Rongeurs

1 528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sur l'oreille, sous anesthésie, des applications répétées d'imiquimod pour induire une maladie proche du lupus, ainsi que des traitements par diverses voies, des prélèvements sanguins et des recueils d'urine par isolement de quatre heures, sur une durée pouvant atteindre dix semaines, pour tester des candidats médicaments. Le porteur décrit un modèle encore à mettre en place et sans expérience préalable sur les nuisances. Il affirme que l'efficacité d'un candidat médicament ne peut être démontrée que chez l'animal, dans un organisme complet.

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune caractérisée par la production d’auto-anticorps qui conduisent à de nombreuses affections des organes notamment des reins, des articulations, de la peau et du système nerveux. Le lupus néphrétique, une lésion rénale associée au lupus, affecte 30 à 70% des patients lupiques et a un impact négatif sur le pronostic des patients. Ce lupus néphrétique est divisé d’un point de vue médical en 6 classes. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle induit par l’imiquimod (substance médicamenteuse dont les propriétés sont de modifier la réponse immunitaire) appliqué en local chez la souris qui récapitule la classe II du lupus néphrétique. Cette induction topique entraine une activation de cellules clés du système immunitaire nous permettant ainsi de mieux comprendre l’interaction entre les différents mécanismes d’action et de pouvoir étudier l’impact de nos candidats médicaments sur ces différents mécanismes d’action. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études conduites dans le cadre ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur les maladies auto-immunes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique et de pouvoir étudier l’impact de nos candidats sur les différents mécanismes d’action impliqués dans cette pathologie

Procédures

Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : - Application de la crème sous anesthésie : temps d’absorption 10 min (? à consolider après réalisation de la procédure 1), 3 fois par semaine, 10 semaines max -traitement iintra veineux, intra péritonéal, sous cutanée ou per os, per os : moins d’une minute, fréquence suivant le protocole de l’étude, 10 semaines max - Prélèvement de sang par microsampling : (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène) (moins de 30 secondes) avec une fréquence dans la limite des recommandations de la structure de Bien-Etre Animal -Urine : jusqu’à 4 heures sur sable hydrophobe (mais un suivi sera établi pour réduire ce temps au maximum), tous les 15 jours (hébergement individuel durant 4 heures max), 10 semaines max -Pesée de la souris : moins de 30 secondes

Impact sur les animaux

Selon les données de la littérature et sans expérience sur ce modèle, les nuisances estimées sont les suivantes : -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale, intra-veineuse, sous-cutanée ou per os pouvant induire stress et douleur ponctuels -Inflammation de l’oreille pouvant induire éventuellement rougeur, gonflement douleur transitoire (durée d’une heure après l’application de la crème) -Prélèvements de sang pouvant induire stress et douleur ponctuels

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour la collecte des organes et tissus et les analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Pour ce projet spécifiquement, le modèle présenté permettrait d’évaluer plusieurs cibles cellulaires impactés dans les maladies auto immunes dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle, un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour l’évaluation des candidats médicaments

Raffinement

L’application de la crème sur le pavillon de l’oreille de la souris sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse pour éviter que l’animal n’enlève la crème et que celle-ci ne soit absorbée par l’animal par une voie d’administration non désirée (par lechage par exemple). Des prélèvements de sang répétés sont réalisés à différents temps afin de mesurer en cinétique les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « microsampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu en respectant les recommandations de la SBEA, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude. Les recueils d’urine pour examens biologiques seront réalisés sur litière de sable hydrophobe en remplacement des cages à métabolisme, maintenant ainsi les animaux dans de meilleures conditions de stabulation. Le volume de recueils sera régulièrement contrôlé pour ainsi arrêter la diurèse si le volume nécessaire est obtenu et sans dépasser une durée maximale de 4h pour limiter le stress des animaux dû à la séparation des congénères durant le recueil. Projet dédié à identifier de nouveaux mécanismes afin de rechercher des candidats traitements les modulants : l’objectif n’est pas d’atteindre l’installation complète de la pathologie de lupus néphrétique mais d’identifier les modulations des biomarqueurs et autres données relevantes et permettant les réponses scientifiques. Les études n’iront donc pas au-delà de 10 semaines et pourront même potentiellement être plus réduites Une coupe des griffes de pattes arrières pourra être réalisée, à l’occasion d’une anesthésie pour application de la crème, afin d’éviter des complications supplémentaires dues au grattage si des premiers signes de prurit apparaissent. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs, l’évaluation de candidats médicaments comme les anticorps nécessite souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats. Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 6 semaines, tel que décrit dans la littérature de ce modèle

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, une chimiothérapie par anthracyclines et des injections et prélèvements répétés au niveau du sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, avec un suivi de la tumeur par bioluminescence, pour étudier l'effet d'une protéine sur la cardiotoxicité de la chimiothérapie. Le porteur indique que la croissance de la tumeur et la chimiothérapie peuvent être douloureuses. Il affirme que l'effet du traitement doit être vérifié in vivo, les cultures cellulaires ne représentant pas la complexité d'un organisme.

