Rongeurs

80 souris transgéniques vont être utilisées, chacune portant un mélanome injecté sous la peau qui peut atteindre 1 000 mm3, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection dure cinq secondes sous anesthésie à l'isoflurane, et toutes sont tuées ensuite pour prélever les tumeurs et les organes lymphoïdes. Le porteur affirme que ces tumeurs ne provoquent ni nécrose, ni métastase, ni gêne à la mobilité, et ramène les nuisances au stress de la manipulation et de la contention. Le bénéfice annoncé tient en une phrase : montrer qu'une protéine détectrice de danger pourrait servir de cible thérapeutique en cancérologie.

Objectifs

Nos résultats précédents ont montré in vitro et in vivo qu’une protéine détectrice de danger donnait des fonctions pro tumorales à certaines cellules immunitaires. Pour mieux comprendre ces observations et, pourquoi pas, à terme développer une stratégie thérapeutique, nous avons mis en place une collaboration avec une équipe ayant développé des souris transgéniques portant des mutations sur cette protéine. Une des mutations induit un profile antitumorale de nos cellules d’intérêt in vitro. Toujours in vitro, notre collaborateur a pu identifier une molécule agissant sur cette mutation. Pour valider que ces observations sont bien associées à un ralentissement de la croissance des tumeurs, nous utiliserons des souris transgéniques et évaluerons la croissance du mélanome dans ces souris. A la fin de l’expérience, les tumeurs et organes lymphoïdes secondaires des souris seront prélevés pour analyse

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir montrer que la protéine détectrice de danger peut servir de cible thérapeutique en cancérologie.

Procédures

Dans le cas des tumeurs sous cutanées les souris recevront une injection de cellules tumorales (durée de l’injection +/- 5 sec). Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie. Sur la durée de l’expérience (les plus grosses tumeurs atteignant un volume de 1000mm3), ces modèles de tumeurs ne provoquent pas de nécrose, pas de métastase et pas d’impact sur la mobilité des souris. Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisées in vitro. La réponse immunitaire anti-tumorale étant un phénomène complexe faisant intervenir beaucoup de cellules, de molécules et leurs interactions, il est impossible d’en modéliser l’entièreté en dehors d’un organisme vivant.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront répétées que deux fois et les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, nous avons fait appel à une méthodologiste afin de déterminer au mieux le nombre minimal de souris requis pour que nos tests statistiques soient suffisamment puissants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Chaque animal sera examiné quotidiennement tout au long de l’expérimentation. En cas de signes de douleur ou de souffrance les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à partir de 8 semaines, c’est-à-dire possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour sous forme génétiquement modifiée.

Greffées de cellules d'adénocarcinome colorectal humain sous anesthésie, 80 souris mâles portent une tumeur pendant deux à trois semaines, traitées tous les trois jours et passées deux à trois fois en microtomographie à rayons X. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune nuisance ni douleur n'est prévisible puisque les animaux sont anesthésiés pendant les manipulations puis tués en fin de protocole, tout en listant la perte de poids, le stress et la perte de mobilité parmi les effets à surveiller. Le projet transpose au cancer colorectal des peptides déjà testés sur un modèle de mélanome, jugé moins utile parce que ce cancer est plus rare et de meilleur pronostic.

Objectifs

Avec plus de 43000 personnes touchées par an en France, le cancer colorectal se situe au troisième rang des cancers les plus fréquents chez l’homme et au deuxième rang chez la femme. Il constitue la deuxième cause de décès par cancer et représente près de 12 % de l’ensemble des décès par cancer, en particulier chez les 65 ans et plus. Le choix du traitement du cancer colorectal dépend du stade, de sa localisation et de l'état général du patient. Bien que la  chirurgie  soit utilisée en première ligne, la chimiothérapie peut être prescrite à tous les stades de la maladie, et plus récemment, des thérapies ciblées sont utilisées en association avec la chimiothérapie . Malheureusement tous les patients ne répondent pas à ces thérapies et des phénomènes de résistance se développent très souvent. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du cancer colorectal demeure donc un défi majeur.

