisés par des personnels expérimentés, selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée, limitant stress, douleur et saignement. L'anesthésie n'est prévue que sur les animaux de plus de 21 jours. L'anesthésie chez les petits ajouterait une nuisance non nécessaire. Une surveillance et un suivi de la cicatrisation sont réalisés dans les jours suivant le prélèvement. Cette méthode de prélèvements de tissus sera utilisée jusqu’à validation des procédés de génotypage à partir de prélèvements de poils, procédure moins invasive.

Choix des espèces

Les lignées en élevage sont définies par les besoins des projets autorisés. Les animaux seront prélevés d’un bout d’oreille (

  • Recherche fondamentale
    • Oncologie
Souris : 360
Souffrances
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▲ 360
Devenir
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 360

Anesthésiées, tondues sur le flanc, injectées de cellules cancéreuses, 360 souris entrent dans un protocole de vingt à vingt-quatre jours classé au niveau de souffrance sévère. Dès que la tumeur atteint le volume fixé, 120 reçoivent une chimiothérapie au platine chaque jour pendant six jours, 240 une injection dans la tumeur tous les quatre jours, dont 120 les deux traitements à la suite. Toutes sont pesées deux fois par semaine et leurs tumeurs mesurées au pied à coulisse sur animal vigile, cinq minutes par mesure, le porteur écrivant qu'aucune analgésie n'est préconisée aux doses utilisées et que le développement tumoral ne devrait pas gêner leurs déplacements. Toutes sont tuées à la fin pour récupérer les échantillons qui permettront de juger de l'effet des traitements.

Objectifs

Le cancer du poumon (dont 85% sont des cancers bronchiques dits non à petites cellules ou NSCLC) reste la 1ère cause de mortalité par cancer dans les pays développés avec plus d’1 million de décès par an dans le monde. Le traitement de 1ère intention des NSCLC se fait par chirurgie mais un 1/3 des patients présente des stades trop avancés de la maladie rendant ainsi l’ablation de la tumeur impossible. La chimiothérapie (utilisation de sels de platine) représente une facette essentielle dans la prise en charge des patients atteints de cette pathologie. Même si ces agents anticancéreux éliminent une grande majorité des cellules tumorales pulmonaires, il est fréquent qu’une proportion d’entre elles résiste favorisant ainsi l’apparition de récidives et de métastases. Dans ce contexte, des analyses sur des cohortes de patients ont montré que dans de nombreuses tumeurs présentant une résistance à la chimiothérapie le gène codant une protéine particulière était surexprimé. Cette protéine, la mucine 1, est notamment impliquée dans la protection des cellules en contact avec le milieu extérieur contre toutes sortes d’agressions. Dans ce projet, nous nous intéresserons donc à la mucine 1. Dans le cancer du poumon, elle est surexprimée dans 60-80% des adénocarcinomes en comparaison avec un poumon sain. Les données de la littérature montrent que la surexpression de la mucine 1 est associée à la progression tumorale, aux phénomènes de chimiorésistance et la mise en place d’un microenvironnement immunosuppresseur (qui supprime la réponse immunitaire face à la tumeur). De ces observations, nous avons émis l’hypothèse que la mucine 1 pourrait être impliquée dans les phénomènes de chimiorésistance au cisplatine et interviendrait également sur les propriétés des cellules cancéreuses pulmonaires et sur le microenvironnement tumoral. Afin de valider cette hypothèse, nous étudierons le rôle de la mucine 1 sur les propriétés et le microenvironnement des cellules cancéreuses pulmonaires et nous évaluerons de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester le bénéfice de nouvelles stratégies thérapeutiques associant des inhibiteurs oligonucléotidiques à des agents de chimiothérapie conventionnelle.

Procédures

Ce projet se déroulera en deux parties. Cependant, plusieurs étapes sont communes à l’ensemble des parties. L’ensemble des animaux (360) sera soumis à une anesthésie par injection (durée 20 min) afin, dans un premier temps de tondre une partie de leur pelage au niveau du flanc où ils recevront une injection de cellules cancéreuses (durée injection : 30 sec). Dès que le volume tumoral défini pour intervention sera atteint, une partie des animaux (120) recevront une injection d'un agent de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours (durée : 1 min). L'autre partie des animaux (240) recevront dans un premier temps une injection dans la tumeur de notre traitement d'intérêt à raison d'une injection tous les 4 jours jusqu'à la fin du protocole (durée : 1 min). En addition de ce traitement, 120 animaux seront en plus traités par la suite avec l'agent de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours (durée : 1 min). L'ensemble des animaux (360) seront pesés deux fois par semaine (durée : 2 min par animal) et la taille des tumeurs sera mesurée par l’utilisation d’un pied à coulisse (sur animaux vigiles, durée : 5min/intervention). De plus, pour 120 animaux, l'évolution de la tumeur sera également évaluée par imagerie. Pour cela les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et une molécule facilitant la lecture de l'imagerie sera injectée (durée anesthésie : 20-30 min, durée injection : 30 sec). La durée maximale des manipulations sera de 24 jours pour 240 animaux et de 20 jours pour 120 animaux et ce, dépendamment du type de cellules tumorales injectées.

