Rongeurs

20 rats Sprague-Dawley vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent des tests comportementaux puis subissent deux chirurgies de 90 minutes sous anesthésie, dont une injection virale dans le nerf vague, la dernière se terminant par une mise à mort sans réveil. Le projet, présenté comme pilote, étudie la propagation de l'alpha-synucléine du cerveau vers le cœur dans la maladie de Parkinson. Le porteur affirme qu'une modélisation informatique ou in vitro est impossible parce qu'il étudie des systèmes entiers en interaction.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une accumulation pathologique de la protéine alpha-synucléine au niveau cérébral mais également dans des organes périphériques tels que le coeur induisant des symptômes moteurs et également un dysfonctionnement cardiaque avec une hypotension orthostatique, une augmentation de la variabilité de la pression artérielle, une altération des baroréflexes et une hypertension nocturne. Ces symptômes augementent donc considérablement le risque d'arythmies, de crise cardiaque et de mort cardiaque subite. Les dysfonctionnements cardiaques dans la maladie de Parkinson sont liés à la dégénérescence des neurones du noyau dorsal moteur du nerf vague. Le noyau dorsal moteur du nerf vague est rapidement impacté par l'accumulation d'alpha-synucléine et induit une propagation pathologique bidirectionnelle de la protéine : vers le cerveau et vers le coeur. Le projet est une expérimentation pilote ayant pour but de réaliser une étude de la propagation pathologique et de l'accumulation d'alpha-synucléine dans la voie allant du noyau dorsal moteur du nerf vague vers le système nerveux cardiaque. Nous permettant ainsi de déterminer comment le système nerveux cardiaque intrinsèque est modulé, la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mettre en évidence les effets cardiaques dans la maladie de Parkinson en déterminant comment le système nerveux cardiaque intrinsèque est modulé par l'agrégation protéique pathologique d'alpha-synucléine, quelle serait la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux tests comportementaux, un premier test d'évaluation de l'activité locomotrice spontanée ne nécessitant pas d'intervention directe de l'expérimentateur et durant 1 heure et un second test moteur nécessitant une légère contention mais ne durant que quelque secondes. Ils seront ensuite soumis à une chirurgie d'une durée de 90 minutes où ils seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs. Puis après deux ou quatre mois, les animaux passeront de nouveau les deux tests comportementaux et une seconde chirurgie de 90 minutes où ils seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs sera effectuée à la suite de laquelle les animaux seront mis à mort sans réveil préalable.

Impact sur les animaux

Les tests moteurs peuvent induire un léger stress transitoire du respectivement à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test d'openfield et à la légère contention au cours du stepping test. La chirurgie d'injection virale peut induire un léger stress au réveil des animaux ainsi qu'une légère perte de poids et des douleurs/un inconfort au cours de premiers jours suivant l'acte chirurgical.

Devenir

Tous les animaux (n=20) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à obtenir des résultats de l'activité cardiaque et des analyses histologiques des coeurs et cerveaux récupérés.

Remplacement

Les approches de modélisations informatiques ou basées sur des cultures cellulaires in vitro sont impossibles à mettre en place dans ce projet puisque nous nous intéressons à l'intégration et aux modifications de réseaux et systèmes entiers.

Réduction

Le nombre d'animaux inclus dans ce projet pilote est restreint à son maximum pour nous permettre d'avoir des résultats préliminaires avant le lancement d'un projet où le nombre de rats par groupe sera estimé par un calcul de puissance. Nous avons donc 5 rats/groupe/temps de mise à mort soit 20 rats au total.

Raffinement

Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (médicamentation définie avec le vétérinaire référent et tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux ou très rapide et ne nécessitant qu'une légère contention). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec monitoring de la température corporelle, additionnée d’une analgésie locale en présence d’antalgique périphérique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h postopératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis au bout de cet arbre décisionnel. Les rats sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement par bâton de bois est disposé dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Une phase d'habituation à l'animalerie et aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateur reste le même tout au long de l'étude.