Objectifs

Depuis longtemps la cardio-toxicité des agents chimiothérapiques est établie chez l'Homme, cependant la chronologie et les facteurs aggravant de la maladie ne sont pas connus. Aussi, aucune stratification des patients n’est réalisable en amont du traitement car les mécanismes précis de cette cardiotoxicité restent complexes et imparfaitement étudiés. L’objectif du projet est de déterminer l’impact de l’inhibition de la Dipeptidyl Peptidase 3 (DPP3), une protéine fréquemment surexprimée dans différents cancers, sur le devenir des animaux traités aux anthracyclines , un des traitement de base du cancer du sein. Ce qui nous intéresse tout particulièrement sera la capacité du coeur à se contracter lorsque nous initierons le traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : 1. De valider l’hypothèse que les effets toxiques de la tumeur sur le coeur pré-traitement sont médiés par le DPP3 retrouvé dans la circulation 2. De confirmer l’intérêt d’utiliser le DPP3 dans la circulation comme biomarqueur prédictif de cardiotoxicité associée à la chimiothérapie 3. De prévenir la cardiotoxicité associée aux anthracyclines par l’utilisation d'un anticorps dirigé contre notre protéine DPP3.

Procédures

Anesthésies par voie intrapéritonéales: 1 à 2/semaine pendant 6 semaines, durée 20 minute. Prélèvements rétroorbitaires sur animaux anesthésiés: 1/semaine pendant 6 semaines, durée 5 min. Injection rétro-orbitaires 1/semaines pendant 3 semaines, durée 5 min. Injection sous cutané 1 fois en début de protocole, durée 5 min. Les produits utilisés seront un réactif luminescent présent chez les lucioles afin de suivre la croissance tumorale avec un appareil de bioluminescence, une chimiothérapie pour mimer le traitement de la tumeur chez l'homme, un anesthésiant à action rapide pour l'anesthésie en vue de l'échographie ou des injections/prélèvements sanguins dans le sinus rétroorbitaire, un analgésique à action rapide pour l'analgésie durant l'anesthésie, et notre anticorps dirigé contre la protéine d'intéret.

Impact sur les animaux

A la suite de l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses, les souris développeront une tumeur qui sera suivie au cours du temps par bioluminescence. Ce suivi est indolore mais nécessite une injection de réactif 3 fois par semaine et peut donc engendrer un stress pour l’animal. La croissance de la tumeur pourrait être douloureuse. La chimiothérapie utilisée peut elle aussi engendrer des douleurs pour l’animal.

Devenir

L'euthanasie de tout les animaux à la fin de la procédure permettra une analyse histologique des organes d'intérêts, ainsi qu'une analyse protéique et génétique de divers tissus selon les groupes d'appartenance des animaux.

Remplacement

Les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudié in vivo pour être sûr de son efficacité dans un organisme vivant complexe qui contient une multitude de tissus et organes qui peuvent être touchés.