Impact sur les animaux

Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation. L’injection des cellules et/ou de la luciférine pourrait entraîner un stress ou une douleur chez les animaux. Pour limiter le stress des animaux, ces derniers seront anesthésiés lors de ces étapes de la procédure. Aux sites où les cellules seront injectées, le développement des tumeurs ne devrait pas entraver la liberté de mouvement des souris, cependant si cette liberté était altérée, une mise à mort des animaux sera réalisée. Les doses d'agent de chimiothérapie et du traitement d'intérêt utilisés dans ce protocole ne sont pas décrits dans la littérature comme susceptibles d’induire des effets indésirables (toxicité) sur les animaux. De même, aucune analgésie encadrant leurs injections intra-tumorales n’est préconisée au vu des doses utilisées. Le suivi régulier des animaux permettra de pallier toute souffrance ou détresse ressenties par ces derniers.

Devenir

TDans ce projet, nous étudions l'effet d'une nouvelle combinaison de traitements sur des tumeurs établies. Afin de mieux comprendre l'impact de nos traitements sur l'organisme, nous devrons récupérer différents échantillons nécessitant la mise à mort des animaux.

Remplacement

Les modèles utilisés dans ce projet ne nécessitent pas de mises au point car elles utilisent des procédures couramment décrites dans la littérature. De plus, les sélections de Gapmers ont été réalisés sur des modèles in vitro de manière à remplacer la mise au point sur les animaux. Cependant, les processus étudiés dans ce projet mettent en jeu de nombreux types cellulaires (cellules tumorales et celles du microenvironnement dont celles du système immunitaire), leur étude en concomitance ne peut se concevoir que sur un organisme entier d’où ce recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Pour la reproductibilité, les expériences seront répétées au moins 3 fois. Les courbes de survie seront établies grâce à un test statistique spécifique dont la fiabilité prévoit des échantillons d’une taille minimum de 30 animaux. Pour cela, des groupes de 10 animaux sont prévus. Les différences significatives entre les courbes de survie des animaux des groupes traités ou non seront analysées par un test statistique adapté aux données. Les différences significatives entre les courbes de survie des animaux des groupes traités ou non seront analysées par un test statistique adapté aux données.

Raffinement

Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles en groupes sociaux enrichies avec des cotons de nidification et dans des conditions classiques de stabulation. Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Des points limite de douleur ont été déterminés préalablement au projet. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale repose sur la grande disponibilité des outils moléculaires (anticorps spécifiques pour l’immunohistochimie, le western blot et la cytométrie en flux, souches animales adaptées, amorces et sondes spécifiques pour la RT-qPCR) permettant de mener à bien ce projet. De plus, cette espèce est l’une des mieux caractérisée au niveau immunologique. Nous pouvons également bénéficier de modèles immunodéficients largement décrits dans la littérature qui sont essentiels au bon déroulé de notre projet. En nous basant sur les données de la littérature concernant les modèles que nous souhaitons étudier, nous utiliserons des souris âgées de 4 à 8 semaines pour le premier modèle et de 6 à 10 semaines pour le second modèle.

  • Recherche fondamentale
    • Multisystémique
    • Oncologie
    • Système cardiaque
Souris : 324
Souffrances
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▲ 324
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Devenir
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 324

Rendues obèses par une suralimentation organisée dès après leur naissance, les souris de ce projet doivent développer un trouble du rythme cardiaque. 324 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie un capteur d'électrocardiogramme implanté par trois incisions, quatre injections intraveineuses de microvésicules, et passe deux séjours en cage individuelle que le porteur reconnaît stressants. Vient ensuite une exploration électrophysiologique par l'œsophage, dont il indique que l'animal n'est pas réveillé, et il affirme que ces altérations ne s'observent que dans un "organisme entier", aucun modèle cellulaire ou in silico ne pouvant répondre à la question posée.

Objectifs

La fibrillation atriale est une trouble du rythme cardiaque, qui fait battre le coeur de manière irrégulière, c’est-à-dire de façon arythmique. Son apparition est favorisée par l’obésité et l’altération des vaisseaux sanguins. Dans ce projet, notre hypothèse est qu’une protéine sécrétée par ces vaisseaux, nommée brain-derived neurotrophic factor, généralement appelée BDNF est impliquée dans cette dysfonction du coeur. A partir de souris en surpoids à cause d’une suralimentation postnatale, invalidées ou non pour le gène du BDNF, nous allons vérifier en mesurant leur électrocardiogramme si cette protéine est vraiment impliquée dans ce trouble électrique du coeur.

