Rongeurs

55 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant sept jours des injections quotidiennes d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de patients atteints de myopathie nécrosante, subissent trois microprélèvements de sang et deux tests de force par traction, avant le prélèvement de leurs muscles gastrocnémiens. L'objet du projet est de vérifier si les anticorps de quatre nouveaux malades déclenchent bien la maladie chez la souris, pour disposer d'un modèle où tester des médicaments. Le porteur écrit que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance ou de perte de poids, tout en prévoyant une gêne de la mobilité du train arrière et un traitement antidouleur quotidien pour tous les lots.

Objectifs

Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) anti-Signal Recognition Particle (SRP) ou, plus récemment, d'aAc anti-3-hydroxy-3-méthylglutaryl- Coenzyme A réductase (HMGCR) et la corrélation de leur titre avec le myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris C57BL/6J d'IgG purifiées issues de patients porteurs d’aAc anti- HMGCR ou anit-SRP. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de C5b-9 (ensemble de protéines formant un pore dans la membrane) à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Ce modèle nous a permis récemment de tester de nouvelles thérapies avec succès. Cependant, les aAcs de certains malades n'induisent pas de myopathies chez la souris pour des raisons inexpliquées. Les IgG anti-HMGCR et anti-SRP sont purifiées à partir de plasmaphérèse de patient qui sont extrêment rares à obtenir. En relation avec différents hôpitaux en France, nous avons réussi à obtenir des plasmaphérèses de 4 nouveaux malades. L'objectif général de notre programme est d'évaluer la pathogénicité des anticorps de ces nouveaux patients dans le but de les utiliser en cas de résultat positif dans des protocoles d'évluation de l'efficacité de nouveaux médicaments. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.

Bénéfices attendus

Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal , nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Les plasmaphères de pateints sont rares et épuisables. La possibilité de disposer de nouvelles sources d'anticorps de malades permettra de tester de nouvelles molécules thérapeutiques qui ne peuvent pas être testées dans les modèles in vitro que nous développons parallèlement.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 3 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 7 jours soit 7 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacun. 2 grip test seront réalisés pour chacune des souris à 8 jours d'intervalle, durée moins de 10 secondes. Les gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.

Impact sur les animaux

L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux autorisés avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids. Lors des injections IP les souris pouront ressentir un peu de stress du à la contention et l'injection en elle même, mais qui sera de très courte durée. Pour les souris de l'étude qui développeront une myopathie consécutive à l'action pathogéne des anticorps testés une gêne dans la mobilité du train arrière pourra être observée.

Devenir

Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementauxautorisés utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de des dispositions pour réduire la douleur (conférer paragraphe suivant). Un traitement préventif quotidien (par voie orale) de la douleur sera mis en place pour les animaux de tous les lots. En cas de douleur, un traitement en sous cutané (s.c) sera administré. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en s.c).

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.

Génétiquement modifiées pour développer de l'athérosclérose, privées du récepteur aux LDL ou de l'apolipoprotéine E, 376 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 300 d'entre elles reçoivent pendant trois mois un régime enrichi en cholestérol, avec des prises de sang sous anesthésie gazeuse, et une partie est maintenue en vie jusqu'à 28 mois pour croiser vieillissement et maladie. Toutes sont tuées, le porteur listant le sang, le cœur, l'aorte, le liquide péritonéal, la moelle osseuse, le foie, la rate, les reins, le tissu adipeux, les quadriceps et les artères fémorales parmi les prélèvements attendus. Il décrit l'athérosclérose et la stéatose hépatique induites comme asymptomatiques et sans altération de la qualité de vie, tout en déclarant une souffrance modérée pour l'ensemble du projet.

