Rongeurs

Cinq jours de traitement destiné à enflammer l'intestin, quatre injections ou quatre gavages selon le groupe, puis une coloscopie sous anesthésie au dixième jour. 45 souris mâles de neuf à dix semaines traversent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec pertes de poids et saignements possibles. Le porteur qualifie l'induction de l'inflammation de traitement sévère mais "nécessaire", et s'appuie sur une dose largement utilisée dans la littérature et sur un modèle qu'il décrit comme maîtrisé depuis longtemps. La coloscopie terminée, elles sont tuées sans reprendre conscience, et le foie, le cœur, la rate, l'intestin entier, les ganglions, le sang, les urines et les selles sont prélevés.

Objectifs

Nous développons une nouvelle méthode d’administration de traitement anti-inflammatoire dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) comme la maladie de Crohn et la Rectocolite Hemorragique. Les études in vitro et in vivo ont d’ores et déjà montré des résultats prometteurs, permettant le dépôt d’un premier brevet. L'objectif général est de développer une stratégie alternative aux produits biologiques (anticorps administrés actuellement par voie injectable) dans le traitement des MICI modérées à sévères, par l'administration locale de petites molécules à base d'ARN, enveloppés dans des microcapsules qui peuvent être administrées par voie orale. Cette nouvelle technologie présente de nombreux avantages par rapport aux traitements conventionnels : (1) réduction des effets indésirables grâce à une action locale ; (2) diminution des effets secondaires par rapport aux anticorps injectés largement utilisés à l’heure actuelle (3) action simultanée possible sur plusieurs cibles en délivrant différentes petites molécules en une seule fois, à l'instar des stratégies biologiques doubles utilisées chez les patients atteints de MICI réfractaires (4) administration orale beaucoup moins contraignante par rapport aux voies injectables, permettant une meilleure observance thérapeutique. Pour optimiser et valider la stratégie d'administration orale de nos molécules à l'aide de microcapsules, les objectifs sont maintenant l'évaluation préclinique, sécurité et efficacité de nos microparticules par rapport aux produits biologiques conventionnels dans un modèle bien caractérisé d'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Les petites molécules à base d’ARN vont inhiber localement l’expression de protéines cibles impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce projet permettra donc à long terme de développer une stratégie alternative aux produits biologiques afin de traiter les MICI modérées à sévères. Grâce à l’administration orale de petites molécules permettant d’améliorer l’observance thérapeutique des patients puisque la voie orale est beaucoup moins contraignante et risquée que les traitements injectables utilisés aujourd'hui chez les patients souffrants de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.

Procédures

4 interventions seront réalisées durant ce projet : (1) Le traitement pro-inflammatoire pour "imiter" les symptômes d'une Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale sera réalisé sur tous les animaux (45 souris) durant 5 jours. (2) Les injections du traitement de référence chez 9 animaux ou d’une solution tampon chez les autres animaux seront réalisées sur animal vigile 4 fois au cours du protocole (durée : quelques secondes). (3) L’administration par voie orale des microcapsules ou d’une solution tampon sera réalisée sur animal vigile 4 fois au cours du protocole (durée quelques secondes). (4) L'endoscopie rectale : examen de quelques minutes (10 min maximum) réalisé le dernier jour du protocole (10ème jour) sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation de l’intestin (intervention n°1) réalisée sur tous les animaux est un traitement sévère pour les animaux mais nécessaire pour étudier l’inflammation intestinale. Les souris pourront perdre du poids ou présenter des saignements pendant la durée du traitement. Cependant, la dose administrée est une dose très largement utilisée dans la littérature scientifique. C’est un modèle maîtrisé depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement est aussi très dépendante de l’environnement de l’animal et que de par nos protocoles antérieurs, les symptômes sont rapidement identifiés afin d'intervenir sans délai et ainsi limiter la souffrance des animaux. Aucun effet indésirable n'est attendu concernant l'administration des molécules anti-inflammatoires aussi bien par voie injectable (intervention n°2), en s’appuyant sur la littérature scientifique ; que par voie orale (intervention n°3) en s’appuyant sur le protocole initialement réalisé dans un modèle similaire d'inflammation chez la souris. L'administration par gavage ou par injection étant réalisé par un zootechnicien qualifié maîtrisant les gestes interventionnels, ceci limite le risque de nuisance pour les animaux. Enfin, concernant la coloscopie (intervention n°4), elle est réalisée sous anesthésie générale et suivie de la mise à mort des animaux donc sans nuisance ni effets indésirables.