Bénéfices attendus

Historiquement, nos premiers résultats sur les effets anti-cancéreux de nos peptides ont été obtenus sur un modèle de mélanome, en association avec un laboratoire de dermatologie. Toutefois, en France, le mélanome cutané se situe au 9ème rang des cancers tous sexes confondus et ne représente que 2 à 3 % de l’ensemble des cancers. C’est également un cancer de bon pronostic avec une survie à 5 ans supérieure à 80% dans le cas du mélanome de stade I, représentant lui-même 84% des cancers diagnostiqués. A l’heure actuelle, les traitements sont souvent efficaces depuis les progrès de l’immunothérapie. Le cancer colorectal est, quant à lui, le troisième cancer le plus fréquent, tous sexes confondus, en France où il représente la deuxième cause de décès par cancer. Les traitements peuvent être très lourds avec de nombreux effets secondaires. Il apparaît donc important de cibler de nouvelles approches thérapeutiques, c’est pourquoi nous souhaitons vérifier que l’activité anti-tumorale de notre molécule et de ses analogues, observée in vivo dans un modèle de mélanome murin, est transposable au cancer colorectal. En effet, les résultats préliminaires obtenus dans un modèle in vitro de tumeur 3D sont très prometteurs.

Procédures

Pour nos expériences, les animaux seront sous anesthésie générale (quelques minutes) pour l'injection des cellules de cancer colorectal. 7 jours après, les animaux seront traités tous les 3 jours (quelques secondes par animal) pendant 2 à 3 semaines. Le suivi longitudinal (imagerie 3D par microtomographie rayons X) des animaux se fera sous anesthésie (10 à 15 minutes) à raison de 2 à 3 fois au cours des 2 dernières semaines du projet.

Impact sur les animaux

Pas de nuisances ou critère prévisible de douleur dans la mesure ou les animaux seront sous anesthésie générale durant les manipulations puis euthanasiés en fin de protocole. Douleur potentielle modérée et passagère (piqure) à l'injection des molécules. Une surveillance quotidienne du développement des tumeurs permettra de s'assurer du bien-être des animaux (absence de gêne à la locomotion ou de signes visibles de souffrance). Les effets indésirables surveillés pourraient être : perte de poids, stress, perte mobilité.

Devenir

Pour chaque procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations, afin de prélever et d'analyser les tumeurs.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisées in silico, in vitro et ex vivo. Les peptides testés ont fait l’objet d’une étude in silico afin de sélectionner les meilleurs candidats potentiels. Ces candidats ont ensuite été validés par des études in vitro (migration et invasion cellulaire, modèles 3D multicellulaires) et ex vivo (anneaux aortiques) et nous testerons dans ce projet les peptides ayant donnés les meilleures réponses. Ce projet vise donc à valider in vivo les effets observés. Aucune méthode de substitution n’existe actuellement pour mesurer les effets sur la croissance tumorale.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les peptides candidats ont été sélectionnés sur des modèles de sphéroïdes 3D. Ainsi seuls les peptides à fort potentiel seront testés. Ainsi l’étude considérée dans sa globalité est susceptible de concerner un nombre maximal de 80 souris mâles, réparties en 4 groupes et 2 procédures : 1 groupe contrôle, 3 groupes de test. Afin d’obtenir des résultats significativement robustes, un nombre maximal de 10 souris par groupe sera utilisé. L’analyse statistique se fera avec le test U de Mann-Whitney bidirectionnel.

Raffinement

Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (tubes de jeu, niche, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 7 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du Bien-être animal et les animaux seront anesthésiés lors des procédures pouvant apporter un stress (jusqu'à l'euthanasie), de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris. Il s’agit du modèle de référence pour l’étude de la croissance tumorale.

Douze semaines de régime enrichi en graisse jusqu'à l'obésité, puis six semaines de restriction calorique avec un gavage cinq fois par semaine : 168 souris suivent ce protocole de 18 semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées trois fois dans un tube de mesure de la composition corporelle, et mises à jeun six heures avant chacun des deux tests de tolérance au glucose, avec six gouttes de sang prélevées à la queue sur trois heures, à vif. Le porteur annonce une dyslipidémie, une hyperglycémie chronique et une intolérance au glucose comme effets attendus du régime, et un risque d'irritation de l'œsophage lié au gavage. À la dix-huitième semaine, toutes sont tuées pour prélever le tissu adipeux, le foie et le muscle.

