Rongeurs
Etude des récupérations sensorimotrices chez le rat après lésion de la moelle épinière et implantation d’une matrice contenant des cellules souches issues du tissu adipeux.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une contusion de la moelle épinière au niveau thoracique, 125 rats mâles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, cinq autres étant anesthésiés et tués sans réveil pour prélever la graisse dont sont tirées les cellules souches implantées. Tous sont tués à l'issue. Après l'opération, chaque rat est testé quinze minutes par semaine pendant trois mois sur sa récupération sensorimotrice, puis soumis à un enregistrement électrophysiologique d'une heure. Le porteur décrit des troubles de la miction imposant des massages manuels de la vessie, des douleurs pouvant persister trois semaines et, rarement, de l'automutilation. L'effectif reste ouvert entre 25 et 130 animaux selon les premières vagues, le porteur prévoyant d'abandonner l'étude s'il ne parvient pas à dégager de différence entre les groupes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de cellules souches issues du tissu adipeux et mises en culture sur un support 3D. Il s’agira d’étudier chez le rat mâle Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après une contusion spinale thoracique, à réparer ou préserver la moelle épinière à l’aide d’un hydrogel contenant des cellules souches. L’objectif principal étant de réduire les déficits post-traumatiques et d’entraîner une récupération sensori-motrice la plus complète possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subi des dommages de la moelle épinière. L’évaluation qui portera sur la récupération sensorimotrice et l’activité électrophysiologique (réflexe H : réflexe spinal monosynaptique entre les fibres afférentes proprioceptives Ia et les fibres motrices efférentes issues des motoneurones-α, activité des fibres nerveuses, ajustements ventilatoires) sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.
Bénéfices attendus
Dans le domaine de la réparation de la moelle épinière, malgré une recherche intensive depuis les cinquante dernières années, à ce jour aucune stratégie thérapeutique n’a été proposer afin de limiter la progression des déficits fonctionnels post-lésionnels et d’entraîner des récupérations sensori-motrices suffisantes permettant une récupération de l’autonomie des patients. Des études récentes très prometteuses ont montré que les cellules souches issues du tissu graisseux semblent entraîner une récupération fonctionnelle, une neurogenèse et une neuroprotection après lésion de la moelle épinière. Les cellules souches apparaissent comme une alternative prometteuse pour préserver et réparer la moelle épinière endommagée. Toutefois, ces études n’ont pas permis d’obtenir des résultats suffisamment marqués pour envisager une application chez des patients blessés médullaires car les cellules prélevées étaient mises en culture sur un support matriciel 2D ne permettant pas d’exprimer toutes leurs potentialités. Notre étude pré-clinique vise à tester l’efficacité thérapeutique de cellules souches mises en culture sur un support 3D en vue de proposer une thérapie transférable à l’Homme. Elle représente donc une étape très importante avant un transfert vers la clinique humaine.
Procédures
Chirurgie lésionnelle : n=1, durée : 1h ; Test sensorimoteurs : 1 fois par semaine pendant 3 mois, durée : 15 min ; Enregistrements électrophysiologiques : n=1, durée : 1h
Impact sur les animaux
La contusion spinale thoracique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels, ainsi que des troubles végétatifs, notamment en ce qui concerne la miction. Des douleurs peuvent également être présentes, ainsi qu’une perte de poids, une déshydratation ou une dénutrition. La littérature scientifique et notre expérience indiquent que les troubles végétatifs et les douleurs liées à la chirurgie peuvent persister jusqu’à 3 semaines selon le type et l’importance de la lésion spinale, ce qui nécessite une évaluation quotidienne des animaux. Toutefois, il faut noter que les lésions nerveuses centrales peuvent rarement conduire à de l’autophagie. Les autres nuisances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs liées aux injections intrapéritonéales, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux.
Devenir
A l'issu des procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Les études in vivo n’utilisant pas des mammifères ou celles in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité́ infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise donc à proposer une nouvelle stratégie de préservation et/ou réparation de la moelle épinière directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière.
Réduction
Un à cinq animaux seront nécessaires pour prélever de la graisse à partir de laquelle les cellules souches seront isolées pour être mises en culture. Afin de mener à bien notre projet, nous devrons constituer 5 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g (environ 2 mois d’âge) lors de la chirurgie initiale. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques paramétriques (analyse de la variance), nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 (+ 5 pour l’extraction des cellules souches) animaux, soit un total de 125 (+ 5 pour l’extraction des cellules souches) animaux. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous enrôlerons, dans un premier temps, 5 (+ 1 pour l’extraction des cellules souches) animaux par groupe, soit un total de 25 (+ 1 pour l’extraction des cellules souches) animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, d’une puissance de 80% et d’un seuil de significativité de 5%, avec un test statistique approprié, les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre le groupe traité et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement ou qu’aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et conclurons à l’inefficacité du traitement thérapeutique.
Raffinement
Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection d’antalgique sera réalisée avant les chirurgies et une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique (dans l’eau de boisson renouvelée toutes les 12h), ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne (7j/7) de l’état de santé des animaux (à l’aide de la grille d’évaluation jointe en Annexe) et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures destinées à réduire la douleur et le stress. En cas de trouble de la miction, des massages seront réalisés afin de vidanger la vessie jusqu’à reprise d’une miction naturelle. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés selon la procédure réservée aux animaux éveillés. Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénères. Toutefois, même si les animaux sont placés seuls dans leur cage enrichie avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois en peuplier…), ils ne seront pas à l’isolement. Leurs cages seront placées sur des portoir de cages à côté des cages des autres animaux. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénères dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge, morceaux de carton, papier, petites pièces de bois en peuplier…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire. Nous nous efforcerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins et des gestes adaptés.
Choix des espèces
Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre chez les mammifères après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière et dont la littérature scientifique est très pauvre en ce qui concerne l’utilisation de ces genres. De plus, nous disposons de plateformes d’analyse du mouvement et des dispositifs d’enregistrement électrophysiologiques uniquement destinés aux genres Mus et Rattus. Les animaux seront des jeunes adultes de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ. Afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes.
Evaluation du bénéfice thérapeutique systémique d’une molécule innovante de thérapie génique permettant la réexpression de dystrophine
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les rats utilisés sont génétiquement dépourvus de dystrophine, donc atteints d'une dégénérescence musculaire progressive qui rend, passé dix mois, la mastication difficile et une tumeur musculaire probable. 54 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 30 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 24 un niveau modéré. Chacun reçoit jusqu'à vingt-quatre injections intraveineuses précédées d'un sédatif, une dizaine de prélèvements sanguins mensuels complétés par des séries de six ponctions étalées sur 168 heures, et des sessions répétées de mesure de force musculaire de trente minutes sous anesthésie. Ils sont maintenus en vie jusqu'à treize mois, âge où la maladie a le plus progressé, puis tués pour les analyses histologiques, le porteur retenant le rat plutôt que la souris parce qu'il "mime les maladies humaines similaires de manière beaucoup plus fidèle".
Objectifs
Les dystrophies musculaires sont des myopathies génétiques rares qui touchent principalement les muscles et le cœur. Certaines dystrophies sont causées par des changements dans le gène DMD, porté par le chromosome X. Pour cette raison, cette maladie touche surtout les hommes. Le gène DMD produit normalement une protéine appelée "dystrophine". Chez les patients, la production anormalement faible ou absente de dystrophine induit une détérioration progressive des muscles, provoquant une faiblesse musculaire. La forme la plus sévère (absence de dystrophine) apparaît dès l'enfance et entraîne un déclin progressif de la mobilité et du fonctionnement cardiaque, fatale de façon prématurée. L’objectif de notre étude est de comparer l’efficacité à long terme d’une thérapie génique qui permettra de contourner les changements dans le gène DMD afin de produire à nouveau de la dystrophine chez le rat. La dystrophine produite dans le cadre de ce traitement, plus petite que la dystrophine naturelle, conserve une partie importante de son activité. En adoptant un protocole le plus proche possible de celui réalisé chez les enfants actuellement suivis dans le cadre d'un essai clinique, ce projet permettra d’obtenir des données complémentaires précieuses impossibles à obtenir en un temps court chez les enfants. Ces données éclaireront donc les cliniciens pour optimiser les prochaines étapes de l'essai clinique.
