Rongeurs

2 190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure, porte des fibres optiques sur la tête pendant les enregistrements et passe une semaine seule en cage calorimétrique, cinq jours d'adaptation puis deux jours de mesure. Les autres reçoivent des injections intrapéritonéales, des tests de métabolisme du glucose de quatre heures et des prélèvements de sang sur animal vigile, avec une biopsie de la queue pour les lignées transgéniques. Les retombées annoncées contre l'obésité restent au conditionnel et à long terme, alors que la mise à mort de toutes les souris pour prélever des tissus est déjà programmée.

Objectifs

Le contrôle de la balance énergétique par l'hypothalamus est la résultante d'un équilibre entre l'apport et la dépense énergétique. Cette régulation repose sur la capacité du cerveau à intégrer les signaux provenant des organes périphériques, indiquant les états nutritionnels et énergétiques de l'organisme et à établir des réponses appropriées. Cependant, l'altération de cet équilibre, due à notre environnement alimentaire moderne, peut conduire au développement de troubles métaboliques associés au surpoids et à l'obésité. Malgré les avancées et les progrès accomplis, nous continuons à rechercher des stratégies innovantes et plus efficaces pour lutter contre cette pathologie. Les hormones jouent un rôle majeur dans le maintien de nos fonctions biologiques et régulent de manière critique le développement du cerveau. Cependant, malgré l’importance grandissante donnée aux hormones dans la régulation des fonctions du cerveau, leur mode d’action reste encore largement inconnu. De plus, de nombreuses hormones n’ont pour le moment pas encore été étudiés pour leur effet sur le cerveau. C’est en particulier le cas d’une hormone produite par les glandes parathyroïdiennes : la parathormone ou l’hormone parathyroïdienne. L’hormone parathyroïdienne, sécrétée par la glande parathyroïde est connue pour être impliquée de façon majeure dans l’intégrité des os. Cependant, son rôle dans le contrôle du métabolisme et de la prise alimentaire est très peu connu. Notre projet s’inscrit donc plus précisément dans l’identification et la caractérisation du mode d’action de cette hormone et l’implication de cette dernière dans le contrôle du comportement alimentaire à travers des études réalisées sur des modèles animaux. La règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux (réutilisation des animaux dans différentes procédures n'entrainant pas de douleur ou de stress) et en raffinant les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux.

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela constitue, de ce fait, un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Cependant, et malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. Ce projet vise ainsi à établir un nouveau cadre conceptuel impliquant le rôle du système PTH/PTH1R dans la régulation des processus métaboliques induits par les neurones AgRP. Cette nouvelle régulation de l'équilibre énergétique par le cerveau offre un cadre idéal pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques qui peuvent prévenir les défauts de répartition des nutriments induits par l'obésité. Ce projet nous permettra d'identifier des rôles encore insoupçonnés du PTH1R hypothalamique et de son ligand PTH dans la régulation intégrée du métabolisme du corps entier. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées par ce projet pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).

Procédures

Pour 5 lots à une chirurgie (environ 1h) (classe modérée), puis après une période de repos, les animaux seront soumis à des tests de comportements et/ou de métabolisme du glucose (environ 4h pour chaque test) (classe légère). Pour les études calorimétriques réalisées sur 2 lots d'animaux, environ 1 semaine de procédure est envisagée (environ 5 jours pour permettre aux animaux de s'adapter à l'individualisation et environ 2 jours pour l'enregistrement) (classe légère). Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots (classe légère). -pour 4 lots, les animaux seront soumis à des injections de différents modulateurs par voie intrapéritonéale et à des tests de comportement et/ou de métabolisme du glucose (environ 4h pour chaque test) (classe légère). Pour les études calorimétriques réalisées sur 1 lot d'animaux, environ 1 semaine de procédure est envisagée (environ 5 jours pour permettre aux animaux de s'adapter à l'individualisation et environ 2 jours pour l'enregistrement) (classe légère). Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront fait sur un lot (classe légère). Pour 1 lot de souris à une chirurgie (classe modérée), les souris vont porter des fibres optiques sur la tête pendant les enregistrements ce qui peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement (classe modérée). Pour les souris transgéniques, une biopsie à la queue sera réalisée vers 6 jours (douleur légère de courte durée).