Devenir

Les interventions successives sont réalisées sur animal vigile, seule la dernière (coloscopie) est réalisée sous anesthésie générale et à l’issue de celle-ci les animaux sont mis à mort sans réveil afin que tous les organes (foie, cœur, rate, intestin entier, ganglions mésentériques) ainsi que le sang, les urines et les selles soient prélevés.

Remplacement

A ce jour, les maladies intestinales ne peuvent pas être entièrement reproduites par des modèles cellulaires. En effet, la physiologie intestinale est complexe car elle implique plusieurs systèmes distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et la flore intestinale. Aussi, les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant des organes extérieurs au tube digestif, il n’existe donc pas de remplacement possible du modèle animal pour explorer l'effet thérapeutique de notre nouvelle technologique d'administration d'un traitement anti-inflammatoire.

Réduction

Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, 45 souris (4 groupes expérimentaux de 9 animaux et un groupe témoin de 9 animaux également) seront nécessaires dans cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été calculé par une approche statistique sur la base d'études antérieures menées au sein du laboratoire, dans la même animalerie et sur le même modèle expériemntal pour permettre les analyses statistiques a postériori.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 4 à 5 animaux, dans des cages ventilées, avec à disposition du papier, des cabanes en carton pour se cacher et grimper, des buchettes de bois pour usure des dents et autres matériaux d’enrichissement tout au long du protocole. Toutes les interventions expérimentales seront réalisées par des personnes formées et expérimentées. Elles auront lieu dans l’animalerie du laboratoire, dans un environnement sécurisant pour l’animal et les coloscopies se feront sous anesthésie générale. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé selon un score défini au préalable et en tenant compte des signes éventuels de mal-être. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biologiques. Le modèle d'inflammation est un modèle bien maîtrisé et les symptômes sévères sont repérés rapidement afin de limiter la souffrance des animaux et intervenir sans délai.

Choix des espèces

Il n’existe pas d’alternative pour étudier l’effet d’une nouvelle molécule dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin car : - La physiologie de l’intestin est complexe d’une part, et la réponse inflammatoire implique de nombreux acteurs présents dans l’ensemble de l’organisme. Les cultures cellulaires ont montré des résultats intéressants mais ne sont donc pas suffisantes pour valider l'effet anti-inflammatoire sur organisme entier. - La sévérité de l’inflammation étant évaluée notamment par endoscopie rectable, l’utilisation de l’animal comme modèle d’étude est donc indispensable. - Le choix du modèle murin permettra de comparer nos résultats avec d’autres études réalisées avec des modèles transgéniques (modèle de colite spontanée Il10-/- où l’inflammation est chronique et non aiguë). Les animaux utilisés sont des souris mâles car la réponse à la colite est plus variable chez les femelles. L'âge fixé des animaux est de de 9 à 10 semaines correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au stade « jeune adulte » car les MICI sont des maladies du jeune adulte donc cela correspond aux besoins du projet.

528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 480 reçoivent une endotoxine bactérienne quatre jours de suite pour déclencher une neuroinflammation et détruire une partie de leurs neurones dopaminergiques, 288 se font implanter une électrode sur le nerf de la rate avec des connecteurs fixés au crâne, et 384 traversent une piste les pattes encrées pour mesurer leur longueur de foulée. Reliée trente-six jours par un fil à un stimulateur électrique, chaque souris opérée est séparée de ses congénères, et le bénéfice annoncé pour les personnes atteintes de Parkinson reste une piste thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'un tel travail ne peut être mené que sur des "organismes entiers" préservant les interactions entre système nerveux et système immunitaire.