Bénéfices attendus
L’absence totale de dystrophine au sein du muscle le fragilise et précipite la mort des fibres qui le composent. L’hypothèse sous-jacente propose que la conversion dystrophique du muscle squelettique, au moins en partie, peut être réversible après une restauration efficace et à long terme de la dystrophine. Comme chez la souris, nous espérons que le traitement restaurera la dystrophine de façon homogène le long de la fibre entière avec une large distribution homogène dans les fibres. Cette restauration répandue est probablement essentielle au succès thérapeutique. L’étude va permettre de fournir des preuves de l’efficacité thérapeutique à long terme. Nos résultats seront comparés à ceux obtenus chez les enfants enrôlés dans l'essai clinique en cours en vue d’affiner les futures analyses réalisées lors de sa probable extension.
Procédures
Le projet se décompose en deux parties distinctes, une première pour déterminer la dose idéale du composé à injecter et une seconde pour mesurer son bénéfice thérapeutique. Pour la première procédure, chaque animal recevra en 2 mois 8 injections intraveineuses durant 30 secondes, chacune précédée d'une injection sous-cutanée (20 secondes) d'un sédatif. La première et la dernière injection seront suivies de 6 prélèvements sanguins de 30 secondes étalés sur 168h. À trois reprises et 1 mois d'intervalle, les animaux réaliseront trois tests non invasifs (test d’agrippement, électrocardiogramme et analyse du patron ventilatoire) pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. De plus, la locomotion spontanée et les comportements quotidiens seront investigués par le biais d’une évaluation cognitive en filmant les animaux dans une cage à furet pendant une heure. A l'issue du traitement, les animaux recevront une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle tibial antérieur (TA) sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes via un ergomètre. Avant le début de la seconde procédure, chaque animal vigile réalisera test d’agrippement, un ECG et une pléthysmographie pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. Puis les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle tibial antérieur sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes à l’aide d’un ergomètre. Le traitement sera ensuite dispensé sur 8 mois par 16 injections intraveineuses d’une durée de 30 secondes, chacune précédée d'une injection sous-cutanée (20 secondes) d'un sédatif. À 9 reprises (au début de la procédure puis tous les mois), les animaux se verront prélever leur sang au moyen d’un geste de 30 secondes. Les deux premières prises de sang seront également suivies de 6 autres prélèvements sanguins de 30 secondes étalés sur 168h. À 5 reprises pendant 8 mois (tous les 2 mois), les animaux vigiles réaliseront les tests fonctionnels, test d’agrippement, ECG et pléthysmographie pour une durée respective de 20, 10 et 25 minutes. À 3 reprises pendant 8 mois (tous les 4 mois), les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et la force isométrique produite par leur muscle TA sera mesurée pendant des sessions de 30 minutes via un ergomètre. Enfin, les animaux anesthésiés en fin de procédure seront également soumis à une échocardiographie de 20 minutes.
Impact sur les animaux
Pour la première partie de ce projet, les animaux DMD seront mis à morts à l’âge de 3 mois, bien avant l’expression des signes cliniques évocateurs d’un effet délétère majeur du phénotype sur les animaux. Jusqu’à 10 mois, aucune entrave majeure à une qualité de vie autonome et globalement compatible avec la vie dans une cage n’a été observée. Pour la seconde partie, les animaux DMD seront mis à morts à l’âge de 13 mois, soit après l’âge de 10 mois à partir duquel les nuisances majeures du phénotype dystrophique sont observées (difficulté croissante à mastiquer et probabilité croissante du développement d’une tumeur musculaire).. Il est attendu que le traitement atténue, réduise voire annule l'ensemble de ces nuisances. Toute observation ou signe clinique anormal dans le décours de la maladie (gêne, douleur ou souffrance exprimée par l'animal) sera quantifiée par le remplissage de la grille d’évaluation dédiée. En fonction du score, les actions décrites sur la grille seront mises en œuvre. L'équipe sera donc mobilisable 7 jours sur 7 pour préserver ces données dans un contexte de décision médicale rapide et centrée sur le bien-être des animaux. Les cas d’insuffisance cardiaque décompensée et mortelle n’ont été observés qu’au-delà de 13 mois. Un effet indésirable du test d’agrippement est la cassure d’une griffe trop longue lors du saisissement de la barre, raison pour laquelle nous vérifions les griffes avant le test et les raccourcissons si besoin. Les rats DMD peuvent exprimer une réponse aiguë de stress supérieure à la normale. Ils se figent pendant quelques minutes. Nous connaissons cette réaction et l'évitons à travers l'habituation progressive des animaux à la manipulation et aux différentes procédures. Nous pouvons aussi- avoir recours à un sédatif administré qui protège l'animal des problèmes cardiaques éventuellement induits par l'excès de cette réponse de stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Ce qui a pu être testé de l’efficacité des composés sans l’usage d’animaux a été réalisé en amont de ce projet. L’innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l’éventuelle toxicité des produits administrés, mais aussi de tous leurs métabolites issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l’animal vivant avec l’ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle de limiter la progression de la maladie ou même d’inverser les signes cliniques associés à cette maladie et ce, de façon très large, incluant bien entendu la musculature mais aussi le système nerveux.
Réduction
De nombreuses données ont été cumulées sur les modèles de rats utilisés dans ce projet. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Le calcul de puissance statistique nous recommande de n’utiliser qu'un maximum de 8 rats par groupe. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés, pour lesquels nous avons pu conclure qu'il était suffisant. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sains et atteints traités avec un placebo, l’histoire naturelle de la maladie est documentée avec fiabilité en comparaison avec les congénères sauvages. Pour la première partie du projet concernant la pharmacocinétique du composé, des projets antérieurs ont permis de s’assurer que 6 animaux par groupe étant suffisant pour obtenir des données fiables.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le cycle d’éclairage respecte l’alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites ont été établis et affichés. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère évolutivement proche de nous et constitue donc un modèle biomédical apprécié. Les récents outils d’édition du génome ont permis d’en faire un modèle de choix pour l’analyse des affections musculaires. Nos modèles de rats déficients en dystrophine miment les maladies humaines similaires de manière beaucoup plus fidèle que ne le font les modèles historiques de la souris. Le rat conserve néanmoins certains atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). En médecine translationnelle, le rat s’insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d’environnement, format). Pour la première procédure de ce projet, les animaux utilisés seront âgés de 4 à 12 semaines. À cet âge, l’impact de la maladie sur les muscles est détectable par des analyses de sang, de force, cardiaques et respiratoires. En utilisant des animaux de cet âge, il sera possible de conclure sur l’efficacité d’un traitement à un stade précoce de la malade. Pour la seconde procédure, les rats seront âgés de 5 à 13 mois, ce qui correspond au stade où la maladie progresse le plus et les muscles sont de plus en plus impactés, fonctionnellement et morphologiquement. Cet âge correspond également chez le rat au stade de développement de la maladie des enfants, âgés de 6 ans ou plus, pour lesquels une thérapie est envisagée.
Effets à court terme de six composés à visée thérapeutique en développement chez la souris sauvage soumise à une alimentation enrichie en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Six candidats médicaments d'un client pharmaceutique sont évalués sur leur capacité à réduire la prise alimentaire et le poids de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses. 78 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Hébergées seules en cage, elles reçoivent quatorze administrations par voie orale, sont pesées treize fois, puis anesthésiées et tuées pour le prélèvement de leur tissu adipeux. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance, la relativise par le maintien d'un contact visuel et olfactif, et affirme qu'il n'existe "aucune méthode de substitution" permettant d'étudier l'effet d'un composé sur le poids corporel.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'une famille de six candidats médicaments de notre client et vise à tester leur efficacité à réduire la prise alimentaire et le poids corporel à court terme chez la souris non obèse mais nourrie avec une alimentation enrichie en graisse. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement subaigu du candidat médicament sur l'appétit et le poids corporel du modèle d'obésité. Les composés les plus efficaces seront alors étudiés sur de plus longues durées, chez la souris obèse.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait, à terme, aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (13 mesures au cours de l’étude ; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule ou d’un candidat médicament par voie orale (14 administrations ; durée de la mesure : 1 minute); 3) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée : 10 minutes).