Objectifs

L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement des maladies cardiovasculaires et du diabète. Différentes stratégies existent pour réduire le poids corporel (restriction calorique, chirurgie bariatrique ou traitements pharmacologiques) qui induisent à court terme une amélioration, mais qui ne perdurent généralement pas dans le temps, avec fréquemment un rebond pondéral avec retour des anomalies métaboliques, en particulier la dysfonction du tissu graisseux. Par exemple, les anomalies fonctionnelles du tissu adipeux comme la fibrose (définie par l'accumulation excessive de matrice de collagène dans le tissu gras), présente chez de nombreux patients en situation d'obésité ne sont pas résolues au cours de la perte de poids, et constituent un facteur important d'échec des interventions thérapeutiques de réduction pondérale. Cette situation peut être reproduite chez la souris rendue obèse par un régime riche en graisse, qui développe une fibrose du tissu adipeux comme les patients. Ce sont les cellules souches du tissu adipeux qui produisent l'excès de matrice extracellulaire. Notre objectif est de tester l'efficacité de stratégies visant ces cellules souches pour éviter leur transformation. Nous avons identifié deux traitements potentiels a administrer pendant la période de réduction pondérale, que nous souhaitons valider in vivo dans le modèle souris. Ces traitements se basent sur l'administration de 2 molécules déjà administrées chez l'homme dans d'autres contextes. Nous testerons si elles peuvent améliorer la réponse a la perte de poids lorsqu'elles sont administrées en combinaison à la restriction calorique chez des souris préalablement rendues obese par régime gras.

Bénéfices attendus

Ce protocole doit constituer une preuve de concept chez la souris de l'efficacité des traitements combinés avec la restriction calorique pour restaurer la santé métabolique, en utilisant des approches ciblant la fibrose du tissu graisseux. A terme ces experiences constitueront une indication de ces traitements vers une application en clinique humaine.

Procédures

Pendant 18 semaines, des changements de régime alimentaire seront effectués, avec mise sous régime enrichi en graisse (12 semaines) puis retour à un régime standard (pendant 6 semaines). La stabulation sera effectuée a thermoneutralité (30degrés Celsius) dans une enceinte a climat constant afin de limiter la dépense d'énergie liée au maintien de la température corporelle. Pendant 6 semaines a partir de la semaine 12 les animaux recevront un gavage avec les composes A ou B ou véhicule. Le gavage est réalisé sur animal vigile par simple contention a raison de 5 fois /semaine, et dure moins de 30 secondes. La nuisance est liée au risque d'inflammation de l'oesophage. Ni A ni B n'entrainent d'effet toxiques, ces composés sont approuvés et utilisés chez l'homme dans d'autres contextes. Le suivi métabolique longitudinal comprend des pesées hebdomadaires. Nous réaliserons des mesures non invasives de la composition corporelle à 3 temps : avant la mise sous régime, à la fin du régime gras, et à la fin de la période de traitement. Cette mesure implique de placer les animaux dans un petit tube et de placer l’animal dans l’appareil de mesure durant 2 minutes. Le test de tolérance au glucose est réalisé 2 fois a 12 et 18 semaines, comportant la mise a jeun pendant 6h suivie de prélèvements séquentiels de gouttes de sang a la queue (1 goutte x 6 pendant 180 minutes) sur animaux vigiles. Apres 18 semaines : prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse suivie immédiatement d'euthanasie pour prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus du projet sont ceux liés à l’induction de l’obésité et aux altérations métaboliques associées. En effet, la consommation d’un régime enrichi en lipides tel que celui utilisé ici, peut mener à une dyslipidémie, des altérations de la glycémie avec notamment une hyperglycémie chronique, une intolérance au glucose et une altération de la sensibilité à l’insuline, facteurs de risque cardiovasculaires chez la souris comme chez l'homme. Une fois l'obésité constituée nous initierons une période de restriction calorique pour induire une perte de poids, ce qui permet de reverser partiellement les troubles métaboliques. Cependant le gavage avec les composés a tester nessecite des manipulations de contention, et peut aussi induire des effets indesirables par irritation de l'oesophage. Pour l’évaluation métabolique des animaux, nous privilegions les procedures non invasives pour limiter le stress/douleur. Il est cependant necessaire de proceder au prélèvement de gouttes de sang a la queue pour le test de tolérance au glucose et les mesures de glycémie et de cétonémie, qui doivent etre réalisées sur animaux vigiles pour l'obtention de résultats valides. Les prélèvements sanguins peuvent générer un stress/douleur de courte durée.