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer sur des modèles murins l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique de la maladie de Parkinson. Ce modèle de Parkinson est caractérisé par une réponse pathogénique neuroinflammatoire médiée par le système immunitaire. Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrostimulation en clinique. La maladie de Parkinson est une maladie du cerveau qui entraîne de la neuroinflammation, des problèmes moteurs, des troubles de la santé mentale et du sommeil, ainsi que des douleurs et d’autres problèmes de santé. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable obligeant à changer souvent de molécule. Il n’y a pas de traitements curatifs. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement la neuroinflammation dans un modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité inflammatoire. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur l’évolution de la maladie de Parkinson n’a jamais été évalué. Le projet consiste à : 1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique); 2- puis induire la maladie de Parkinson (modèle par injection intra-péritonéale d’une endotoxine bactérienne ; 3- puis réaliser ou non des sessions d'électrostimulation du nerf de la rate. La comparaison des scores cliniques entre les animaux ayant subi une électrostimulation du nerf splénique et ceux n'ayant pas subit cette électrostimulation nous permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation sur le développement de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules immunitaires pathogéniques impliquées dans la sclérose en plaque pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.

Procédures

Induction de la maladie de Parkinson : 480 animaux Les animaux subiront une anesthésie générale gazeuse et recevront une injection d'endotoxine bactérienne tous les jours pendant 4 jours consécutifs afin d’activer le système immunitaire (durée de l'intervention: 10 minutes). Implantation électrode : 288 animaux. Les animaux recevront un analgésique 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale pendant 20 minutes. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique et les connecteurs seront fixés au niveau du crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain de l'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire maintenu pendant les 3 jours suivants. Mesure de la longueur de foulé : 384 animaux. Les longueurs de foulée sont mesurées sur une piste plein champ contenant une bande de papier et disposée pour déboucher sur de la nourriture. Les pattes antérieures et postérieures de la souris sont humidifiées au préalable avec de l'encre avant d'être relâchées pour traverser la piste éclairée. Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

1- Nuisances associés à l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'endotoxine bactérienne : Dans ce modèle, la maladie de Parkinson est induite par injections d'une endotoxine bactérienne. Ces injections provoquent chez l’animal une réaction immunitaire induisant de la neuroinflammation et à terme la perte partielle de neurones dopaminergiques dès le 5ième jour. A partir du 19ème jour après la première injection , un déficit moteur modéré apparaît qui se traduit par une diminution maximale de la longueur de foulé de l’ordre de 8%. Le pic de la pathologie est atteint aux alentours du jour 19 post induction puis les symptômes associés à la maladie vont décroitre progressivement jusqu’à la fin de l’expérimentation (jours 36). 2- Nuisances associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. La procédure d'implantation d'une électrode sur le nerf de la rate et l'électrostimulation chronique de ce nerf est réalisée de manière récurrente au sein de notre équipe. Une douleur d’une durée estimée à 48 heures est par contre engendrée par la procédure chirurgicale permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requiert une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 36 jours (risques de rognage de fils).

Devenir

Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure

Remplacement

Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.

Réduction

Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par une approche statistique afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulé de l’expérimentation et donc de limiter le nombre d’animaux

Raffinement

Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique et une grille d’observation préétablie prévoyant des mesures correctives et la mise en oeuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'une endotoxine bactérienne a été bien caractérisée. Le projet portera sur des souris mâles C57Bl/6 âgées de 12 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20 et 25 gr).