Objectifs

L’athérosclérose est un facteur de risque majeur des maladies cardiovasculaires, première cause de mortalité en France. Elle se caractérise par une accumulation de graisses (lipides) au niveau des artères. En s’oxydant, ces lipides sont reconnus comme des signaux de danger par les macrophages de la paroi artérielle. Progressivement, ces macrophages vont se charger en lipides oxydés. Ceci, en entraine leur mort, contribue à la formation progressive de la plaque d’athérome et mène à l’obstruction des artères. L’âge est un facteur de risque majeur de l’athérosclérose. Pourtant, les mécanismes sont peu compris et peu étudiés. L’athérosclérose est associée à une inflammation de bas grade et au recrutement de cellules immunitaires qui jouent un rôle central dans le développement de la plaque. Les altérations de la fonction des cellules immunitaires et l’inflammation chronique constituent une piste de choix pour expliquer l’athérosclérose liée à l’âge. Les travaux de notre équipe suggèrent que l'activation des cellules myéloïdes est liée à des changements dans l’élimination des mitochondries endommagées (mitophagie). Le vieillissement est associé à un ralentissement de la mitophagie qui contribue à une altération des fonctions mitochondriales. De manière intéressante, in vitro, nous avons observé un phénotype similaire dans des monocytes et macrophages de sujets âgés. L’objectif de ce projet est d’étudier les altérations de la fonction mitochondriale et de la mitophagie dans les cellules myéloïdes dans des modèles de souris génétiquement modifiées sensibles à l’athérosclérose d’âges différents. Ces paramètres seront évalués chez des souris nourries avec un régime standard ou favorisant l’athérogénèse. Le niveau de mitophagie et la fonction mitochondriale seront modulés par des approches pharmacologiques via l’utilisation de modulateurs pharmacologiques de la mitophagie.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de décrypter le rôle des altérations de la mitophagie et de la fonction mitochondriale dans l’athérosclérose liée à l’âge. La première stratégie mise en place permettra de caractériser en détail l’impact de l’âge et du sexe sur l’athérogénèse dans le cadre d’un régime standard ou d’un régime athérogénique. Cette caractérisation reposera sur une analyse détaillée des tissus. Ceci nous permettra de décrire avec précision les modifications de la mitophagie et de la fonction mitochondriale dans les cellules myéloïdes au cours du vieillissement et de mettre ces résultats en parallèle du degré de développement de l’athérosclérose et des critères de gravité associés. Cette étude nous permettra également d’évaluer la pertinence d’une stratégie de restauration pharmacologique de la mitophagie ou de la fonction mitochondriale pour lutter contre l’athérosclérose. Les 2 volets de cette étude permettront de déterminer si les altérations de la mitophagie et/ou de la fonction mitochondriale dans les cellules myéloïdes contribuent à l’athérosclérose liée à l’âge. Ce travail de recherche pré-clinique nous permettra également d’évaluer la pertinence du ciblage pharmacologique de cette voie. Ainsi, ce travail contribuera à améliorer la connaissance de la physiopathologie de l’athérosclérose liée à l’âge en lien avec la fonction des cellules myéloïdes et d’évaluer l’efficacité de deux nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

300 souris seront placées sous régime athérogénique enrichi en cholestérol pendant 3 mois. Les prises de sang seront réalisées sous anesthésie gazeuse de même que l’euthanasie des animaux qui seront toutes réalisées par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Le régime athérogénique enrichi en cholestérol va induire une athérosclérose et une stéatose hépatique chez les souris. Ces évènements sont asymptomatiques et ne se traduisent pas par une altération de la qualité de vie des animaux pour un régime d’une durée de trois mois. Des animaux âgés seront utilisés dans le cadre de ce projet. Il s’agit d’un processus physiologique. Dans les conditions standards d’hébergement, les animaux ne présentent aucun signe de souffrances visibles jusqu’à un âge 30 mois. Au-delà de cet âge, des cas d’altérations de l’appareil locomoteur peuvent être observés. Par ailleurs, il est également classique d’observer une perte de poids. Ce phénomène est également physiologique et non lié aux investigations mises en place.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse pour prélever le sang, le cœur, l’aorte, le liquide péritonéal, les fémurs (prélèvement de moelle osseuse), le foie, la rate, les reins, le tissu adipeux, les quadriceps et les artères fémorales. L’objectif de tous ces prélèvements est de réduire la nécessité de reproduire ces l’expérience.