Bénéfices attendus

L'un des principaux résultats du projet sera d'aborder le rôle du BDNF dans la FA métabolique d'un point de vue translationnel, ce qui ouvre la voie à la découverte de nouveaux mécanismes, cibles et médicaments grâce à la genèse d'un large éventail de données innovantes. Par exemple, certains résultats obtenus sur nos modèles expérimentaux pourraient être pris en compte dans des études cliniques à grande échelle afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques pour traiter ou prévenir la FA. Ces résultats serviront à guider le volet clinique de ce projet. Ainsi, notre projet a des impacts scientifiques, socio-économiques et cliniques élevés. Les données obtenues dans ce projet seront régulièrement présentées à la communauté scientifique lors de conférences nationales et internationales. Les résultats seront publiés dans des revues d’audience internationale à comité de lecture.

Procédures

Les animaux des groupes ‘SAPN’ auront une prise de poids supérieure aux animaux non SAPN, conduisant ce groupe à un surpoids. Les animaux seront soumis sous anesthésie gazeuse et locale à une implantation chirurgicale d'un capteur permettant de mesurer l'électrocardiograme (durée 25 min). Les animaux seront soumis à une exploration électrophysiologique transoesophagienne sous anesthésie gazeuse (20 à 35 min). Les animaux auront 4 injections intraveineuses de microvésicules pour rétablir leur niveau circulant de BDNF sous anesthésie gazeuse. L’ensemble des animaux auront deux périodes d’hébergement individuel pouvant conduire à un stress.

Impact sur les animaux

Le projet repose sur une suralimentation conduisant à un surpoids des animaux. La caractérisation fonctionnelle repose d'une part sur l'enregistrement de l'électrocardiogramme par un système implanté qui envoie des données à distance par télémétrie. L'implantation du dispositif ECG est bien maitrisée et aucune nuisance supérieure à une sévérité légère n'est attendue par l'acte chirurgical en lui-même (implantation sous cutanée nécessitant 3 petites incisions de la peau). Ces animaux implantés devront être hébergés individuellement en cage unique à 2 reprises pour des raisons de suivi et techniques (post-implantation du capteur de télémétrie d’une durée supérieure à 24h et enregistrement de l’électrocardiogramme, durée égale à 24h). Cet hébergement individuel pouvant conduire à un stress sera pris en compte pour le suivi journalier de l'animal. L'exploration électrophysiologique transoesophagienne a été choisie car elle est réalisée sous anesthésie générale de l'animal et est non-invasive. L'animal n’est pas réveillé à la fin de la procédure. Pour l’ensemble des actes des procédures, cette DAP est classée comme sévérité modérée.

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

La fibrillation atriale est l'arythmie cardiaque la plus fréquente et dont la prévalence chez l’humain augmente dans le monde. Cette arythmie est associée à des complications délétères majeures telles que les accidents vasculaires cérébraux, l'insuffisance cardiaque et la mortalité. L’ensemble de ces altérations sont observables chez l’animal uniquement dans un organisme entier et impliquent des interactions inter organes. Ainsi, les modèles cellulaires ne peuvent pas se substituer à un modèle animal impliquant des relations entre les organes et ne peuvent donc pas être utilisés dans ce projet. De même, auccun modèle in silico ne pourrait répondre à notre questionnement.

Réduction

Ne sera utilisé que le nombre d’animaux strictement nécessaire à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes afin d'en tirer des conclusions non biaisées. L'utilisation de plusieurs techniques sur le même animal permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront hébergées avec un enrichissement de leur milieu de vie (nid en cellulose et carré de cellulose, morceau de bois), dans une pièce calme et tempérée, avec régulation des cycles lumineux. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins per-opératoires et post-opératoires comprenant anesthésie générale et analgésie seront apportés tout au long de l’étude. Une grille d'évaluation clinique permettant l’établissement d’un score selon une échelle de douleur permettra leur suivi et le respect des points limites. Selon cette échelle, une décision sera prise dont, notamment, la mise à mort de l’animal si un point limite est atteint afin de prévenir ou arrêter les souffrances.

Choix des espèces

La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. De surcroît, les mécanismes physiologiques du controle du rythme cardiaque et physiopathologiques conduisant à la genèse de la FA chez les souris sont semblables à ceux de l'Homme, ce qui nous permet de réaliser des études translationnelles. Les animaux seront âgés de 4, 6 et 12 mois afin de suivre l’évolution dans le temps des paramètres cardiaques des animaux en fonction du temps d'installation progressive des troubles métaboliques. Ces différents âges correspondent à la période jeune adulte à adulte vieillissant chez l’Homme.

  • Recherche appliquée
    • Troubles nerveux
Souris : 1824
Souffrances
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▲ 1824
Devenir
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 1824

Si l'analgésique administré ne suffit pas, l'animal est mis à mort. 1 824 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit sous anesthésie une chirurgie de trente minutes qui comprime et lèse le nerf sciatique, puis une injection quotidienne pendant 28 ou 42 jours et deux électromyographies, le porteur reconnaissant que la lésion "provoquera de la souffrance" et que la pesée quotidienne y ajoute du stress. Deux questions justifient ces 1 824 souris, l'effet de candidats-médicaments et celui du vieillissement sur la repousse nerveuse, et le seul bénéfice annoncé tient dans la poursuite du développement de ces molécules si les résultats sont positifs.