Impact sur les animaux

Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements, nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles).

Raffinement

Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, bâtons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.

Pour comprendre le rôle de gènes responsables chez l'humain d'une malformation cérébrale appelée hétérotopie, 4 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 171 d'entre elles et modéré pour 1 981. Des femelles gestantes sont opérées quarante-cinq minutes sous anesthésie pour une électroporation in utero, des juvéniles et des adultes subissent une chirurgie de dix minutes sans jamais se réveiller, et des femelles gestantes éveillées reçoivent des injections intrapéritonéales. Le porteur présente l'électroporation comme un moyen de réduire le nombre d'animaux par rapport à la création de lignées transgéniques, tout en portant l'effectif du projet à 4 152 individus. Aucune de ces souris ne peut entrer dans un autre protocole après les injections reçues, et toutes sont tuées pour les analyses histologiques.

Objectifs

Le développement du système nerveux comprend des phases de prolifération et de migration cellulaires et des phases de différenciation au cours desquelles les neurones établissent des connexions entre eux. Il est important d'identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent ces processus pour améliorer notre compréhension du développement normal et physiopathologique du cerveau. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les rôles de gènes dont les mutations sont responsables chez l’homme de malformation d’une région du cerveau appelée « hétérotopie ». Notre stratégie repose sur l’étude de souris génétiquement modifiées. Nous avons d’abord étudié une lignée porteuse d’une mutation spontanée responsable d’hétérotopie comme celle observée chez l’homme. Nous avons plus récemment créé d'autres lignées permettant de contrôler l’inactivation du gène spécifiquement dans le temps et l’espace. Ainsi, nous pouvons générer des souris dont la mutation n’est exprimée que pendant la phase de prolifération, alors que chez d’autres souris, la mutation ne sera exprimée que pendant la phase de différenciation des neurones excitateurs. Ces inactivations spécifiques vont nous permettre de décortiquer les mécanismes responsables de l’hétérotopie. En analysant les capacités de prolifération et de différenciation de neurones par des études d'injection de produits et d’immunohistochimie, nous identifierons le défaut primaire lié à une perturbation de ces gènes. L’utilisation de protéines fluorescentes spécifiques de certaines structures subcellulaires nous permettra de préciser et de localiser les anomalies par des techniques dynamiques de videomicroscopie. Nous testerons l’action d’agents pharmacologiques pour pallier les défauts de prolifération, de différentiation et de migration observés aux stades embryonnaires. Nous ferons ensuite des essais de thérapie génique par une approche de chirurgie par électroporation in utero visant à traiter les souris mutantes et donc à mieux comprendre les fonctions des gènes électroporés pendant le développement cortical.

Bénéfices attendus

Les malformations corticales sont des maladies rares (incidence 1: 100000) pour lesquelles les mécanismes pathogéniques et physiopathologiques sont peu étudiés. Elles sont associées à des retards de développement et des déficits intellectuels sévères. S’agissant d’anomalies de neurodéveloppement, les anomalies apparaissent in utéro. L’étude de malformations induites par des mutations génétiques permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeu pendant le développement lors de la prolifération, la migration et la différenciation des cellules du système nerveux central. Les mutations génétiques sont très informatives car elles peuvent être modélisées chez l’animal, permettant une vision du développement physiologique in vivo. Les processus sont pour la plupart conservés entre l’Homme et les rongeurs. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en inactivant l’expression d’un gène impliqué dans les cellules en division et les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires, subcellulaires et moléculaires clés qui sont pertinents pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Femelles gestantes vigiles : une injection d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale (1 minute). Juvéniles et adultes : chirurgie sous anesthésie et analgésie, sans réveil (durée : 10 minutes). Femelles gestantes: chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur) pré et post opératoire.