Réduction

Nous avons effectué un calcul nous permettant d’avoir le nombre précis de souris nécessaire à l’étude. En utilisant les résultats d’une précédente étude de notre laboratoire sur un projet relativement similaire, nous sommes arrivés au chiffre de 12 souris par groupe en fin de protocole au moment dde l'euthanasie. Enfin, le suivi par bioluminescence permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d'acclimatation de 5 jours et seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie ainsi que par l'expérimentateur. Différents points limites seront particulièrement surveillés et seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux tous les jours. Les animaux âgés de 12 semaines recevront une injection sous cutanée de 200 microlitres de cellules cancéreuses du sein. A cette occasion, ils seront surveillés de manière visuelle (fréquence respiratoire) pendant 2h après injection. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé 3 fois par semaine par une technique d'imagerie par chimioluminescence qui permet: 1- une surveillance non invasive des points limites pour limiter le stress des animaux; 2- une réduction du nombre d'animaux nécessaires car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires. Les animaux seront préliminairement anesthésiés et après l'injection de produit fluorescent, ils seront placés dans l'appareil d'imagerie pour visualiser la taille de la tumeur. La manipulation dure 5 min max/animal. Ceux-ci seront ensuite replacés dans leurs cages d'origine à la fin de ce protocole. Deux semaines après l'injection de la tumeur, les animaux, mâles et femelles, recevront une injection intrapéritonéale de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours, laquelle peut engendrer des douleurs et donc une analgésie adaptée sera administrée en cas de besoin. Chaque semaine pendant 6 semaines, le prélèvement sanguin et l’échocardiographie seront faits l’un après l’autre pour limiter le nombre d’anesthésie hebdomadaire. Nous évaluerons la fonction cardiaque par échographie sous anesthésie légère, puis nous ferons des prélèvements sanguins via le sinus rétro-orbitaire, environ 100 microlitres à chaque prélèvement. Une pommade ophtalmique afin de réhydrater l'oeil de l'animal sera utilisée post prélèvement. La même procédure aura lieue pour l'injection de notre médicament candidat, avec l'ajout d'une pommade anesthésiante en amont. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement, l’apparence physique et la gêne pour se déplacer. En cas d’atteinte des points limites, les souris concernées auront alors un suivi adapté avec analgésie quotidienne, nourriture en gelée dans la cage, et si les points limite persistent, elles seront alors exclues de l'expérience.

Choix des espèces

La souris est utilisée en sciences expérimentales pour plusieurs raisons essentielles. Tout d’abord les souris partagent une grande homologie génétique et physiologique avec les humains, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Ensuite, les souris se reproduisent rapidement et sont relativement peu coûteuses à élever, ce qui permet d'obtenir rapidement des cohortes expérimentales. Troisièmement, les souris peuvent être facilement génétiquement modifiées pour étudier l'impact de gènes spécifiques sur les processus biologiques, offrant ainsi des informations précieuses sur la fonction des gènes. Pour notre étude, nous avons choisis des souris mâles et femelles d'une lignée de souris fréquemment utilisée dans la recherche en cancérologie pour sa capacité à développer des tumeurs injectées manuellement. Les animaux seront agés de 12 à 16 semaines dans un but de prendre des souris adultes, car le cancer du sein est une maladie fortement liée à l'âge. Prendre des souris plus jeune ne serait pas justifé pour ce protocole.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée hypercholestérolémique, elles reçoivent jusqu'à 42 gavages, une injection intraveineuse et plusieurs prélèvements sanguins, un lot subissant une chirurgie terminale sans réveil, pour tester l'effet d'extraits végétaux sur le cholestérol. Le porteur présente ces extraits comme des actifs "100% naturels" et attend une amélioration sans effets indésirables. Il affirme être "contraint" d'utiliser le modèle animal, le métabolisme du cholestérol ne pouvant selon lui être étudié in vitro.

Objectifs

Notre projet s’inscrit dans le cadre de la lutte contre les maladies cardiovasculaires (infarctus, Accident Vasculaire Cérébrale) et en particulier dans la détermination de nouvelles pistes thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des dyslipidémies. L’objectif de notre programme de recherche est de caractériser d’extraits végétaux sur les niveaux de cholestérol sanguins et de comprendre l'impact sur les voies métaboliques impliquées.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d’identifier le pouvoir hypolipémiant d’extraits végétaux administrés 1) par voie orale ; 2) ou dans un régime. En outre, il permettra de valider son intérêt thérapeutique en démontrant que les extraits exercent des effets anti-athérogéniques.

Procédures

Deux lots de souris recevront 42 gavages oraux (environ 5-10 secondes par gavage), une injection intraveineuse (environ 5-10 secondes par injection) et des six prélèvements sanguins (environ 30 secondes par prélèvement). Un dernier lot de souris sera soumi à 10 prélèvements sanguins (environ 30 secondes par prélèvement) et subira une chirurgie terminale sans réveil (environ 1 heure/ souris).

Impact sur les animaux

Nous utilisons une lignée de souris présentant une hypercholestérolémie. A l'exception des souris contrôles recevant la solution véhicule. Les autres souris devraient voir leur homéostasie du cholestérol s’améliorer sans nuisances ou effets indésirables attendus. Nos expérimentations impliquent des gavages oraux, des prélèvements sanguins et des injections intraveineuses susceptibles d'induire en dépit de nos précautions une altération du bien-être, du stress et des douleurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. Nous récolterons du sang et des organes afin finaliser le phénotypage métabolique des souris et caractériser les altérations moléculaires induites.