Devenir

A la fin du protocole, tous les animaux sont euthanasiés en vue de prelever et d'etudier differents organes (tissu adipeux, foie, muscle etc). Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et que cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux

Remplacement

Le tissu adipeux excerce une fonction de stockage de l'energie en exces et de production de molecules signalisatrices qui va être déterminée par le microenvironnement tissulaire complexe. Ainsi, il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire les fonctions de ce tissu in situ, en particulier sa flexibilité et les changenement ponderaux. L’évaluation de l’activité du tissu adipeux en réponse à des changements d'environnement métabolique et nutritionnels sont des processus biologiques et physiopathologiques complexes qui ne peuvent être explorés que par des approches expérimentales in vivo.

Réduction

Chaque animal (au total 168) sera exploité afin d’apporter le maximum d’information. Si possible, nous utiliserons les données de manière transversale entre les protocoles afin de réduire le nombre d’animaux. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. Lorsque cela est possible techniquement, sans affecter la qualité des données recueillies, les souris partageant un même groupe contrôle seront étudiés en même temps afin de réduire le nombre d’animaux. La taille des groupes expérimentaux a également été optimisée afin de répondre aux besoins de mettre en évidence des différences statistiques et pour prendre en compte les variations liées à la diversité de la réponse biologique. Le calcul de puissance indique que 12 souris par groupe est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables compte tenu de la variabilité interindividuelle des paramètres mesurés (poids,tolérance au glucose, tailles des adipocytes, contenu en collagène, analyse de cytométrie en flux).

Raffinement

Un suivi du poids des animaux sera effectué avant mise sous régime puis de manière hebdomadaire pendant les 12 semaines de régime riche en graisse. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (regroupés à 4 animaux par cage) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les animaux seront maintenus à une temperature de 30 degrés Celsius qui correspond a la thermoneutralité pour les petits rongeurs (absence totale de stress thermique, réduction de la thermogénese). Nous utilisons une enceinte climatique homologuée permettant de contrôler la température, l'humidité et le niveau d'éclairage. De plus, le personnel expérimenté de l'animalerie veille au bien-être des animaux et l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement pour vérifier le respect des points limites définis pour ce projet. De plus, un suivi hebdomadaire de prise alimentaire et du poids sera réalisé, ce qui permet, en plus des données expérimentales, de s’assurer du bon état de santé des animaux et de les habituer aux manipulations afin de reduire le stress potentiel lors des procédures ultérieures (tests de tolérance au glucose). Nous prendrons soin de faire exécuter toutes les manipulations des animaux (pesées, gavages) par des personnes expérimentées afin de réduire le stress au maximum. Nous avons également choisi un matériel et des procédures adéquats pour limiter la douleur, avec en particulier l’utilisation des sondes de gavage en plastique fines et souples. Un laps de temps de minimum 1 semaine entre les actes sera respecté afin de laisser un temps de récupération aux animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent car les mécanismes de régulation de la balance énergétique sont très proches de ceux a l'œuvre chez l'homme. En cas de surnutrition, les souris développent une obésité (accumulation de tissu adipeux) qui ressemble à la situation chez l'homme avec des troubles du métabolisme glucidique (diabète) et d’autres perturbations métaboliques. Il est à noter que les modèles murins ont généré des apports conceptuels dans le domaine de la régulation du poids corporel, avec la découverte de la leptine, hormone d'origine adipocytaire qui contrôle la prise alimentaire. Cette hormone a été découverte grâce a des mutations naturelles chez la souris (mutation ob). De plus en rapport avec le projet, les souris répondent a des restrictions caloriques par perte de poids, elles peuvent aussi, comme les patients atteints d'obésité, développer une fibrose du tissu adipeux, avec des conséquences deletaires sur leur santé. Nos études requièrent que les animaux soient sexuellement matures avec un métabolisme adulte. Les souris seront donc mises sous régime à partir de l’âge de 6-8 semaines, pour une étude de durée totale de 18 semaines.