370 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant soit quatre membranes artificielles implantées sous la peau du dos, soit une perte de substance créée dans le fémur et fixée par une plaque vissée. Trente rats pour la première phase, cent dix pour la deuxième, deux cent trente pour la troisième. Après l'opération, ils sont placés seuls en cage jusqu'à sept jours, le temps que la douleur et la boiterie s'atténuent, et le porteur prévoit une hyperthermie possible par infection, une perte de poids et des anomalies de cicatrisation pendant une quinzaine de jours. Les bénéfices décrits concernent des patients humains, une seule chirurgie au lieu de deux et un retour plus rapide au travail, quand l'atteinte porte, elle, sur des fémurs de rats ouverts puis prélevés.

Objectifs

La gestion des pertes de substances osseuses critiques (supérieur à 5 cm) est une préoccupation quasi quotidienne en chirurgie orthopédique et traumatologique. Elle peut être prise en charge par la technique de la « membrane induite ». Cette technique consiste à placer une entretoise en ciment (PMMA ou polymethylmetacrylate) dans la zone de perte de substance osseuse. Une réaction autour du ciment permet la formation d’une membrane (en 2 à 3 mois environ) qui servira de réceptacle à une autogreffe osseuse prélevée sur le patient. Malgré les avancées permises par cette technique, il s’agit d’une procédure nécessitant le développement de cette membrane dans un délai assez long, requérant donc 2 interventions, retardant tout autant la récupération de l’autonomie du patient. De plus, la qualité de la membrane induite par l’organisme reste variable et dépendante du patient (âge, fumeur, comorbidités…), elle est hélas parfois quasi inexistante, friable et fragile, limitant les chances de succès et entraînant donc d’autres procédures chirurgicales plus agressives. L’immobilisation du patient et la mise en décharge plusieurs semaines présente des conséquences physiques lourdes à savoir : Amyotrophie, enraidissement articulaire mais aussi des conséquences socio-économiques avec une hospitalisation à deux reprises, souvent supérieures à 48-72h et un retard au retour aux activités personnelles et professionnelles (coût social de la perte d’activité). Ainsi, l’objectif de ce projet est d’être dans la mesure d’évaluer in vivo de membranes artificielles synthétiques, implantables, autorisant une consolidation osseuse en une chirurgie tout en ayant une maniabilité compatible avec le terrain chirurgical orthopédique et traumatologique. Ces membranes artificielles auront pour rôle d’être un soutien à la formation de la membrane induite naturellement par le corps mais également de servir de soutien à la greffe osseuse qui serait réalisée en un seul temps opératoire, optimisant donc la technique initiale sur les plans orthopédiques, rééducatifs mais aussi socio-économiques pour les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants : - Limiter les échecs de la technique de la membrane induite dans sa forme actuelle en implantant un dispositif artificiel permettant de soutenir la formation de cette membrane induite, qui aurait donc des caractéristiques plus propices à la consolidation osseuse. - Limiter le nombre de chirurgies : en effet, il est impossible chez l’homme et chez l’animal de simplement greffer de l’os lorsque la perte osseuse est trop importante, cela résulte en une résorption du greffon et donc en un échec de la technique. Implanter une membrane artificielle aux propriétés supérieures permettrait de surseoir au temps de formation de la membrane induite, réduisant la chirurgie en 1 seul temps au lieu de 2. - Retirer le temps de formation de la membrane. Chez le rat, cette membrane se forme en 4 semaines mais chez l’homme celle-ci se forme en minimum 6 semaines (conditions idéales du jeune homme sans comorbidités) voire plusieurs mois (en moyenne 3 mois). Ce temps de formation chez l’homme, très long, limite grandement les capacités de mobilisation du membre concerné et donc la rééducation (avec pour conséquence une perte de musculature, un enraidissement articulaire), la reprise des activités professionnelles et personnelles. Les matériaux employés par les membranes artificielles ont pour objectif de maintenir l’autogreffe viable en 1 seul temps chirurgical, le temps d’obtenir une une consolidation osseuse indépendamment de la formation de la membrane induite et donc des comorbidités des patients et de la gravité de leur affection. - Au final : Limiter le temps d’immobilisation du patient, sa mise en décharge et ses conséquences : Perte musculaire, enraidissement articulaire, limitation des conséquences socio-économiques à savoir une double hospitalisation, souvent d’une durée supérieure à 48-72h, limiter le temps avant retour aux activités professionnelles et personnelles et donc limiter le coût socioéconomique de ces pathologies orthopédiques. - Accélération de la consolidation osseuse : les membranes artificielles, ayant des caractéristiques angiogéniques et ostéogénique ont pour objectif associé d’obtenir une consolidation du defect dans un délai plus rapide.