Choix des espèces

L'espece animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il sagit de l'espèce la plus utilisée pour l'étude de la maladie de Parkinson. Des méthodes d'injection dans le nerf vague sont également décrites chez cette espèce ainsi que les enregistrements des paramètres physiologiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.

128 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation de 90 secondes sans anesthésie, puis une injection de cellules souches humaines modifiées et des prélèvements sanguins mensuels à la joue, également sans anesthésie. Le porteur reconnaît qu'une prolifération incontrôlée des cellules peut causer perte de poids, diarrhées et souffrance, et prévoit une euthanasie douze semaines après l'injection. Il affirme que la culture in vitro ne reproduit pas le microenvironnement des patients, ce qui rend selon lui la souris "indispensable".

Objectifs

La leucémie aiguë lymphoblastique B est un cancer du sang affectant les lymphocytes B, un type de globule blanc de notre système immunitaire. Nous cherchons à améliorer la prise en charge de certaines leucémies dîtes de haut-risque, puisqu’elles présentent une très mauvaise réponse aux traitement actuels. Nous cherchons à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans le développement de la cellule leucémique et d’identifier des vulnérabilités exploitables avec des molécules ciblées, dans l’optique de s’éloigner de la chimiothérapie. Afin de mieux comprendre les effets fonctionnels causés par ces altérations, nous voulons les rajouter à des cellules souches humaines. Pour cela, nous allons modifier génétquement ces cellules afin d’induire l’expression des altérations d’intérêt et injecter ces cellules à des souris pour évaluer les conséquences dans un modèle vivant. Nous espérons pouvoir reproduire les conséquences biologiques observées chez les patients et identifier les processus biologiques directement impliqués dans le développement leucémique.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la transformation des cellules normales en cellules cancéreuses. Ceci devrait nous permettre de trouver un traitement ciblé plus efficace que la chimiothérapie actuelle, et à plus long terme, d’améliorer le devenir de ces patients.

Procédures

Les souris receveuses sont immunodéficientes, modifiées génétiquement afin de présenter un déficit de certaines cellules immunitaires ; ce qui les rend donc plus susceptibles aux infections. Les animaux seront ensuite soumis à une irradiation sans anesthésie de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et permettre la greffe, survie et prolifération des cellules humaines injectées. Le lendemain, il y aura une injection unique de cellules souches humaines par voie intra-veineuse dans la veine de la queue sans anesthésie. Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par mois au niveau de la veine de la mâchoire, sans anesthésie Ceci permettra de suivre la prise de greffe des cellules injectées et anticiper toute prolifération massive. L’injection et le prélèvement sanguin sont des procédures rapides qui ne durent qu’entre 30s et 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sont rapides et non invasives. Cependant, l’irradiation peut causer des diarrhées et l’injection en elle-même peut causer une douleur brève au niveau du site d’injection. Les cellules souches humaines modifiées peuvent éventuellement causer une prolifération massive des cellules et nous ne pouvons pas anticiper l’effet des altérations étudiées dans les cellules injectées, avec potentiellement une prolifération accélérée. Ceci peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement, ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage, le plus souvent la perte de poids et des diarrhées précèderont ces évènements.

Devenir

Afin d’analyser le devenir des cellules humaines modifiées injectées, les animaux seront euthanasiés 12 semaines après leur injection pour permettre la collecte et l’analyse des différents organes tels que la moelle osseuse et la rate.

Remplacement

A ce jour, certains modèles de culture en milieu artificiel (in-vitro) permettent l’étude du développement de la leucémie mais leur pertinence reste partielle car la différenciation in vitro est très artificielle, et ne récapitule pas complétement la différenciation humaine normale. L’utilisation d’un modèle animal assure la présence du microenvironnement complexe récapitulant ce qui se passe chez les patients. Cela rend donc indispensable l’utilisation d’un modèle animal pour conduire des études fonctionnelles et précliniques.