Remplacement

L’athérosclérose est une pathologie complexe faisant intervenir des interactions entre plusieurs organes et entre le métabolisme des lipides et des lipoprotéines, l’inflammation et le système immunitaire (cellules myéloïdes en particulier). Ce type de pathologie ne se développe que chez les mammifères et ne peut pas être mimée in vitro. Seule l’utilisation de modèles animaux présentant une physiopathologie de l’athérosclérose proche de celle observée chez l’Homme peut permettre une meilleure compréhension de cette pathologie. Les souris déficientes pour le gène codant pour le récepteur aux LDL (lipoprotéine de basse densité) ou l’apolipoprotéine E (apolipoprotéine présente au niveau des lipoprotéines LDL qui permet leur captation tissulaire) sont deux modèles bien décrits pour l’étude de l’athérosclérose. En effet, les souris de souche sauvage ne développent que de rares lésions athéromateuses avec un régime athérogénique. C’est pourquoi ces 2 modèles, qui conduisent à une augmentation des niveaux plasmatiques de lipoprotéines LDL sous régime athérogénique, sont classiquement utilisés. Il est par ailleurs très bien établi que la physiopathologie de l’athérosclérose dans ces modèles mime parfaitement la situation humaine sur une durée beaucoup plus courte. Par ailleurs, la souris est un modèle parfaitement adapté pour étudier les conséquences du vieillissement sur cette pathologie à l’échelle d’un organisme entier. Cette approche permet ainsi d’étudier les conséquences sur plusieurs organes en parallèle.

Réduction

Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables en ce qui concerne la formation de lésions athéromateuses, nos études requièrent 10 animaux par groupe. Cet effectif a été établi en tenant compte de la variabilité inter-individuelle. Par ailleurs, cet effectif par groupe est en cohérence avec les nombreuses publications scientifiques basées sur l’utilisation de ces mêmes modèles animaux. La pertinence d’un tel effectif est également basée sur l’expérience acquise par notre laboratoire durant de nombreuses années avec ces modèles animaux. Afin de prendre en compte la différence de susceptibilité à l’athérosclérose liée au sexe, les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous n’utiliserons qu’un modèle de souris sensible au développement de l’athérosclérose pour la première partie de l’étude visant à décrire l’impact de l’âge et du sexe sur le développement de l’athérosclérose. Ces résultats seront confirmés sur le second modèle de souris sensibles à l’athérosclérose avec un nombre de groupe limité.

Raffinement

Les régimes alimentaires ne sont pas générateurs de souffrance. Néanmoins, le suivi de animaux permettra d’identifier des signes de souffrances qui pourraient survenir de manière indépendante, notamment en raison de l’âge des animaux dans certain groupe expérimentaux. Si les points limites définis sont atteints, les animaux seront immédiatement mis à mort. Le milieu d’hébergement sera enrichi avec des nids. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10 animaux pour maintenir les interactions sociales.

Choix des espèces

L’utilisation de modèles murins pour étudier l’athérosclérose est nécessaire car l’athérosclérose est un processus physiopathologique complexe ne pouvant pas être modélisé in vitro et les souris génétiquement modifiées sont le modèle de référence dans ce domaine. Les similarités génétiques, développementales, physiologiques et biochimiques entre la souris et l’homme, nous permettent d’extrapoler les conclusions à l’Homme, en particulier dans le domaine de l’athérosclérose où la souris demeure le modèle pré-clinique de référence dans lequel sont testées la majorité des stratégies thérapeutiques émergentes. Ce projet vise à caractériser l’impact du vieillissement sur l’athérogénèse en lien avec un déficit de la mitophagie et/ou de la fonction mitochondriale. Ainsi, des animaux âgés de 3 à 4 mois, de 14 à 16 mois, de 22 à 24 mois et de 28 mois seront utilisés.

648 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun hébergé seul en cage pendant 77 jours après la pose d'un cathéter intraveineux. Chaque rat enchaîne vingt-cinq séances quotidiennes d'auto-administration de nicotine de six heures, six semaines d'abstinence, une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter une enzyme qui dégrade le cholestérol, puis une séance de test de rechute. Chacun reçoit une trentaine d'injections intraveineuses en condition vigile. Les retombées annoncées, une meilleure prise en charge des personnes dépendantes et de futurs médicaments contre la rechute, sont formulées au conditionnel, quand l'isolement de 77 jours figure, lui, parmi les nuisances attendues.

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie comportementale et psychiatrique chronique avec une prévalence croissante, au coût élevé sur le plan médical, social et économique . Le tabagisme fait plus de 8 millions de morts chaque année dans le monde. Sur ces 8 millions, 7 millions sont dus à la consommation directe de tabac, et environ 1,3 million de ces morts subviennent chez des non-fumeurs, qui sont involontairement exposés à la fumée du tabac (selon l’OMS). L’une des caractéristiques de l’addiction est le risque durable de nouvelles consommations même après une abstinence prolongée. Ce risque serait lié à des adaptations durables laissées par les drogues dans le cerveau. La découverte de stratégies pour aider les personnes addicts dans leur désir d’abstinence est une réelle nécessité. Plusieurs évidences suggèrent que le cholestérol cérébral pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique pour traiter l’addiction. En effet, la littérature scientifique indique que le cholestérol pourrait participer aux modifications neuronales persistantes, qui sous-tendent les risques durables de rechute vers une addiction. Ce projet a pour premier but d'identifier chez le rat, une structure cérébrale dans laquelle la manipulation du cholesterol cérébral réduit la recherche de nicotine chez des rats addicts. Quand une structure sera identifiée, nous chercherons à identifier les mécanismes neurobiologiques associés à ces effets comportementaux.