Objectifs

Les atteintes de l’axe moteur, telles que la perte des axones et des neurones moteurs ainsi que la dénervation musculaire, sont à l’origine des maladies neuromusculaires. Des études montrent que dans certaines maladies neuromusculaires, comme la sclérose latérale amyotrophique, les neurones moteurs encore fonctionnels sont capables de compenser cette perte en créant de nouveaux prolongements axonaux et une réinnervation partielle. Ces mécanismes compensatoires sont induits par des voies de signalisations pro-régénératives : on parle de régénérescence de l’axe moteur. Ici, nous avons 2 objectifs : 1) étudier les effets de différents candidats-médicaments pour leur capacité à promouvoir la régénérescence de l’axe moteur après compression/lésion du nerf sciatique. 2) étudier l'effet du vieillissement sur la capacité à promouvoir la régénérescence de l’axe moteur après compression/lésion du nerf sciatique. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de lésion mécanique du nerf sciatique. En effet, la souris possède un système moteur complexe présentant de fortes similitudes avec le système moteur humain. Une lésion du nerf sciatique va en effet conduire à une dénervation musculaire et à une dégénérescence wallérienne, comme chez les humains. Le système moteur des souris est capable de régénérescence après lésion. Seulement 10 jours après la lésion, les souris présentent des signes de récupération fonctionnelle ainsi que réinnervation du muscle. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats-médicaments pour des maladies invalidantes. En cas de résultats positifs, le développement du ou des candidats médicaments pourra se poursuivre.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet subiront la procédure décrite: une chirurgie (1 fois, 30 minutes maximum), sous anesthésie générale, et une analgésie systémique et une analgésie locale. Leur état clinique sera surveillé pendant cinq jours postopératoire pour détecter un effet indésirable ou des signes de souffrance. La procédure 1 inclue des traitements chroniques (une fois par jour, pendant 28 jours, d'une durée de 30 secondes maximum). La procédure 2 inclue des traitements chroniques (une fois par jour, pendant 42 jours, d'une durée de 30 secondes maximum). Les enregistrements électromyographiques (EMG) auront lieu à 2 reprises (J14 et J21 pour la procédure 1, et J35 et J42 pour la procédure 2). Ceux-ci durent maximum 30 minutes, et seront réalisés sous anésthésie générale. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie et une lésion mécanique du nerf sciatique. Cette lésion provoquera de la souffrance. Le traitement quotidien des souris peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Des mesures électromyographiques seront réalisées sous anesthésies. De plus, la mesure quotidienne des poids des animaux peut également engendrer un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (histologie).

Remplacement

Les processus de dénervation et réinnervation impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (motoneurons, cellules de l'immunité et cellules de Schwann) dans différentes structures (moelle épinière, nerf sciatique, muscle). Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre de souris (n par expérience) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique ainsi que l’expérience du porteur du projet suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (puissance: 80%, seuil de significativité à 5%, effect un effet de 25% et un écart type de 15%). Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans un modèle animal de lésion mécanique du nerf sciatique.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésies quand nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par 4 au maximum, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique (buprénorphine, 0.1 mg/kg) sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris possède un système moteur complexe présentant de fortes similitudes avec le système moteur humain. Une semaine après la lésion du nerf, les souris présentent les premiers signes de réinnervation musculaire. La réinnervation et la récupération fonctionnelle est observable à partir de 10 jours après la lésion. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous utiliserons dans ce projet des souris. Afin de pouvoir évaluer l'effet du veillissement sur les procéssus de récupération fonctionnelle après une lésion du nerf, nous utiliserons des animaux âgés de 2, 12, 15 et 18 mois. Afin de tester l'efficacité de différents candidats-médicaments, nous utiliserons des animaux de 2 mois.

  • Recherche appliquée
    • Troubles urogénitaux
  • Recherche fondamentale
    • Biologie du développement
    • Oncologie
Souris : 640
Souffrances
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Devenir
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 640

Un ovule de la taille d'un grain de blé est introduit au pouce dans le vagin de souris maintenues par la base de la queue, pendant deux minutes trente, jusqu'à trois fois pour la même femelle. 640 souris vont être utilisées dans ces procédures, classées au niveau de souffrance léger, pour tester si une molécule odorante, le lyral, empêche la fécondation et pourrait fournir une contraception sans hormone. Le porteur écrit que l'expérimentateur exerce un massage doux pour "apporter du bien être à l'animal pendant ce geste" et que la souris ne montre aucun signe de douleur, tout en prévoyant de surveiller pendant deux à trois semaines l'apparition de dermatites et de conjonctivites dues au caractère allergisant du lyral. Les femelles retournent au pool des accouplements après chaque essai, et les souriceaux qui naissent sont mis à mort immédiatement, sans que leur nombre apparaisse.