L'atteinte d'un point limite déclenche les mesures inscrites sur une fiche d'observation, jusqu'à la mise à mort. 1 000 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats médicaments par l'abdomen, la bouche, la peau, la veine ou le muscle, subissent des prélèvements de sang parfois sans anesthésie, puis une perfusion intracardiaque avant que leur cerveau soit prélevé pour enregistrer l'activité électrique de coupes cérébrales. Le porteur présente ces essais comme un moyen d'accélérer le développement de médicaments contre les maladies du cerveau, sans nommer les composés testés ni les pathologies visées, et prévoit d'utiliser des animaux de 3 à 95 semaines.

Objectifs

Les maladies du cerveau sont un fléau dans notre société. Le développement de nouveaux médicaments est un processus long et coûteux. Afin d’accélérer le développement de nouveaux médicaments, il est crucial de déterminer l’efficacité et la toxicité des candidats médicaments le plus tôt et le plus rapidement possible. Dans ce cadre, l’objectif de ce projet est de tester l'efficacité de candidats médicaments en développement sur l’activité électrique neuronale. Pour ce faire, des candidats médicaments seront administrés à des rongeurs (souris et rats) et leur effet sur l’activité électrique des cellules neuronales sera évalué par la technique d’électrophysiologie, sur coupes cérébrales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’effet de candidats médicaments sur la physiologie des cellules neuronales, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter les pathologies cérébrales.

Procédures

Administrations : intrapéritonéale : 5 secondes, orale : 5 secondes, sous cutanée : 5 secondes, intraveineuse : 10 secondes, intramusculaire : 5 secondes Prélèvements sanguins : avec anesthésie légère par administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie par inhalation (induction maximum 3 minutes) ou sans anesthésie, 5 secondes. Euthanasie : Administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie par inhalation (induction maximum 3 minutes), perfusion intracardiaque d’un liquide physiologique (30 secondes), euthanasie pour prélévement du cerveau (3 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements peuvent induire un certain niveau de stress, et potentiellement une douleur modérée, qui seront limités par la maitrise des gestes techniques. Suite à l’administration des composés à tester, il se peut que des signes légers d’inconfort ou d’intolérance se manifestent (rougeur, gonflement...).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.

Remplacement

Les neurones et leur modulation peuvent être étudiés sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces approches expérimentales ne peuvent pas être remplacées par des méthodes substitutives type approche in sillico / in vitro ou culture cellulaire. L'étude de l'effet de composés en développement et une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessitent donc l'administration de composés sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté, (10 animaux par groupe / entre 2 et 10 groupes par étude et par espèce). Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.

Raffinement

Les animaux plus âgés pourront être placés individuellement pour éviter le risque de bagarre dès leur arrivée, suite à un retour d’expérience et conformément aux recommandations de l’éleveur. Ils resteront toujours en contact visuel et olfactif. Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué sans exception (Week-ends & jours fériés), les animaux seront pesés une fois par semaine dès la fin de la période d’acclimatation par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général. En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude. Ce suivi nous permettra de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. Les animaux seront évalués grâce à la fiche d’observation /points limites et l’atteinte d’un point limite entrainera les actions documentées dans cette fiche. Lors des prélèvements sanguins réalisés par du personnel compétent et qualifié, les animaux pourront être sous anesthésie générale. Une alternance ou rotation des sites d’injection peut être mise en place si les traitements sont sur plusieurs jours pour les différentes voies d’administrations. Afin de respecter le cycle adopté chez le fournisseur et pour des raisons d’études scientifiques, certaines études seront réalisées en cycle inversé jour / nuit pour que le rythme de l’animal soit le moins perturbé possible.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris et le rat, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 95 semaines, afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte âgé.