Impact sur les animaux

L’injection intrapéritonéale implique une douleur légère au point de piqûre ainsi qu’une contention et donc un stress momentané. Un risque mineur de péritonite est possible. Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. Le niveau de douleur sera estimé par rapport à une échelle de grimace et l’observation des difficultés de mouvements. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.

Remplacement

Une partie de notre projet est réalisé in vitro (biochimie et biologie cellulaire). Nous utilisons également la culture cellulaire : transfections de lignées cellulaires, afin de limiter le nombre d’animaux. Mais pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie impliquant des réseaux de neurones à différentes échelles, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, nous avons accès à un modèle animal qui mime la pathologie humaine, qui est une opportunité pour étudier les causes de la maladie. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le système nerveux central et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier in situ les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes.

Réduction

Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de fondateurs. Nous comparerons également des souris de type sauvage et mutantes issues de la même portée, avec une répartition mendélienne. De même, tous les animaux générés (femelles et mâles) sont étudiés. Nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les lignées de souris mutantes représentent des modèles de déficits intellectuels, pour lesquels il est important de continuer la caractérisation afin d’éclaircir la physiopathologie. Pour cela, nous analyserons l’anatomie et la morphologie du système nerveux centrale de ces souris, par des méthodes d’histologie, d’immunohistochimie et de microscopie. L’objectif est d’identifier et d’étudier les anomalies associées aux inactivations de gènes d’intérêt. Des travaux précédents nous ont permis de valider l’analyse des régions cérébrales considérées avec une excellente reproductibilité et donc de réduire le nombre d’animaux requis. L’inactivation de gènes ou l'expression de protéines (par exemple, protéines fluorescentes rapportrices) de manière locale et aigüe chez la souris, in utero ou dans le cerveau postnatal, a l’avantage d’être rapide et de réduire le nombre de souris nécessaire par comparaison aux méthodes classiques de génération de lignées de souris transgéniques. Cette approche est donc la méthode de choix quand nous testons la fonction de nouveaux gènes de pathologies humaines. Grâce à cette méthode nous éclaircirons les voies biochimiques et les mécanismes subcellulaires essentielles pour le développement cortical. L’étude des mécanismes physiopathologiques liés aux déficits des différents gènes d'intérêt, et réalisée par les approches ci-dessus, est nécessaire à la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques. Des approches par chirurgie seront aussi réalisées afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à l'étude. Le projet impliquera l'utilisation de 4152 animaux.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être des animaux, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les souris sont stabulées en portoir ventilés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température, de l’hygrométrie et des pressions, un cycle nycthéméral de 12 :12 et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau, un autoclave et un sas chimique comme barrière, comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d'une maison. Des observations du bien-être sont réalisées 1 fois/jour. Les souriceaux et jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. Les souris sont placées dans les cages avec la litière chirurgicale entre 1 et 2 jours avant la chirurgie afin d’avoir le temps de s’y habituer. L’utilisation de cette litière est particulièrement importante afin d’éviter l’infection de la suture des souris qui se situe au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, avec une anesthésie générale par ventilation et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré et post-opératoire, ainsi qu’une analgésie locale sur le site. Un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux font l’objet d’une attention post-chirurgicale particulière (surveillance et traitement des plaies). En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture...), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Mise à disposition d’un aliment enrichi et d’eau directement dans la cage pour animaux apathiques. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.