Objectifs

La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Il a été montré qu’un odorant, le bourgeonal, modifiait in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes humains et que le lyral, un autre odorant, modifiait lui aussi in vitro le chimiotactisme des spermatozoïdes de souris. Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif, nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.

Bénéfices attendus

Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.

Procédures

L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement la souris est maintenue, sans contrainte par la base de la queue afin de permettre à l'expérimentateur d'accéder à la région vulvaire. L'ovule est introduit délicatement avec le pouce. L'expérimentateur maintient une légère pression avec son pouce sur la région génitale afin d'éviter une sortie de l'ovule et exerce un massage doux de la zone pour faciliter l'introduction complète de l'ovule et apporter du bien être à l'animal pendant ce geste. Le temps d'introduction complète est d'environ 2m30s et l'animal ne montre aucun signe de douleur ou de stress (pas de morsure, de réaction de fuite...) Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.

Impact sur les animaux

Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.

Devenir

Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience. Par ailleurs, rappelons que les ovules sont de qualité pharmaceutique, fabriqués par une société pharmaceutique avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris mâles et femelles utilisées auront entre 8 à 48 semaines.

  • Maintien des lignées génétiquement modifiées
Souris : 20
Souffrances
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Devenir
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 20

Des tumeurs hépatiques apparaissent d'elles-mêmes à partir de six mois chez ces souris, sans qu'aucun geste expérimental ne leur soit infligé. 20 souris vont être utilisées dans cet élevage de lignée à phénotype dommageable, dans une procédure classée au niveau de souffrance léger. Le porteur affirme, en s'appuyant sur la littérature, que l'accumulation de graisse dans leur foie ne nuit pas à leur bien-être et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît jusqu'à douze mois. Les souris utiles à la reproduction sont gardées en vie, les autres tuées avant l'apparition du carcinome, et le projet se limite à faire vivre la lignée, le croisement qui doit répondre à la question scientifique relevant d'une autre autorisation.

Objectifs

Le cancer du foie est la troisième cause de décès par cancer dans le monde. Avec 8500 nouveaux cas par an en France et plus de 7000 morts par an, le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le cancer hépatique le plus fréquent. Le CHC survient à cause d’une accumulation excessive de gras qui favorise le développement tumoral en induisant des modifications majeures dans le métabolisme des cellules du foie. Malgré les progrès thérapeutiques, l’incidence du CHC est en constante augmentation, ce qui constitue un réel problème de santé publique. Les mécanismes moléculaires menant au développement du CHC nécessitent donc d’être plus amplement caractérisés. Des études précédentes ont démontré qu'une protéine est impliquée dans la suppression des métastases lors du développement de la maladie. Récemment, une nouvelle fonction de cette protéine a été découverte. Ce projet de recherche vise donc à étudier le rôle de la nouvelle fonction de notre protéine d'intérêt dans le développement du CHC. Afin d’atteindre cet objectif, il nous faudra ultérieument croiser des souris qui n'expriment pas notre protéine d'intérêt avec des souris qui développent spontannément des tumeurs dans le foie (phénotype dommageable). La DAP ci-présente concernera uniquement l'élevage des souris qui développent le CHC.

Bénéfices attendus

L'élevage de la lignée murine qui développe spontannément des tumeurs dans le foie nous permettra de les croiser ultérieument avec d'autres souris. Ce croisement nous permettra d’élucider le rôle de la nouvelle fonction de notre protéine d'intérêt dans la physiologie et le cancer du foie. Comme notre protéine d'intérêt a des propriétés anti-métastatiques, elle constitue par conséquent une cible potentielle pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. Par ailleurs, cette protéine joue un rôle important dans l'homéostasie du foie et pourrait être impliquée dans l'obésité et le diabète.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention puisqu'il s'agit d'une procédure d'élevage de souris à phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

De 0 à 6 mois, certaines souris accumuleront progressivement du gras au niveau du foie ce qui d’après la littérature ne nuit pas à leur bien-être. Dans ce modèle, le cancer du foie commence à apparaître à partir de 6 mois. Jusqu’à 12 mois d’âges, les animaux ne présenteront aucun signe de souffrance et leur qualité de vie ne sera pas impactée. Les animaux ne seront pas utilisés au delà de 12 mois.

Devenir

Les animaux nécessaires à l'élevage seront gardés en vie tandis que les autres seront euthanasiés. Les souris au phénotype dommageable seront euthanasiées avant le développement du cancer du foie.

Remplacement

Bien que nous ayons commencé à étudier les propriétés de notre protéine d'intérêt dans des cellules cancéreuses humaines, il n’est pas possible de reproduire tous les mécanismes sur lesquels nous travaillons dans ces modèles. En effet, la diversité des types cellulaire ainsi que la communication entre les différents organes présente à l'échelle d'un organisme entier ne sont pas reproductible in vitro. Par rapport au modèle de culture de cellules cancéreuses, le modèle souris permet donc d’appréhender l'ensemble des intéractions entre différent types cellulaires et organes qui sont essentielles dans le développement du cancer de foie.