Procédures

Le nombre d'animaux se base sur une analyse de la littérature sur les mêmes modèles de defect femoral et d'implantation sous-cutanées du rat. La première phase du projet requiert 30 rats, la seconde 110 et la 3ème 230 (au maximum). Les résultats des matériaux étudiés permettront d'ajuster le nombre de rats nécessaires à l'étape 2 puis 3. La première phase consistera en l'implantation sous-cutanée de 4 membranes artificielles dans le dos des rats. Il s'agit de l'unique procédure chirurgicale réalisée par rat. L'objectif principal sera d'évaluer la capacité des matériaux à générer une membrane au propriétés histologiques supérieures à celle produite dans les groupes contrôles. Cette étape est la moins agressive et permettra de diminuer les nuisances animales. Le temps chirurgical est de 30 minutes pour les 4 implantations par rat. Pour la 2ème phase de l'étude, le groupe contrôle comportera 10 rats et 10 groupes de matériaux maximum seront analysés. L'objectif principal sera d'évaluer la capacité des matériaux à produire une membrane aux propriétés histologiques supérieures à celles produites dans le groupe contrôle. Une seule procédure sera réalisée par rat : la création d'un defect osseux fémoral et une stabilisation par plaque vissée (ostéosynthèse). Cela autorisera un appui sur le membre opéré juste après l'intervention. Cette procédure sera réalisée en 1h. Pour la 3ème phase de l'étude, une groupe contrôle de 15 rats sera requis et chaque groupe d'étude comportera 10 rats (10 groups maximum). L'objectif est d'étudier la consolidation en présence des membranes d'interêt comparé à la technique habituelle. L'analyse se fera à 2 points temporels différents. Le groupe contrôle comportera 15 rat car ce groupe requierts 2 chirurgies, augmentant le risque de complications. Cela correspond à ce qui est réalisé chez l'homme (temps de formation de la membrane induite autour du ciment). La greffe osseuse sera réalisée au cours de la 2nd chirurgie, 4 semaines plus tard. Les groupes d'étude ne comporteront qu'une seule chirurgie car il s'agit d'un des objectifs majeurs de ce projet (1 seul temps chirurgical). La greffe osseuse osseuse sera prelevée lors du même temps chirurgical et consistera au prélèvement de 2 à 3 vertèbres de la queue du rat, fragmentées et intégrées au defect osseux fémoral. La chirurgie est réalisée en 1h. Toutes ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) associée à une analgésie multimodale.

Impact sur les animaux

Le projet est pourvoyeur de plusieurs nuisances et effets indésirables qui seront recherchés, anticipés et traités en cas d’apparition. En premier lieu, plusieurs données générales seront analysées notamment : - Douleur de palier modéré à sévère étant donné qu’il s’agit d’une chirurgie avec incision cutanée pour la phase 1 et orthopédique avec réalisation d’un defect osseux pour les phases 2 et 3, la douleur est également prévisible et sera surveillée tout au long de l’étude, particulièrement la 1ère semaine post-opératoire. - Hyperthermie : pouvant être due à une infection post-opératoire, ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Elle sera recherchée par la mesure de la température de l’animal. - Perte de poids : par douleur et/ou difficulté de mobilisation due à la chirurgie sur le membre inférieur de l’animal (phases 2 et 3), entrainant une restriction alimentaire et hydrique, la durée prévisible est 7 jours d’après les modèles retrouvés dans la littérature, les rats retrouvant une mobilité habituelle après ce délai. Elle sera dépistée par la pesée régulière de l’animal. - Anomalie de la cicatrisation cutanée : désunion, saignement, hématome, écoulement suspect (infection), ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Il sera recherché par l’inspection de la cicatrice en période post-opératoire. - Limitation de la mobilité de l’animal dans les suites opératoires : bien que la chirurgie permette la déambulation, une diminution de la mobilité dans les modèles similaires est observée la première semaine post-opératoire (phases 2 et 3 notamment). - Altération de l’état physiologique par stress postopératoire de l’animal : trouble de la posture, du toilettage, dépilation, durée prévisible de 7 jours post-opératoire. Cela sera limité par la médication antalgique associée à ce protocole de recherche.