Réduction

Pour ce projet, nous prévoyons 8 groupes d’animaux qui seront injectés avec des cellules différentes. Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Afin d’obtenir des différences significatives, chaque groupe comptera 4 animaux pour s’assurer d’une bonne reproductibilité ce qui représente au total 32 animaux par expérience qui pourra être répétée au maximum 4 fois. Pour des questions organisationnelles, afin de limiter la taille de l’expérience et de s’assurer de la robustesse des résultats obtenus, nous séparons en 3 répétitions, en anticipant une 4eme en cas de soucis techniques ne permettant pas d’observer de différences statistiquement significatives. L’analyse des résultats obtenus se fera au moyen de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou l’expérimentateur. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux immunodéficents seront hébergés dans des cages ventilées et toutes les manipulations seront réalisées sous hotte afin de limiter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du poids, de l’apparence (pelage, sécrétions, présence de masse tumorale) et du comportement (interactions sociales, posture, mobilité, respiration) sera effectuée par l’expérimentateur dès l’injection des cellules humaines et jusqu’à la fin de la procédure (12 semaines après injection). En cas de détection de certains signes cliniques la surveillance clinique pourra être faite plus fréquemment. Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter une prolifération anormale des cellules injectées. Le suivi des animaux se fera en suivant une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs. Toute souris présentant des signes de souffrance pendant la durée de l’expérience (poil hérissé, prostration, perte de poids, tumeur palpable) sera euthanasiée sans attendre et analysée.

Choix des espèces

Le modèle souris utilisé dans ce projet présente deux avantages : (i) Les souris immunodéficientes sont décrites dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour greffer les cellules sanguines humaines, et étudier le développement des lymphocytes dans un microenvironnement se rapprochant le plus de la physiologie humaine. (ii) Nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et souffrance des souris et donc de leur prise en charge. Les souris seront injectées à partir de 7 semaines, lorsqu’elles auront atteint l’âge adulte, afin de garantir une prise de greffe optimale des cellules sanguines humaines.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de deux modèles transgéniques d'Alzheimer, elles subissent une biopsie de l'oreille puis une série de tests comportementaux de mémoire, dont un test d'évitement passif reposant sur une stimulation électrique des pattes. Le porteur teste des molécules hybrides dirigées contre deux cibles, et renvoie les bénéfices à un éventuel développement clinique. Sur le remplacement, il affirme que ces modèles murins sont le "seul recours" in vivo autre que l'humain présentant les symptômes de la maladie.

Objectifs

Les traitements disponibles aujourd’hui pour traiter la maladie d’Alzheimer (MA) sont essentiellement symptomatiques. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes, la première d'entre elles étant de mettre au point des molécules actives à faible dose et sans effets secondaires pour les patients. Ce projet a donc pour but de créer et caractériser l’effet pharmacologique de molécules hybrides dirigées contre 2 cibles, afin d’avoir un impact majeur sur la toxicité, la neuroinflammation et le stress oxydatif présents dans la MA. Deux modèles transgéniques de la MA seront étudiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de découvrir des molécules neuroprotectrices très efficaces sur des modèles transgéniques,pour contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et espérer un développement pré-clinique et clinique de molécules hybrides actives en combinaison sur 2 cibles, pour modifier de façon durable le décours de la maladie.

Procédures

Les animaux transgéniques auront une biopsie à l'oreille au moment de l'identification. Les animaux seront traités par eau de boisson durant 2 mois. Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec des tests comportementaux. La durée des tests est variable selon le type de test (de 3 à10 minutes) et pour les tests pour lesquels un apprentissage est nécessaire, les sessions sont répétées 3 fois à 20 minutes d'intervalle pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux transgéniques auront une biopsie à l'oreille au moment de l'identification qui peut engendrer un léger stress. Les tests comportementaux peuvent engendrer un léger stress suite à la contention de l'animal et le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme repose sur la perception d'une stimulation électrique de très faible intensité au niveau des pattes de la souris.

Devenir

Après la série de tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés et le matériel biologique sera récupéré pour procéder à des analyses port-mortem.