Bénéfices attendus

Ce projet innovant permettra d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires expliquant la vulnérabilité à la rechute en particulier à l’addiction au tabac. Ces expériences pourraient conduire à une meilleure prise en charge des personnes addictes et au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire voire empêcher la rechute (nouvelle consommation) de nicotine.

Procédures

Tous les rats (648) suivront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (durée : 15minutes) afin d'implanter un cathéter intraveineux permettant les injections de nicotine pendant les sessions d’auto-administration. Après la chirurgie et jusqu’à la fin du projet, ces 648 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de nicotine concernera tous les rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 6 semaines pour tous les rats. Pour modifier la quantité de cholestérol cérébral, tous les rats suivront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale gazeuse pour permettre l’injection d’une enzyme dégradant le cholestérol ou son contrôle dans une région cérébrale précise (environ 2 heures sous anesthésie générale). Après les 6 semaines d’abstinence, tous les rats sont replacés dans la cage d’auto-administration pour une session de test de rechute (1 session, 4 heures). Tous les rats auront 1 injection sous-cutanée avant et les 2 jours après les chirurgies (3 injections par rat) et une injection intraveineuse (par le cathéter), les 5 premiers jours après la chirurgie d’implantation de cathéter et tous les jours d’auto-administration (30 injections), en condition vigile.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, douleur minimisée par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Période d’abstinence : peut causer un léger stress avec certaines drogues mais non observé avec la nicotine. -Isolement : stress modéré (pendant 77 jours)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement de rechute, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux au maximum et pouvoir faire des analyses statistiques de type ANOVA, le nombre d’animaux requis a été calculé par un test dit de puissance qui tient compte de la variabilité des mesures. Ainsi, nous avons trouvé que 18 animaux par lots seront nécessaires avec 36 lots au total soit 648 animaux maximum. Le nombre d'animaux indiqué est un maximum. Le projet est conçue dans une démarche "pas à pas" où certaines expériences ne seront réalisées que si les résultats des expériences précédentes sont concluantes.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoce dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 2 fois par semaine. Lors des procédures de chirurgie un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec la souris, pour lesquelles la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, ce qui correspond au stade de développement utilisé dans l’ensemble de nos projets de recherche afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

Des ultrasons délivrés une minute par jour, jusqu'à cinq jours de suite, pour ouvrir la barrière qui protège le cerveau, après la pose d'un cathéter et l'injection de microbulles de gaz : 176 souris porteuses d'une modification génétique reproduisant la maladie d'Alzheimer subissent ce protocole, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi, à l'état vigile, une injection quotidienne pendant deux jours d'une protéine bactérienne qui déclenche fièvre, poil hérissé et prostration pendant trois à six heures, puis un inhibiteur censé bloquer l'inflammation cérébrale. Toutes sont tuées et leur cerveau prélevé pour analyse. Le porteur annonce des tests comportementaux étalés sur quatorze jours, dix minutes par test sur animal vigile, sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA), constituent un problème de santé et sociétal majeur dans le monde, les causes et les nombreux facteurs contribuant à la MA sont encore mal compris, et les essais cliniques n’ont jusqu'à présent pas réussi à stopper la progression de la MA. Une meilleure compréhension des mécanismes de la MA est nécessaire pour explorer de nouvelles approches thérapeutiques. La contribution de l'inflammation périphérique et cérébrale aussi appelée « neuroinflammation », à la pathologie de la MA est établie mais reste encore mal comprise. L’inflammation peut être ciblée via l’un de ses composants critiques : l’inflammasome, et plus particulièrement par une protéine impliquée dans cette neuroinflammation. Ce projet vise: - à déterminer la contribution de l'inflammation systémique, induit par des stimuli pro-inflammatoires, à la pathologie de la MA - à établir si la protéine peut être ciblée à la fois de manière périphérique et centrale - à utiliser une approche innovante pour améliorer la délivrance cérébrale d'un inhibiteur sélectif de cette protéine en utilisant les ultrasons (US) pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique(BHE).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont : • De valider une cible thérapeutique innovante associée à une technologie permettant d’améliorer l’efficacité potentielle de cette thérapie ; • D’apporter de nouvelles connaissances dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement du rôle de l’inflammation et de la neuroinflammation dans la MA.