Irradiées 90 secondes sans anesthésie, 1 860 souris dépourvues de système immunitaire reçoivent le lendemain des cellules de leucémie humaine, par la veine de la queue ou directement dans la moelle osseuse de la patte. Chacune peut ensuite subir jusqu'à dix ponctions de moelle osseuse et douze prélèvements de sang à la joue, plus un gavage ou une injection quotidiens par cycles de 28 jours répétés jusqu'à trois fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ces procédures de "rapides, non invasives et maîtrisées", tout en décrivant la prolifération leucémique comme une source de souffrance annoncée par une perte de poids et des diarrhées. Toutes sont tuées, au plus tard douze mois après la greffe, pour prélever la rate et la moelle osseuse et conserver les cellules leucémiques en vue d'"utilisations mutualisées".

Objectifs

Les leucémies aiguës (LA) sont des cancers agressifs du sang affectant les différents types de cellules de notre système immunitaire. Notre objectif est de générer des modèles d’étude de ces leucémies humaines en injectant les cellules leucémiques humaines provenant des prélèvements faits sur les patients dans des souris dépourvus de système immunitaire (absence de rejet de greffe). L’établissement de ces modèles nous permettra d’élucider les mécanismes biologiques de ces leucémies et de tester l’efficacité thérapeutique de molécules déjà utilisées en médecine humaine dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients atteints de leucémies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la transformation des cellules normales en cellules leucémiques mais aussi des mécanismes responsables des résistances aux traitements par la chimiothérapie et des rechutes. L’amélioration de ces connaissances devrait nous permettre d’identifier des molécules déjà utilisées en médecine humaine pour d’autres pathologies qui pourraient présenter un avantage thérapeutique aussi pour le traitement des leucémies. A terme, ce projet devrait permettre d’améliorer les thérapeutiques futures en proposant des traitements ciblés plus efficaces et moins toxiques dans le but d’améliorer le devenir des patients.

Procédures

Pour mettre en place le modèle d’étude, des souris dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées seront d’abord soumises à une irradiation de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et faciliter la greffe, survie et prolifération des cellules leucémiques humaines injectées. Le lendemain les cellules leucémiques humaines seront injectées en une fois soit par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée 30 secondes) soit directement dans la moelle osseuse au niveau de la patte des souris anesthésiées et analgésiées. (durée 3 min maximum). Afin de suivre le développement du cancer, des prélèvements de moelle osseuse dans la patte des souris anesthésiées et analgésiées (3 minutes maximum) seront réalisés une fois par mois et au maximum 10 fois ; en alternant la patte prélevée. En complément, des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue des souris (30 secondes maximum) sans anesthésie seront réalisés 2 fois par mois et au maximum 12 fois. La dose, la fréquence et la voie d’administration des molécules thérapeutiques testées peuvent être variables. Les molécules thérapeutiques seront administrées quotidiennement aux souris sans anesthésie soit oralement (avec une sonde de gavage ; durée 1 min) soit par voie intraveineuse (dans la veine de la queue ; durée 30 sec) soit par voie intrapéritonéale (dans la cavité abdominale ; durée 30 sec). Des cycles de traitement d’une durée de 28 jours seront réalisés et pourront être répétés au maximum 3 fois De l’imagerie non invasive sur souris anesthésiées (ayant reçu une injection intrapéritonéale d’une molécule permettant la visualisation des cellules leucémiques) pourra dans certains cas remplacer les prélèvements de sang ou de moelle osseuse pour le suivi de la réponse aux molécules thérapeutiques testées (durée de l’imagerie= 15 min).