Remplacement

Afin de déterminer l’efficacité neuroprotectrice des différents composés hybrides, les tests doivent se faire « in vivo » en vue d’un éventuel développement clinique. De plus, l’utilisation de modèles murins transgéniques de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux les doses administrées se baseront sur les doses efficaces observées sur un modèle aigu de la MA précédemment obtenus au laboratoire. Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Une veille bibliographique sera également prise en compte durant les 5 années du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement minimal du milieu, car un enrichissement trop important interagit avec l’étude de la mémoire. Les animaux auront donc accès à des copeaux de carton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.. Les procédures d’administration des composés par l' eau de boisson n'entraine aucun effet négatif. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et l’animal serait retiré de l'étude

Choix des espèces

Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles ont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés. Une lignée transgénique développe progressivement la pathologie avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter la progression de la MA. L'autre lignée commence à développer des plaques Aβ dès 2 mois avec des déficits cognitifs à l'âge de 4 mois. Ces souris sont utiles pour étudier la MA précoce. Les souris transgéniques seront testées dès l'âge de 2 mois afin de visualiser l’apparition progressive des symptômes et une fois bien installés, l’effet des composés seront testés en traitant les animaux pendant 2 mois après l’apparition des symptômes .

300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles gardées pour l'élevage et les croisements restant en vie, les autres mises à mort pour prélever rate, moelle osseuse et reins. Porteuses d'une mutation reproduisant un lupus humain, elles peuvent développer perte de poids, insuffisance rénale, dermite avec plaies et douleurs articulaires, et subissent des prélèvements sanguins mensuels sous anesthésie à l'isoflurane, dont le porteur reconnaît le caractère aversif. La protéinurie est mesurée chaque semaine pour suivre les points limites. Sur le remplacement, le porteur affirme devoir recourir à un "modèle entier" et à un "organisme entier" pour étudier la production d'auto-anticorps, et juge la souris appropriée.

Objectifs

Ce projet repose sur l'étude d'une mutation décrite chez une patiente atteinte d'un lupus érythémateux systémique. Un modèle murin reproduisant cette mutation a été récemment créé sur fond C57BL/6J, et décrit dans la littérature. Cette souris présente une survie réduite, une autoimmunité avec une augmentation des lymphocytes B et une production d’auto-anticorps (notamment des anticorps anti-nucléaires). Nous souhaitons étudier en détail le phénotype des lymphocytes B à l’origine de la production des autoanticorps pathogènes. Ce projet n'a pas fait l’objet d'une évaluation par d'autres instances mais repose sur une question scientifique non résolue à ce jour et dont les réponses pourraient bénéficier aux patients.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de mieux comprendre comment cette mutation génétique peut conduire à une perte de contrôle de la production d’autoanticorps dans une maladie autoimmune sévère telle que le lupus. Les TLR sont des récepteurs de l’immunité qui ont été impliqués dans la maladie lupique dans la littérature, mais les mécanismes de leur implication sont encore mal connus. Ainsi ces résultats pourraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients, à moyen/long terme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins mensuels, sous anesthésie. Des prélèvements (rate, moelle osseuse, reins) seront effectués sur les animaux en fin de procédure après mise à mort. La protéinurie sera mesurée sur un prélèvement d'urine toutes les semaines, pour l'évaluation des points limites.

Impact sur les animaux

Les souris étudiées dans ce projet développent une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une perte d'appétit et donc une perte de poids, une insuffissance rénale matérialisée par une augmentation de la protéinurie mesurable à l'aide de bandelettes urinaire. De plus, les animaux peuvent développer une adénopathie associée à une dermite, entrainant une dépilation et le développement de plaies. Le lupus peut également se matérialiser par des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement et une mise à l'écart du/des individus, un dos voussé. Les prélèvements sanguins peuvent potentiellement générer une anémie (paleur des muqueuses), une respiration plus rapide ainsi qu'une plaie éventuelle au site de prélèvement. Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes à toute anesthésie (l'anesthésie est cependant ici de courte durée pour un prélèvement sanguin). L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser le prélèvement sur un animal vigile.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle entier afin d'étudier les réponses immunes et la production d'autoanticorps qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques multiparamétriques de type Anova nécessitant l'analyse de groupes de 8 souris minimum pour chaque question posée. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d'optimiser l'utilisation des différentes portées, nous utiliserons les mâles et les femelles de chaque portée générée.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés dans une animalerie à statut sanitaire propre permettant déviter une infection. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décrite pour chaque procédure, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent).