Procédures

Un groupe d'animaux recevra: une injection intra-péritonéale (IP) par jour d'une protéine bactérienne pendant 2 jours d'une durée de 20 secondes par injection. (Animal vigile) et recevra une autre injection intra-péritonéale (IP) d'une molécule inibitrice de la protéine concernée, 1 seule fois, d'une durée de 20 secondes par injection (Animal vigile). Les animaux ayant reçu les injections IP auront une séquence d'ultrasons d'une durée d'une minute: pose de cathéter en IV (1 min) puis injection de microbulles de gaz (1min) et séquence ultrasonore. (sous anesthésie gazeuse). Il auront 1 fois une injection en IP (vigile) pour une anesthésie chimique d'une durée de 20 secondes. Un autre groupe d'animaux recevra également une injection intra-péritonéale (IP) par jour d'une protéine bactérienne pendant 2 jours d'une durée de 20 secondes par injection. (Animal vigile) et recevra une autre injection intra-péritonéale (IP) d'une molécule inibitrice de la protéine concernée de J3 à J7 d'une durée de 20 secondes par injection (Animal vigile). Ces animaux recevront une fois par jour pendant 5 jours une séquence d'ultrasons d'une durée d'une minute: pose de cathéter en IV (1 min) puis injection de microbulles de gaz (1min) et séquence ultrasonore. (sous anesthésie gazeuse). Habituation de la pièce de comportement: 30 min avant les tests. Les souris auront différents tests comportementaux pendant 14 jours pour une durée de 10 min par test (animal vigile). Tous les animaux auront 1 fois une injection en IP (vigile) pour une anesthésie chimique d'une durée de 20 secondes.

Impact sur les animaux

Administration intrapéritonéale et intra veineuse: Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection et la manipulation/contention des souris peut engendrer un certain stress. La protéine bactérienne n’induit pas d’effets indésirables sévères chez les animaux, mais peut induire un état fiévreux : poil hérissé, prostration liée la fièvre (l’inflammation périphérique) induite par la protéine bactérienne pendant les 3-6h suivant l’administration. Ces symptômes disparaissent d’eux-mêmes dans les 6h suivant l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue du projet et leur cerveau sera prélevé pour des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Seules des études chez l’animal vivant peuvent reproduire la complexité de l’ensemble des processus physiopathologiques dans leur intégralité. De plus, il est important de noter que la méthode d’imagerie TEP (tomographie émission de positions) utilisée est intégralement transférable à la clinique et que l’étude chez l’animal nous informera de l’amplitude des différences entre groupes qui lors d’études similaires précédentes se sont révélées similaires de celles observées chez l’homme.

Réduction

L’utilisation de la méthode d’imagerie in vivo permet de réduire le nombre d’animaux utilisé (-25%) par le biais du suivi longitudinal. Le nombre total d’animaux est néanmoins dicté par les groupes expérimentaux requis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée. Ces groupes seront composés de 50% de mâles et 50% de femelles. Bien que des différences mineures de pathologie de la MA aient été notées entre mâles et femelles dans le modèle transgénique, celles-ci ne devraient pas affecter significativement les paramètres mesurés dans cette étude. Nous prévoyons ainsi d’inclure un effectif de 10 animaux/groupe (afin d’assurer un minimum de 8 animaux à exploiter, par exemple en cas d’échec de l’injection du traceur ou de mort au cours de l’imagerie), nombre qui a été suffisant lors d’études précédentes dans ce modèle. Par souci de réduction, nous n’inclurons qu’un seul groupe non transgénique comme contrôle absolu pour tous les autres groupes, puisque d’un point de vue scientifique et translationnel des animaux/patients sains ne recevraient pas de traitement. D’après notre expérience, ce groupe est néanmoins nécessaire car il y une légère augmentation de la neuroinflammation avec l’âge (notamment mesurée par un radiotraceur fluoré) chez ces souris. Dans ce projet, nous utiliserons des tests statistiques appropriées pour analyser les différents paramètres mesurés au cours de ce projet: en imagerie, le comportement, des études in-vitro.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Une récompense alimentaire sera donnée aux animaux après les injections pour diminuer leur stress. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par les procédures. Pendant le protocole, si nous constatons des conflits dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. Pendant le projet, le point d’injection, les expressions faciales, la posture de l’animal, la réactivité de l’animal à des stimuli externes (bruit…) seront monitorés chaque jour. Une perte de poids de plus de 15%, une réactivité anormale à des stimuli externes (bruits), une posture et des expressions associées à une souffrance de l’animal impliqueront sa mise à mort. Le jour de l'imagerie l’induction et le maintien se fera sous anesthésie gazeuse. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la pathologie de la maladie d'Alzheimer (MA) est bien reproduite dans ce modèle d'animal transgénique et les processus inflammatoires lié à cette maladie dans ce modèle sont très similaire à ceux observé chez l'humain. La taille du cerveau de la souris est compatible avec la résolution spatiale de la caméra microTEP. Nous utiliserons des souris adultes car la MA ne concerne que les populations adultes/âgées.