Réduction

Pour réduire au maximum la survenue de petits qui développent des tumeurs hépatiques (phénotype dommageable), les individus seront génotypés puis les reproducteurs optimaux seront sélectionnés en fonction des besoins. Au cours de l’élevage, le nombre minimal d’animaux à phénotype dommageable sera généré pour assurer l'élevage de la lignée.

Raffinement

Les souris seront observées tous les jours afin de contrôler leur mobilité, l’apparence de leur fourrure ainsi leur comportement dans la cage. Concernant l'hébergement, les femelles seront regroupées ensemble tandis que les mâles seront isolés le moins possible. Les animaux seront euthanasiés avant l’apparition du CHC.

Choix des espèces

La souris est un modèle très pertinent pour l'étude du cancer du foie. En effet, le développement de tumeurs chez la souris est facilement réalisable, reproductible et constitue un modèle de référence dans le domaine de l’oncologie. Pour tester nos hypothèses de travail, l'élevage de ce modèle murin à phénotype dommageable est donc nécessaire. Dans ce modèle, les souris commencent à développer des tumeurs hépatiques à partir de 6 mois. Elles seront donc euthanasiées avant cet âge ou avant l’atteinte des points limites détaillés dans les procédures expérimentales. Puisqu’il s’agit d'élever des souris, nous avons besoins d’adultes sexuellement matures c’est-à-dire âgés de 6-7 semaines.

  • Recherche appliquée
    • Autres troubles humains
  • Recherche fondamentale
    • Système immunitaire
    • Système respiratoire
Souris : 2500
Souffrances
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▲ 2100
▲ 400
Devenir
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Toutes tuées à l'issue, sans réutilisation possible parce que leur corps contient la toxine, 2 500 souris vont être intoxiquées par une toxine végétale classée parmi les agents de bioterrorisme aux États-Unis. 2 100 sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 400 à un niveau sévère. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection de toxine puis d'anticorps, avec deux prélèvements de sang, les effets attendus allant de la perte de poids et de la mobilité réduite aux difficultés respiratoires et aux douleurs liées à la destruction des tissus, jusqu'à la mort. Aucun anti-inflammatoire n'est administré, le porteur indiquant qu'il perturberait la survie et l'effet des molécules testées, et le même projet revendique comme second objectif de démontrer la corrélation avec une technique in vitro afin de remplacer "dès que possible" ce test sur les souris.

Objectifs

La toxine d’origine végétale, cible de ce projet, est classée dans la liste des agents bioterroristes des CDC (Centers for Diseases Control and Prevention) aux Etats-Unis. Sa disponibilité dans la nature et sa facilité d’extraction font de cette toxine une arme de bioterrorisme, et de nombreuses tentatives ayant pour objectifs son utilisation à des fins malveillantes ont été répertoriées notamment en France à Paris en 2018 ainsi qu’en Allemagne à Cologne en 2023. A ce jour, aucun traitement n’est disponible commercialement. Une contre-mesure médicale a été développée et il est maintenant nécessaire d’utiliser un test de contrôle de qualité pour garantir que chaque lot de produit pharmaceutique fini possède les caractéristiques d’efficacité revendiquées. Le projet présente deux objectifs majeurs : 1) Contrôler l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques administrés à la dose cible dans un modèle in vivo, à la suite d’une intoxication avec la toxine végétale. Ce premier objectif va permettre le contrôle qualité de l’efficacité et donc la libération de lots de produits pharmaceutiques selon les exigences réglementaires. 2) Le deuxième objectif est de répondre à la demande globale de remplacement des techniques de contrôle de qualité de l’efficacité in vivo (seule technique pertinente aujourd’hui pour la toxine) par une technique in vitro. Il est indispensable, pour sa recevabilité réglementaire, de démontrer que la technique in vitro est fortement corrélée avec la technique in vivo pour le contrôle de l’efficacité thérapeutique des lots de produit pharmaceutique. Le prérequis de cette démarche de remplacement est donc de disposer d’un nombre de données vivo/vitro suffisantes pour démontrer la corrélation des techniques nécessaire au dépôt du dossier d’enregistrement.