Impact sur les animaux
De par leur caractère social, l'hébergement en cage individuelle constituera une nuisance d’isolement sur les animaux. Les animaux garderont toutefois un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les mesures de poids corporel et autres manipulations pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements par voie orale pourraient être source de de stress mais ne sont que très peu douloureux lorsque réalisés par des expérimentateurs habitués à ce type de pratique. Enfin, le maintien sous alimentation enrichie en graisse de courte durée (ici 14 jours) pourrait être une source de très léger inconfort pour les animaux du fait du changement d’habitudes alimentaires.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements de tissu adipeux sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
Bien que le développement des composés testés ait fait l'usage d'approches in vitro dans ces premières étapes, l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste une étape obligatoire et règlementaires pour poursuivre le développement des candidats médicaments, notamment dans le but de poursuivre vers ders études cliniques. Par ailleurs, il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel et la prise alimentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle employé et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non soumis à l'alimentation enrichie en graissees a été réduit à 8 animaux, contre 10 pour les autres groupes expérimentaux, compte tenu de la moindre variabilité des paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement des candidats médicaments, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle pour un des composés testés, une seconde étude sera menée en condition chronique chez les deux genres afin de s'assurer de son efficacité.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. en utilisant des canules de gavage souples pourvues d'un embout en silicone, prévent ainsi toute lésion potentielle du carrefour aéro-digestif. Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour les besoins de l’étude mais les animaux conserveront des contacts olfactifs et visuels. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée (Buprénorphine).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourris avec une alimentation enrichie en graisses est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte, afin de mimer au mieux la population humaine ciblée par les candidats médicaments.
Traitements visant à réduire les symptômes lors d’une coïnfection entre nématodes intestinaux et malaria
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage avec un nématode intestinal, puis par injection dans l'abdomen d'un parasite du paludisme, subissent sept prélèvements de sang en vingt et un jours par incision de la queue puis retrait de la croûte de cicatrisation, et reçoivent jusqu'à six injections de traitement. La coïnfection provoque une anémie plus marquée et plus longue qu'une infection isolée, le porteur qualifiant par ailleurs l'infestation par le ver d'asymptomatique. Il conclut que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro, et que les souris ne peuvent pas être réutilisées, leur système immunitaire n'étant plus naïf.
Objectifs
L’objectif du projet est d’identifier des traitements possibles en vue d’améliorer les symptômes de la coïnfection entre nématodes intestinaux et malaria. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les Plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela a des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque Plasmodium infecte un hôte préalablement infecté par le nématode, on constate une aggravation des symptômes par rapport aux cas où les hôtes sont uniquement infectés par Plasmodium. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité de certains traitements pouvant contribuer à améliorer les symptômes en cas de coïnfection.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier les mécanismes pouvant jouer un rôle dans l’aggravation des symptômes produits par Plasmodium lors de coïnfections avec un nématode intestinal. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection, on constate souvent une aggravation des symptômes induits par Plasmodium. Notre projet vise donc à identifier des pistes thérapeutiques pouvant améliorer les symptômes observés dans les cas de coïnfection.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des groupes expérimentaux): gavage à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée
Impact sur les animaux
Le nématode produit des infections asymptomatiques (aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté). Très rarement (< 1% des cas), l’émergence des vers peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. Plasmodium yoelii 17X NL est une souche non létale. L’infection produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection). A partir de jour 24 post-infection les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Cependant, en cas de coïnfection on constate des niveaux plus importants d’anémie et un temps de récupération plus long. L’infection avec le nématode est effectuée par gavage (intervention réalisée en quelques secondes), à l’aide d’une sonde souris (rigide). Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau. L’infection avec Plasmodium est effectuée par injection intrapéritonéale (intervention réalisée en quelques secondes). Les traitements avec l’érythropoïétine et l’hémopexine nécessitent trois et six injections intrapéritonéales respectivement. Ces injections seront au minimum espacées d’un jour. Les prélèvements de sang sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs. Deux prélèvements maximum par semaine sont réalisés. Ces différentes interventions ne concernent pas toutes les souris. Un chronogramme fourni en annexe indique les interventions pour chaque groupe expérimental.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.
Remplacement
L’objectif de notre étude est d’explorer des mécanismes pouvant conduire à l’aggravation des symptômes induits par Plasmodium chez les hôtes coïnfectés et de tester des traitements visant à améliorer ces symptômes. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental.
Raffinement
Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.
Rôle de la signalisation ocytocinergique dans la modulation des comportements douloureux lors d’une interaction sociale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés deux heures sous anesthésie puis injectés d'une substance inflammatoire dont la douleur n'est pas soulagée, parce qu'elle est l'objet même de l'étude, 1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement. Les chirurgies peuvent provoquer inflammation, infection des points de suture, hypothermie et perte de poids. Le projet cherche à savoir si la présence d'un congénère atténue la douleur, et par quels circuits neuronaux l'ocytocine y participe. Les tests comportementaux, deux par animal et vingt minutes chacun, ne sont désignés que par ce terme, sans qu'aucun ne soit nommé.
Objectifs
Notre but sera de mieux comprendre les interactions entre les relations sociales et l'atténuation de la douleur. Pour ce faire, notre stratégie de recherche s'articule autour de deux objectifs successifs et complémentaires : Dans un premier temps, nous analyserons l’activité des réseaux neuronaux impliqué dans ces interactions puis, nous étirons la relation entre les interactions entre les relations sociale et la douleur grâce à différents tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à décrypter les mécanismes et les circuits neuronaux qui relient la modulation émotionnelle de la douleur par l'intermédiaire des interactions sociales, en mettant l'accent sur un modulateur endogène : l'ocytocine. La douleur chronique touche près de 8 % de la population mondiale, ce qui en fait un fardeau majeur dans notre société moderne. Il a été prouvé que l'ocytocine est au cœur des dysfonctionnements sociaux, ce qui a un impact sur les patients souffrant de douleur chronique et vice versa. Cependant, les circuits neuronaux médiant la régulation émotionnelle du comportement douloureux vis-à-vis des interactions sociales sont largement inconnus. Le bénéfice scientifique de ce projet est de fournir une compréhension détaillée des circuits neuronaux et des mécanismes permettant cette régulation émotionnelle de la douleur et des comportements sociaux..
Procédures
Les animaux seront soumis à principales intervention : 1. Une chirurgie de 2 heures sous anesthésie générale et analgésie générale et locale. 2. Une injection de subtance inflammatoire sur un animal anesthésié et analgésié d’une durée de 5 minutes. 3. Des tests comportementaux de 20 minutes (au maximum de 2 par animal) avec un intervalle de 1 jour entre chaque tests.
Impact sur les animaux
Le modèle inflammatoire ne peut être soulagé étant l’objet de l’étude. L’objectif de la recherche est d’évaluer si l’interaction sociale peut atténuer la douleur. Les chirurgies induisent des douleurs modérées et transitoires. Elles peuvent induire des inflammations, des infections notamment au niveau des points de suture mais aussi une perte de masse de l’animal. Une hypothermie des animaux est également attendue lors des chirurgies. La manipulation des animaux peut induire un léger stress, normalement atténué par la période d’habituation systématiquement appliquée, tant à l’expérimentateur qu’au geste technique effectué
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort pour prélèvement post-mortem afin de réaliser des analyses.