Après cinq jours d'injections quotidiennes dans le ventre, des souris reçoivent des cellules tumorales, subissent une chirurgie qui provoque un lymphœdème ou l'application d'une molécule inflammatoire, puis, pour certaines, une lymphographie par injection entre les coussinets d'une patte. 280 souris femelles de 5 semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récolter leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe étudie, chez des souris génétiquement modifiées qui ne l'expriment plus dans leurs vaisseaux lymphatiques, le rôle d'un ARN, LincPint, retrouvé en excès chez des patientes atteintes de lymphœdème après un cancer du sein. Le résumé ne nomme ni la substance injectée cinq jours de suite ni la molécule inflammatoire, et liste les signes surveillés, dos voûté, yeux mi-clos, poil hérissé, perte de poids, sans dire ce qui arrive à une souris qui les présente.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Immunodéficientes par construction, les souris de ce projet accueillent des cellules souches humaines saines ou leucémiques sans les rejeter. 19 959 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est transportée, irradiée jusqu'à quatre-vingt-deux secondes, injectée par voie intraveineuse, prélevée au sang une fois par semaine et ponctionnée dans la moelle osseuse du tibia sous anesthésie gazeuse. Toutes sont tuées, y compris les trios reproducteurs une fois passés leurs six mois de reproduction, et l'effectif de près de vingt mille souris tient en une phrase du porteur affirmant qu'il correspond au minimum déterminé par une approche statistique.

Objectifs

Décrire les différences génomiques (activation de gènes) entre les cellules souches humaines et les cellules issues de patients souffrant de leucémie afin d’établir des cibles thérapeutiques pour de nouveaux traitements. Découvrir de nouvelles caractéristiques au sein des cellules souches lors de leur développement durant l’hématopoïèse.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement normal et leucémogénique des cellules lymphoïdes humaines. Ce projet constitue un prérequis pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes des leucémies.

Procédures

Injection intraveineuse, 1 min par intervention. Prélèvements sanguins, 2 min par intervention une fois par semaine. Prélèvement de moelle osseuse au niveau du tibia sous anesthésie gazeuse, 5 min par intervention, transport (10min), irradiation (82 secondes maximum).

Impact sur les animaux

Le transport et l’irradiation sur site peuvent provoquer un stress transitoire durant les heures qui suivent. L’anesthésie gazeuse peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les injections intraveineuse et intrapéritonéale peuvent provoquer un stress transitoire. Les prélèvements sanguins et de moelle osseuse peuvent provoquer une douleur.

Devenir

L’ensemble des animaux expérimentaux et trios d'accouplement seront mis à mort à la fin de la procédure. Les animaux expérimentaux sont injectés avec des cellules humaines et leur mise à mort est indispensable pour récupérer les cellules d'intérêts. Les trios d'accouplements seront mis à mort car ils auront passé les 6 mois de reproduction. Ces animaux sont à phénotype dommageable et ne peuvent être remis en liberté.

Remplacement

Les cellules humaines étudiées (saines et leucémiques) ne peuvent être maintenues en culture. L’utilisation d’un modèle murin immunodéficient permet de les maintenir fonctionnelles et de les expandre.

Réduction

Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les animaux seront élevés au sein d’une animalerie dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité important. Les souris seront hébergées à raison de 5 animaux par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnel translucide rouge destiné à diminuer le stress et stimuler l’activité des souris, par des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement et une grille de score d’évaluation sera mise en place. Lors des prélèvements au niveau du tibia, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et sous anesthésie gazeuse et des soins analgésiques seront appliqués.

Choix des espèces

Les souris utilisées ont été décrites dans la littérature scientifique comme le modèle de référence pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines, et ainsi servir de modèles précliniques pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Les animaux subiront une greffe de cellules humaines à l'âge adulte (6 à 8 semaines) car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe

1 440 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, chaque animal recevant trois injections de vaccin à ARN messager espacées de quinze jours et cinq prises de sang, toutes sous anesthésie générale. Les effets attendus reproduisent ceux de la vaccination humaine : rougeur, induration et douleur au toucher au point d'injection, fièvre, perte d'appétit et poils hérissés pendant un à deux jours. Tous sont tués pour prélever des tissus. Le projet vise à établir des corrélations entre modèles cellulaires et réponse du rongeur, le porteur annonçant que ces modèles pourraient à terme remplacer ou réduire fortement l'utilisation d'animaux non-humains, ce qui suppose d'en utiliser 1 590 pour le démontrer.

Objectifs

La vaccination basée sur l’utilisation d’ARN messager complexé dans des particules lipidiques s’est imposée comme une technique efficace lors de la pandémie de Covid-19. Les vaccins ARNm sont basés sur l’utilisation d’un ARN messager, molécule naturellement présente dans les cellules qui est traduit en protéine par la machinerie cellulaire. Néanmoins, la vaccination par ARNm entraîne chez l’homme des effets secondaires indésirables liés au déclenchement d’une réponse immunitaire excessive. Cette réaction immunitaire se traduit par l’apparition de douleur et/ou rougeur et gonflement localisés au site d’injection mais également de fièvre. Elles sont la conséquence de l’activation du système immunitaire. Notre projet a pour but de trouver de nouveaux vaccins ARNm qui ne déclencheraient pas toutes ces réactions secondaires tout en permettant d’obtenir une réponse immunitaire optimale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but premier d’établir des corrélations entre les réponses obtenues sur nos modèles cellulaires et la réponse immunitaire chez le rongeur après vaccination par ARNm. Ceci permettra de ainsi mieux comprendre les voies de l’immunité innée nécessaires à activer (ou bloquer) pour obtenir la réponse immunitaire optimale tout en limitant les effets secondaires. Il est essentiel de mieux comprendre la composante adjuvante de la vaccination ARNm, afin de pouvoir la moduler pour obtenir la réponse immunitaire la plus adéquate. Si des corrélations claires sont mises en évidence sur ce modèle, alors nos modèles cellulaires pourront être utilisés par la communauté scientifique pour optimiser les vaccins ARNm en cours de développement. La validation de nos modèles cellulaires pour prédire notamment les effets secondaires des candidats vaccins pourra donc conduire à améliorer la sécurité des vaccins pour l’homme, mais aussi réduire le nombre d’animaux utilisé pour mettre au point ces candidats vaccins.

Procédures

Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal et sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Concrètement, le modèle utilisé repose sur l’injection chez le rongeur de vaccins ARNm. Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.

Remplacement

Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et les effets secondaires de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 48 souris, soit au maximum 8 groupes de 6 souris. Ceci dans le but de ne pas engendrer de différences artéfactuelles liées à la difficulté de réaliser une expérience avec un trop grand nombre d’animaux au total. Le nombre de 6 animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminera un ou 2 vaccins ARNm optimisés qui seront ensuite testé chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 15 rats, à savoir 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de pouvoir gérer techniquement l’expérimentation tout en gardant suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Néanmoins, une réaction locale au niveau du site d’injection ou généralisé à tout le corps (fièvre) peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Pour détecter l’apparition éventuelle de cette réactogenicité, Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Nous avons établi une grille de « scoring » permettant de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. La grille de « scoring » prend en compte 1) l’état général comprenant l’apparence, la posture, la mobilité, le comportement de l’animal dans la cage, 2) l’inspection de l’aspect au niveau des sites d’injection et 3) le suivi de poids de l’animal. Grace à cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude (cible vaccinale Ovalbumine) est le modèle immunologique de référence chez la souris, tous les réactifs et les outils d’étude sont donc disponibles. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.