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placées seules en cage pendant les 14 semaines du protocole, une contrainte que le porteur reconnaît comme une source de stress modérée, elles subissent des gavages, des prélèvements de sang répétés à la queue et à la joue, puis une ponction intracardiaque terminale. Le projet utilise une lignée transgénique fat-1 dont les tissus sont enrichis en oméga3, pour étudier l'effet de ces lipides sur la barrière intestinale et le microbiote dans un contexte d'obésité alimentaire. Le porteur affirme que ni la culture cellulaire ni un autre modèle murin ne peuvent reproduire cet enrichissement et ces interactions, et conclut à la "nécessité" de l'animal.

Objectifs

L’obésité est une pathologie ayant de multiples origines qui est associée à des altérations métaboliques comme le diabète de type 2 ou des perturbations lipidiques sanguines. Au cours de l’installation de l’obésité alimentaire, une altération (quantité et qualité) de la flore intestinale contribue à perturber la fonction barrière de l’intestin en détériorant à la fois la perméabilité de l’épithélium intestinal et la couche de protection qui le tapisse. Ces altérations conduisent au passage dans le sang de molécules provenant de certaines bactéries de la flore microbienne intestinale conduisant à une inflammation générale légère mais chronique. En tant qu’aliment thérapeutique, les lipides dits en oméga3 (particulièrement présents dans les poissons ou certaines huiles alimentaires comme l’huile de colza) sont connus notamment pour améliorer la fonction barrière intestinale et réduire les altérations de la perméabilité intestinale. Dans ce contexte d’obésité alimentaire, nous étudions ainsi l’impact des lipides dits en oméga3 sur la fonction barrière de l’intestin et en particulier sur l’intégrité de la couche de protection qui le tapisse et la contribution relative de la flore intestinale. Nous avons montré précédemment que des souris dont les tissus contiennent beaucoup de lipides en oméga3 sont protégées de l’obésité alimentaire, de l’altération de la perméabilité intestinale et du passage de molécules issues de bactéries de la flore intestinale dans le sang. Cette protection est transmissible à d’autres souris par la transplantation de la flore intestinale des souris dont les tissus sont riches en lipides en oméga3. Ainsi, un enrichissement tissulaire en lipides en oméga3 pourrait représenter une cible potentielle dans la prévention de l’obésité et de l’inflammation intestinale due aux molécules issues de la flore microbienne. L'objectif de ce projet est donc d'étudier et de comprendre le rôle des lipides en oméga3 dans cette protection un contexte d’obésité alimentaire et plus particulièrement l’effet de ces lipides en oméga3 dans la contribution relative de la flore intestinale et de la couche de protection qui tapisse l’intestin.

Bénéfices attendus

L’obésité, qualifiée aujourd’hui de pandémie, est associée à des pathologies comme le diabète ou le foie dit gras ainsi qu’à une altération de la perméabilité intestinale entrainant un passage de molécules issues de la flore intestinale dans la circulation sanguine qui pourrait être en partie responsable d’une inflammation générale légère et chronique. Le traitement de l’obésité et de ses désordres est donc un enjeu majeur de santé publique. L’impact de l’alimentation et en particulier des lipides en oméga3 est une piste privilégiée dans l’enrayement de cette pandémie. Cependant, les études nutritionnelles, tant chez l’homme que le rongeur, présentent de nombreux biais rendant les données existantes peu concluantes quant aux effets et aux modes d’action des lipides en oméga3. Les souris dont tous les tissus sont riches en lipides en oméga3 représente donc une alternative de choix dans l’étude de l’impact de ces lipides sur les maladies associées à l’obésité alimentaire, bénéfique que nous avons déjà montré sur la prise de poids ou le diabète. Nous avons par ailleurs récemment montré que le seul transfert de la flore de souris aux tissus riches en lipides en oméga3 à d’autres souris sans enrichissement en lipides en oméga3 les protègent également efficacement de ces pathologies mais également des altérations de la couche de protection qui tapisse l’intestin. Ce projet a maintenant pour but de mieux comprendre le rôle de ces lipides en oméga3 et la contribution relative de la flore intestinale dans les mécanismes intimes impliqués dans la structuration de cette couche de protection de l’intestin. Ce projet pourrait également permettre l’identification de souches bactériennes favorables, éventuelles futures cibles probiotiques, essentielles au bon fonctionnement de la barrière intestinale lors de l’obésité.