Remplacement
Pour étudier l'aspect complexe, sensoriel et émotionnel de la douleur, sa relation avec les interactions sociales et les mécanismes des circuits cérébraux sous-jacents, l'utilisation d'animaux dotés d'un cortex développé est indispensable. Il n'est donc pas possible d'utiliser des modèles in vitro tels que la culture cellulaire ou un modèle mathématique complet. À cette fin, les rongeurs sont les modèles animaux les plus appropriés en raison des conditions d'élevage et de la possibilité de comparer et de confronter les résultats obtenus avec la littérature et les données cliniques.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au minimum selon les règles statistiques de façon à garantir des enregistrement fiables exploitables statistiquement. Les résultats seront comparés avec des tests statistiques appropriés permettant d’émettre en évidence le rôle de l’ocytocine dans le comportement douloureux en lien avec les interactions sociales
Raffinement
Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives (groupes sociaux) enrichies (bâtons, frisure, tunnel en carton) permettant ainsi aux animaux d’exprimer leur comportement naturel. Les animaux seront préalablement acclimatés à leur environnement (2 semaines avant l’expérimentation) et habitué à la présence de l’expérimentateur, aux différents tests le cas échéant, et à la contention. Les approches invasives seront réalisées sou anesthésie analgésie. La température corporelle de l’animal sera garantie par des tapis chauffant thermostaté et le dessèchement de la cornée sera prévenu par application d’un gel oculaire hydratant. Pour faciliter la récupération post-opératoire de l’animal un traitement analgésique sera mis en place et de la nourriture gélifiée appétante sera ajoutée sur le sol de la cage. L’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille de score et des points limites précoces permettant d’interrompre les procédures et de mettre fin à la souffrance animal ont été définis.
Choix des espèces
Le recours à l’animal est nécessaire dans l’étude des phénomènes complexes d’interactions douleur et interactions sociales ; à ce jour aucune approche alternative n’est existante. Le modèle expérimental chez le rat est un standard pour ce type d’expériences et comporte une série de symptôme superposable avec la pathologie humaine (syndrome de Pradder-Willy, anxiété chronique, douleurs inflammatoires …). De nombreuses études sont réalisées concernant les réseaux neuronaux ocytocinergiques chez les rats : les outils sont donc bien validés sur cette espèce, ce qui concourt à assurer la fiabilité des résultats obtenus, leur interprétation ainsi que leur comparaison avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 8 semaines. lorsque l’encéphale et donc les circuits neuronaux sont parfaitement mâtures.
Etude de la fonction des macrophages de la cavité péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une unique injection dans l'abdomen d'une dizaine de secondes, susceptible de provoquer une inflammation au point d'injection, avant que le contenu de sa cavité péritonéale ne soit analysé après sa mort. Le projet vise à décrire une population de cellules immunitaires, les petits macrophages péritonéaux, dont la fonction reste inconnue, avec l'espoir lointain d'applications lors de dialyses péritonéales humaines. Aucun calcul ne vient étayer l'effectif de 1 040 animaux, le porteur indiquant seulement qu'il utilisera un nombre minimum mais nécessaire à des analyses statistiques pertinentes.
Objectifs
La cavité péritonéale est l’espace physique contenant les organes de l’abdomen comme le foie, l’estomac et les intestins. Cette cavité contient du fluide péritonéal, qui agit comme un lubrifiant facilitant les mouvements et réduisant la friction entre les organes. De nombreuses cellules immunitaires résident au sein de cette cavité. Chez la souris comme chez l’Homme, la majorité de ces cellules immunes sont des macrophages et des cellules dendritiques qui jouent un rôle clé au cours des réponses immunitaires. En particulier, une population de cellules appelée « petits macrophages péritonéaux » (PMP) a été identifiée chez la souris et chez l’Homme. La fonction des PMP reste totalement inconnue. Des études préliminaires chez l’Homme et chez la souris ont révélé une forte ressemblance entre les PMP et les macrophages (ce qui explique leur nom), mais aussi des points communs avec d’autres cellules immunitaires appelées cellules dendritiques. Leur profil « hybride » suggère que ces cellules puissent avoir la capacité d’activer la réponse immunitaire adaptative, menant notamment à la production d’anticorps. Les PMP circulent librement au sein du fluide péritonéal, mais ils peuvent également adhérer à la surface des organes péritonéaux et en particulier à l’omentum. L’omentum est un organe juxtaposé à l’estomac, qui contient des aggrégats de cellules immunitaires. Les PMP peuvent également être recrutés à l’omentum et nous émettons l’hypothèse que ces cellules peuvent y intéragir avec d’autres cellules immunitaires pour les activer. Les objectifs du projet sont : 1/ Caractériser précisémment les PMP au sein de la cavité péritonéale. 2/ Caractériser la capacité des PMP à intéragir avec les autres cellules immunes au sein de l’omentum activer la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
La cavité péritonéale contient de nombreuses cellules immunitaires ayant la capacité de phagocyter des pathogènes au cours de la réponse immunitaire innée, mais également de présenter des antigènes et activer le système immunitaire adaptatif. En particulier une partie de ces cellules appelées « PMP » sont parfaitement homologues chez la souris et chez l’Homme, cependant l’origine et la fonction de ces cellules restent indeterminées. Ce projet permettra d’étudier en détails la biologie des PMP afin de comprendre la fonction de ces cellules. Notre étude sur modèles murins est réalisées en parallèles d’une étude de PMP humains obtenus chez des patients nécessitant un recours à des dialyses péritonéales. A long terme, l’identification de facteurs régulant la génération, la survie et les fonctions des PMP permettrait de cibler ces cellules. Il est envisageable que nos approches d’édition génétique et transfert intrapéritonal soient applicables à l’Homme, au cours de dialyses péritonéales par exemple.
Procédures
La seule intervention réalisée au cours de nos protocoles est une injection intrapéritonéale, effectuée sur animaux vigiles. Chaque souris incluse dans notre protocole (1040 animaux) recevra une injection intrapéritonéale au cours de sa vie. La durée de cet acte (contention, injection et remise en cage) est d’environ 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets négatifs attendus sont liés au stress subit par les souris lors de la contention et de l’injection péritonéale. Lors de ces injections, une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure dans le but d’analyser le contenu cellulaire de la cavité péritonéale et répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, des études in vitro seront réalisées sur des cellules primaires et lignées cellulaires. Cependant, pour comprendre en détails l’origine et les fonctions des PMP, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents types cellulaires présents dans la cavité péritonéale et entre les différents organes. Notamment, les cellules stromales de la cavité péritonéale sont source de facteurs de croissance permettant la différenciation et le maintien des cellules immunitaires. Ces cellules diffèrent selon leur localisation au sein de la cavité et l’aspect spatial est donc essentiel dans notre étude.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, les souris seront maintenues au sein de notre élevage, 100% d'entre elles pourront être utilisées pour l’expérimentation. Si une cohorte numériquement plus importante est nécessaire, nous achèterons ces souris auprès d’un fournisseur agréé pour répondre à ce besoin ponctuel. Afin de réduire davantage le nombre de souris, nous utiliserons une approche d’édition génétique, ce qui permettra d’éviter la génération de nombreuses lignées murines. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’une injection intrapéritonéale, nous surveillerons l’aspect du site d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (dont la fréquence est adaptée à la procédure) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure. Un animal avec une blessure sans perte de substance sera isolé et la blessure sera traitée avec un antiseptique (une fois par jour s’il n’y a pas de suintement et 2 fois par jour s’il y a suintement). Nous éviterons l’utilisation de méthodes d’identification ou de biopsies pour ces animaux et confirmerons seulement leur genotype post mortem, ce qui permettra d'éviter un geste invasif sur ces souris.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. D’autre part, nous disposons des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. De plus, nous étudions des populations cellulaires présentes chez l’Homme comme chez la souris. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Ces critères font de la souris l’espèce la plus adaptée pour répondre à nos questions scientifiques. Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 6 semaines, correspondant à un stade auquel le développement est complet et la maturité sexuelle est atteinte.
Etude chez la souris de l’action protectrice d’un probiotique instillé en prophylaxie et en curatif sur les infections pulmonaires à Pseudomonas aeruginosa.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Anesthésiées deux à trois fois pour recevoir dans la narine un probiotique puis une suspension de Pseudomonas aeruginosa, 845 souris développent une infection pulmonaire aiguë. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec pertes de poids, chute de température et immobilité progressive sur sept jours au maximum. Le porteur qualifie de faible l'intensité de chaque geste pris isolément, préhension, anesthésie, injection d'analgésique, tout en reconnaissant que l'évolution de l'infection va jusqu'à une intensité sévère. Toutes les souris infectées sont tuées, précisément parce qu'elles ont subi cette infection pulmonaire aiguë.