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sont rapides, non invasives et maîtrisées par l’ensemble du personnel. Cependant, l’irradiation des souris peut causer du stress et des diarrhées. L’implantation des cellules leucémiques peut causer une douleur légère et brève au niveau du site d’injection. Les prélèvements de sang et moelle osseuse peuvent causer une douleur légère et brève au niveau du site de prélèvement. L’implantation et le prélèvement dans la moelle osseuse peut potentiellement entrainer une perte de mobilité sur une très courte durée. L’administration de molécules thérapeutiques peut causer un stress ainsi qu’une douleur légère et brève au site d’injection. L’administration répétée de molécule thérapeutique par gavage peut potentiellement causer une irritation. La prolifération des cellules leucémiques peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage ; le plus souvent une perte de poids et des diarrhées précéderont ces évènements.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales (et au plus tard 12 mois après l’implantation des cellules leucémiques humaines ou l’arrêt du traitement en cas d’absence de greffe) afin de collecter les différents organes tels que la rate et la moelle osseuse. Cela permettra de réaliser des analyses complémentaires sur les cellules leucémiques mais également de les conserver afin de permettre des utilisations mutualisées.

Remplacement

Les lignées de cellules leucémiques existantes ne permettent pas de représenter la diversité des leucémies observées chez les patients ni de modéliser les étapes de transformation de cellules normales en cellules cancéreuses ni les mécanismes biologiques responsables des résistances aux traitements et des rechutes. De plus à ce jour il n’existe que quelques modèles de culture en milieu artificiel (in vitro) qui permettent seulement de maintenir temporairement des cellules leucémiques humaines mais leur pertinence reste partielle car cela ne récapitule pas la complexité de l’environnement physiologique ou pathologique des cellules humaines. Au contraire, l’utilisation d’un modèle animal entier vivant assure la présence d’un environnement complexe récapitulant les conditions retrouvées chez les patients. Ainsi l’utilisation d’un modèle utilisant un animal entier vivant est donc nécessaire et indispensable pour étudier la biologie des leucémies et tester des molécules thérapeutiques dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients.

Réduction

Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Pour certains modèles, de l’imagerie in vivo non invasive sera réalisée permettant de faire un suivi en direct de l’évolution de la maladie et de l’efficacité des traitements. De plus cela permettra d’anticiper les signes cliniques visibles.

Raffinement

Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou les expérimentateurs. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux dépourvus de système immunitaire seront hébergés dans des conditions permettant d’éviter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du comportement, de l’apparence physique, du poids sera effectuée par les expérimentateurs dès l’implantation des cellules leucémiques humaines et jusqu’à la fin de la procédure (ou au plus tard 12 mois après l’implantation en cas d’échec de greffe). Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de moelle osseuse et bimensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter et quantifier la prolifération des cellules leucémiques humaines implantées. Le suivi des animaux se fera en à l’aide d’une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs avec un système de scores. Toute souris présentant des signes de souffrance ou atteignant les points limites pendant la durée de l’expérience sera euthanasiée sans attendre et analysée. Néanmoins certains signes cliniques observés pourront entraîner des actions comme le renforcement du suivi clinique pendant 1 semaine, une réhydratation. De plus, le recours à de l’imagerie in vivo non invasive permettra de suivre en direct l’évolution de la maladie et d’anticiper les signes cliniques visibles.

Choix des espèces

L’utilisation de souris adultes dépourvues de système immunitaire est largement décrite dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour la greffe de cellules leucémiques humaines. Ce modèle permet également d’étudier la biologie des leucémies humaines, et de servir de modèles précliniques permettant de tester de nouvelles molécules thérapeutiques dans un environnement tumoral complexe se rapprochant de ce qui se passe chez les patients. De plus, nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et de souffrance des souris et donc de leur prise en charge Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7 à 12 semaines, afin de garantir une prise de greffe maximale des cellules leucémiques humaines.

Quinze minutes : une injection d'anesthésique dans l'abdomen, puis une chirurgie qui ne se termine pas par un réveil. 800 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet cartographie l'innervation de l'hypothalamus, centre de régulation du comportement alimentaire et social, en comparant des souris sans flore intestinale et des souris de souche classique à 14, 21 et 56 jours de vie. Le porteur annonce des lots de 10 souris par condition, ce qui laisse l'essentiel des 800 animaux sans justification chiffrée, et écrit par ailleurs que la procédure "n'induit pas de nuisances sur les animaux".

