Rongeurs

Toutes tuées lors d'un prélèvement d'organe, à l'atteinte d'un point limite ou en fin d'étude, 6 750 souris reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intraveineuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite un composé thérapeutique jusqu'à une fois par jour pendant dix-huit semaines, une molécule déplétante un jour sur deux, et jusqu'à deux micro-prélèvements de sang par jour. Parmi les effets qu'il qualifie lui-même de sévères, le porteur cite une paralysie, une perte de poids et une modification du comportement liées à la greffe, alors que l'ensemble des procédures est déclaré en souffrance modérée. Ce prestataire prévoit 75 études en cinq ans et affirme qu'il est "indispensable" de recréer la pathologie chez la souris pour évaluer les composés.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer l’efficacité d’un composé à visée thérapeutique seul ou en combinaison chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur greffée en intraveineuse. Les doses et les fréquences de traitement seront déterminées grâce aux études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de toxicité préalablement réalisées et/ou en se basant sur les données de la littérature et notre expérience.

Bénéfices attendus

Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur greffée en intraveineuse pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales (1 injection) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour pendant 18 semaines maximum) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 1 jour sur 2 pendant 18 semaines maximum) ; Microprélèvement de sang (maximum 2 fois /jour). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (4 fois maximum) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante maximum 2 fois /semaine pendant 18 semaines maximum) ; Prélèvement de sang terminal.

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s) et de la molécule déplétante/neutralisante. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, paralysie. Possibilité d’effets indésirables sévères liés au(x) composé(s) thérapeutique(s) : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.

Remplacement

Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 75 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. L’apparence/comportement de l’animal ainsi que la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé injecté pourra induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement) sera suivi lors des mesures de poids (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.

Toutes tuées, par prélèvement d'organes, à l'atteinte d'un point limite ou en fin d'étude, 51 050 souris portent une tumeur greffée sous la peau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un composé jusqu'à une fois par jour pendant seize semaines, une molécule déplétante un jour sur deux, et jusqu'à deux micro-prélèvements de sang par jour. Le porteur annonce comme effets possiblement sévères une perte de poids, une modification du comportement, une nécrose, une ulcération ou une inflammation de la tumeur, tout en classant l'ensemble des procédures en souffrance modérée. Ce prestataire prévoit un maximum de 250 études sur cinq ans et affirme qu'il est "indispensable" de recréer la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer l’efficacité d’un composé à visée thérapeutique seul ou en combinaison chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur greffée en sous-cutanée. Les doses et les fréquences de traitement seront déterminées grâce aux études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de toxicité préalablement réalisées et/ou en se basant sur les données de la littérature et notre expérience.

Bénéfices attendus

Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur greffée en sous-cutanée pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.

Procédures

• Sur animal vigile : Greffe de cellules tumorales (1 à 2 injections) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour pendant 16 semaines maximum) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 1 jour sur 2 pendant 16 semaines maximum) ; Microprélèvement de sang (maximum 2 fois /jour). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang (maximum 4 fois) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 16 semaines maximum) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 2 fois /semaine pendant 16 semaines maximum) ; Prélèvement de sang terminal.

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s). Stress et douleur légère lors de l’administration de la molécule déplétante/neutralisante. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur. Possibilité d’effets indésirables sévères liés au(x) composé(s) thérapeutique(s) : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.

Remplacement

Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. Les conditions et le taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester sont également déterminés dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires dans les procédures impliquant une greffe tumorale. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10-15 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvements de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 250 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. L’apparence/comportement de l’animal, l’aspect et le volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le composé injecté pourra induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. Dans ce cas, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (minimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.

Toutes tuées pour des prélèvements post-mortem, 860 souris reçoivent une greffe de tumeur puis des injections répétées sur animal vigile, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur détaille jusqu'à huit injections intraveineuses par souris sur quatre semaines et annonce comme nuisances une douleur à l'injection, des infections au point d'injection, une perte de poids de plus de 10 %, une gêne liée à la tumeur ou à sa nécrose, et une dégradation de l'état général due à la toxicité des traitements. L'objectif consiste à vérifier chez la souris l'efficacité de complexes anticorps-médicament déjà validés sur cellules. Le porteur affirme avoir "besoin" de connaître les effets sur un organisme vivant, et présente ces études comme un prérequis obligatoire avant une première administration chez l'humain.

Objectifs

Dans beaucoup de cancers une des causes majeures de l’échec des traitements, que ce soit la chimiothérapie ou l’immunothérapie, réside dans la capacité des cellules tumorales à développer des mécanismes de résistance spécifiques qui dépendent du médicament utilisé. Afin de contourner cette résistance et améliorer la survie des patients, de multiples stratégies ont été envisagées, incluant l’utilisation de nouvelles molécules originales avec des mécanismes d’action différents ou l’utilisation de combinaisons de médicaments. Au laboratoire nous avons identifié une nouvelle classe de molécules qui ressemblent à de l’ADN et qui sont capables de bloquer la croissance de divers types de cellules tumorales humaines. Ces données nous ont poussé à développer un système dans lequel nos molécules sont associées à des anticorps utilisés en thérapeutique. Nous avons obtenu la preuve de concept sur des cellules que ces premiers composés sont capables de bloquer la croissance des cellules cancéreuses et nous souhaitons maintenant démontrer qu’ils présentent la même efficacité chez les souris en étant capables d’inhiber le développement tumoral.

Bénéfices attendus

Si nos molécules sont efficaces, nous devrions observer une diminution de la taille de la tumeur chez les souris traitées, voire même une disparition complète. Nous devrions également observer une synergie de l’association entre nos molécules et l'immunothérapie. Les résultats de ce projet permettront donc de confirmer les résultats d’efficacité des molécules que nous avons obtenus sur les cellules cancéreuses. Ces résultats pré-cliniques pourront également permettre, à termes, de proposer une nouvelle stratégie permettant d’améliorer la réponse aux immunothérapies en les combinant avec nos molécules pour augmenter les chances de survie des patients atteints de ce cancer.

Procédures

Tous les gestes seront réalisés sur animaux vigiles. -190 animaux recevront 2 injections intra-veineuse par semaine et sur 4 semaines (3 minutes par injection et par souris). - 430 animaux recevront 1 unique injection sous-cutanée (2 minutes par souris) et 1 unique injection intra-veineuse (3 minutes par injection). - 240 animaux recevront 1 unique injection sous-cutanée (2 minutes par souris). Puis, sur ces 240 souris : - 220 recevront 2 injections intra-veineuse (3 minutes par injection) par semaine pendant 4 semaines ; - 10 recevront 2 injections intra-péritonéale (2 minutes par injection) pendant 4 semaines ; - 10 recevront 2 injection intra-veineuse (3 minutes par injection) ainsi que 2 injections intra-péritonéale (2 minutes par injection) pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : - Une douleur légère au moment de l’injection ou stress ; - Une infection au site d’injection (iv ou ip) ; - Une perte de poids supérieure à 10% du poids initial ; - une gêne liée à la présence d’une tumeur ou nécrose tumorale précoce ; - Une dégradation de l’état général des animaux à cause de la toxicité des traitements.

Devenir

Pour chaque procédure, l'ensemble des souris seront euthanasiées afin de réaliser des prélèvements post-mortem.

Remplacement

Des études d’efficacité de nos complexes anticorps-médicaments sont réalisés in vitro, cependant ce système ne permet pas d’appréhender la complexité d’un organisme entier. Nous avons besoin de connaitre leurs effets sur un organisme vivant et d’étudier leur impact sur le stroma tumoral ainsi que sur la modulation de l’activité anti tumorale du système immunitaire. Par ailleurs, ce projet a pour ambition d’être transféré vers la clinique et ces études sont un prérequis obligatoire pour justifier l’investigation clinique et la première administration chez l’Homme.

Réduction

Afin de réduire à son minimum le nombre de souris utilisé pour l’ensemble des études, nous testerons in vivo les 5 complexes anticorps-medécament les plus efficaces in vitro parmi l’ensemble des complexes générés. Concernant l’approche statistique, chaque lot d’animaux comprendra 10 animaux afin de réaliser les tests statistiques pertinents sur un effectif suffisant. DAu total, sur les 5 ans du projet, le nombre maximal de souris utilisées sera de 860 souris.

Raffinement

Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne y compris les week-ends et jours fériés. Le suivi de la croissance tumorale ainsi que du poids des animaux seront réalisés 2 fois par semaine. Dans le cas où un animal présente un signe de souffrance, différentes décisions peuvent être prises comme l’adaptation des conditions d’hébergement, l’application de soins ou l’euthanasie. Les animaux seront euthanasiés si leur état général est fortement altéré ou si les points limites sont atteints.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est la mieux défini génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses. Les animaux seront utilisés à 6 semaines, âge de leur maturité sexuelle

Sur 418 souris, 400 sont tuées à l'issue d'expériences terminales et 18 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est génétiquement modifiée pour ne plus produire une protéine dans les cellules qui fabriquent les plaquettes. Selon les groupes, 270 souris reçoivent des traitements et trois prises de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, puis un prélèvement de sang à l'aorte, 30 subissent ce seul prélèvement, 100 sont opérées du crâne sous une anesthésie de trois heures au plus, sans réveil, et 18 passent une mesure du temps de saignement à la queue. L'équipe veut comprendre comment se forme le réseau de membranes internes de ces cellules, et le porteur renvoie les retombées pour les patients manquant de plaquettes "à plus long terme". Il affirme que ces expériences demandent "un animal adulte vivant", parce que ces membranes se développent mal dans les cellules en culture.

Objectifs

Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse et sont vitales pour l'arrêt des saignements. Les MKs possèdent la caractéristique unique de contenir un réseau complexe de membranes internes (DMS). Ce réseau joue un rôle essentiel dans la production journalière de plaquette puisqu’il forme la membrane plasmique des futures plaquettes. Ainsi, la production par chaque MK d’environ 2000 plaquettes nécessite une production abondante et régulée de ce réseau membranaire. Un développement anormal est associé à une diminution du nombre de plaquettes circulantes dans certaines maladies héréditaires hémorragiques. A ce jour, les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des membranes internes sont encore largement méconnus. De façon remarquable, nous avons récemment observé la présence de jonctions serrées au niveau de ces membranes internes. Nous avons précédemment montré la présence d'une protéine particulière à ce niveau. Notre hypothèse est que cette protéine est un acteur clé du développement normal de ces membranes internes et dans la libération des plaquettes vers la circulation sanguine. Nous savons que ce réseau de membranes est sous-développé dans les MK en culture. C'est la raison pour laquelle le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, l'environnement de la moelle osseuse. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant plus cette protéine d'intérêt spécifiquement dans la lignée MK, qui sont disponibles au laboratoire, et ne présentent pas de phénotype dommageable.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre la biogénèse du réseau de membrannes internes du MK (DMS), une étape clé et indispensable de la formation des futures plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension de la formation des plaquettes permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par MK, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements chez les patients thrombopéniques

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 différents types d'interventions : 1- Anesthésie générale par voie injectable et prélèvement terminal à l'aorte : 30 souris. 2- Anesthésie gazeuse de 5 minutes au masque pour injection des traitements pharmaceutiques et suivi répétée de la numération à la queue (x3), puis anesthésie générale par voie injectable pour le prélèvement terminal de sang à l'aorte : 270 souris. 3- Anesthésie générale longue de 3h au maximum, par voie injectable, et chirurgie du crane pour 100 souris, la chirurgie est sans réveil. 4-Anesthésie gazeuse de 15 à 30 minutes pour la réalisation d'un temps de saignement à la queue : 18 souris. Total : 418 souris

Impact sur les animaux

Les injections et prélèvements de sang répétés présentent un risque modéré de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés aux traitements pharmaceutiques ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère . En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie intravitale, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.

Devenir

Lors de ce projet, sur les 418 animaux : 400 seront mis à mort puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales, et 18 animaux seront réutilisés (prélèvement d'organes).

Remplacement

Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la compléxité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie, en particulier notre sujet d'étude, le DMS, diffèrent fortement dans des MKs en culture par rapport à ceux observés in vivo

Réduction

A la fin des expériences les animaux seront mis à mort et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est réduit au minimum mais déterminé afin d’obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes et traitements. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).

Raffinement

Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme, enrichi et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine en particulier pour la production de plaquettes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Les souris seront utilisées sans distinction à un stade de développement adulte de 8 à 35 semaines.