Objectifs
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive et chez les patients en réanimation. Cette bactérie devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi, il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, exercent des effets positifs sur la santé. Nous avons pu valider une preuve de concept, suite aux résultats prometteurs d’une bactérie à potentiel probiotique actuellement en développement au laboratoire, et ayant une action protectrice vis-à-vis de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa. L'objectif du projet est de tester l'efficacité du probiotique à des souris ayant une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentielles bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose ou la bronchopneumopathie chronique obstructive.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés deux à trois fois et recevront durant 1 minute du sérum physiologique ou un probiotique dans la narine puis la seconde fois une suspension bactérienne sur une durée de 1 minute. Si une troisième instillation est prévue, les souris recevront du sérum physiologique ou un probiotique durant 1 minute dans la narine.
Impact sur les animaux
Selon les procédures, les suivis quotidiens pourront durer de 3 à 7 jours. Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment lors de la préhension de l’animal, pour les suivis, les pesées et la prise de température (2 à 3 fois par jour maximum) : intensité faible, durée environ 1 min. Les animaux auront au maximum 3 anesthésies : Intensité faible, durée environ 2 min. Des pertes de poids et de température, une mobilité réduite voire, une inactivité après le début de l’infection pulmonaire peuvent être observées, elles sont d’intensité progressive avec l’évolution de l’infection pouvant aller jusqu’à une intensité sévère sur une durée de 7 jours maximum. Les analgésies par injection des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 30 secondes.
Devenir
A l'issu du projet tous les animaux ayant été infectés, seront mis à mort. Et certains auront des prélèvements de tissus. Tous les animaux doivent être mis à mort, car ils ont subi une infection pulmonaire aigue.
Remplacement
Nous souhaitons observer dans cette demande un pourcentage de survie d’animaux à une infection pulmonaire causée par Pseudomonas aeruginosa mais également observer les effets aux niveaux tissulaires (poumons et autres) de l’instillation du probiotique sur l’infection à Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal ou des dommages tissulaires à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal. De plus, nous souhaitons étudier la sécurité du potentiel probiotique ce qui doit impérativement se faire sur un modèle animal.
Réduction
Lors des études de survies, l’analyse de la survie sera réalisée par des tests statistiques, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 10 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux, le nombre de souris dans notre groupe recevant uniquement notre probiotique est réduit au minimum car nous n’attendons aucune mortalité. Lors des procédures d’études de l’inhibition de Pseudomonas aeruginosa au niveau pulmonaire, le nombre de souris nécessaire afin de garantir une puissance statistique est de 6 souris minimum dans chaque groupe. Pour nos procédures de test du probiotique de manière curative 10 souris minimum sont nécessaires dans chaque groupe. Par ailleurs, dans nos procédures, nous nous limitons à une seule souche clinique de notre probiotique alors que plusieurs espèces sont décrites.
Raffinement
Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés, une analgésie est mise en place en accord avec notre table se suivi de soin. De plus, un gel appétent contenant de l'analgésiant est déposé dans les cages 24h/24. Ce gel permet une analgésie continue pour les animaux tout au long de la journée. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement (2 à 3 fois par jour) à l’aide d’une table de suivi de soins mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies, car leur sensibilité à Pseudomonas aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.
Etude des changements d’efficacité de la communication entre les neurones dans un contexte d’addiction.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cathéter veineux posé sous anesthésie, puis dix séances de six heures d'auto-administration de cocaïne ou vingt-cinq séances de trois heures pour la nicotine, six semaines d'abstinence, une chirurgie cérébrale de deux heures trente : 960 rats enchaînent ce protocole, isolés en cage individuelle pendant 57 ou 81 jours. Les 1 088 rats du projet finissent par trois heures d'enregistrement de l'activité de leurs neurones sous anesthésie générale, 128 d'entre eux n'étant pas réveillés, les 960 autres relevant d'un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour analyser leur cerveau. Le porteur annonce que ces travaux pourraient mettre en évidence une nouvelle approche thérapeutique pour les personnes dépendantes, quand l'isolement de 57 à 81 jours et la prise chronique de cocaïne figurent, eux, parmi les nuisances attendues.
Objectifs
Le cerveau est en permanence soumis à des phénomènes de plasticité, c’est-à dire à des changements de l’efficacité de la communication entre des neurones, permettant l’encodage de nouvelles informations. L’exposition chronique à des drogues d’abus est connue pour induire de tels phénomènes, ce qui pourrait constituer une mémoire de la drogue et faire partie du processus pathologique menant à l’addiction et aux épisodes de rechute. Ce projet vise à étudier le rôle du cholestérol cérébral dans ces processus de changement d’efficacité synaptique induits par les drogues d’abus telles que la cocaine et la nicotine chez le rat.
Bénéfices attendus
La conduite de ce projet devrait permettre d’identifier les mécanismes par lesquels la manipulation du métabolisme du cholestérol cérébral modifie la recherche de drogue et la rechute (nouvelle consommation) chez des rats addicts. Ces expériences pourraient mettre en évidence une nouvelle approche thérapeutique, en ciblant le cholestérol cérébral chez les patients addicts pour les aider dans leur désir d’abstinence.
Procédures
Tous les rats (1088) seront pesés 2 fois par semaine. 960 rats auront une injection d’un antalgique et immédiatement après suivront une chirurgie sous anesthésie générale (15 minutes) afin d’implanter un cathéter veineux Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 960 rats seront hébergés seuls dans leur cage (57 jours pour les rats sous cocaïne et leurs contrôles (480 rats), 81 jours pour les rats sous nicotine et leurs contrôles (480 rats)). L'auto-administration de drogue se fera avec ces 960 rats pendant 10 sessions pour la cocaïne (480 rats) ou 25 sessions pour la nicotine (480 rats) à raison d’une session par jour (durée d'une session : 6 heures pour la cocaïne ou 3 heures pour la nicotine) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles ils sont libres de leur mouvement. Ces rats (960) seront ensuite placés en abstinence dans leur cage d’hébergement (6 semaines). Parmi les 1088 rats, 640 rats auront une injection d’un antalgique et immédiatement après une chirurgie cérébrale permettant l’injection d’un produit modifiant le cholestérol dans une région précise du cerveau (2h30 sous anesthésie générale gazeuse). Tous les rats (1088) seront soumis à des enregistrements de l’activité des neurones (3 heures sous anesthésie générale gazeuse).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques pendant et après la chirurgie et inconfort transitoire au réveil. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. -Auto-administration : La prise chronique de cocaine (bien que volontaire) peut causer un stress modéré et transitoire chez certains individus (poil hérissé, irritabilité) -La Période d’abstinence : peut causer un léger stress. -Isolement : stress modéré (57 jours pour les rats en auto-administration de cocaïne et leurs contrôles ; 81 jours pour les rats en auto-administration de nicotine et leurs contrôles)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de procéder à des analyses sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, qui vise à mesurer le changement d’efficacité synaptique cérébrale chez l’animal anesthésié suite à une exposition volontaire à la cocaïne ou à la nicotine, implique d’utiliser des modèles d’animaux vivants. L’étude des processus de changement d’efficacité synaptique cérébrale nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et des méthodes de substitution à l’animal entier ne peuvent être utilisés.
Réduction
Pour étudier les changements d’efficacité synaptique cérébrale en réponse à la consommation volontaire de cocaïne ou de nicotine, nous progresserons pas à pas en utilisant un arbre décisionnel de type Go/noGo pour étudier plusieurs protocoles de stimulation permettant d’induire ces changements. Dans la procédure1, nous avons choisi de tester 4protocoles d'enregistrement/stimulation/enregistrement pour chacune des 4régions cérébrales ciblées, et d’utiliser 8animaux maximum par protocole. Chaque animal sera son propre contrôle et nous comparerons les changements d’efficacité synaptique avec les différents protocoles. L’ordre des protocoles testés dans chaque région cérébrale sera basé sur la littérature scientifique. Dès qu’un protocole entrainera un changement d’efficacité synaptique, il sera retenu pour la région cérébrale et les autres protocoles ne seront pas testés. Si aucun changement d’efficacité pour une région, alors elle ne sera pas étudiée dans les procédures suivantes et la région cérébrale suivante sera étudiée avec le même cheminement. Lorsqu’un protocole induira des changements d’efficacité synaptique, nous étudierons si la consommation de cocaïne ou nicotine impacte cette efficacité. Si aucun effet des drogues n’est observé, alors cette région ne sera pas étudiée dans l'étude de l'effet du cholésterol. Pour réduire le nombre d’animaux et faire des analyses statistiques, le nombre d’animaux requis par groupe expérimental a été calculé par une méthodedite de puissance qui tient compte de la variabilité des mesures.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux et des pesées 2 fois par semaine. Selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans la décision d’intervention et d’arrêt. En effet, des points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoce dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal, atteignant un point limite défini nécessitant une intervention, sera pris en charge sans délai par l’expérimentateur. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale et de l’administration d’antalgiques. Un maintien de la température grâce à un tapis chauffant et une hydratation régulière des tissus seront assurés pendant les chirurgies.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Les rats ont des réponses aux drogues similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec d’autres espèces. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui limite le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rat en phase d’adolescence (juvéniles).