Devenir

A l’issue de chaque étape de ce protocole il sera réalisé une euthanasie car il est nécessaire de prélever les membrane formées et les fémurs opérés pour analyse comparative. Les méthodes d’euthanasie employées seront le surdosage d’anesthésique, réalisé sur animal préalablement sédaté (anesthésie gazeuse) ou l’inhalation de CO2 par incrémentation progressive.

Remplacement

Le principe de la membrane induite repose sur la réaction de l’organisme à la présence d’un matériau (le ciment en PMMA) sur le lieu de l’implantation, provoquant une réaction tissulaire à corps étranger, vascularisée et riche en facteurs de croissance. Dans notre travail, différents biomatériaux auront pour vocation à remplacer le PMMA pour optimiser cette réaction. Le but étant de former une membrane « induite » optimisée autour du matériau. Il s’agit d’une réaction complexe mêlant à la fois une réaction immunitaire « à corps étranger », une hypervascularisation locale et une stimulation de la formation d'os sur un organisme vivant. Dans la membrane induite, il est retrouvé des éléments cellulaires de ces 3 lignées (immunitaire, vasculaire et osseuse) avec une différenciation qui a lieu sur plusieurs semaines avant d’obtenir une membrane induite mature. Il n’est pas retrouvé dans la littérature de modèle in vitro, ex vivo ou in silico permettant de reproduire l’ensemble des éléments et des étapes menant à la formation de la membrane induite et cela empêche l’analyse in vitro. La seule analyse préalable, permettant de réduire l’agressivité chirurgicale est l’implantation sous-cutanée, suffisante pour analyse la réaction tissulaire immunitaire et la formation de vaisseaux et limitant drastiquement la sévérité du geste sur l’animal. Néanmoins, avant réalisation des études sur animal, des analyses in vitro de cytotoxicité et cytocompatibilité sur les des cellules osseuses, vasculaires et immunitaires seront menées sur les matériaux sélectionnés pour remplacer le PMMA actuel afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’analyse in vivo.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux se base sur une analyse de la littérature étudiant le même modèle animal, sur le même sujet d’étude. 5 études d’implantation sous cutanée dans la littérature ont également été analysées. Le nombre moyen d’animaux par matériau analysé était de 10 pour l’implantation osseuse (10 échantillons par groupe). Pour l’analyse en implantation sous-cutanée, 5 échantillons de membrane induite étaient utilisés en moyenne par groupe. Une seule (defect osseux) étude publiée réalisait une analyse de puissance basée sur les résultats histologiques, avec un niveau de puissance de 80% et retrouvait un nombre requis minimal de 8 rats par groupe. En se basant sur ces différentes études et leurs résultats, un nombre de 10 rats par groupe a été sélectionné. La stratégie de réduction s’applique également dans le design de l’étude puisque pour limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires, la première phase consistera à étudier la formation de la membrane induite après implantation sous-cutanée du matériau et la seconde phase après réalisation du defect osseux. L’implantation sous-cutanée permet également d’implanter plusieurs matériaux (jusque 4) sur un seul rat ce qui n’est pas possible en implantation osseuse. L’ensemble des membranes artificielles aura eu préalable une analyse de cytotoxicité et de cytocompatibilité in vitro. Ces analyses ne permettent pas de reproduire le procédé in vivo de formation de la membrane induite qui intègre simultanément des phénomènes immunitaires, vasculaires et osseux. Cependant elle permettra de vérifier sur chaque lignée l’absence de cytotoxicité limitant l’implantation chez l’animal. De même, ce projet est réparti en 3 phases car à l’issue de chaque phase, des résultats inférieurs aux groupes contrôles entraîneraient le retrait du matériau lors des étapes suivantes de l’étude. Cela permettra de sélectionner les matériaux ayant les meilleurs résultats à l’issue de chaque étape tout en limitant l’agressivité chirurgicale des procédures.