Remplacement

Le métabolisme du cholestérol est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier la physiopathologie du cholestérol d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. La cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme du cholestérol. Nous disposons d’un modèle de souris hypercholestérolémiques et prédisposées au développement rapide de la plaque d’athérosclérose lorsqu'elles sont nourries avec un régime hyperlipidique. Nous utiliserons des souris mâles adulte agés de 8 semaines au moment de l'initiation de l'étude. A cet age, l'état hormonal et le métabolisme des lipoprotéines sont matures et stabilisés et permettent de réaliser nos mesures en limitant l'hétérogénéité des données.

90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus de lignées obèses et diabétiques, ils reçoivent une charge quotidienne de sel qui aggrave leur insuffisance cardiaque, subissent des échographies, des prises de pression à la queue et des prélèvements sanguins pendant un mois, puis sont mis à mort par décapitation pour prélever le cœur. Le porteur indique surveiller les effets délétères de ces interventions par des contrôles quotidiens. Il affirme que l'étude systémique de la fonction cardiaque ne peut être simulée autrement et qu'il est "vital" de disposer de ces animaux pour isoler les cardiomyocytes.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque aiguë décompensée (ICAD) et son précurseur, l'insuffisance cardiaque, sont un problème médical en croissance rapide qui présente le taux de mortalité le plus élevé après le cancer du poumon dans les pays développés. Lors d'épisode d' insuffisance cardiaque et en particulier d'un dysfonctionnement diastolique, un remodelage cardiaque se produit, provoquant un dépôt excessif de tissu cicatriciel conduisant à une rigidité accrue de la matrice extracellulaire (MEC), diminuant la capacité à se détendre et à se remplir. Hormis l’hypertrophie des cardiomyocytes, cet effet sur la structure des cardiomyocytes est actuellement relativement inconnu. De plus, les études mécanistiques approfondies du cœur sont limitées par l’accès aux tissus cardiaques sains et malades. L'objectif est d' évaluer les mécanismes métaboliques présents et l'étendue du remodelage de la MEC qui sera en corrélation avec la raideur, lors du remodelage dans un modèle de rongeur de syndrome métabolique et d'insuffisance cardiaque; ensuit d'étudier l'effet de ce remodelage sur la morphologie et la fonction des cardiomyocytes; de d'analyser les protéines transmembranaires responsables de la mécano-transduction des cardiomyocytes et d'étudier l'effet de toute différence dans les protéines transmembranaires mécano-transductrices des cardiomyocytes résultant du remodelage cardiaque et métabolique.

Bénéfices attendus

Nous espérons que les résultats de ce travail aideront à déterminer les mécanismes de l'insuffisance cardiaque et du dysfonctionnement diastolique en ce qui concerne le remodelage métabolique et ce développement d'une progression précoce et légère à une progression plus sévère pour aider à identifier les cibles thérapeutiques potentielles. De plus, ce projet fournira un aperçu de la réponse et de la fonction des cardiomyocytes isolés en ce qui concerne ce remodelage. Cela permettra de cibler de nouveaux domaines de recherche potentiels en matière de recherche mécaniste et thérapeutique.

Procédures

Aucun animal ne subit un acte chirurgical. Chaque animal subira 3 interventions. Les animaux seront évalués par échocardiographie (durée : 20 min/animal), plethysmographie (prise de pression artérielle par brassard sur la queue – durée 15 min/animal) et prélèvement de sang (durée : 10 min/animal) au niveau de la queue pendant 1 mois. Certains animaux recevront du sel dans l'eau de boisson pour les 2 groupes décompensés. Concernant l’euthanasie ; entre le début de l’anesthésie, la mise à mort par décapitation et l’ablation du cœur, nous comptons un délai de 15 min par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux obèses ZSF-1 et Zucker présentent déjà un syndrome métabolique et un diabète qui seront exacerbés par divers degrés d'insuffisance cardiaque et/ou de remodelage cardiaque avec la charge quotidienne de sel et l'IDAC (stade final) avec la charge de sel de lavage gastrique. Nous surveillerons de près tout autre effet délétère de ces interventions avec des contrôles quotidiens par le chercheur.