Caractérisation de nouveaux modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, dont 1 248 opérées sous anesthésie sans jamais reprendre conscience, 1 934 souris vont être utilisées pour caractériser quatre nouveaux modèles génétiques de la maladie de Huntington. Les 686 autres relèvent d'un niveau de souffrance léger. Certaines lignées sont maintenues jusqu'à onze mois pour que des symptômes neurologiques et moteurs apparaissent, symptômes que le porteur dit jamais handicapants, avant une série de tests comportementaux d'une semaine au maximum puis une chirurgie terminale. Ces tests, présentés comme très fins et seuls capables de révéler les symptômes en question, ne sont nommés nulle part dans le résumé.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Afin de pouvoir répondre à des questions fondamentales sur les mécanismes de cette maladie, quatre nouveaux modèles murins génétiquement modifiés ont été développés. Cependant, avant de pouvoir les utiliser en recherche, une description complète de leur comportement est indispensable. De plus, il faut également analyser si les modifications génétiques ne perturbent pas le développement des animaux afin de valider la fiabilité de ces nouveaux modèles. Cette étape est primordiale pour s'assurer que de futurs projets de recherche dans lesquels ces modèles seront utilisés ne seront pas biaisés.
Bénéfices attendus
Les différents modèles murins déjà existants pour étudier la maladie de Huntington ne permettent pas d’étudier et de visualiser directement et à l'état normal les protéines défaillantes et responsables de la maladie. Pour cela, il faut utiliser des intermédiaires cellulaires permettant de tracer et marquer les protéines. Cependant, l'ajout de ces intermédiaires peut engendrer des modifications cellulaires indésirables et fausser certains des résultats. Ainsi, ces nouveaux modèles murins vont être de précieux outils pour atteindre les objectifs des projets qui visent à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et à aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie et/ou d’empêcher l’apparition des symptômes. Ainsi, la caractérisation du développement, du comportement et des fonctions physiologiques de ces souris est essentielle.
Procédures
Parmi les animaux de ce projet, certains développent un phénotype dommageable avec l'âge. Tous les animaux effectueront une seule série de tests comportementaux pendant une durée maximale d'une semaine, puis une chirurgie terminale sera réalisée.
Impact sur les animaux
Certains des nouveaux modèles présentés ici peuvent développer avec l’âge des symptômes légers de la maladie de Huntington. Ces symptômes neurologiques et moteurs associés au modèle ne sont observés que lors de tests comportementaux très fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive ni une perte d'autonomie. Il est possible d’identifier 3 nuisances légères potentielles : 1) un stress léger pendant leur transport d'une animalerie vers l'autre. 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements et pendant la réalisation des tests comportementaux. 3) un stress léger d'une femelle ayant mis bas lorsque les animaux seront prélevés.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin des procédures. Leurs tissus cérébraux ainsi que d'autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés et conservés afin de réaliser des expériences ultérieurement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, les nouveaux modèles murins de la maladie de Huntington qui ont été développés vont permettre d'étudier le rôle de plusieurs protéines impliquées dans le développement de la maladie en conditions physiologiques et/ou pathologiques sans devoir utiliser des intermédiaires pouvant biaiser les résultats. Le modèle murin est indispensable pour comprendre le rôle de la protéine huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier.
Réduction
Le nombre total d’animaux pour ce projet a été calculés en considérant que les expérimentations doivent être validées avec au minimum deux groupes de souris afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Dans une démarche de réduction, les souris utilisées vont permettrent de faire plusieurs études et de répondre à différentes questions fondamentales. De plus, à la fin de chaque étude, les tissus cérébraux ainsi que d’autres organes clés dans la maladie de Huntington seront prélevés. Ceci permettra d’obtenir du matériel biologique précieux sans devoir générer des animaux supplémentaires.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez ces animaux. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées et équipées d’une litière stérile ainsi que de la paille permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. De plus, différents matériaux pour divertir les rongeurs seront ajoutés dans la cage avec une rotation chaque semaine pour que les animaux aient chaque semaine un nouveau divertissement. Ces cages seront changées toutes les semaines. L’accès à l’eau et à la nourriture sera illimité. Les biberons d'eau et les croquettes seront également changés toutes les semaines. Le transport des animaux d’une animalerie à l’autre sera effectué en cages occultées avec au moins un matériau de divertissement et des croquettes mouillées à disposition. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. L’état de santé des animaux sera surveillé toutes les semaines ou tous les jours si besoin jusqu'à la fin de leur vie. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la maladie de Huntington. Certaines souris seront utilisées au stade de jeunes adultes, c'est-à-dire entre 8 et 12 semaines, d’autres devront atteindre l’âge de 11 mois afin qu'elles développent les symptômes légers de la maladie de Huntington et permettre que l’étude soit pertinente. Concernant les études développementales, les animaux seront utilisés à différents stades de développement cérébrale car cette période est fondamentale pour la mise en place des tissus cérébraux. En outre, de plus en plus d'études montrent que des dyfonctionnements cérébraux s’installent très tôt, bien avant l'apparition des symptômes de la maladie de Huntington.
Le rôle du système inhibiteur du système vestibluospinal dans le contrôle de la posture chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour cartographier les réseaux de neurones inhibiteurs entre la moelle épinière et le cerveau, 224 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. 64 subissent une chirurgie d'injection dans la moelle épinière, 60 en subissent deux, moelle épinière puis tronc cérébral, et 100 reçoivent une injection dans le tronc cérébral puis l'implantation d'une fibre optique. Ces dernières passent trois épreuves comportementales, un couloir, un plateau basculé à 45 degrés dix fois par jour pendant deux semaines et un tapis roulant, pendant que la lumière active ou inhibe leurs neurones. Les suites annoncées sont le saignement, la douleur postopératoire, l'infection des sutures, le déséquilibre et la perte de poids, quand le bénéfice tient en une phrase, des connaissances utiles à la compréhension du système postural.
Objectifs
Les interactions entre la moelle épinière et le cerveau sont responsables de nombreux comportements, plus particulièrement les comportements moteurs. Cependant les mécanismes d’interaction entre ces deux systèmes (moelle et cerveau) ne sont pas comlètement élucidés. La connaissance de l’anatomie et du fonctionnement de ces interactions reste essentielle à la compréhension des mécanismes locomoteurs. En effet, les réflexes permettant la position debout et la stabilité pendant les déplacements ainsi que les positions statiques sont contrôlés par ces interactions. Si le réseau de neurones excitateurs a bien été étudié et caractérisé, ce n’est pas le cas pour les interactions entre ce réseau dit « excitateur » et celui dit « inhibiteur ». Le but de cette étude est donc de comprendre comment sont anatomiquement organisés les réseaux de neurones inhibiteurs de la moelle épinière et du cerveau et de caractériser également leur fonctionnement. Dans ce but nous travaillerons sur le modèle murin, et plus particulièrement sur des souris génétiquement modifiées dont les neurones cibles ont été rendus facilement répèrables par des outils de génie génétique ce qui permettra leur ciblage pour les étudier. La souris possède un système locomoteur quadripède assez proche de l’homme, de par les structures cérébrales qu’il implique. Pour ce faire, nous allons utiliser des approches de marquage des projections neuronales entre la moelle épinière et le cerveau, ainsi que des approches fonctionnelles permettant d’activer ou d’inhiber les neurones cibles en utilisant la lumière.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra une meilleure compréhension du système postural impliqué dans le maintien corporel d’un être vivant. L’étude anatomique et fonctionnelle de ce système d’adaptation apportera des connaissances utiles piur la compréhension de son fonctionnement en situation pysiologique et pathologique.