Choix des espèces

Nous comparerons des souris contrôles et mutantes issues de la même portée. Le développement du cerveau murin est bien caractérisé, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. Le développement embryonnaire du système nerveux centrale de la souris est extrêmement proche de celui de l’homme, ce qui en fait un parfait modèle d’étude. L’utilisation de lignées de souris, avec des croisements en retour réguliers permet d’éviter la dérive génétique, une meilleure reproductibilité des résultats et réduit le nombre d’animaux utilisés. La technique d’électroporation in utero dans le cerveau a été mise au point chez le rat et la souris, c’est une méthode de choix efficace pour analyser le rôle des gènes pendant le développement. Cette procédure est simple et rapide, donne un bon rendement, avec une cytotoxicité faible et implique beaucoup moins d’animaux adultes qu’une lignée transgénique. Pour chaque procédure, des souris adultes sont utilisées pour l’élevage et le maintien des lignées. Plusieurs stades seront ensuite analysés : nous nous intéressons au développement cortical, comprenant les étapes de la prolifération et migration (stades embryonnaires de 12,5 à 18,5 jours post-fécondation), ainsi qu'à l'organisation des couches corticales (stades juvéniles 1 et 10 jours post-natal et adulte à 90 jours post-natal). Ces stades seront nécessaires afin d'apprécier l'impact des mutations sur le développement cortical et la permanence du phénotype.

5 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 520 d'entre elles et modéré pour 3 240. Des femelles gestantes subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, le temps d'injecter un produit dans le cerveau de chaque embryon, et les souriceaux sont génotypés par prélèvement de queue à dix jours. Le porteur annonce l'identification de cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives, sans que le RNT précise laquelle il étudie. Les reproductrices sont tuées à six mois et les reproducteurs à huit, lorsque le porteur observe une baisse de leur reproduction.

Objectifs

Ce projet vise à étudier le développement cérébral dans la maladie neurodégénératives. Nous évaluerons les conséquences de cette maladie sur la génération des différents types cellulaires du cortex en développement, ainsi que les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place dans ces modèles pathologiques pour pallier ces effets. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces. Cette étude permettra également d’identifier des cibles thérapeutiques pour retarder ou atténuer les symptômes associés à la neurodégénérescence .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus qui découlent de ce projet sont les découvertes de mécanismes clés dans les maladies neurodégénérative, notamment l’identification de cibles thérapeutiques possibles pour la prévention et le traitement précoce de la pathologie.

Procédures

Lors de la procédure d’élevage, un prélèvement inférieur à 1mm de l’extrémité de la queue sera réalisé sur les petits âgés de 10 jours. Cet acte se fera une seule fois sur animal vigile et durera moins de 1 minute par animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (30-45minutes) et anti-douleurs afin de réaliser une injection intracérébrale dans le cerveau de chaque embryon. Tous les animaux (femelles adultes, embryons, souriceaux) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin des procédures pour collecter des échantillons pour réaliser nos analyses.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de 1 mmm de l’extrémité de la queue pour génotypage peut générer une légère et brève douleur chez l’animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie et analgésie avec les risques inhérents à ce type de geste (dépression cardio-respiratoire, hypothermie, hémorragies, infections, cicatrisation) qui seront maitrisés au maximum par les moyens et le suivi mis en place. La mutation de l’animal peut générer des souffrances à partir de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et pertes de poids, nous ne maintiendrons pas les animaux à des stades aussi avancés.

Devenir

Tous les animaux reproducteurs ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés à 6 mois pour le femelle et 8 mois pour les mâles, lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. Les femelles gestantes seront euthanasiées car elles ne pourront pas être réutilisées suite à leur chirurgie. Tous les embryons ayant reçu l’injection intracérébrale seront euthanasiés à différents stades pour les études histologiques.

Remplacement

L’étude du cerveau en développement nécessite le recours au modèle souris car il permet de préserver l’environnement du développement utérin (impliquant différents types cellulaires qui interagissent entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire). L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles de souris. Nous utiliserons des cultures cellulaires afin de valider les outils moléculaires qui seront ensuite injectés chez l’animal. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude

Réduction

Le nombre total d’animaux est de 5760. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en prenant en compte les lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à l'étude et en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés.