Devenir

Les animaux doivent être euthanasiés, dans le but de récupérer le cœur indemne, afin de procéder à l’analyse des cardiomyocytes.

Remplacement

Les expériences in vivo ne peuvent pas remplacer les informations qui seront générées dans ce projet. Le but est d'étudier l'effet systémique des cardiomyocytes, de la fonction cardiaque et du remodelage et ne peut donc pas être simulé d'une autre manière. Sur cette note, les rats représentent les caractéristiques physiopathologiques présentées chez les humains aux stades précoces et tardifs de l’insuffisance cardiaque. Cependant, nous avons conçu ce projet pour tenter de remplacer certaines des investigations in vitro en cultivant les cardiomyocytes isolés ex vivo. Nous pouvons effectuer une partie de l'analyse et de la réponse à la rigidité sans ajouter plus d'animaux, ce qui permet d'avoir plus de points d'investigation sur ce nombre de animaux. Cela signifie qu’il est vital que nous disposions de ces animaux pour l’isolement des cardiomyocytes.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous avons développé une nouvelle méthode d'isolement des cardiomyocytes qui permet d'utiliser un morceau de tissu cardiaque, laissant le reste pour d'autres analyses biochimiques, ce qui a considérablement réduit notre nombre d’animaux. De plus, sur la base de données antérieures obtenues chez des rats et de nos propres simulations pour chaque paramètre étudié chez des rats sains témoins non traités, nous avons un taux de réussite minimum de 90%, de plus par une approche statistique, nous estimons que le nombre d'animaux sera de 90 rats dans total.

Raffinement

Une fois que les rats auront atteint l'âge d'environ 15 semaines, ils seront autorisés à s'acclimater pendant une semaine et maintenus pour permettre au remodelage cardiaque de commencer à se produire naturellement avec l'âge avant l'intervention à 20 semaines lorsque l'expérimentation commence. Ils resteront en cage par groupes de trois pour la socialisation avec du carton pour la construction du nid et les enrichissements. Pour les conditions générales de soins, ils resteront dans une pièce ventilée avec des cycles lumière/obscurité de 12 heures, une surveillance quotidienne de la nourriture et de l'eau et un nettoyage hebdomadaire de la cage. Pour les conditions de soins en ce qui concerne les méthodes utilisées dans le projet, le plus grand soin sera pris pour garantir qu'il y ait un minimum, voire aucun, de douleur, de détresse ou de souffrance par une surveillance quotidienne tout au long du protocole pour détecter l'un de ces signes. Pour évaluer, les animaux seront observés pour leur comportement (mouvement, vigilance et toilettage), leur état physique et émotionnel (état de la peau, position du pelage, posture de l'animal, yeux et profondeur de la respiration). Le poids et la température seront surveillés chaque semaine et si une fluctuation de la perte de poids se produit de 2 à 5 % par rapport à une température de 2 à 4 °C, l'animal sera surveillé quotidiennement au cas où des seuils seraient atteints de 10 % pour la perte de poids et une fluctuation de température de 5 °C. quand l'animal sera euthanasié. En présence d'une légère détresse, l'animal peut recevoir une prémédication à base de buprénorphine par voie sous-cutanée et sous une anesthésie (gazeuse, afin de ne pas causer de détresse supplémentaire à l'animal par contention.

Choix des espèces

L'insuffisance cardiaque est plus fréquente chez les individus obèses et se manifeste généralement chez ceux qui souffrent du syndrome métabolique. C'est pourquoi le rat obèse Zucker (FA/FA) (ZF) est utilisé comme modèle pour l'obésité, le syndrome métabolique et le diabète de type 2, ce qui rend ce rat sensible à l'hypertension. et le remodelage lorsqu'il est exposé à une consommation accrue de sel et en utilisant Zucker maigre comme contrôle sain. Le rat ZFS-1 est un modèle de syndrome métabolique plus sévère et de dysfonctionnement diastolique (insuffisance cardiaque avec fraction d'éjection préservée) qui est affecté par la charge de sel pour induire "l'DAIC". Ces deux modèles démontreront différents niveaux d’insuffisance cardiaque et de progression. Les rats Zucker Lean control, Zucker FA/FA (Met-S), Lean control ZSF-1 et ZSF-1 obèses seront âgés de 15 semaines à l'âge d'arrivée et gardés jusqu'à 20 semaines ayant donc un syndrome métabolique au moment de l'inclusion dans l'étude. L'âge d'arrêt sera de 24 semaines après soit une charge quotidienne de sel pendant 4 semaines. Le choix de l'âge et des types de rats est justifié par les données publiées et l'expérience en laboratoire sur différents modèles de syndrome métabolique au cours des 15 dernières années, montrant le développement du remodelage cardiaque à cet âge et l'effet de la charge saline provoquant une insuffisance cardiaque.

205 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules de cancer du sein triple-négatif, des traitements quotidiens cinq jours sur sept et des séances d'imagerie après injection d'un radio-traceur dans la veine de la queue, avant une mise à mort entre 30 et 100 jours pour prélever tumeurs et organes. Le porteur indique que le radio-traceur n'a jamais été testé chez la souris et attend une douleur modérée liée aux injections. Il présente le suivi par imagerie comme un moyen de réduire le nombre d'animaux par rapport aux mesures classiques.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est le cancer féminin le plus important en France et dans le monde en termes d'incidence et de décès. Le CS dit triple-négatif (CS TN) est très agressif et de mauvais pronostic. Il est important de trouver de nouveaux moyens de le soigner. Nous avons identifié un onco-métabolite qui stimule la prolifération des cellules de CS TN. Nous avons identifié des traitements qui bloquent la production de cet oncométabolite et le développement des CS TN. Nous avons développé un nouveau radio traceur qui est capté par les cellules de CS TN en culture qui produisent cet onco-métabolite. Les objectifs de ce projet sont d'étudier, par imagerie médicale, la capacité de ce radio traceur à détecter les CS TN chez l'animal et à suivre l'inhibition du développement des tumeurs suite aux traitements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont de valider, in vivo, le radio-traceur pour la détection non-invasive, par imagerie médicale, des tumeurs qui produisent cet onco-métabolite. De plus, les bénéfices seront de démontrer l'intérêt de ce radio-traceur pour le suivi de l’efficacité de deux traitements que nous avons identifiés pour inhiber les effets de l’onco-métabolite sur le développement des cancers mammaires triple-négatifs (CS TN). Les retombées seront de déposer de publier dans un article scientifique les résultats de ce projet et d’en faire bénéficier la communauté scientifique. A terme, ce projet permettra de proposer un radio-traceur pour la détection non-invasive des CS TN et le suivi des nouveaux traitements pour traiter les cancers du sein TN, qui sont de très mauvais pronostic et pour lesquels peu de thérapies efficaces sont disponibles.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront : l'injection en sous cutanée des cellules tumorales pour établir une tumeur : 1 injection/expérience (Exp 1 à Exp 3), avec une durée de 1 min/souris ; Traitement avec une molécule : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 1 min/souris. Traitement avec deux molécules : 1 fois par jour, 5 jours/7, avec une durée de 2 min/souris. Traitement avec trois molécules 1 fois par jour, 5 jours, avec une durée de 3 min/souris.

Impact sur les animaux

Les études in vitro et in vivo avec le traceur n’a pas montré d’effets indésirables. Le radio-traceur n’a jamais été étudié et injecté chez la souris. L’onco-métabolite, à la dose qui sera utilisée, a été testé in vivo sur plusieurs modèles de cancers mammaires TN (dont celui étudié dans ce projet) et aucun effet indésirable n'a été observé. Les deux thérapies qui seront testés, ont déjà été utilisés in vivo (rapporté dans la littérature) sans effet indésirable observé sur les animaux aux doses qui seront testées mais jamais en combinaison. Les différents traitements qui seront administrés aux souris causeront une douleur modérée due à la piqure de l’aiguille lors de l’injection. Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux car la piqure d’une aiguille pour injection du radio-traceur par voie intraveineuse dans la veine caudale est réalisée sous anesthésie des animaux. L’induction des tumeurs dans les animaux peut affecter la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que l’animal ne souffre pas de douleur, de la faim ou de la soif, d'inconfort, de blessures ou d’immobilité. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que les animaux ne souffrent pas de ces différents maux. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement mis à mort sous anesthésie.

Devenir

Pour les procédures 1 et 2 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J30-J45, car les organes et la tumeur seront prélevés à la fin des acquissions d'imagerie pour analyser la biodistribution du radio-traceur. Pour la procédure 3 : Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie à J80-100, car nous ferons un suivi dans le temps de l'efficacité des traitements d'intérêts par imagerie médicale non invasive et les souris seront mises à mort sous anesthésie au temps J80-J100 qui permettra d'analyser la croissance tumorale et la survie des animaux.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie médicale est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale. Ainsi, il sera possible d’étudier la distribution du radio-traceur et sa captation dans la tumeur dans les mêmes cohortes de souris, dans le temps, au cours du développement tumoral. De même, cette méthode permettra de détecter les tumeurs et de suivre l’efficacité des thérapies. Cette procédure permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en jeu par comparaison aux procédures classiques de biodistribution nécessitant le sacrifice d’un groupe d’animaux par condition et par temps d’observation.

Réduction

Le choix du nombre de souris par groupe selon les expériences et la répétition des expériences se base sur des travaux réalisés précédemment avec l'onco-métabolite sur les mêmes modèles de lignées cellulaires implantés chez la souris et sur l'analyse statistique des données. De plus, le suivi longitudinal des animaux par imagerie permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux mis en œuvre par comparaison avec la procédure de biodistribution ex-vivo nécessitant le sacrifice d’un groupe de souris par temps d’observation et par condition expérimentale. La fiabilité des résultats obtenus est par ailleurs renforcée du fait que le suivi d’un même animal au cours du temps permet de réduire le biais statistique induit par la variabilité interindividuelle.

Raffinement

Les animaux utilisés au cours de cette expérience seront maintenus dans des conditions optimales (Hébergement en surpression, 5 animaux par cage IVC ventilée, sous un éclairage et une température (19-21°C) contrôlés) avec une surveillance régulière de leur bien-être et un enrichissement du milieu adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Ils seront manipulés dans des enceintes protégées. Les animaux auront un suivi clinique quotidien (observations, manipulation/palpation, état général) et pesés 2 fois par semaine afin d’intervenir rapidement si les animaux manifestent des signes de douleur (selon une grille de scoring). Une attention particulière sera apportée au maintien de la température corporelle des animaux anesthésiés qui seront mis sur un tapis chauffant. Si une souffrance est observée (selon une grille de scoring), un traitement pour éliminer la douleur sera mis en place sur prescription du vétérinaire désigné. Si des symptômes correspondant à des critères d’arrêt de l’expérience sont observés, voir ci dessous, l’animal sera mis à mort sous anesthésie. De même, les animaux seront mis à mort sous anesthésie si la tumeur atteint un volume supérieur à 2000 mm3, si elle est nécrosée ou présente une inflammation ou si des signes de souffrance apparaissent, voir ci-dessous. Les critères d’arrêt de l’expérimentation afin de minimiser la souffrance et/ou la détresse des animaux sont les suivants : Perte de poids rapide > 20 % du poids initial ou longue période de perte de poids, ulcération des tumeurs, comportement moribond, automutilation, diarrhée prolongée, paralysie, râle, écoulement nasaux, signes d'atteinte du système nerveux central, anorexie, saignement abondant par un orifice ou lésions interférant avec la prise de nourriture et d'eau.

Choix des espèces

La souris est le modèle utilisé majoritairement par la communauté scientifique internationale pour tester in vivo les effets de molécules anticancéreuses ou pro-tumorales et pour l’imagerie médicale et permet de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires. Les modèles utilisés se reproduisent bien. De nombreux outils sont disponibles pour l’étude de cette espèce. Les souris sont achetées à l’âge de 6 semaines et greffées après la période d’acclimatation. Les souris sont adultes lorsqu'elles sont traitées car le cancer du sein se développe chez l'adulte.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie une sonde de température sous la peau, subissent des prélèvements sanguins, un isolement de 24 heures en calorimétrie et une exposition au froid à 4 °C pendant six heures qui abaisse leur température corporelle, pour mettre au point un test d'étude de la thermogenèse. Le projet vise à "compléter l'offre" d'analyse du métabolisme énergétique de l'établissement. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro pour étudier le métabolisme d'un organisme complet.

Objectifs

Les mammifères ont acquis la capacité de maintenir une température corporelle constante dans des environnements à température variable grâce à un processus physiologique adaptatif appelé la thermogenèse. Le tissu adipeux est considéré comme le principal site de thermogenèse et de production de chaleur, ce qui permet aux rongeurs de maintenir l'euthermie à des températures inférieures à la thermoneutralité. Les altérations de la thermogenèse sont actuellement considérées comme étant à la fois potentiellement responsables et capables de contrer l'obésité. Une compréhension et une évaluation adéquate de la thermogenèse sont donc primordiales pour les études métaboliques. En effet, des gènes impliqués dans la thermogenèse peuvent être facilement induits dans les adipocytes du tissu adipeux en réponse à une exposition au froid. Lorsqu'ils sont activés, les cellules adipeuses consomment une grande quantité de lipides circulants et de glucose. Dans ce contexte, notre projet est de mettre en place et de valider le test d’exposition au froid combiné à l’analyse de l’énergie par calorimétrie indirecte pour compléter notre offre d’étude du métabolisme énergétique chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif la mise en place et la validation d'un test d'exposition au froid pour analyser la thermogenèse et le métabolisme énergétique chez la souris. Cela nous permettra d'offrir un test qui permet de compléter l'analyse des effets métaboliques de certains gènes impliqués l'obésité.

Procédures

Implantation sous-cutanée de mini-sondes de température par chirurgie (durée 30 min par animal) -Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire (moins de 5min par animal) -La calorimétrie indirecte : l’isolement des animaux pendant 24 heures. - Exposition au froid (+4°C) pendant 6h.

Impact sur les animaux

Notre protocole d’étude peut induire les contraintes suivantes : -les animaux subiront une implantation sous-cutanée de mini-sondes de température. Celles-ci restent sous la peau durant l’ensemble du projet, et ont une longueur de 15.5 mm, un diamètre de 6.5 mm et pèse 1.1 g. la chirurgie dure 30 min par animal. -Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire peuvent induire du stress et douleur (moins de 5min) - La calorimétrie indirecte : l’isolement des animaux pendant 24 heures - Exposition au froid (+4°C) pendant 6h : chute de température corporelle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem biochimiques.

Remplacement

Cette étude a pour but d’étudier la thermogenèse et le métabolisme chez la souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier le métabolisme énergétique à l’échelle d’un organisme complet.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable des résultats. Une approche statistique basée sur la variabilité inter-individu constaté dans les études précédentes en calorimétrie indirecte, et de la revue de la littérature pour la mesure de la température corporelle (sous exposition au froid) nous permet de fixer le nombre d’individu à 10 par groupe. De ce fait, nous prévoyons au total 20 souris (10 mâles et 10 femelles).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales d'animalerie, en groupes, avec un enrichissement, nourriture et boisson à volonté avant les tests. -Implantation des mini-sondes : Les animaux recevront un antalgique par injection intra-péritonéale avant leur anesthésie. Ils auront un antalgique en post-opératoire pour couvrir les douleurs possibles lors de la cicatrisation. -Afin de diminuer le stress et la douleur liées aux prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle, ces prélèvements se feront sous anesthésie par inhalation d’isoflurane. De plus un volume maximum de 200 μl et correspondant donc à moins de 20% du volume sanguin de l'animal sera prélevé et afin de compenser ce prélèvement, une solution de NaCl 0,9% correspondant au volume de sang prélevé sera injectée par voie intrapéritonéal. -Concernant les tests de calorimétrie indirecte, ceux-ci se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles. La seule contrainte est donc l’isolement des animaux pendant 24 heures. A la fin de ce test, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement) -Exposition au froid : les souris seront soumises à une température de +4 °c pendant 6h. Les souris s’adaptent bien au froid, leur température corporelle pouvant descendre de 37°C à 34°C. Afin d’éviter de trop grandes variations dans les mécanismes d’adaptation au froid, les animaux seront placés dans des cages individuelles comprenant de la litière. Néanmoins, tout animal dont la température corporelle chuterait en dessous des 34°C , montrant son incapacité à s’adapter au froid, sera sorti du test, et placé sur une plaque chauffante. Chaque semaine, les animaux seront pesés et évalués pour constater leur état général et s'assurer qu'aucune dégradation de celui-ci n'est constatée. Si ce cas se présentait, un protocole spécifique serait mis en place avec une surveillance quotidienne approfondie. En cas de perte de poids supérieure à 20% sur une semaine, prostration avec vocalisation, lésion du site d'implantation, hypothermie, les animaux seront mis à mort

Choix des espèces

La souris est l'animal de choix pour la création et l’étude de modèle avec des mutations genetique. De plus, la souris est un modèle animal adapté à l’étude du métabolisme energetique et la thermogenèse. Enfin, il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier des alterations de la thermogenèse d’un organisme complet. Nous allons étudier le metabolisme et la thermogenèse chez des souris adultes, en effet, nous souhaiterions mettre en place et valider ce test dans le cadre des études du métabolisme en âge adulte chez la souris.