Procédures
-64 animaux seront soumis à 1 chirurgie d’injection dans la moelle épinière, d’une durée de 30 à 45 min sous anesthésie générale. -60 animaux seront soumis à 2 chirurgies : 1 injection dans la moelle épinière d’une durée de 30 à 45 min, puis 3 à 4 semaines après, 1 injection dans le tronc cérébral, chirurgie d’une durée de 1h. -100 animaux seront soumis à 2 procédures de chirurgies et 3 tests comportementaux : 1 injection au niveau du tronc cérébral (30min). 3 semaines après, 60 animaux seront soumis à une implantation de fibre optique au même niveau que le lieu d’injection précédemment mentionné (30min). Les 60 autres animaux seront implantés dans la moëlle épinière (1h) La stimulation optogénétique : durée et fréquence 30 sec toutes les minutes pendant 10 minutes Les animaux utilisés en comportement recevront 3 comportements différents : couloir (3 jours, 5x1min par jour), bascule (2 semaines, 10 basculements de 45° par jour), tapis roulant (6 jours, 4x 3 min).
Impact sur les animaux
Il s’agit de risques généraux suite à la chirurgie tel que le saignement, la douleur post-chirurgicale, l'infection au niveau de la suture, la réduction de la mobilité à court terme, le déséquilibre, la perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation pour l'étude histologique
Remplacement
En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent aux questions scientifiques posées par notre étude. Le recours donc au modèle animal « souris » est indispensable pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions. Cependant, nous avons réalisé des études pilotes chez le xénope pour mettre au point les protocoles et s’assurer de leur fonctionnement avant de les adapter à la souris.
Réduction
Avant la mise en place de ce projet, nous avons réalisé des expériences pilotes pour la mise au point des injections spinales cervicales afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux du projet. La réduction du nombre d’animaux a été prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique. Le nombre maximal, en prenant en compte les variations expérimentatles, ne dépasse pas ainsi 15 animaux par groupe pour l’étude fonctionnelle et 8 par groupe pour l’étude anatomique. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées.
Raffinement
Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. De plus, de la nourriture enrichie est fournie pendant au moins 3 jours suivant la chirurgie. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin.Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter la souffrance des animaux, pour cela, les animaux seront suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques (perte de poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration) et ce pendant 3 jours après la chirurgie. Les sutures seront particulièrement surveillées pendant la première semaine et seront reprises en cas d’ouverture.
Choix des espèces
Cette étude nécessite d’agir sur des neurones dont les modifications génétiques ne sont maitrisées n’existant que chez la souris, d’où le choix de cette espèce. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de minimum 8 semaines et n’excédant pas 6 mois pour des raisons de conservation de mobilité optimale car nous nous interressons à l’organisation des réseaux locomoteurs matures et fonctionnels.
Profilage toxicologique de mélanges chimiques complexes associés aux particules de carbone suie: application aux hydrocarbures aromatiques polycycliques
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Injectés trois jours de suite dans l'abdomen avec des hydrocarbures aromatiques polycycliques associés aux particules de suie, 112 rats passent ensuite par dix échocardiographies de vingt minutes, une IRM de trente à quarante-cinq minutes et un cathétérisme cardiaque terminal. 72 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 40 d'un niveau léger, et tous sont tués pour prélever poumons, aorte et cœur. Le porteur attend une atteinte cardiaque dès l'injection, avec accumulation de tissu non contractile et baisse de la contractilité, et suit les animaux jusqu'à 180 jours. Sa grille déclenche la mise à mort au-delà de 20 % de perte de poids ou d'un score cumulé supérieur à 4, qui additionne poil ébouriffé, posture anormale, immobilité et automutilation.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de développer une stratégie intégrée visant à identifier et étudier le potentiel bioactif de mélanges complexes de polluants environnementaux émis lors de procédés de combustion et susceptibles d’induire des effets respiratoires et cardiovasculaires. Ce projet se focalisera sur une famille de polluants environnementaux ubiquistes, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et leurs dérivés oxygénés (oxy-HAP) associés aux particules de carbone suie.
Bénéfices attendus
L’ensemble de cette étude in vivo permettra de mettre en évidence la prédictivité du biotest et d’apporter de nouvelles connaissances sur les effets chroniques d’expositions à faibles doses de mélanges de HAP.
Procédures
Les animaux subiront des injections IP lors des injection qui durée 10 secondes (avec la contention de l'animal vigile ) pendant 3 jours consecutif puis une échocgraphie cardique d'une durée de 10* 20 minutes, une irm d'une durée de 30-45 minutes et la fonction cardiaque sera également évaluée par cathétérisme cardiaque en phase terminal d'une durée de 20-30 minutes avec prlévement d'organe a la fin de la procédures .
Impact sur les animaux
Nous supposont une atteinte cardique sur l'animal du a la toxicité intrinseque de la molécule injecter des que l'animal a recut la molécule . L'atteinte cardiaque correspond à une accumulation de tissue non-contractile et une dysfunctionnement des mitochondries. Ces deux effets induiront (probablement) une diminution de la relaxation cardiaques. L'atteinte entraine une diminution de la contractibilité cardiaque .
Devenir
Le projet nécessite des prélévements d'organes vitaux pour chaque procédure.
Remplacement
Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous vérifions dans ce projet l’intérêt de mesurer la bioaccessibilité in vitro, pour estimer une biodisponibilité par inhalation in vivo. Le volet in vivo faisant l’objet de cette saisine permettra de fournir des indications sur la prédictivité de méthodes in vitro.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons un criblage cellulaire à l’aide de cultures pour choisir le mélange de molécules à tester (fraction bioaccessible) ce qui limite considérablement le nombre d’animaux à utiliser. Nous limitons les prélèvements tissulaires qui ne se feront qu’à un seul temps avec un suivi de la fonction cardiaque de façon non invasive pour nous guider dans la date de mise à mort, avec une durée maximale de suivi de 180 jours. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=12 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. L’analyse répétée en échocardiographie / IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Nous utiliserons un nombre limité d’animaux afin de mettre au point tous les marqueurs biologiques envisagés. Les organes d’intérêt sont les poumons, l’aorte et le cœur mais d’autres organes seront prélevés pour constituer une banque de tissus pouvant être analysés ultérieurement (foie ; intestins ; reins).. Les tests statistiques utilisés seront: Pour la fonction cardiaque par échographie . Pour l'hémodynamique invasive, Test paramétrique.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 animaux par cages avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation de deux semaines après réception des rats sera maintenue avant tout début de protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation du bien-être animal se décompose en : A) changement du poids corporel 0. Normal 1. Perte de poids
Choix des espèces
Le rat Wistar adulte est par excellence l’espèce utilisée dans la plupart des études toxicologiques dont il existe au sein du consortium des données historiques. Rats Wistar adultes de 225-250 g âgés d’environ 50 jours en début de protocole. L'évaluation toxicologique des molécules à tester sera effectuée sur des rats adultes s'assurant ainsi d'une maturité des systèmes de défense mis en jeu.
Effets d’une thérapie ciblée dans des modèles murins de tumeurs à cellules squameuses
- Recherche appliquée
- Cancers
Trois injections intraveineuses par semaine pendant trois mois, une injection de chimiothérapie par semaine sur la même période, des tumeurs mesurées deux à trois fois par semaine : 780 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des cellules cancéreuses humaines leur sont greffées sous la peau, des plaies peuvent s'ouvrir sur les tumeurs et s'infecter, et la chimiothérapie provoque chez certaines un affaiblissement important avec forte perte de poids. Le projet teste un anticorps seul ou associé à une chimiothérapie contre des cancers de l'épiderme, un essai clinique avec cet anticorps étant déjà à l'étude. Le porteur retient la souris immunodéficiente précisément pour que son système immunitaire, amputé d'une partie de ses cellules, n'élimine pas les cellules humaines greffées.