Raffinement

Les cages sont maintenues en portoirs ventilées avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. La température et d’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour et se met en place progressivement. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères et l’isolement est évité au maximum. Les cages sont enrichies d’un nid et de bâtons en bois. Pré et post chirurgie seront enrichies d’une maison et d’un nid en coton afin d’améliorer le bien-être de la mère. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel qualifié des animaleries. Un suivi renforcé sera mis en place à la suite de la chirurgie et jusqu’à la mise bas. Les procédures chirurgicales seront raffinées grâce à un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié à une laparotomie sur une femelle gestante. Le matériel et la préparation du site chirurgical doivent limiter le risque d’infection, le risque hypothermique est limité par l’utilisation de tapis chauffant thermorégulé, d’une cage de réveil thermostatée. Le risque hémorragique sera contrôlé par le choix de la voie d’abord, une manipulation douce des organes et un contrôle de l’hémostase au cours de la chirurgie. Les animaux seront réhydratés et les organes exposés irrigués régulièrement le temps de la chirurgie. La profondeur de l’anesthésie sera vérifiée et adaptée aux gestes à réaliser, la respiration et les réflexes seront appréciés régulièrement. De l’eau sous forme d’hydrogel ainsi que de la nourriture facile d’accès dans la cage seront également fournis à l’animal. Les chirurgies seront réalisées le matin afin de pouvoir observer les animaux le soir et administrer les médicaments nécessaires (analgésie). Après les chirurgies les animaux seront ensuite examinés une fois par jours pendant deux jours. Une attention particulière sera donnée à la surveillance d’éventuelles infections ou à une mauvaise cicatrisation de la laparotomie. Le points limites définis avant la chirurgie seront surveillés : une échelle d’évaluation de la douleur sera utilisée, seront également surveillés l’amaigrissement et des signes de prostration ou d’agitation anormales Les animaux seront observés et toute anomalie sera rapidement prise en charge et confrontée aux points limites définis pour les respecter et éviter toute souffrance. Le génotypage, réalisé par des personnes compétentes dans un endroit calme et dédié, est réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulations.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthodes expérimentales in vitro pour étudier le développement et la complexité du cortex. Ces analyses nécessitent l'utilisation de souris pour trois raisons : le comportement des neurones corticaux diffère selon leur environnement ; ils migrent et se différencient différemment in vitro et in vivo ; la mise en place de l'organisation laminaire du cortex, ainsi que les connexions neuronales formées, ne peuvent être reproduites en culture cellulaire ; la complexité des interactions entre les différents types cellulaires du cortex au long de la vie ne peut être étudiée qu’in vivo. Ainsi les modèles in vitro sont insuffisants voire inexistants pour étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux dans le cortex. Sachant que le but de ce projet est de suivre le développement de ces animaux, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : entre le jour de la naissance et une semaine, ( phase de croissance, maturation en cours) puis au stade de 21 jours, lorsque le cortex est mature.

Les souris de ce projet sont invalidées pour un récepteur de la voie EGF, ce qui doit provoquer chez elles une maladie des valves cardiaques. 40 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la moitié et modéré pour l'autre. Elles subissent deux anesthésies gazeuses de trente minutes pour des échographies cardiaques, et peuvent recevoir des diurétiques en cas d'œdème pulmonaire. Le porteur indique que ce modèle n'a jamais été caractérisé, qu'il ignore la vitesse d'évolution de la maladie et son impact sur le bien-être des animaux non-humains concernés, et que l'anesthésie de souris au cœur défaillant augmente le risque de mort.

Objectifs

Les maladies des valves cardiaques, appelées aussi valvulopathies, sont le plus souvent provoquées par l’usure (maladies dites dégénératives). C’est pourquoi le risque de développer des valvulopathies augmente avec l’âge. Il existe cependant d’autres causes comme les anomalies congénitales. Les valves jouent le rôle de clapets, s'ouvrant et se fermant alternativement au gré des pressions régnant dans les cavités, empêchant le reflux du sang flux sanguin. Ces structures sont donc soumises au flux sanguin qui peut probablement participer à l’apparition progressive du dysfonctionnement des valves cardiaques. Nous avons identifié une voie de signalisation qui conduit à une valvulopathie. Notre projet a pour objectif d’étudier la fonction valvulaire d’un modèle invalidant le récepteur de cette voie de signalisation pour mieux comprendre la physiopathologie des valvulopathies et développer éventuellement une approche thérapeutique ciblée.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet d’augmenter les connaissances sur la physiopathologie des valvulopathies associées à la déficience de la voie EGF et ainsi améliorer au mieux la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

A l'âge de 3 semaines, les souris seront identifées à l'aide d'un poinçon à l'oreille. Les animaux seront soumis à deux anesthésies générales gazeuses durant environ 30 minutes afin de réaliser une échographie cardiaque. En cas d'apparition de signes d'oedème pulmonaire, les animaux pourraient recevoir un traitement diurétique par injection intrapéritonéale (2 fois par jour, maximum 3 jours). En cas de signe de douleur, un traitement anti inflammatoire pourrait être proposé par injection sous cutanée (une fois par jour, maximum 3 jours).

Impact sur les animaux

Les animaux devraient développer une valvulopathie dont nous ne connaissons pas les vitesses d’évolution ou l’impact sur le bien-être. Si les souris développent des symptômes proches de ceux identifiés chez l’homme, elles pourraient développer une insuffisance cardiaque (avec des oedèmes dont des oedèmes pulmonaires associés à des difficultés respiratoires, une fatigabilité et des difficultés à se déplacer), des troubles du rythme et des morts subites. Les points limites mis en place permettront de limiter au strict miminum la durée de ces effets. Les échographies réalisées pour le suivi de la fonction cardiaque seront réalisées sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Cependant, les anesthésies pourront être réalisées sur des animaux dont la fonction cardiaque n'est pas optimale. Le risque de mort inhérent à toute anesthésie pourrait être augmenté chez ces animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse d'organes.

Remplacement

Les premières étapes de notre projet ont consisté à étudier l’effet de la modification de l’activation de la voie EGF sur des cultures primaires de cellules valvulaires issues de la valve aortique de rat. Malheureusement, le développement de la valvulopathie ne peut être modélisé avec des cultures cellulaires. Afin de comprendre l’impact du dysfonctionnement de la voie EGF sur la fonction valvulaire, nous devons maintenant passer à l’analyse d’un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons différentes approches : - étude longitudinale : nous avons prévu de réaliser un suivi par échocardiographie des animaux afin d’analyser leur phénotype et son évolution au fil du temps (âges de 1 et 3 mois) sans sacrifier les animaux pour lesquels ce n’est pas nécessaire. - approche statistique : nous analyserons les données (morphologie et fonction). En fonction de ces paramètres, il nous faut au moins 17 souris par groupe. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15%, nous arrivons à un total de 20 souris par groupe.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage ce qui permet de réduire la douleur et le stress des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe. L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention à faible stress (préhension avec les mains en coupelle et avec tunnels). Le modèle que nous allons utiliser n’a jamais été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations très poussée des animaux et identifier de la manière la plus précoce l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la structure chargée du bien-être animal de notre établissement. Au cours du projet, des échocardiographies seront réalisées sur les souris. Bien que cette technique d’imagerie soit indolore, elle nécessite que l’animal soit immobilisé. Afin de réduire le stress et limiter la contention des souris, l’échographie sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction du cœur des souris sont proches de celles du cœur humain. Les souris génétiquement modifiées sont de bons modèles d’étude des atteintes des cardiopathies, de leurs conséquences hémodynamiques et de leurs causes génétiques. Afin de réaliser une cinétique d’apparition de dysfonctionnement des valves cardiaques, le souris seront étudiées aux âges de 1 et 3 mois, correspondant aux stades clés du développement post natal des valves.

Deux chirurgies intracérébrales par animal, la première sur des nouveau-nés d'un jour anesthésiés par immersion dans la glace, la seconde de quarante-cinq minutes à l'âge adulte pour implanter une fibre optique. 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour récupérer leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 320. Le porteur note que le refroidissement rapide de la peau est connu pour être douloureux chez l'homme, et enveloppe donc les souriceaux dans un gant de latex avant de les poser sur la glace. Le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre comment les odeurs facilitent la mémorisation de souvenirs plaisants.

Objectifs

Marcel Proust, dans son livre « Du Côté de Chez Swann » (1919), décrit l'odeur d'une madeleine trempée dans du thé de tilleul comme déclenchant une joie immense, le ramenant au temps des après-midi passés auprès de sa tante. Nos souvenirs sont en effet associés à diverses informations sensorielles, notamment olfactives. Les souvenirs évoqués par les odeurs ont souvent été décrits dans la littérature comme ayant des caractéristiques très spécifiques qui les différencient des autres mémoires sensorielles. Ils ont notamment été rapportés comme étant plus anciens et ayant une charge émotionnelle, notamment positive, plus importante. Cependant, les bases neurales de cette mémoire olfactive formée à l'enfance restent aujourd’hui méconnues. Dans ce contexte, l'objectif est de réaliser une étude longitudinale visant à modéliser un souvenir olfactif précoce chez la souris. Ainsi l’étude consiste à mettre en mémoire une information olfactive durant la période infantile et à tester son rappel à l’âge adulte (ce qui n’est pas envisageable sur le modèle humain). Ce modèle permettra également d’étudier les bases neurales de la mémoire olfactive infantile à l'âge adulte avec un intérêt particulier pour le rôle des neurones nés en post-natal dans le bulbe olfactif, la première structure cérébrale en charge du traitement de l’information olfactive (ce qui est à nouveau inenvisageable sur le modèle humain). Ce projet permettra de mieux comprendre comment ces odeurs d’enfance ont cette faculté de donner ces caractéristiques mnésiques et émotionnelles si particulières à nos souvenirs. Ce projet de recherche fondamental sera mené sur 800 souris sur une période de 5 ans. La signature neurale du souvenir olfactif formé à l’enfance sera étudiée chez l’adulte, principalement post-mortem à l’échelle cellulaire et moléculaire. Nous modulerons également par optogénétique (outil permettant d'activer ou d'inhiber des neurones d'intérêts à l'aide d'une stimulation lumineuse) les neurones du bulbe olfactif nés en post-natal, pour étudier leur rôle dans le souvenir olfactif. Enfin, grâce à la photométrie de fibre optique (technique consistant à enregistrer un signal optique, émis ici par les neurones cibles), nous étudierons l’activité en temps réel, en réponse à l’odeur mise en mémoire, de structures impliquées dans le souvenir olfactif.

Bénéfices attendus

Nous étudions les bases neurales des souvenirs olfactifs de l’enfance. D’un point de vue fondamental, ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes qui permettent aux odeurs de faciliter la mise en mémoire à long-terme de souvenirs émotionnellement intenses et plaisants.

Procédures

Nous procèderons à des injections cérébrales de vecteurs viraux (la durée de la chirurgie est d'environ 10 minutes par souris, avec un temps d'injection virale de 3 à 6 secondes) et à la mise en place de fibres optiques (la durée de la chirurgie est d'environ 45 minutes par souris) dans la même structure. L'approche utilisée permettra d’étudier le lien causal entre activité de structures cérébrales et comportement, en fonction de la valeur hédonique des odeurs ou du genre de l’animal. L’ensemble de cette procédure chirurgicale comprend 2 chirurgies intracérébrales, avec une l’injection virale chez le nouveau-né et une implantation de fibre optique à l’âge adulte. La phase de récupération et la phase de comportement s’étend sur 3 mois maximum. Les tests comportementaux corresponderont à des mesures de temps d'investigation et de locomotion en présence d'odeurs, pour étudier leur mémorisation, sur de courtes durées (1 à 5 minutes). Les animaux seront également soumis à une injection intrapéritonéale de marqueurs de prolifération aux jours postnataux (P) P1 et P7, respectivement, pour marquer les nouveaux neurones.

Impact sur les animaux

Les animaux implantés (procédure chirurgicale) étant remis entre congénères (pour éviter l'isolement des animaux), ils peuvent être susceptibles de se blesser. Des dégradations du matériel d’implantation et donc de la zone neurale correspondante peuvent aussi être engendrées. Les chirurgies peuvent également induire des effets secondaires indésirables (perte de poids, douleurs, stress, apathie, stéréotypie etc). Enfin, la manipulation des animaux ainsi que les injections intrapéritonéales peuvent induire chez les animaux un stress léger. Une surveillance adaptée sera mise en place à l’aide d’une grille de score évaluant l’état physiologique et comportemental de l’animal, définissant des points limites connus et maitrisés.

Devenir

Tous les animaux utilisés selon cette procédure seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et contrôler les injections ou analyser l’activité neuronale.

Remplacement

L’étude de processus physiologiques et plus particulièrement l’étude des bases neurales du comportement nécessite l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux (15 souris minimum par groupe), pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats (ANOVA, t-test, test de corrélation). Ces prévisions sont basées sur les précédentes études de l’équipe et les données de la littérature. De plus, pour assurer de la fiabilité statistique nous randomiserons les animaux et les groupes, et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous corrélerons (grâce à des statistiques adaptées) le comportement et les paramètres cellulaires sur les mêmes animaux.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée, à l’aide d’une grille d’évaluation, pour détecter les points limites de souffrance. Pour réduire le risque d’un impact physique et psychique, une semaine de repos sera effectuée à l’arrivée des animaux avant mise en reproduction. Une sciure avec copeaux longs sera utilisée (avec ajout de coton pour les mères et les petits). Les animaux seront maintenus en groupe (de 5 maximum). Les cages sont transparentes pour favoriser la communication. Procédure chirurgicale chez le nouveau-né (jour postnatal (P) P1) : les souris seront anesthésiées par hypothermie (la température centrale du corps des rongeurs restant ici bien inférieure à celle nécessaire pour éprouver de la douleur). Après chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante jusqu’à leur réveil (~10 minutes) afin de limiter le risque de rejet des nouveau-nés par la mère. Cette méthode d’anesthésie est préférable à d’autres méthodes (inhalation de gaz), du fait de la capacité des nouveaux-nés à stopper leur respiration. Puisque le refroidissement rapide de la peau non protégée est connu pour être douloureux chez l’homme, nous envelopperons les souris dans une protection (gant de latex) avant de les placer dans la glace. Procédure chirurgicale à l’âge adulte : les souris seront placées sous anesthésie générale à l’aide d’un analgésique approprié. Une injection d’antalgique sera pratiquée avant et après chirurgie, réitérée ensuite en fonction de l’état de l’animal. En attendant un réveil partiel, les animaux seront placés sous une lampe chauffante. Le test de pli de peau sera pratiqué pour vérifier le niveau d’hydratation (une injection de NaCl sera faite si besoin). Les animaux seront transportés via des cages à couvercles filtrants jusqu’à une armoire ventilée en secteur conventionnel, pour y être placés dans une cage propre avec nourriture et eau à volonté. Leur poids sera contrôlé pendant les 3j suivants. L'état général sera évalué régulièrement pendant la phase de récupération (3 semaines).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car son comportement et l’importance écologique de la fonction olfactive de cette espèce sont particulièrement adaptés à la question de recherche qui nous intéresse. De plus le système olfactif humain et de la souris présentent de grandes similarités, faisant de cette espèce un très bon modèle pour étudier le système olfactif. Enfin, l’ensemble des données antérieures a été obtenu chez cette espèce, elle est classiquement utilisée dans ce type d’étude, et nos données pourront être comparées à celles de la littérature. La période de formation de la mémoire olfactive prend place du jour postnatal (P) P23 à P33, correspondant au stade juvénile chez la souris. C’est en effet cette période qui est la cible de la plus grande partie des souvenirs olfactifs chez l’Homme (c'est-à-dire avant 10 ans). Les tests comportementaux, visant à étudier la mémoire et la préférence de l’odeur d’enfance, seront réalisés aux stades jeune adulte (2 mois), adulte (6 mois), et adulte avancé (1 an), afin d’étudier l’acquisition ainsi que la rétention à long terme du souvenir olfactif. La maturité sexuelle, qui se situe 8 semaines chez les femelles et 10 chez les mâles, est atteinte.