Procédures

Les animaux seront manipulés de façon hebdomadaire afin d’évaluer leur poids. De plus, - Au début du régime, les animaux seront placés en cages individuelles avec couvercle filtrant - Au départ de la mise sous régime puis aux semaines 2 et 13 des fèces seront collectés (3 à 4 crottes sur une durée d’une dizaine de minutes) - Prélèvement de sang aux semaines 2 et 13 d’expérimentation, 4 heures après le gavage avec une solution de Dextran au niveau de la région submandibulaire afin de mesurer la perméabilité intestinale. Chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde par souris. - Prélèvement de sang, 4 heures après le gavage avec une solution de glucose, aux semaines 1 et 12 d’expérimentation. Le prélèvement est réalisé au niveau de la partie terminale de la queue de la souris aux temps 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes après le gavage au glucose pour mesurer la glycémie (chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde par souris). - Prélèvement de sang, 4 heures après l’injection d’insuline, au départ de la mise sous régime puis à la semaine 10 d’expérimentation. Le prélèvement est réalisé au niveau de la partie terminale de la queue de la souris aux temps 0, 15, 30, 60, 90, 120 minutes après l’injection d’insuline pour ensuite mesurer la glycémie (chaque prélèvement sanguin sera réalisé en une vingtaine de seconde par souris). - Un prélèvement terminal sera effectué à la fin de la semaine 14 via une ponction intracardiaque nécessitant une à deux minutes par animal.

Impact sur les animaux

L’isolement en cage individuelle représente une source de stress attendue pour l’animal, d’autant plus qu’il sera maintenu durant toute la durée de l’expérimentation (14 semaines). Cette nuisance peut être classée en modérée. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la partie terminale de la queue (à l’aide d’une aiguille 26G) pour la mesure de la glycémie lors du test de tolérance au glucose), les gavages oro-gastriques (pour les instillations de microbiote) et l’injection intrapéritonéale d’insuline (aiguille 26G) sont des gestes pour lesquelles peu ou pas de douleur sont attendus puisqu’ils seront réalisés par un personnel maitrisant très bien ces gestes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue du projet afin de réaliser des prélèvements de différents tissus (sang, colon)

Remplacement

Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux car cette souris possède intrinsèquement (grâce au transgène fat-1) un niveau d’enrichissement des lipides tissulaires en AGPI oméga3 qui n’existe dans aucun modèle murin. D’une part, l’ubiquitisme de l’enrichissement tissulaire en AGPI oméga 3 et d’autre par les taux tissulaires obtenus rend impossible le remplacement du modèle de souris Fat-1 par des modèles in vitro. De plus, le protocole décrit vise à étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la fonction barrière de l’intestin et en particulier de la formation du mucus colique et les interactions de ce dernier avec le microbiote intestinal. Il est impossible de complètement modéliser ce processus et ces interactions à travers des approches in vitro. En effet, si des modèles de lignées cellulaires coliques secrétant de mucus existent (LS174T/HT29MTXE12), ces modèles ne permettent pas de reproduire in vitro la complexité des interactions entre microbiote et cellules coliques ainsi que la structuration de cette couche de mucus qui apparait in vivo en bicouche et avec une structuration lamellaire. Cette structuration représentant une niche écologique pour le microbiote intestinal. Enfin, cette étude est menée dans un contexte d’obésité alimentaire. Ce contexte est difficile à modéliser en raison de la complexité des impacts métaboliques observés et de la diversité des approches de régimes utilisés. Cet aspect ne peut donc également pas s’affranchir de l’utilisation d’animaux. Cette étude est donc unique dans l’approche de l’impact des AGPI oméga3 sur le mucus et le microbiote intestinal dans un contexte d’obésité alimentaire et de ses pathologies associées.