Objectifs
Les cancers de l’épiderme (à la surface de la peau) sont des cancers qui touchent principalement les cellules squameuses (cellules qui se détachent au fur et à mesure que de nouvelles se forment) au niveau de la tête, du cou et des poumons entre autres. Le taux d’incidence de ce type de cancer a augmenté de 200% sur les 30 dernières années avec 1,8 millions de cas diagnostiqués chaque année malgré les campagnes de prévention. Sans traitement mis en place, les tumeurs peuvent se développer dans des couches plus profondes et engendrer des métastases dans d’autres parties du corps. Actuellement le traitement de choix contre ce genre de tumeurs est principalement différents types de chirurgie d’ablation des tumeurs lorsqu’elles sont détectées de manière précoce et possibles puis en combinaisons ou non avec de la radiothérapie, de l’immunothérapie et/ou de la chimiothérapie. Néanmoins, une proportion importante de patients ne répondent pas ou rechutent suite à ces traitements. Il convient donc de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques offrant une nouvelle option aux patients atteints de stade avancé de la maladie. L'objectif principal de ce projet est d’étudier l’effet d’un anticorps (ciblé contre une protéine) seul ou en association avec une chimiothérapie sur le développement de certaines formes de cancers de l'épiderme dans des modèles cellulaires humains greffés chez la souris.
Bénéfices attendus
L'hypothèse de ce travail est que la protéine ciblée par notre anticorps joue un rôle dans le développement des cancers de l’épiderme. Ceci est basé sur l'expression de cette protéine ciblée dans les tumeurs de patients atteints de cette maladie. Dans le cadre de cette étude, l’effet anti-tumoral de notre anticorps seul ou en combinaison avec une chimiothérapie sera évalué dans des modèles de souris. Un projet d’essai clinique portant sur le traitement de ces cancers avec cet anticorps est actuellement à l’étude. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement de cet anticorps sur ce type de cancer et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie (si l’anticorps est capable d’améliorer l’effet des chimiothérapies). Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.
Procédures
Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations 2 à 3 fois chaque semaine pour des prises de poids, les mesures des tailles des tumeurs pendant 3 mois. Mais aussi des injections intraveineuses d'anticorps = traitement (3 injections par semaine pendant 3 mois) et/ou des injections dans l’abdomen de chimiothérapie (1 injection par semaine pendant 3 mois). Mais aussi une seule injection sous-cutanée de cellules cancéreuses en début de protocole. 3 prises de sang réalisées par du personnel qualifié représente un stress de 1 à 2minutes et les volumes de sang prélevés sont inférieurs aux volumes maximums recommandés avec une semaine de récupération entre chaque prise de sang.
Impact sur les animaux
Dans les trois procédures il est possible d’observer l’apparition de plais sur les tumeurs à la surface de la peau qui peuvent dans de rares cas provoqués des infections. Dans les traitements avec chimiothérapie, un affaiblissement important de l’organisme associé à une forte perte de poids peut être observée chez certains individus. Toutes les souris prévues dans le protocole subiront différentes manipulations chaque semaine pouvant engendrer un stress pour des prises de poids et le suivi de la croissance tumorale. Le stress liés aux injections intraveineuses d'anticorps dure moins d’une minute ainsi que moins de 20 secondes pour les autres injections et la douleur est restreinte aux quelques secondes de la piqûre. 3 prises de sang seront réalisées seulement dans la dernière procédure et nécessitant une contention et donc un stress de 1 à 2 minutes ainsi qu’une douleur restreinte au moment de la piqure. Dans de rare cas ces prises de sangs peuvent entrainer des saignement anormales (volume plus important ou de l’oreille ou du nez). Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de précautions spécifiques à chaque geste.
Devenir
Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet.Les animaux non porteurs ne pourront pas être réutilisés et devront également être mis à mort en cas de développement de tumeurs de manière tardive.
Remplacement
Les cancers de l’épiderme nous intéressent pour la diversité des cellules qui les composent ainsi que toutes les interactions entre elles = microenvironnement tumoral. Ces éléments sont nécessaires à la compréhension des mécanismes d’action de notre thérapie ciblée. Les modèles retrouvés dans la littérature montrent que cette diversité n’est pas retrouvée dans les cultures cellulaires (qui contiennent en général un nombre très limité de types cellulaire différents) mais uniquement dans les greffes de cellules cancéreuses chez la souris où l’on retrouve un microenvironnement tumoral complet avec tous les types cellulaires comme les cellules cancéreuses, les cellules immunitaire, les cellules des tissus touchés par ce type de cancer.
Réduction
Tout d'abord nous testons 6 lignées cellulaires cancéreuses de cancer de l’épiderme (3 groupes de 2 qui forment des tumeurs à des endroits différents) pour voir si une fois injectées chez la souris elles forment des tumeurs. Nous nous basons sur des données de la littérature scientifique pour décider du nombre de cellules injectées. Nous utilisons 5 souris par lignée cellulaire injectée à 2 endroits différents pour tester la prise tumorale de 10 tumeurs tout en utilisant moins de souris. Dans le cas où aucune tumeur ne se forment, 5 nouvelles souris par lignée cellulaire pourront être utilisées pour tester une nouvelle condition de prise tumorale. Les lignées cellulaires n’ayant montré aucune croissance tumorale ne seront pas utilisées pour les prochaines procédures, ce qui limitera donc le nombre de conditions testées. Une nouvelle procédure permet cette fois-ci de tester l’efficacité de notre anticorps en combinaison ou non avec une chimiothérapie sur la croissance tumorale. Pour cela et selon des tests statistiques nous aurons besoin de 15 souris par groupe de traitement. Nous testerons 4 groupes de traitement différents. Si les des 2 groupes de traitement contenant notre anticorps ne montrent aucune efficacité antitumorale dans cette procédure sur une lignée cellulaire, celle-ci ne sera pas testée dans la dernière procédure conduisant à une nouvelle réduction du nombre d’animaux. Enfin une dernière procédure permettra de répéter le schéma de traitement précédent en mettant fin au protocole de manière plus précoce (arrêt de la procédure à partir d’un volume tumorale 3 fois inférieur à la procédure 2) dans le cas d’efficacité antitumorale de notre anticorps afin de nous permettre d’étudier les mécanismes d’action de cette thérapie dans les temps précoces du traitement.
Raffinement
A leur arrivées les animaux ont une période d’habituation à leur nouvel environnement d’hébergement et aux expérimentateurs qui vont suivrent le protocole. Les souris seront élevées et hébergées par groupes, avec un milieu enrichi pour favoriser la nidation (maison en carton, coton). Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux (pesées, mesure de la croissance tumorale etc.) plusieurs fois par semaine permettra la recherche de tout signe de souffrance. Toutes les souris immunodéficientes (manque d’une partie de leurs cellules immunitaires) sont hébergées en cage ventilée et manipulées sous hotte qui leur permettent de rester dans des zones stériles limitant les risques d’infections de ces souris plus fragiles que les autres. Des points limites adaptés sont mis en place au-delà desquels, si aucun moyen de correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort. Toutes les injections et les mesures de croissance tumorale sont réalisées par du personnels qualifiés afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux. Une prise de sang réalisée par du personnel qualifié représente un stress de 1 à 2minutes et les volumes de sang prélevés sont inférieurs aux volumes maximums recommandés avec une semaine de récupération entre chaque prise de sang.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente (manque d’une partie des cellules immunitaires) est le modèle le plus approprié pour injecter des cellules cancéreuses humaines et éviter que le système immunitaire de la souris ne s’en prennent à ces cellules et les élimine. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps et chimiothérapies sont bien standardisés chez la souris (voie, doses, et fréquence des injections) contrairement à d'autres modèles animaux. De plus la protéine étudiée dans ce projet n'est pas exprimée dans toutes les espèces. On retrouve une forte ressemblance entre la forme humaine et murine, justifiant encore l'usage des souris. En dernier lieu, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils destinés à l'analyse des tumeurs qui n'existent pas tous pour d'autres espèces que l'homme et la souris. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes.