Rongeurs
Etude de l’activation des cellules myéloïdes dans les maladies d’inflammation vasculaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont la douleur ne cède pas au traitement analgésique sont tuées, l'atteinte d'un point limite entraînant l'arrêt du protocole. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Les modèles de vascularite rénale et pulmonaire qui leur sont imposés peuvent provoquer une insuffisance rénale, une gêne respiratoire, un affaiblissement général et une perte de poids, et chaque souris subit selon le protocole des injections dans le péritoine à l'état vigile, trois injections derrière l'œil sous anesthésie, une instillation dans le nez et jusqu'à huit heures en cage métabolique. Les retombées annoncées tiennent à des molécules ciblant deux récepteurs, déjà en développement pour d'autres maladies, dont le porteur écrit qu'elles pourraient ouvrir des perspectives dans les vascularites.
Objectifs
Les vascularites, maladies inflammatoires des vaisseaux sanguins, représentent un groupe hétérogène de maladies systémiques avec des mécanismes physiopathologiques distincts et des stratégies thérapeutiques distinctes. Les vascularites sont classées selon la taille des vaisseaux affectés et peuvent conduire à l’altération d’autres organes tels que les poumons et les reins. Ces pathologies se caractérisent par la présence d’un infiltrat inflammatoire, composé particulièrement de cellules immunitaires, qui viennent envahir la paroi aortique, entraînant un remodelage de cette dernière pouvant aller jusqu’à l‘occlusion du vaisseau. Une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans la régulation des cellules inflammatoires et aortiques est indispensable. Les objectifs du projet est d’étudier le rôle de deux récepteurs présents à la surface des cellules immunitaires, les monocytes/macrophages, et leur modulation au cours des maladies inflammatoires. Les modèles murins de maladies inflammatoires étudiés seront des modèles de vascularites rénales, pulmonaires et des gros vaisseaux, et un modèle de réponse inflammatoire systémique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l’implication potentielle de deux récepteurs membranaires présents à la surface des monocytes/macrophages dans la physiopathologie de maladies inflammatoires, notamment les vascularites affectant les vaisseaux de gros et petit calibre, entraînant l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Des molécules venant cibler ces récepteurs sont en cours de développement dans d’autres pathologies, et les travaux réalisés pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans les vascularites.
Procédures
Prélèvement à la queue (1fois 30sec) sur souris vigile, une injection intra-péritonéale (10 secondes, nombre d'injections variant selon le protocole), une injection rétro-orbotaire sous anesthésie (15 secondes, 3fois), une instillation intranasale sous anesthésie (1fois), une injection intraveineuse (45sec, nombre d'injections variable selon le protocole), un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie (45 sec). Cages métaboliques : inférieur à 8h avec accès à l'eau.
Impact sur les animaux
Les différents modèles peuvent induire un affaiblissement général de l’animal, asthénie, perte de poids, insuffisance rénale (modèle de glomérulonéphrite et vascularite rénal), gène pulmonaire (modèle de vascularite pulmonaire). L’ensemble des modèles peut induire des douleurs de courtes durées et peu intenses liées aux injections. Enfin, un stress chez les animaux peut survenir subissant des contentions et manipulations répétées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever le sang et les organes pour y réaliser des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les vascularites et maladies systémiques impliquent des réponses immunitaires complexes au sein de divers organes. Actuellement, les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire finement l’environnement physiopathologique dans lequel la réponse immunitaire est mise en jeu. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de la physiopathologie de ces maladies observées chez l’Homme. Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitment, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre d’animaux restreint au maximum, de sorte à obtenir des résultats permettant d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour y ttirer des conclusions biologiquement pertinentes. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Les méthodes d'imagerie étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours temps et les paramètres étudiés seront mesurés à chaque passage pour chaque animal. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.
Raffinement
Les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animal vigile tandis que les injections rétro-orbitaires et pulmonaires seront réalisées sur animal anesthésié et posé sur un tapis chauffant pour le confort de l’animal. Pour les injections répétées nous alternerons les points d’injections afin de maintenir le confort de l’animal. Une évaluation générale de l’animal, basée sur son apparence physique et comportemental, sera faite grâce à l'établissement de points limites. Le poids corporel sera relevé tous les 3 jours pour les traitements inférieurs à 10 jours et 1 fois par semaine pour ceux supérieurs à 10 jours. Les animaux seront élevés dans des cages enrichies et regroupés en groupe sociaux pour éviter tout isolement. Le personnel qualifié assure un suivi quotidien et tout comportement anormal sera reporté au responsable du projet. L’atteinte d’un point limite établi entrainera une mise à mort anticipée de l’animal et l'arrêt du protocole. Nous aurons recours à de l’imagerie non invasive afin de monitorer les lésions inflammatoires dans le cas d’apparition de vascularites spontanées, et de pouvoir suivre l’évolution de ces modèles de la manière la moins invasive possible. Pour toutes les analyses d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste ou fluorescent. Les animaux seront surveillés tout au long de l’expérience afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les manipulations seront arrêtées et les animaux mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle animal nous permet de réaliser des expériences de physiopathologie d’inflammation vasculaire et systémique (induit ou spontané) de mammifère en prenant en compte l’ensemble des paramètres physiologiques existant in vivo. Les analyses in vitro ou in sillico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l’inflammation vasculaire et systémique car trop de paramètres physiologiques entrent en jeu. Les pathologies induites décrites précédemment font l’objet de protocoles publiés.
Etude de la stéatose hépatique non alcoolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des dommages hépatiques sévères provoqués par une molécule, un régime riche en graisses maintenu des semaines, jusqu'à huit injections, un gavage et trois prises de sang : 2 340 souris subissent ces procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur décrit chacune de ces atteintes en une ligne et qualifie de légères la douleur des injections comme la contrainte du gavage, la seule mention de sévérité portant sur les dommages au foie qu'il induit délibérément. Il ajoute que les souris deviendront un peu moins actives en prenant du poids, et qu'une mise à jeun de six heures leur imposera une sensation de faim. Toutes sont tuées en fin de procédure pour récupérer des prélèvements qu'il juge "indispensables" à la compréhension de la stéatose hépatique.
Objectifs
La stéatose hépatique non-alcoolique est une maladie chronique caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation. Elle est plus fréquente chez les personnes atteintes d’obésité et/ou du diabète de type 2. Dans notre projet, nous visons à utiliser des modèles de souris pour comprendre le développement et les facteurs contribuant à cette maladie et proposer des solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant l’inflammation du foie et pourrait permettre de définir de nouvelles approches thérapeutiques dans la stéatose hépatique non-alcoolique et ses complications.
Procédures
Injections sous anesthésie locale (maximum 8, durée 1 minute). Gavage (n=1, durée 1 minute). Prélèvements de sang (n=3, durée 2 minutes).
Impact sur les animaux
Régime riche en graisse (HFD) long-terme : les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines et devenir un peu moins actives. - Injection : douleur légère. - Mise à jeun de 6 heures: Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une contrainte due à la sensation de faim. - Gavage : contrainte légère due à la contention et à la sonde de gavage. -Induction de dommages sévères au foie par une molécule.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans le foie dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans sa globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes régimes.
Réduction
Le nombre de souris est réduit a son minimum. De nombreux tissus et cellules seront collectés apres la mise a mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses données. De plus nous avons determiné un nombre de souris par groupe, suivant les procédures, en fonction de données de la littérature ou grâce a l'utilisation d'un outil statistique (calcul de puissance) pour le calcul des effectifs. En détail, nous avons déterminé le nombre de souris par régime et par génotype grâce à l'utilisation d'un outil statistique pour le calcul des effectifs avec un test de puissance . Concernant les résultats, une analyse statistique sera réalisée en tenant compte de la variabilité intra-groupe ainsi que test d'analyse de variance sur mesures répétées par les valeurs d'enzymes hépatiques et les poids des souris.
Raffinement
Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour évaluation clinique adaptée à chaque procédure, et mise en place d'actions correctives pertinentes. Des traitements antalgiques seront mis en place pour soulager les animaux en procédure. Des point limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de l’obésité alimentaire et l’insulinorésistance. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des travaux publiés précédents. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront entre 8 et 10 semaines au début de la procédure, il s’agit de souris adultes car la pathologie humaine se développe chez le jeune adulte et chez l'adulte.
Étude de l’homéostasie et fonctionnement de cellules immunitaire et de leurs rôles dans la réponse immunitaire contre des tumeurs solides
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 428 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur par voie intraveineuse, sous la peau ou directement dans la paroi intestinale lors d'une chirurgie de quinze minutes, d'autres sont infectées par une entérobactérie, et certaines sont maintenues endormies deux à quatre heures pour de l'imagerie après une opération de trente minutes. Le porteur estime que les souris rencontrent peu d'effets indésirables et que la localisation de la tumeur ne semble affecter ni leur mobilité ni leur comportement, tout en fixant comme points limites le poil ébouriffé, la prostration et la diarrhée. Aucune ne peut être réutilisée, replacée ou adoptée, ayant reçu des cellules tumorales ou subi une chirurgie viscérale qu'il décrit comme non opérable.
Objectifs
L’objectif du projet consiste à étudier le développement des cellules lymphoïdes (ILCs), ainsi que leurs fonctions dans l’homéostasie tissulaire et dans l’initiation et le maintien de la réponse immune contre des tumeurs et l’infection bactérienne. D’une part, nous analyserons les mécanismes de développement permettant la génération des différents types d’ILCs. Cette étude consistera à déterminer les signaux activateurs et inhibiteurs permettant la génération, le maintien et la régulation fonctionnelle de ces cellules. D’autre part, nous étudierons leurs rôles et leurs interactions au sein du système immunitaire lors de la réponse anti-tumorale et antibactérienne.
Bénéfices attendus
Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules lymphoïdes innées dans un modèle tumoral et infectieux. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire dans des conditions normales et pathologiques. Ainsi, la compréhension du mécanisme qui régule les premières phases de l'immunité innée contre la progression tumorale et infectieuse pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir l’infection bactérienne ou améliorer l'espérance de vie après la tumorigenèse.
Procédures
Certains animaux recevront une greffe tumorale qui consistera à une intervention chirurgicale de 15 minutes. Les injections instantanées seront réalisées i.v, i.p, et/ou intra lamina propria intestinale. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer l’imagerie et seront maintenus endormis pendant 2 à 4h.
Impact sur les animaux
Notre projet propose, d’une part d’étudier les cellules lymphoïdes innées (ILCs) infiltrant une tumeur et nécessite la greffe intraveineuse, sous-cutanée ou intestinale de tumeur aux souris et d’autre part d’étudier l’infiltration des ILCs dans le tissu infecté par une entérobactérie. Notre connaissance suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale ou l’infection bactérienne. La localisation de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, leur alimentation, leur pelage et leur comportement et l’infection aura des effets transitoires sur le poids de la souris. Nos précédentes expériences montrent que l’injection de molécules (anticorps) que nous proposons d’étudier dans ce projet n’aura pas d’effets indésirables dans la période expérimentale. Injection des tumeurs par voie i.v. : effets légers Injection des tumeurs par vous sous-cutanée : effets modères Injection des tumeurs intestinale : effets modères Infection des souris avec des entérobactéries : effets modères
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales ou une chirurgie viscérale non opérable.
Remplacement
Nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action des ILCs car les modèles in vitro actuels ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. Néanmoins, nous ne réaliserons que les tests in vivo les plus nécessaires (emplacement spatiale des ILCs dans les tumeurs/métastases et la croissance des tumeurs/métastases. Par contre, afin de caractériser la fonctionnalité de l'ILC, nous remplacerons les expériences in vivo par des tests in vitro afin de réduire le nombre des animaux dans les expériences.
Réduction
D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Le nombre de souris nécessaire à l’expérimentation a été déterminée en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de tumeur(s) ou infectés par des bactéri es. L'utilisation cytométrie spectrale nous permet de réduire le nombre d'animaux utilisé car cette technologie permet d'acquérir plus de paramètres que la cytométrie classique à partir d’un un même animal. Dans la mesure du possible, les expériences de cytométrie, séquençage, et d’immunohistochimie seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation.
Raffinement
Modèles tumoraux : Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures. Nous utilisons ces modèles de tumeurs depuis plusieurs années et nous connaissons leur tumorigenèse dans des souris contrôles et immunodéficientes (absence des cellules lymphoïde adaptatives et innées). D’après notre expérience et la littérature, nous estimons que le développement tumoral dans les souris mutantes comprises dans ce projet se situera entre ces deux extrêmes. Cependant, nous prévoyons les mesures suivantes et dans l’ordre dès apparition d’un signe clinique : l’ajout du gel hydrique dans la cage pour faciliter la réhydratation et prise de nourriture, réhydratation sous-cutanée, amélioration de la température (plaque chauffante ou chaufferette) de la cage et si pas amélioration mise à mort. Dans le cadre de la tumorigenèse pulmonaire et intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après la mise à mort. Le nombre de cellules tumorales injectées est établi depuis plusieurs années afin de contrôler la pousse tumorale et de pouvoir comparer des résultats de diffèrent projets. L’injection se faisant intraveineuse, sous-cutanée ou intra tissulaire (face intestinale externe), l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Modèle infectieux : Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (perte de poids, poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures. Nous utilisons le modèle bactérien depuis plusieurs années et nous connaissons son développement dans des souris contrôles et immunodéficientes (absence des cellules lymphoïde adaptatives et innées). D’après notre expérience et la littérature, les souris utilisées dans la procédure auront une infection proche de celle observée dans les souris controles. Cependant, En cas de souffrance observé, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le développement lymphocytaire et les réactions immunitaires sont des processus complexes. De façon générale, l’immunité nécessite plusieurs types de lymphocytes participants chacun dans une ou plusieurs interaction(s) directe(s) ou indirecte(s) avec un ordre spatio-temporel. De ce fait, les systèmes de culture in vitro actuels ne permettent pas de modéliser cet environnement complexe. De plus, il n’existe, pour le moment, aucune lignée cellulaire murine ou humaine de cellules lymphoïdes étudiées (NK/ILC1, ILC2, ILC3). Par conséquent, l’étude de ces processus nécessite pour l’instant l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, la compréhension du mécanisme de développement cellulaire faite in vivo, nous permettra probablement d’établir de nouveaux modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires afin de réduire la contribution animale. Par conséquent, le modèle murin est essentiel dans notre domaine de recherche. Le nombre de souris est calculé en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’animaux tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement significatifs dans les différentes conditions expérimentales. Cette évaluation est déterminée grâce à nos données préliminaires et/ou antérieurs et à la bibliographie scientifique. Elle tient également compte de la faisabilité de nos expériences. En effet l’analyse post-mortem nécessite un temps de préparation conséquent, ce qui nous contraint à analyser de petits groupes d’animaux et d’augmenter la répétition des expériences pour une analyse statistique satisfaisante. Cependant, nos résultats précédents ont permis d’estimer les variabilités biologiques et expérimentales et ainsi minimiser la répétition expérimentale.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisés pour l’étude de la déficience en OTC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Tuées quand leur génotype ne présente pas d'intérêt, gardées vivantes dans le cas contraire : sur les 3 113 souris de ce projet d'élevage, 2 823 sont conservées pour être utilisées dans d'autres projets. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et consistent, pour une partie des animaux, en un prélèvement de trente secondes à l'oreille pour lire leur génotype. Le projet sert à purifier le fond génétique d'une lignée modifiée pour ne plus produire un acide aminé, lignée dont les souris perdent du poids et voient leur fonction cardiaque se dégrader sous régime pauvre en protéines. Le porteur affirme qu'un modèle in vivo est "indispensable" pour cette physiologie intégrée et que la souris est la seule espèce permettant de choisir le lieu et le moment exacts de la mutation.
Objectifs
Depuis plusieurs années, l’intérêt s’est porté sur les propriétés régulatrices des acides aminés. En effet, différents travaux ont montré qu’un acide aminé particulier avait des effets sur plusieurs fonctions de l’organisme, comme sur la fonction musculaire, la fonction cardiaque, le système immunitaire, le métabolisme glucidique,... Cependant, dans toutes les études réalisées jusqu’alors sur cet acide aminé, celui-ci était apporté par voie exogène. Les effets de cet acide aminé endogène, c’est-à-dire produit par l’organisme, et plus particulièrement dans un organe précis, n’ont quant-à-eux jamais été étudiés. Pour palier cela, nous avons développé une lignée de souris qui n’exprimait pas le gène de l’enzyme responsable de la production de cet acide aminé, et qui ne produisait donc pas cet acide aminé au niveau de l’organe voulu. A l’aide de ce modèle, nous avons mis en évidence que l’absence de cet acide aminé au niveau plasmatique (via l’absence de production), lors d’un régime standard, n’avait pas d’effet sur les animaux. En revanche, sous régime faible en protéines, l’absence de cet acide aminé au niveau plasmatique entrainait une importante perte de poids chez les animaux (masse maigre et masse grasse) ainsi qu’une forte altération de leur fonction cardiaque. Cependant, le rôle majeur de cet acide aminé en cas de régime hypoprotéique, et non sous régime standard, sur le métabolisme protéino-énergétique et sur le système cardiovasculaire n’est pas encore totalement compris. Lorsqu’on possède une lignée de souris transgéniques, il est nécessaire, pour éviter une dérive génétique, de purifier le fond génétique de ces souris en les croisant avec des souris sauvages ayant un fond génétique « pur ». Le but de ce projet-ci est donc de purifier puis de conserver notre lignée de souris génétiquement modifiées. Pour cela, nous devons effectuer un génotypage invasif afin de définir les animaux qui comportent la modification génétique et ceux qui ne la possèdent pas.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de purifier le fond génétique de notre lignée de souris transgénique, puis de conserver nos 2 lignées de souris de façon à poursuivre les investigations pour une meilleure compréhension du rôle de notre acide aminé d’intérêt dans les différentes fonctions de l’organisme.
Procédures
Une partie des animaux sera prélevée au niveau de l’oreille pour génotypage (durée : 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances sur les animaux sont les suivantes : stress lié au prélèvement d’un morceau de l’oreille pour le génotypage.
Devenir
Certains animaux sans génotype d’intérêt sont mis à mort et les autres sont conservés pour une utilisation continue dans les projets (2823 souris).
Remplacement
Le modèle animal que nous souhaitons conserver est utilisé dans des projets qui étudient les conséquences d’une diminution de la concentration d’un acide aminé au niveau plasmatique (via la suppression de l’enzyme permettant sa production) sur différentes fonctions de l’organisme, et notamment le métabolisme protéino-énergétique. Le recours à des modèles alternatifs comme des cellules en culture n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas possible parce que nous nous situons dans le domaine de la physiologie intégrée. L’objectif des projets qui utilisent ce modèle de souris transgéniques est de mieux comprendre comment cet acide aminé module différentes fonctions de l’organisme au niveau corps entier. Dans ce but, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce qui permet de créer des animaux transgéniques pour lesquels nous pouvons choisir le lieu exact de la mutation génétique, ainsi que le moment précis où nous voulons que celle-ci apparaisse.
Réduction
Comme un des gènes que nous ajoutons au génome des souris transgéniques doit absolument rester à l’état hétérozygote, nous devons obligatoirement conserver les 2 lignées distinctes. Cependant, tous les calculs ont été effectués de façon à ajuster au maximum les accouplements et les animaux à conserver pour la purification du fond génétique de la lignée dans laquelle notre gène d’intérêt est marqué et la conservation de ces 2 lignées.
Raffinement
Les animaux seront en collectivité, en cages ouvertes, permettant aux individus de sentir la présence de leurs congénères, avec un milieu enrichi par l'ajout d'objets dans les cages (tunnels, abris en carton...). De plus, nous utiliserons des points limites gradés précis et adaptés permettant de suivre objectivement l’état général des animaux, et d’agir rapidement en cas de problème. Enfin, les expérimentateurs/soigneurs ont été formés aux différentes techniques utilisées dans ce protocole, et ont développé les compétences permettant de respecter le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Le recours à l’utilisation de lignées cellulaires n’est, dans l’état actuel des connaissances, pas réalisable parce que nous évoluons dans le domaine de la physiologie intégrée et nous nous inscrivons dans une approche fonctionnelle du métabolisme. L’objectif des projets utilisant ces lignées de souris est de mieux comprendre le rôle d’un acide aminé endogène dans la régulation de l’équilibre protéino-énergétique au niveau corps entier. Dans ce but, un modèle in vivo est indispensable. Le choix de la souris se justifie car c’est la seule espèce qui permet de créer des animaux transgéniques pour lesquels nous pouvons choisir le lieu exact de la mutation génétique, ainsi que le moment précis où nous voulons que celle-ci apparaisse. Les animaux seront mis en accouplement à l’âge de leur maturité sexuelle, soit 8 semaines.
Évaluation de l’effet thérapeutique du transfert adoptif de lymphocytes T humains optimisés dans le traitement de tumeurs solides humaines dans un modèle de souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
400 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules cancéreuses humaines dans le flanc puis, pendant trois semaines, une injection intraveineuse hebdomadaire de lymphocytes T modifiés. Une tumeur pousse dans leur flanc. Toutes sont tuées par dislocation cervicale après anesthésie, dès qu'un signe clinique sévère ou trois signes notables apparaissent, pour des analyses effectuées sur des prélèvements post mortem. Le porteur cherche des preuves de concept susceptibles de justifier ces immunothérapies chez l'humain, alors que les essais cliniques déjà menés avec ces cellules ont montré une efficacité anticancéreuse qu'il qualifie lui-même de trop limitée.
Objectifs
L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer le cancer. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie par transfert adoptif de cellules immunitaires repose sur l’administration à un patient de ses propres cellules immunitaires reconnaissant et éliminant spécifiquement les cellules cancéreuses, appelées « lymphocytes T cytotoxiques ». Des essais cliniques d’injections de ces cellules immunitaires ont déjà été réalisés chez l’humain et, s’ils ont montré une bonne tolérance, leur efficacité anti-cancéreuse est encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement du cancer de la peau et du cancer colo-rectal, d’immunothérapie par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, des souris immunodéficientes (n’ayant plus de système immunitaire) recevront dans un premier temps une greffe de cellules cancéreuses humaines puis dans un second temps des injections de ces lymphocytes T humains optimisés. Cette optimisation passe par des modifications génétiques qui ont pour but de potentialiser les fonctions anti-cancéreuses de ces lymphocytes T.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de ces modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés, dans le traitement de cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certaines molécules exprimées par ces lymphocytes T.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection en sous-cutanée de tampon salin (avec ou sans cellules cancéreuses) dans le flanc au premier jour de l’étude dans chaque procédure. La procédure d’injection des cellules cancéreuses dans le flanc sera réalisée sous anesthésie. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir du 7ème jour de l’étude) en intraveineuse d’un tampon salin (avec ou sans cellules immunitaires optimisées) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrinsèque à l’injection (piqûre) dans le flanc ou en intraveineuse, de cellules dans un volume donné de tampon salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.
Remplacement
Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'humain du bénéfice thérapeutique de l’administration de cellules immunitaires, dans le cadre de traitements anti-cancéreux, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant ces immunothérapies anti-cancéreuses, il est établi que les cellules cancéreuses se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la mort cellulaire et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration des cellules immunitaires injectées au niveau des cellules cancéreuses), et de définir les modalités optimales d’administration de ces cellules immunitaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.
Réduction
Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris (procédure 1) et de 10 souris (procédures 2, 3 et 4). D'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé ici est réduit au minimum tout en permettant d’obtenir des différences statistiquement significatives. En effet, plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche, et nos propres études antérieures avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot pour le développement de greffes de cellules cancéreuses humaines, et 10 animaux par lot pour l’évaluation du bénéfice thérapeutique de l’administration de différents types de lymphocytes T.
Raffinement
Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec un enrichissement par frisottis et/ou dôme et un accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne en présence de deux signes cliniques notables. De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort après une anesthésie, par dislocation cervicale. Les signes cliniques sont basés sur le comportement/mouvement, l’aspect physique extérieur, la manipulation, la consommation de nourriture, l’excrétion, l’évolution du poids, l’évolution de la tumeur, l’aspect de la tumeur).
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie pour le traitement des cancers, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de greffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients pour éviter le rejet de greffe, tels que les souris NSG. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation thérapeutique de cellules immunitaires d'origine humaine. Les souris seront utilisées à partir de 9 semaines (période où le poids se stabilise), pour des raisons de maturité du développement squelettique, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules cancéreuses et de lymphocytes T, mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques.
Etude des capacités de cellules humaines à former des vaisseaux sanguins dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris de ce projet sont immunodéprimées, ce qui les expose à un gonflement, du pus ou un hématome là où la matrice qu'elles reçoivent est implantée. 624 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit sous la peau du dos deux implants contenant des cellules prélevées sur des valves aortiques humaines, retirés quatorze jours plus tard sous anesthésie, pour repérer quelles cellules de la valve forment des vaisseaux sanguins. Toutes sont tuées au retrait, le porteur indiquant que la recherche des implants exige deux grandes cicatrices dorsales et que leur extraction abîme la chair de l'animal, ce qu'il qualifie lui-même de nuisance très importante.
Objectifs
La sclérose valvulaire aortique est le rétrécissement de l'ouverture de la valve aortique due à une atteinte structurelle de la valve cardiaque. C’est un enjeu majeur de santé publique qui touche 2 à 6 % des personnes âgées de plus de 65 ans. Sa prévalence est susceptible de doubler au cours des 50 prochaines années en raison du vieillissement croissant de la population. La sclérose valvulaire aortique est maintenant principalement considérée comme un processus incluant une formation de vaisseaux sanguins pathologiques à l’intérieur de la valve aortique. Ainsi notre projet consiste à comprendre quelles cellules de la valve permettent de former des vaisseaux sanguins, notamment en fonction de leur localisation dans la valve aortique. Le but du projet est d’étudier la capacité des cellules, issues de différentes parties de la valve aortique humaine, à former des vaisseaux sanguins dans un modèle murin. Nous comparerons l’aptitude à former des vaisseaux sanguins les cellules isolées de différentes parties de la valve aortique à des cellules endothéliales de sang de cordon ou de sang adulte connues pour former des vaisseaux sanguins. L’objectif est de mettre en évidence le type cellulaire capable de former de manière la plus importante des vaisseaux sanguins et de rechercher des voies de blocage afin d’envisager des nouveaux traitements de la sclérose valvulaire aortique.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre les caractéristiques de fonctionnement des cellules de la valve devrait conduire à une meilleure compréhension des dégénérescences valvulaires et éventuellement proposer des stratégies de modulation des fonctions de ces cellules dans un objectif thérapeutique afin à terme de traiter et/ou de prévenir la sclérose valvulaire aortique.
Procédures
Les souris seront anésthésiées 5 minutes maximum pour les deux injections en sous-cutanée des deux implants 1 fois, chaque injection dure au maximum 20 secondes. Les souris seront anésthésiées 5 minutes maximum pour le retrait des implants au bout de 14 jours.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent avoir un inconfort lié à la préhension des animaux et une potentielle douleur au point d’injection de la matrice extracellulaire. Les souris immunodéprimées peuvent avoir au niveau de la zone d’injection de la matrice extracellulaire un gonflement, du pus ou un hématome.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après la récupération des implants. Malgré le repérage des implants par palpation la recherche des implants nécessite deux grandes cicatrices au niveau dorsal. De plus le retrait des implants abime la chair de l’animal. Ces deux points constituent une nuisance très importante pour l’animal tant au niveau de la cicatrice que de la chair.
Remplacement
Malgré l’existence de nombreux modèles in vitro évaluant les différents processus impliqués dans la capacité des cellules à former des vaisseaux, l’utilisation de modèles in vivo reste indispensable en raison des nombreuses interactions entre les cellules et leurs environnements qui permettent la génération de vaisseaux fonctionnels
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux : -Nous effectuerons en amont des études in vitro afin d’étudier la capacité des cellules à former des tubes. Deux implants seront injectés par animal pour limiter le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux devra être de 5 par condition (soit 10 implants) afin d’avoir des résultats significatifs. Ce nombre a été calculé selon l'expérience acquise dans notre équipe en tenant compte de la variabilité observée lors d'expériences similaires et les données de la littérature. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Afin de réduire au maximum la douleur et le stress, les animaux disposent d’un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson et d’un environnement enrichi (coton). De plus, l’injection sous-cutanée et le retrait des implants seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux seront surveillés de façon hebdomadaire avec mise en place de points limites qui permettront une prise en charge précoce en cas de douleur ou de souffrance. Si les animaux présentent une douleur ou une souffrance, un traitement analgésique sera administré et la fréquence de surveillance sera augmentée (au minimum 2 fois par semaine).
Choix des espèces
Le système vasculaire murin est proche du système vasculaire humain (vertébré) et la souris est un des modèles les plus utilisés dans la littérature pour l’étude de l’angiogenèse chez un animal adulte (modèle d’angiogenèse tumorale, modèle d’ischémie du membre inférieur). Souris adultes de 6-8 semaines pour que les animaux aient une taille suffisante pour permettre l'injection de deux implants sur le dos.
Evaluation des mécanismes de devenir des oligodendrocytes dans un modèle d’atrophie multisystématisée
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une heure trente de chirurgie intracérébrale pour injecter un virus qui fera exprimer une protéine toxique dans les cellules de soutien du cerveau, puis quatre à cinq prises de sang à la queue : 320 rats Sprague-Dawley subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leur cerveau. L'induction de la maladie ralentit leur activité locomotrice et dégrade leur motricité fine. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de l'atrophie multisystématisée, maladie neurodégénérative sans traitement, et d'identifier des marqueurs sanguins qui seront ensuite vérifiés chez des patients. Le porteur annonce deux tests comportementaux répétés quatre à six fois sur des rats vigiles, l'un de trois minutes sur trois jours, l'autre d'une heure, sans indiquer à aucun moment lesquels.
Objectifs
L'atrophie multisystématisée est une maladie neurodégénérative fatale avec un handicap moteur sévère. Il n'existe actuellement aucun traitement disponible pour atténuer la gravité des symptômes ou la progression clinique de cette maladie orpheline. Elle se caractérise au niveau cellulaire par l'accumulation et l'agrégation d’une protéine dans les oligodendrocytes (cellule de soutien essentielle à la fonction et à la survie des cellules nerveuses) entrainant une neurodégénérescence. Dans ce projet, des rats recevront une injection de virus permettant l’expression de cette protéine spécifiquement dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires responsable du dysfonctionnement des oligodendrocytes et aboutissent à leur perte de fonction dans le cerveau en utilisant des approches comportementales (évaluation motrice), histologiques et cellulaires. De plus les prélèvements de sang réalisés chez les animaux à différentes étapes du développement de la maladie permettront d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour lesquelles des stratégies pourraient être développées afin de prévenir ou de corriger les altérations qui touchent les oligodendrocytes, dans le but de restaurer leur fonctionnement normal. Les marqueurs d'oligodendrocytes qui pourront être identifiés dans le modèles précliniques seront ensuite validés chez des patients atteint d’atrophie multisystématisée.
Bénéfices attendus
Le projet actuel propose d’identifier les mécanismes moléculaires responsables du dysfonctionnement des oligodendrocytes et la mise en évidence de biomarqueurs au niveau sanguin. Ces résultats de recherche amélioreraient considérablement la compréhension de la physiopathologie de l’atrophie multisystématisée d’une part et auraient des implications considérables pour les soins aux patients et le développement thérapeutique et de biomarqueur dans l’atrophie multisystématisée d’autre part.
Procédures
- Pour 320 animaux : test comportemental 1 d’une durée de 3 minutes sur 3 jours et test comportemental 2 d’une durée d’1h sur une journée. Ces tests comportementaux sont réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (4 à 6 fois maximum en fonction des lots de rats) sur animaux vigiles. - Pour 320 animaux : prélèvement sanguin au niveau de la queue sur animaux anesthésiés d’une durée de 3 minutes (4 à 5 fois maximum en fonction des lots de rats) - Pour 320 animaux : chirurgie intracérébrale réalisée sur animaux anesthésiés et sous couverture antalgique périphérique et locale, d'une durée d'1 heure 30. - Pour 160 animaux : perfusion intracardiaque réalisées sur animaux anesthésiés par une double dose d'un mélange d'anesthésique et antalgique permettant également une couverture antalgique périphérique.
Impact sur les animaux
- La chirurgie stéréotaxique peut induire une légère perte de poids et un stress notamment au réveil, la douleur occasionnée est soulagée par des antalgiques pendant et après la chirurgie. - L’induction de l’AMS va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. - Prélèvements de sang peuvent ponctuellement induire un hématome au niveau de la veine caudale. - Petit inconfort de la contention ou léger stress lors de la pesée hebdomadaire.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récuperer les ceveaux et de réaliser des analyses histologiques, cytologique et transcriptionnel.
Remplacement
Malgré des recherches sur des modèles cellulaires dans l’atrophie multisystématisée, dans le cadre de ce projet basé sur la compréhension du développement de la maladie et de ces effets comportementaux ainsi que l’analyse de biomarqueurs sanguins le modèle animal entier ne peut pas être substitué car nécessite l’intégrité des réseaux neuronaux et ne peut donc pas être réalisée in vitro, ni in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance. Ces critères impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 20 animaux par condition expérimentale par suivi longitudinal et par sexe soit 320 rats afin d'obtenir des résultats statistiques interprétables.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et les tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h post- opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage autant que possible (isolement de maximum 7 jours après la chirurgie restant une démarche de soin exceptionnelle), avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement (bâtons à ronger et baguette de papier compressé) est disposé dans les cages d'hébergement. Un tunnel sera également rajouté si les animaux nécessitent un isolement. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude de l’atrophie multisystématisée. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison des données déjà disponibles dans la modélisation de la maladie et de la similitude avec la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (8 semaines au début des tests comportementaux réalisés avant la chirurgie) de façon à se rapprocher du stade de développement de l’atrophie multisystématisée.
Pharmacothérapies pour améliorer la structure-fonction artérielle dans des conditions physiopathologiques liées à des altérations des fibres élastiques (1/2).
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Placées quatorze jours dans une atmosphère appauvrie en oxygène, ou traitées trois mois par un composé mêlé à l'eau de boisson, ou injectées trois fois dans la veine de la queue, 2 475 souris subissent ensuite des mesures de pression artérielle à l'état vigile, trois fois par jour pendant trois jours, puis une échographie cardiaque de trente minutes sous anesthésie. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à sévère. Deux tiers des souris portent une délétion du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1 qui altère leurs vaisseaux dès la naissance et peut provoquer des sténoses ou des anévrismes, et celles maintenues jusqu'à vingt-quatre mois pour former les groupes âgés peuvent se retrouver seules quand leurs congénères meurent de vieillesse. Aucune ne sort vivante de ce projet : toutes finissent par un prélèvement d'organes vitaux mené sous anesthésie sans réveil, destiné à l'artériographie, à l'histologie et à la culture de cellules musculaires lisses.
Objectifs
L'élasticité des grosses artères est essentielle pour permettre une perfusion correcte des tissus. Les fibres élastiques, responsables de l'élasticité artérielle, sont composées à 90% d'élastine (Eln) et à 10% de microfibrilles riches en fibrilline-1 (Fbn1), et ne sont produites que jusqu'à la fin de l'adolescence, ne faisant ensuite que fonctionner tout en se dégradant (avec perte d'élasticité artérielle) jusqu'à la fin de la vie. Cette dégradation de l'élasticité artérielle a des conséquences délétères majeures sur la fonction cardiaque, la pression et la circulation sanguines, et la perfusion des organes. C'est ce qui advient au cours du vieillissement normal, mais aussi dans les maladies génétiques liées à l'organisation anormale des fibres élastiques : syndrome de Williams-Beuren (rétrécissements artérielles dûs à la déficience en Eln) et syndrome de Marfan (anévrismes dûs à la déficience en Fbn1). Des études récentes ont également montré que l'altération des fibres élastiques et les dysfonctions artérielles correspondantes (dont la rigidification artérielle) sont associées à l'hypoxie intermittente générée par le syndrome d'apnée obstructive du sommeil, qui concerne 10-20% de la population générale et jusqu'à 30-50% des personnes âgées. Il a préalablement été démontré que 3 traitements pharmacologiques, administrés à des souris, peuvent, dans des situations fixées, protéger et/ou restaurer la production des fibres élastiques et diminuer la rigidité artérielle. Ces 3 traitements n'ayant jusqu'alors pas été appliqués dans les mêmes situations pathologiques, ce projet propose de comparer de manière systématique chez les mêmes souris l'efficacité des 3 traitements, dans trois modèles pathologiques présents au laboratoire, en fonction du sexe et de l'âge. Le but ultime est de proposer le traitement le plus efficace pour chacune des trois pathologies, chez les patients humains. Le projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs qui apporteront chacun l'accès à des techniques spécifiques différentes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est motivé par l'importance en santé publique de la dégradation des fibres élastiques artérielles dans différentes situations physiopathologiques comme le vieillissement, la déficience génétique du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1, ou l'hypoxie intermittente causée par le syndrome d'apnée du sommeil. Ceci conduit à des dysfonctions artérielles et à l'hypertrophie et l'insuffisance cardiaques induites, couplée à une hémodynamique altérée, une mauvaise perfusion et une dysfonction des organes. La réparation des fibres élastiques dégradées est donc un enjeu thérapeutique majeur. La littérature fait état de nombreux travaux à ce sujet (plusieurs milliers, mots-clefs: elastic fiber artery), montrant l'intérêt général pour comprendre les mécanismes et améliorer ou restaurer l'élasticité artérielle. Les résultats obtenus sur ces modèles de souris permettront de vérifier et de comparer les efficacités des trois traitements pharmacologiques dans le maintien ou l'amélioration de l'élasticité artérielle et des paramètres physiologiques associés chez des animaux modèles de 3 pathologies humaines. Suivant la pathologie, le traitement le plus efficace pourra s'avérer ne pas être le même, et nos résultats permettront donc de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique la plus appropriée chez les patients atteints par chacune de ces trois affections.
Procédures
1/3 des animaux seront exposés à la normoxie ou à l'hypoxie durant 14 jours avant leur mise à mort. Les autres animaux (2/3) ont un gène délété qui altère, dès la naissance, la plasticité et l'élasticité de leurs vaisseaux : 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de l'élastine ou seront les animaux témoins de ceux-ci, et 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de la fibrilline-1 ou seront les animaux témoins de ceux-ci. Dans chacun de ces 3 groupes d'animaux, les effets de 3 traitements pharmacologiques seront étudiés : un premier tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le premier traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), un deuxième tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le deuxième traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), et le dernier tiers des animaux de chaque groupe sera injecté dans la veine de la queue 3 fois à 5 jours d'intervalle juste avant la fin de l'expérimentation avec le troisième traitement pharmacologique ou du sérum physiologique (durée de l'injection 30 secondes). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jours pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives, par sphygmomanométrie à la queue (tail-cuff). La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de l'ensemble des procédures, des prélèvements d'organes seront réalisés sous anesthésie et analgésie, entrainant la mort des animaux. Ces organes seront utilisés par la suite dans des expériences de physiologie, de biochimie, d'histologie et de biologie moléculaire, et pour réaliser des cultures de cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, les animaux mis en vieillissement pour former les groupes des souris âgées de 24 mois auront, par conséquent, un hébergement de longue durée. Les expériences d'échographie sur animal anesthésié seront réalisées dans l'EU2 ; toutes les autres expériences seront réalisées dans l'EU1, porteur principal du projet.
Impact sur les animaux
La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Les animaux en hébergement longue durée pour du vieillissement pourraient se retrouver isolés si leurs congénères venaient à mourir de vieillesse. La mise en hypoxie des animaux entraine une perte de poids les premiers jours le temps de l'adaptation à la restriction d'air de façon récurrente et répétée et une diminuation de leur prise alimentaire. Les animaux génétiquement modifiés ont une perte l'élasticité et de plasticité de leur vaisseaux pouvant conduire à des sténoses ou à des anévrismes. L'administration des traitements testés devraient limiter les effets délétaires de l'hypoxie ou celles induites par les modifications génétiques, voire améliorer la plasticité et l'élasticité vasculaire.
Devenir
Tous les animaux se verront appliquer un prélèvement d'organes vitaux terminal au cours d'une procédure sans réveil. Aucun animal ne restera donc en vie à la fin des procédures expérimentales. Ces prélèvements d'organes permettront des études d'artériographie de pression, d'histologie classique ou en microscopie synchrotron, de biologie moléculaire (expression des gènes et protéines liés aux fibres élastiques) et, concernant l'aorte, pour généréer des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires.
Remplacement
Remplacer : la mécanique et la réactivité vasculaires reposent sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires, ainsi qu'une interaction entre les signaux circulants et les différents types cellulaires vasculaires, aussi bien que sur l'interaction entre les différents types de cellules vasculaires structurées de manière très précise dans la paroi, nécessitant forcément une approche in vivo. Aucune méthode alternative ne peut donc se substituer à l’utilisation des animaux pour la réalisation de notre projet car il requiert une approche intégrée.
Réduction
Réduire : Sur la base des résultats de nos expériences publiées antérieurement et du niveau de dispersion des données constaté chez les souris, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 12 animaux par groupe chez les adultes (16 par groupe à mettre en vieillissement pour obtenir 12 animaux agés, du fait du taux de décès spontané avant 24 mois) sont prévus mais le maximum de procédures expérimentales non-sévères seront réalisées sur tous les animaux, ce qui permet de ne pas devoir recourir à des groupes d'animaux séparés/additionnels pour réaliser des procédures différentes, sauf nécessité absolue due à l'impossibilité de réaliser de multiples études de physiologie sur différents organes vivants en même temps. Aussi, nous aurons besoin de constituer des groupes témoins non-traités pour chaque traitement, sans pouvoir les mutualiser de manière générale. Cependant, deux des traitements pharmacologiques étant tous deux simplement ajoutés à l'eau de boisson des animaux, nous constituerons des groupes témoins mutualisés pour ces deux traitements (animaux buvant de l'eau de boisson normale), ce qui permettra une réduction sensible du nombre d'animaux utilisés. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo et in vitro post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, un certain nombre d'expériences de signalisation cellulaire seront menées sur des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires issues de nos souris, ce qui permettra de réduire encore le nombre des animaux nécessaires pour atteindre nos objectifs.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions de l'hébergement de longue durée des animaux en vieillissement, seront particulièrement surveillées afin de limiter au maximum les risques de décès spontané liés à l'âge. L'organisation des cages sera optimisée (mise en place d’enrichissement supplémentaire pour les animaux âgés en situation d’isolement, croquettes mouillées au sol dans les cages pour les animaux âgés). Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Aussi, les lignées de souris génétiquement déficientes pour l'élastine ou la fibrilline-1 sont à phénotype dommageable car les individus homozygotes meurent quelques jours ou semaines après la naissance. Les animaux homozygotes n'étant pas un objet de notre étude, ils ne seront pas produits, en n'effectuant que des croisements d'animaux de type sauvages avec des animaux hétérozygotes. En raison d'une mortalité intra-utérine partielle des animauxhétérozygotes pour l'élastine, les mères seront particulièrement surveillées en période périnatale (deux fois par jour au lieu d'une) de façon à détecter au plus vite tout problème et appliquer les mesures de soin ou critères d'arrêt définis. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement.
Choix des espèces
Nos travaux évalueront l'efficacité réparatrice de trois traitements pharmacologiques sur les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme (déficits génétiques responsables des syndromes de Williams-Beuren et de Marfan, et hypoxie intermittente due à l'apnée obstructive du sommeil), en fonction de l'âge et du sexe. Notre étude concerne la physiologie cardiovasculaire et les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche fondamentale dans ce domaine, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec nos résultats antérieurs et avec la littérature. Les souris utilisées dans le cadre de ce protocole sont âgées de 6 mois (jeunes adultes) et de 24 mois (âgées), ce qui correspond aux âges ciblés pour une vérification optimale des potentialités thérapeutiques des trois traitements pharmacologiques sur nos modèles murins physiopathologiques.
Immunisation pour la génération d’anticorps monoclonaux in vitro
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
60 souris âgées de six semaines vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées au quinzième jour pour prélever leurs ganglions. Chacune reçoit deux injections d'antigènes de micro-organismes pathogènes dans le muscle du jarret, avec pesée et surveillance quotidiennes. Le porteur affirme que ce protocole n'entraîne jamais de détérioration de l'état général, puis liste comme effets possibles la boiterie, des grosseurs, des yeux mi-clos, une prostration et un pelage ébouriffé, la mise à mort étant envisagée en cas de nécrose au point d'injection. Les anticorps seront ensuite produits in vitro, et il conclut que la souris reste "irremplaçable" pour cette étape, invoquant notamment des "protocoles bien établis" et un "historique de succès clinique".
Objectifs
Depuis l'attribution du prix Nobel de Médecine en 1983 pour la découverte de la génération et de production d'anticorps monoclonaux, le développement et l'utilisation de ces derniers sont devenus des outils essentiels dans tous les domaines de la biologie, couvrant des questions scientifiques fondamentales jusqu'au développement de traitements des infections. La présente demande d'autorisation de projet vise à obtenir des anticorps de souris spécifiquement dirigés contre des antigènes d'intérêt impliqués dans les mécanismes infectieux de différents pathogènes affectant tant l'homme que les animaux. Ces anticorps de souris spécifiques auront plusieurs objectifs : (1) améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires du cycle de vie des micro-organismes pathogènes, (2) servir de référence en tant qu'outils d'études pour tous les laboratoires ou sociétés internationales travaillant dans le domaine de l'infectiologie, et (3) être utilisés dans le développement de stratégies thérapeutiques visant à lutter contre les agents infectieux émergents. Le processus de génération d'anticorps nécessite une étape d'immunisation des animaux pour susciter une réponse immunitaire permettant d'obtenir ces anticorps. Dans le cadre de l'immunisation, les souris sont injectées dans le muscle du jarret des pattes arrières avec les antigènes d'intérêt. Au bout de 15 jours, les souris sont euthanasiées afin de collecter les ganglions, qui seront utilisés pour développer des anticorps dirigés contre les antigènes d'intérêt. Ces anticorps joueront un rôle essentiel dans les diagnostics et les thérapies à venir contre les agents infectieux.
Bénéfices attendus
Le projet de génération et de production in vitro d’anticorps monoclonaux permettra des avancées à court, moyen et long terme, contribuant tant aux connaissances scientifiques qu'aux bénéfices thérapeutiques pour les êtres humains et les animaux contre des pathogènes infectieux. Les bénéfices à court terme résulteront d'une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires des micro-organismes pathogènes par l'étude et la compréhension de leur cycle de vie. En effet, les anticorps monoclonaux produits in vitro à partir des cellules immunitaires des souris deviendront des outils essentiels pour d'autres laboratoires nationaux et internationaux, facilitant la recherche en infectiologie. À moyen terme, l'identification de nouvelles cibles permettra le développement de thérapies pour lutter contre les maladies infectieuses émergentes. Ces connaissances acquises pourraient conduire à des stratégies thérapeutiques anti-infectieuses innovantes dans le domaine de la recherche médicale. Les impacts à long terme se feront sentir sur la santé publique grâce au développement de moyens préventifs et curatifs plus efficaces contre les agents infectieux à l'échelle nationale et mondiale. De plus, cela aura un impact positif sur l'environnement en permettant une meilleure compréhension et gestion des maladies infectieuses émergentes, réduisant potentiellement leur l'impact sur les écosystèmes. En résumé, le projet offre des bénéfices immédiats en termes d'avancées scientifiques et d'outils de recherche. À moyen et long terme, il pourrait conduire à des solutions innovantes pour traiter les maladies infectieuses, contribuant durablement à la recherche médicale et ayant des effets positifs sur la santé animale et humaine.
Procédures
Le processus de création des anticorps monoclonaux s'étend sur quinze jours et implique une immunisation chez la souris réalisée par deux injections, chacune d'une durée de 5 secondes, de protéines d'organismes pathogènes visant à stimuler leur système immunitaire. Durant ce protocole, les souris sont surveillées et pesées quotidiennement.
Impact sur les animaux
Ce protocole n'entraîne jamais de détérioration de l'état général des animaux et n'a jamais nécessité la mise en œuvre d'une médication générale dans le but de réduire la douleur, la souffrance ou l'angoisse. Cependant, les effets potentiels indésirables pourraient inclure des symptômes tels que la boiterie, la rougeur, la formation de grosseurs, des yeux mi-clos, une prostration, ou encore un aspect ébouriffé du pelage.
Devenir
Tous les animaux qui suivront le protocole d'immunisation seront euthanasiés afin de prélever leurs cellules immunitaires, permettant ainsi de générer des anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes des pathogènes étudiés.
Remplacement
Il est important de souligner que l'utilisation de souris pour la production d'anticorps monoclonaux peut être justifiée dans de nombreux cas, mais il est tout aussi essentiel de reconnaître qu'il existe des situations où d'autres alternatives peuvent être envisagées. Cependant, pour certains scénarios, les souris restent irremplaçables pour les raisons suivantes : (1) Une similitude avec la réponse immunitaire humaine : Les souris partagent une similitude dans leur réponse immunitaire avec les humains, ce qui en fait un modèle précieux pour la production d'anticorps monoclonaux destinés à des applications médicales. (2) Des protocoles bien établis : les techniques de génération d'anticorps monoclonaux chez la souris sont éprouvées et bien établies, avec des protocoles standardisés qui ont prouvé leur efficacité au fil des décennies. (3) Une polyvalence : les souris offrent une polyvalence d'applications, couvrant un large éventail de besoins de recherche et de développement thérapeutique, ce qui peut ne pas être aussi bien accompli avec d'autres modèles. (4) Historique de succès clinique : de nombreux anticorps monoclonaux développés chez la souris ont démontré leur succès clinique, soulignant leur efficacité dans la pratique médicale. (5) Une standardisation des résultats : en raison de la standardisation des protocoles et de la disponibilité de souches de souris bien caractérisées, les résultats obtenus avec les souris sont souvent plus prévisibles et reproductibles. Bien que des alternatives telles que les cellules humaines, les cellules animales autres que les souris, ou même des techniques in vitro soient envisageables dans certaines circonstances, la complexité du système immunitaire et les exigences spécifiques des applications médicales rendent souvent les souris indispensables dans la production d'anticorps monoclonaux.
Réduction
Le protocole proposé dans cette demande d'expérimentation permet de réduire de moitié le nombre de souris utilisées par rapport au protocole de référence. De plus, il réduit le nombre d'injections nécessaires à seulement 2, comparé à 6 dans le protocole précédent, et raccourcit la période d'expérimentation à quinze jours au lieu de deux mois. Ce protocole d'immunisation requiert l'utilisation de deux souris pour obtenir des anticorps dirigés contre l'antigène d'intérêt.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation, en groupes de 2 à 5 individus, avec un environnement maintenu à des niveaux adéquats de température, d'éclairage, de bruit, et doté d'une litière ainsi que de matériaux de construction de nids adaptés à l'espèce. L'injection des antigènes dans les jarrets permet de maintenir une excellente mobilité des animaux. En cas de signes de douleur tels que la boiterie, la rougeur, la formation de grosseurs, des yeux mi-clos, la prostration, ou un pelage ébouriffé, un analgésique est administré. Si nécessaire, la réhydratation de l'animal est envisagée par l'injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée, et l'accès à la nourriture est facilité en plaçant celle-ci au sol dans la cage. En présence de signes de prostration, d'hypoactivité, ou de piloérection accompagnant une plaie, une infection, ou une nécrose au point d'injection, l'euthanasie est envisagée.
Choix des espèces
Afin d'identifier, de comprendre et de caractériser les mécanismes d'infection des microorganismes pathogènes étudiés, il est nécessaire de disposer d'anticorps monoclonaux spécifiques dirigés contre les facteurs impliqués dans ces mécanismes. Pour obtenir ces anticorps monoclonaux, il est essentiel de passer par une étape d'immunisation d'animaux suffisamment éloignés de l'homme pour générer une réponse immunitaire robuste. La souris est l'espèce de choix depuis la publication du protocole de génération d'hybridomes pour la production d'anticorps monoclonaux en 1975, récompensé par le prix Nobel en 1983. Les souris utilisées dans ce protocole ont un âge de 6 semaines, avec un poids supérieur à 20 g. Ces jeunes souris possèdent un système immunitaire permettant ainsi une meilleure réponse immunitaire.
Génotypage par biopsie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un millimètre de queue coupé ou un poinçon dans l'oreille, vers vingt jours d'âge et sous anesthésie générale : 36 000 souris subissent ce prélèvement pour que leur génotype soit lu. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur écrit qu'il n'y aura ni saignement, ni nuisance, ni effet indésirable, tout en indiquant que le prélèvement de poils, moins invasif, n'est pas encore au point pour toutes les lignées et que la biopsie a été retenue pour sa fiabilité. Les souris dépourvues du génotype recherché et les surnuméraires sont tuées par inhalation progressive de CO2, les autres restant en vie pour l'élevage, environ un quart partant vers des projets soumis à autorisation.
Objectifs
Les études faites au sein de notre animalerie nécessitent l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Afin de pouvoir définir le génotype des souris, un génotypage est nécessaire. Après avoir testé différents types de prélèvements sur les animaux, il s’avère que le prélèvement le moins invasif (prélèvement de poils) n’est pas encore au point pour toutes les lignées. Nous devons donc effectuer ce génotypage par biopsie. Ce mode de prélèvement a démontré une meilleure fiabilité que d’autres prélèvements. Afin de s’assurer du bien-être des animaux, ces prélèvements sont effectués sous anesthésie générale au vetflurane et les animaux sont tout de suite remis dans leurs cages d’hébergement pour réveil avec leurs parents.
Bénéfices attendus
Le génotypage permet de connaitre le génotype des animaux et donc de sélectionner les bons animaux pour le projet ou le maintien de lignée
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement de 1 mm de bout de queue ou d’un poinçon de l’oreille vers 20 jours d’âge sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
Les animaux étant prélevé à un jeune âge et sous anesthésie, la coagulation se fera rapidement, il n’y aura pas de saignement. Les animaux se réveilleront avec leurs parents, il n’y aura pas de nuisances ni d’effets indésirables.
Devenir
Les animaux surnuméraires ou ne possédant par le génotype nécessaire seront mis à mort par inhalation progressive de CO2. Les animaux possédant le bon génotype seront gardés en vie pour le maintien de la lignée ou pour la réalisation de projet ne nécessitant pas de demande d’autorisation de projet. Environ 25 % partiront dans le cadre d'une utilisation continue dans des projets nécessitant une demande d'autorisation de projet
Remplacement
Le génotypage des animaux est indispensable au bon déroulé des études et à la bonne gestion de lignées OGM. Le modèle vivant ne peut donc pas être remplacé.
Réduction
Le génotypage des animaux permet de ne garder que le minimum d’animaux. En effet si la lignée suit la loi de Mendel, nous pouvons supposer du nombre d’animaux possédant le bon génotype issu d’un accouplement. Cela permet donc de ne garder qu’un nombre minimum de parents géniteurs et donc un nombre minimum de petits à génotyper
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permet l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bienêtre des animaux. Les différentes manipulations des animaux et prélèvements seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Afin de diminuer le stress des animaux, le puçage et la coupure du bout de la queue se font en même temps sous la même anesthésie générale par inhalation de vetflurane. Ainsi les animaux ne sont anesthésiés qu’une fois.
Choix des espèces
Au sein de notre animalerie, nous n’effectuons de prélèvements que sur les souris car seules les souris génétiquement modifiées sont mises en accouplement et nécessite un génotypage. Les animaux seront prélevés à l’âges de 20 jours, cet âge permet de pouvoir génotyper les animaux avant la date de sevrage et donc de pouvoir répartir les animaux dans les cages d’hébergement par génotype au moment du sevrage.
Thérapie génique innovante pour la gestion de la spasticité après lésion médullaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six ou sept enregistrements électromyographiques de vingt minutes chacun, sur animal maintenu en contention et sans analgésie : 554 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. La moelle épinière de chaque souriceau est sectionnée complètement dans les premiers jours de vie pour provoquer une spasticité, puis chacun reçoit des injections dans les pattes arrière et dans le péritoine, également sans analgésie, le porteur indiquant que les animaux lésés ne ressentent plus la douleur dans leur arrière-train. 533 d'entre elles sont tuées pour prélever leurs tissus nerveux. La souche a été retenue parce que ses femelles ont un bon instinct maternel et prennent soin des nouveau-nés blessés, parce que les portées comptent douze à quatorze petits, et parce que les souriceaux, plus gros à la naissance, survivent mieux à la section de la moelle.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est de trouver un traitement efficace pour réduire la spasticité. La spasticité est un trouble moteur qui survient tardivement après une lésion de la moelle épinière. Elle se manifeste par une forte résistance musculaire à l’étirement, en raison d'une hyperexcitabilité du réseau de neurones qui connecte le muscle. Elle s’accompagne souvent de spasmes (mouvements involontaires) et d’une hypersensibilité à des stimuli sensoriels normalement bénins. Ce que l'on constate au niveau cellulaire, c'est une excitabilité anormalement élevée des neurones moteurs (MNs). Toutefois, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cela ne sont pas élucidés. Des travaux récents ont montré l'implication d'une famille de protéines présente à la surface des MNs, dans ce phénomène. Leur présence est fortement diminuée après la lésion de la moelle épinière, conduisant à une plus grande excitabilité du neurone et contribuant à l'apparition de la spasticité. En tentant de générer de nouvelles protéines à la surface du neurone grâce à l'outil génétique et en faisant une étude approfondie des mécanismes mis en jeu d'un point de vue fonctionnel et structurel, ce projet a pour but de diminuer la spasticité du réseau neuronal contrôlant la locomotion. Il sera mené sur 2 sites différents, (établissements 1 et 2) qui sont à proximité l'un de l'autre.
Bénéfices attendus
La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables du déséquilibre entre excitation/inhibition au sein du réseau moteur sous-lésionnel. En ciblant spécifiquement ces protéines par l'outil génétique sur le modèle murin, ces études approfondies fourniront des données solides pouvant être transposées à la recherche clinique. En effet, ce travail proposera des outils thérapeutiques innovants pour répondre précisément aux besoins des patients souffrant de spasticité, car à l'heure actuelle le choix médicamenteux est très restreint avec beaucoup d'effets secondaires indésirables, et avec une efficacité éphémère. Ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté biomédicale travaillant sur la spasticité.
Procédures
Une lésion de la moelle épinière sera réalisée dans l'établissement 1 sous anesthésie générale sur l'ensemble des animaux de ce projet (durée intervention 5-8min), suivie d'une seule injection d'un composé potentiellement thérapeutique dans la patte postérieure gauche et droite de chaque animal (durée de l'intervention 5min). Une fois lésés les animaux ne ressentent plus la douleur dans leur arrière train donc toute injection dans la cavité du péritoine (durée intervention 1min) se fera sans analgésie préalable. Chez les jeunes souris, cette injection sera faite soit une fois par jour sur une période de 7 jours, à partir du sixième jour après la naissance, soit 2 jours consécutifs au début des première, deuxième et troisième semaines après la naissance. Chaque injection précède un enregistrement électromyographique (EMG) des muscles de la patte postérieure avec l'animal en contention sans analgésie préalable (car l'animal ne ressent plus rien en dessous de la lésion) d'une durée de 20 min maximum et une vidéo de 5 min de l'animal pour observer son comportement. Au total, il y aura 6 ou 7 EMG par animal et autant de vidéos. Ces expérimentations sont effectuées dans l'établissement 2 tant qu'une installation pérenne n'est pas disponible dans l'établissement 1.
Impact sur les animaux
Afin d'induire une hyperexcitabilité de la moelle épinière et des symptômes de spasticité, nous procédons à une lésion complète de la moelle épinière chez les souris nouveau-née. Suite à cette intervention les symptômes de la spasticité se manifestent quelques jours seulement après la lésion chez les jeunes souris. Une conséquence de la chirurgie peut être l’émergence de la douleur. Suite à l’intervention, une perte de poids (10%) peut être observée. Les manipulations des animaux pour les enregistrements electromyographiques et vidéos peuvent également engendrer du stress.
Devenir
Les animaux à la fin de chaque procédure seront euthanasiés. Chez la grande majorité des animaux (533 souris), le tissu sera prélevé pour une étude approfondie de l'activité et la fonctionnalité des cellules nerveuses mais aussi pour les protéines présentes à leur surface.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre et à lutter contre la pathologie du système moteur suite à une lésion de la moelle épinière. Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux sollicités. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle, en effet, le modèle de spasticité chez la souris possède les principales caractéristiques de la spasticité chez l'homme. Comme la compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, le modèle murin, reste pour le moment, indispensable. Nous supposons ainsi que l'identification d'un acteur principal dans cette pathologie chez la souris, aurait un potentiel thérapeutique significatif pour l'homme.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 554 animaux lésés. Il s'agit d'une continuation directe des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de minimiser davantage ce nombre, les médicaments testés seront administrés en série aux mêmes groupes expérimentaux lors des différentes procédures. Chez la grande majorité des animaux, les tissus seront prélevés à la fin des procédures pour être utilisés, ce qui permettra de limiter encore le nombre d'animaux. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. L'expérimentateur ne sera pas informé du groupe expérimental afin d'éviter tout biais possible.
Raffinement
Les animaux anesthésiés, reçoivent une injection d'analgésique. Une fois opérées, les souris sont maintenues en fratrie et ramenées à la mère. Pour minimiser les épisodes de cannibalisme de la mère envers les nouveau-nés blessés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements anxieux. De plus, nous utilisons des friandises autorisées comme récompense pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...).Que ce soit pour la chirurgie ou les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur et les zootechniciens, en observant leur état général et leur comportement. Du gel nourrissant sera proposé aux animaux âgés de plus de 15 jours à chaque sortie de leur zone d'hébergement pour les séries d'expérimentation. le transport des animaux entre les deux sites d'expérimentation se fait en moins de 10 minutes grâce à une cage de transport confinée à l'abri de la lumière et des odeurs extérieures. et contenant la litère de la cage d'origine. De plus pour minimiser le stress des animaux au cours du transport, des friandises leurs seront données.
Choix des espèces
Le modèle de souris est utilisé dans notre étude car c'est un modèle de spasticité reconnu. Nous supposons que l'identification des mécanismes moléculaires engendrant cette pathologie pourrait avoir un potentiel thérapeutique significatif pour d'autres mammifères, y compris l'homme. La compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, ainsi une grande partie de cette recherche a déjà été menée sur des lignées cellulaires et par modélisation. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle. Le modèle de spaticité chez la souris juvénile est choisi en première intention car l'apparition de la spasticité est rapide (5 à 6 jours). Ce modèle est également compatible avec les investigations fonctionnelle qui font appel à la technique d'électrophysiologie, ce qui n'est pas le cas du modèle de spasticité adulte. Enfin la gestion des animaux opérés est plus simple car c'est essentiellement la mère qui s'en charge. Juste une surveillance accrue des animaux pour déceler une souffrance, ou un comportement anormal relative à la chirurgie est faite par l'expérimentateur et le zootechnicien. Nous avons choisi cette lignée de souris pour les raisons suivantes : (1) les mères de cette souche ont un bon instinct maternel et prennent généralement bien soin des nouveau-nés, y compris ceux qui sont blessés ; (2) les portées sont plus nombreuses que chez les autres souches de souris, avec une moyenne de 12-14 nouveau-nés par portée ; (3) les nouveau-nés sont plus gros à la naissance (poids moyen = 1,6 - 1,8 g), ce qui augmente le taux de survie après une lésion de la moelle épinière. Une partie des animaux sera utilisée à un stade développemental précoce correspondant à la première, deuxième et troisième semaine postnatale.
Induction de la pathologie TDP-43 chez des souris à partir de protéines pathologiques issues du système nerveux central de patients atteints de Sclérose Latérale Amyotrophique sporadique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une semaine d'acclimatation, puis une injection dans le liquide céphalorachidien chaque semaine pendant huit semaines, sous anesthésie générale à chaque fois, et entre deux injections des tests de motricité et de force musculaire de dix minutes chacun. Un test de mémoire intervient au deuxième ou au troisième mois, des prélèvements de sang ont lieu en cours d'étude, et un mois après la dernière injection les 396 souris sont tuées pour prélever des structures de leur système nerveux central. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le porteur écrit qu'il est probable que les souris injectées perdent peu à peu leur mobilité et leur masse musculaire, la mise à mort devant intervenir avant qu'elles ne puissent plus se déplacer, s'alimenter ni boire. Ce qui leur est inoculé provient du système nerveux central de patients atteints de sclérose latérale amyotrophique, dans l'espoir de reproduire chez elles une maladie dont le porteur dit qu'aucun modèle animal fiable n'existe.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (ou maladie de Charcot) est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière, responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe, à ce jour, aucun traitement de la maladie, et la faible connaissance des mécanismes physiopathologiques impliqués associée à l’absence de modèles animaux fiables freinent la recherche sur la SLA. Deux formes de SLA existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques (moins de 10% des patients), et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie reste inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : la protéine TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de SLA et semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de SLA familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique. Plusieurs équipes de recherche ont récemment tenté de reproduire la maladie en injectant la protéine TDP-43 issue de patients atteints de SLA dans le cerveau de souris. Ces études ont permis de reproduire des symptômes semblables à ceux présentés par les patients, et l’accumulation anormale de TDP-43 au sein des neurones des souris a été retrouvée comme celle observée chez les patients. Si ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes, les modalités d’induction de la maladie restent pour le moment très invasives pour les animaux (injections intracérébrales) et difficiles à réaliser. Afin de pallier ces contraintes, nous souhaitons mettre au point un protocole d’induction de la maladie plus facile et moins invasif pour les animaux. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la SLA en générant un modèle animal de SLA sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Si les souris développent une pathologie similaire à la SLA chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués afin de mieux comprendre la genèse et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Les souris subiront une injection par semaine pendant 8 semaines sous anesthésie générale courte. L’anesthésie générale dure en moyenne 15 minutes. La procédure démarre par environ une semaine d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux. Ces tests sont au nombre de 2 et visent respectivement à évaluer la motricité et la force musculaire . La durée de ces tests est d’environ 20 minutes par souris (2 tests différents de 10 min chacun avec des temps de récupération entre chaque). Un test de mémoire sera réalisé entre 2 et 3 mois après le début de l'expérience ( test d'environ 10 minutes par souris). Une fois le modèle mis en place, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations durent quelques secondes pour chaque animal. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les administrations par voie intrathécale et la procédure terminale de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, du fait de l'anesthésie générale (total de 9 anesthésies sur 12 semaines). Les tests moteurs peuvent induire un léger stress chez l'animal. Si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). L'administration de nouveaux candidats médicaments par voie systémique ou orale peut également conduire à un léger stress chez l'animal vigile. Ces interventions peuvent générer un stress transitoire lié à la contention et une légère douleur comparable à l'introduction d'une l'aiguille selon l'art et la pratique vétérinaire. Il n'est pas attendue de douleur ou souffrance spécifique par les candidats médicaments eux-mêmes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques. Ces analyses impliquent le prélèvement de structures du SNC et ne permettent donc pas le maintien en vie des animaux.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la Sclérose Latérale Amyotrophique. En effet la physiopathologie de la SLA met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central. Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et sub-cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Les tests statistiques ont été choisis de manière à répondre le plus précisément possible aux questions scientifiques
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 à 6 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (coton, tunnel, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et/ou les techniciens. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie par isofluorane. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Les animaux seront euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement (point limite lié à ce protocole).
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherche. Les souris C57BL/6J seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et matures car la SLA est une maladie qui touche des adultes.