Bénéfices attendus

L’objectif premier du projet est de contrôler l’efficacité de différents lots de produit pharmaceutique d’une molécule thérapeutique en utilisant un modèle murin d’intoxication par une toxine végétale. Dans le contexte de la classification de cette toxine végétale comme agent de bioterrorisme et l’absence de traitement, le bénéfice attendu est la mise sur le marché d’un traitement contre les intoxications à cette toxine. Cette technique in vivo d’intoxication dans le modèle murin, seule technique fiable pour contrôler l’efficacité d’une molécule thérapeutique contre cette toxine, va permettre de répondre aux requis réglementaires de contrôle de l’efficacité du produit pharmaceutique dans le cadre de l’enregistrement de cette molécule thérapeutique et sa mise sur le marché. De plus, elle permettra la libération des lots de produits pharmaceutiques de cette molécule thérapeutique au cours des années. Le second objectif du projet est de démontrer la corrélation des techniques vivo/vitro pour la mesure de l’efficacité de lots de produits pharmaceutiques. Le bénéfice attendu de cet objectif est de pouvoir remplacer, dès que possible, la technique in vivo par une technique in vitro. Plusieurs techniques sont en cours d’évaluation et les mesures obtenues in vitro seront comparées, pour les mêmes échantillons, aux données obtenues par le modèle de référence in vivo. Si l’une des techniques in vitro démontre une corrélation suffisamment robuste avec les données de la technique in vivo, et si ce niveau de corrélation est accepté par les autorités réglementaires, elle sera alors utilisée en remplacement de la technique in vivo.

Procédures

Des prélèvements de sang et des injections (intoxication à la toxine et administration des anticorps) seront réalisés sur les animaux. Ces manipulations pouvant entrainer des perturbations du bien-être animal, elles seront réalisées sur des animaux anesthésiées. Les prélèvements sanguins seront au nombre de deux et seront réalisés rapidement (30 à 60 secondes). Le volume prélevé sera adapté au poids de l’animal et toujours réalisé sur animaux anesthésiés. L’intoxication et l’administration des anticorps ne sera réalisé qu’une seule fois et ce fera de manière rapide (30 à 60 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables (douleur et stress) liés aux gestes associés à la procédure (injections et/ou prélèvements) seront limités car réalisés sous anesthésie générale. Les effets indésirables associés à l’intoxication sont une perte de poids, une mobilité réduite, des difficultés respiratoires ainsi que des douleurs associées aux destructions tissulaires en lien avec les effets de la toxine pouvant entraîner la mort de l’animal. Ces effets indésirables sont pris en compte dans la définition des points limites. L’objectif premier de ce projet étant le contrôle qualité d’une contre-mesure médicale, à priori efficace. La majorité des souris seront traitées avec cette contre-mesure, limitant les effets de l’administration de la toxine.

Devenir

A la fin de cette procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Les animaux ne peuvent être réutilisés dans une autre procédure étant donné la présence de la toxine.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico n’est capable de prédire à 100% l’efficacité des molécules thérapeutiques lors de l’intoxication par cette toxine végétale. En effet, il existe des disparités entre les résultats obtenus par les méthodes actuelles in vitro et ceux obtenus in vivo. Nous avons ainsi pu observer qu’une molécule apportant une très bonne neutralisation à l’échelle d’une lignée cellulaire dans le modèle in vitro avait une efficacité très modérée in vivo. Ainsi, les mécanismes d’action des molécules thérapeutiques contre cette toxine peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. A ce jour, il est donc nécessaire de passer par des modèles plus complexes pour contrôler l’efficacité de lots de produit pharmaceutique, prenant en compte la distribution de la toxine comme celle de la molécule thérapeutique, la réponse inflammatoire et immunitaire, comme c’est le cas avec des modèles murins. Le deuxième objectif de ce projet est de démontrer la corrélation entre la technique de contrôle de l’efficacité in vivo et de nouvelles techniques in vitro. Si la corrélation est suffisante aux requis réglementaires, la technique in vivo sera remplacée par une technique in vitro pour le contrôle de l’efficacité des lots de produit pharmaceutique.

Réduction

Objectif 1 : Le nombre d’animaux utilisés pour contrôler chaque lot de produit pharmaceutique doit correspondre au nombre permettant de conclure que l’échantillon contrôlé a bien une efficacité supérieure à la spécification et différente du groupe placébo. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour comparer les taux de survie obtenus lors d’un test in vivo à la spécification d’efficacité du produit avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 2 : Le nombre d’animaux utilisés pour démontrer la corrélation entre les techniques vivo/vitro doit correspondre au nombre permettant de s’assurer que la technique in vitro est fiable et robuste pour contrôler l’efficacité des lots de produit pharmaceutique. La détermination de ce nombre minimum d’animaux a fait l’objet d’une analyse biostatistique qui tient compte les différentes variables du modèle. Cette analyse a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux par groupe nécessaire pour réaliser les analyses de corrélations entre les techniques vivo/vitro avec un niveau de confiance minimal requis réglementairement. Objectif 1 & 2 : Les groupes placébo seront mutualisés. Un seul groupe placébo sera utilisé pour chaque phase expérimentale incluant des groupes répondant à l’objectif 1 (avec plusieurs lots de produit pharmaceutique) et des groupes répondant à l’objectif 2 (avec plusieurs lots de corrélation).

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une hutte en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront également ajoutées pour maximiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront également observés quotidiennement durant toute la durée des essais, et lors de l’ensemble des procédures par du personnel qualifié. L’ensemble des procédures sera réalisé sur animaux anesthésiés. Les points limites déterminés pour ces essais (notamment les signes cliniques) nous serviront à nous assurer du bien-être des animaux, et nous permettront d’éviter une souffrance trop importante. Lors des essais avec la toxine, des aliments hydratés seront ajoutés dans la cage pour éviter la déshydratation des animaux. L’utilisation d’anti-inflammatoires est impossible, du fait de leurs effets potentiels sur la survie et sur l’effet thérapeutique des molécules testées.

Choix des espèces

Le modèle murin est majoritairement utilisé et a été amplement validé pour l’évaluation d’activité de différentes contre-mesures médicales contre ricinecette toxine. Les souris utilisées sont adultes car elles possèdent à cet âge-là un système immunitaire mature. La facilité d’élevage et de manipulation des souris font de ces animaux un modèle adéquat pour faire ces essais. Par ailleurs, la petite taille des souris fait utiliser une dose de toxine qui est très inférieure à la dose toxique chez l’homme, ce qui constitue un facteur de sécurité pour les opérateurs qui manipulent la toxine.

  • Maintien des lignées génétiquement modifiées
  • Recherche fondamentale
    • Système gastrointestinal
Souris : 2500
Souffrances
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Devenir
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Un bout de queue coupé sur animal vigile, en quelques secondes et sans anesthésie, parfois complété d'une biopsie d'oreille quand le premier génotypage échoue : 2 500 souris subissent ce prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'opération sert à trier les souriceaux au sevrage selon qu'ils portent ou non l'invalidation du gène MLKL, dans deux lignées destinées à l'étude des hépatites. Le porteur qualifie la douleur de brève et d'intensité limitée, tout en signalant que son animalerie cherche activement d'autres méthodes de génotypage, à partir de poils, de salive ou de fèces. Aucune de ces 2 500 souris n'est tuée dans ce projet, 165 sont gardées comme reproductrices et 2 335 passent en "utilisation continue" vers d'autres protocoles expérimentaux.

Objectifs

L'objectif du projet est d'identifier en fonction de leur génotype les souris génétiquement altérées pour une cible (MLKL), protéine impliquée dans une voie de mort cellulaire programmée, la nécroptose. Deux lignées de souris seront exploitées. Au sein de l'une d'elles, la protéine MLKL ne s'exprime dans aucune cellule de tout leur organisme. Quant à la seconde lignée, seules les cellules principales du foie (hépatocytes et cholangiocytes) n'expriment pas la protéine MLKL. Ces souris seront générées pour d'une part maintenir les lignées et d'autre part pour être utilisées dans des projets scientifiques ayant pour but d'étudier l'implication de cette protéine exécutrice de la nécroptose dans des hépatites aigües ou chroniques.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le génotypage de souris nécessaires au maintient des 2 lignées de souris et pour fournir des animaux pour différents projets scientifiques (utilisation continue vers des DAP d'expérimentation).

Procédures

Le projet permettra d'identifier par génotypage les animaux à partir d’un prélèvement unique d'une biopsie de queue, éventuellement complété d'un second prélèvement de biopsie d'oreille en cas d'échec exceptionnel du premier génotypage. La procédure de prélèvement s'effectue en quelques secondes sur animal vigile. Cela concerne 500 animaux par an.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont celles liées au prélèvement unique d'une biopsie de queue par individu, voir d'un éventuel second prélèvement au niveau de l'oreille. Ce type de prélèvement, qui s'effectue en quelques secondes seulement, n'induit qu'une douleur d'intensité limitée et est extrèmement brève. Elle peut entrainer une sensation d'inconfort, nuisance passagère qui n'entraîne pas de complications majeures.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie, non pas pour une réutilisation, mais pour utilisation continue pour les expérimentations (2335 animaux) ou pour maintien de la lignée (reproducteurs, 165 animaux).

Remplacement

Aucune alternative à un génotypage par PCR à partir d'un échantillon d'ADN isolé à partir d'un fragment de tissu de l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux subissant un prélèvement pour génotypage est réduit à son minimum: La production est lié au maintien des lignées et aux besoins des projets scientifiques. Les schémas d'accouplement sont optimisés pour ne produire que des animaux "utiles" porteurs de modifications génétiques d'intérêt.

Raffinement

Pour minimiser la douleur associée au prélèvement de l'extrémité de la queue des souris âgées de 3 semaines, l'équipe de l'animalerie travaille activement à l'exploration de nouvelles techniques de génotypage. Le prélèvement de tissu est réalisé par une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée de façon à limiter les effets indésirables (stress et douleur). Des approches alternatives, comme le prélèvement de poils, de salive ou de fèces, sont actuellement en cours d'étude.

Choix des espèces

Cette espèce (souris) permet de modéliser la pathogenèse humaine d'hépatites aigües ou chroniques sur des temps raccourcis à l’échelle de vie de cet animal. Par ailleurs, ce modèle murin permet de tester in vivo les conséquences de l’absence d’expression au sein de cellules d’une ou plusieurs protéines potentiellement impliquées dans ces pathologies. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule manipulation). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.