Objectifs

Le cerveau est divisé en différentes régions, noyaux et sous-noyaux produisant de nombreux neuropeptides avec son rôle propre dans le comportement de l’hôte. L’hypothalamus est le centre de régulation du comportement motivationnel : alimentaire, social. Il produit des neuropeptides et des récepteurs qui vont influencer le comportement motivationnel de l'hôte. Des mutations des gènes produisant ces neuropeptides ou récepteurs peuvent influencer ces comportements. L'objectif du projet est d'étudier l'innervation de l'hypothalamus par différentes populations neuronales impliquées dans le comportement motivationnel (comportement alimentaire, comportement social notamment), en conditions normale et pathologiques.

Bénéfices attendus

Une meilleure visualisation et l’établissement d’une cartographie des cellules nerveuses exprimant ces différents peptides et récepteurs permettra de mieux appréhender les mécanismes de communication neuronale, et ce chez différentes espèces ayant des métabolismes et comportements différents (sociaux, alimentaires). Une quantification des neurones positifs peut être faite pour comparer l’expression entre les souches. Une quantification de l’expression des peptides et récepteurs permettra de compléter ces datas et de comparer entre les souches l’expression des ARN messagers.

Procédures

Les animaux soumis à la procédure 1 recevront une injection intra-péritonéale d'anesthésique/analgésique, suivie d'une chirirgie terminale sous anesthésie générale. La procédure complète dure 15 minutes à compter de l'injection. cette procédure n'induit pas de nuisances sur les animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une douleur au niveau du site d'injection et a un éventuel stress dû à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Cependant, les gestes étant réalisés par des personnes habilités et habitués à ces procédures, la durée et l'intensité de ces effets sera minime, 2 minutes maximum.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements d'organes pour des études histologies

Remplacement

Les techniques de prélèvement du cerveau pour des etudes d'histologie et d'imagerie sont à ce jour irremplaçables pour observer les projections neuronales entre les différentes régions cérébrales. Ce sont des techniques classiques utilisées en neurosciences, tant pour observer l’expression génique que l’expression protéique. Des méthodes in vitro existent pour étudier la structure et le fonctionnement d'un organe en condition physiologique et pathologique. Nous pouvons notamment citer les techniques d'organes sur puce (organ on chip), qui sont tout à fait pertinentes pour étudier les effets de molécules / médicaments sur l'organe ainsi que réaliser des tests de toxicité sur le tissu. Cependant, dans le cadre de ce projet, nous souhaitons observer les différentes structures anatomiques (noyaux neuronaux) et l'architecture mise en place dans le cerveau pour relier les différents noyaux (fibres), ce qui n'est pas reproductible in vitro. De plus, nous souhaitons également voir l'impact du microbiote intestinal sur le développement du cerveau (souris axéniques vs souris C57Bl6), impliquant 2 organes, ce qui est actuellement pas reproductible in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, des marquages multiples seront réalisés sur un même tissu. De plus, l’utilisation de ce type de modèles animaux permet de réduire le nombre de souris utilisées puisque le génotype est plus garanti que via des mutations spontanées. De mêle pour les études d'expression génique, plusieurs marqueurs peuvent être ciblés par tissu. Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les marquages seront analysés sur des lots de 10 souris par condition. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement comparables. Nous allons quantifier le nombre de cellules positives par région, et comparer les différences entre les conditions (age et sexe). Nous évaluerons aussi la densité des fibres nerveuses positives, chaque noyau possédant plusieurs projections neuronales. Les 30 animaux par sexe correspondent donc à 10 souris à P14, 10 à P21 et 10 à P56.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à trois à cinq par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale). Bien que la mise au point de ces modèles animaux soit couteuse, cela permet d’éviter la souffrance des animaux induite par l’administration des toxines.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère entier, donc in vivo chez l’animal, peut nous permettre de comprendre de façon globale l’organisation des neuropeptides dans un tissu entier. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques liées à la prise alimentaire, le comportement social, permettant ainsi une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. Nous étudierons les animaux avant le sevrage (P14) ainsi qu’au sevrage à P21 et à l'age adule P56, afin d’observer le processus de développement chez les jeunes animaux et comparer les circuits hypothalamiques qui se développement principalement après le sevrage.