Raffinement

En premier lieu les conditions de vie des animaux respecteront un cycle de 12h jour/nuit en alternance. Le milieu de vie sera dans une salle à flux d’air contrôlé, avec une température contrôlée (21°C). Les animaux disposeront d’un accès à l’eau et à l’alimentation à volonté, selon des aliments standards (pas de modifications du régime alimentaire habituel). Le milieu de vie sera enrichi et consistera en un sol dur comportant une litière, disposant de moyens d’exploration et de cachettes (tunnels en cartons par exemple, ou petits dômes en papier maché etc.). Des éléments permettant la nidification seront présents également, (cylindre de coton, carré de cellulose, rondelles de peuplier compressé), enfin des éléments permettant aux rats de ronger seront présent (morceaux de bois). Avant l’intervention, les rats seront placés en cages, avec 3-4 rats par cages afin de respecter leur comportement social. Cependant, après la chirurgie et devant les conditions diminuées de déambulation et de douleur post-opératoire (notamment phases 2 et 3), ils seront placés en cage seuls, pour une durée minimale mais pouvant aller jusqu’à 7 jours. Il s’agit du temps requis avant reprise d’une déambulation habituelle et sans douleur à l’issue de la procédure. Plusieurs éléments seront analysés pour contrôler le bien-être des animaux à savoir : le poids avec mesure bihebdomadaire pendant 7 jours post-opératoire puis une fois par semaine, la température à la recherche d’une hyperthermie, mesurée tous les jours en post-opératoire (recherche d’une infection post-opératoire). Une analyse de la plaie post-opératoire (désunion, saignement, hématome) sera quotidienne les 7 premiers jours postopératoire. Une évaluation quotidienne de la capacité de déambulation de l’animal qui doit progressivement devenir normale en 7 jours pour les phases 2 et 3. Enfin une analyse comportementale sera réalisée notamment la posture, la position des oreilles, l’enfoncement des yeux mais aussi si un manque de toilettage est constaté (à l’aide de l’échelle d’évaluation des expressions faciales du rats, édité par la NC3Rs). Les sources d’eau et de nourriture seront placés à des lieux accessibles à proximité de la zone de repos et stabilisés pour qu’ils ne soient pas renversés facilement.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est le rat. Il s’agit dans la littérature de l’espèce animale la plus utilisée. Dans une revue systématique publié en 2022, 70% (28/40) des études animales évaluant la membrane induite étaient réalisées sur un modèle de rat. Sur ces études sélectionnées et utilisant un defect fémoral (24 études), 20 étaient réalisées sur le rat. Le choix de cette espèce permet donc d’obtenir des résultats comparables avec la littérature. En outre, l'élevage de ces animaux est plus rapide et plus facile, avec des coûts considérablement réduits. Les rats seront à un stade adulte de leur développement, correspondant à 10 semaines de vie avec un poids de 400-450 gr. Cela correspond à l’âge d’un humain adulte d’environ 18 ans. En effet, la technique de la membrane induite est le plus fréquemment utilisée chez le jeune adulte dans le cadre d’accidents à haute cinétique de la voie publique (moto, voiture etc.). De plus, l’utilisation des moyens d’ostéosynthèse chez des rats non matures et plus jeunes expose à des difficultés techniques matérielles (moyen d’ostéosynthèse non adapté à la taille des fémurs de rats plus jeunes).