Réduction

Les effectifs ont été optimisés sur la base des coefficients de variabilité reportés dans la littérature et les différences attendues entre les différents groupes pour les paramètres clés de l’étude. Lors de la conception du protocole expérimental nous avons déterminé le nombre de 8 animaux par groupe nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux intégrables dans le protocole, en amont de la production des animaux, les souris WT sont croisées entre elles et les souris Fat-1 homozygotes entre elles générant des descendants tous intégrables dans le protocole et ce sans génotypage.

Raffinement

La mise en isolement en cage individuelle représentant une source attendue de stress générant une nuisance pour l’animal, d’autant plus qu’il sera maintenu durant toute la durée de l’expérimentation (14 semaines), une attention particulière sera apportée à l’enrichissement du milieu afin de minimiser cette nuisance qui peut être qualifiée de modérée. En effet, toutes les souris auront accès à des enrichissements de milieu dans chaque cage, constitués de carré de coton et/ou papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Une attention particulière sera également portée à la surveillance de la prise de nourriture et aux comportements liés au stress. Les souris seront habituées au geste de la contention et de la pesée dès leur arrivée en secteur conventionnel et intégration dans le projet. A la suite des interventions (OGTT, ITT, instillations de microbiote par gavage) chaque animal sera examiné. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Bien que n’étant pas réalisés tous les jours, nous pourrions être amenés à utiliser une sonde de gavage souple lors des gavages pour l’instillation de microbiote. Des points limites adaptés en lien avec l’obésité attendue ou les gestes pratiqués (gavage, prélèvement de sang) ont été définis. Si ces points limites définis sont atteints, un arrêt de la souffrance engendrée sera effectué par mise à mort de l’animal après anesthésie profonde puis dislocation cervicale.

Choix des espèces

La détermination de l’impact d’un régime obésogène sur la perméabilité intestinale et la relation entre microbiote/mucus est primordiale à notre étude. Cet aspect ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux afin de mimer au mieux un contexte d’inflammation bas grade. Bien que relativement éloignée de l’Homme, l’espèce murine est l’espèce animale de référence dans ce domaine de recherche et la plus utilisée en recherche préclinique avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le modèle de souris transgénique fat-1 est un modèle précieux qui rend cette étude unique dans l’approche de l’impact des AGPI oméga3 sur la prévention de l’hyperperméabilité intestinale induite par un régime obésogène. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 12 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids supérieur à 20g. En effet, nous nous intéressons à l’obésité et aux conséquences métaboliques associées développées par les jeunes adultes car il a été montré que l’augmentation en France de l’obésité touche toutes les tranches d’âge mais que la fréquence semble plus élevée dans les tranches 25-34 et 35-44 (de l’ordre de 8% par an). De telles données sur le jeune adulte ont été également confirmées aux Etats-Unis et récemment en France. De plus, les études précédentes mettant en évidence la transmission de la résistance partielle de l’induction de l’obésité alimentaire par le microbiote de souris fat-1 à des souris WT au laboratoire a porté sur l’animal jeune adulte. Nous souhaitons pouvoir inscrire ces nouvelles expérimentations dans notre objectif thématique plus global.

618 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer colorectal sur le flanc, puis des injections répétées de chimiothérapies et d'un médicament donneur de monoxyde d'azote, avec un suivi de la tumeur qui peut gêner la mobilité de la patte arrière, pour tester si cette association améliore le traitement. Le porteur fixe un point limite de mise à mort à un volume tumoral de 2 centimètres cubes ou en cas de souffrance. Il affirme que les cultures cellulaires ne peuvent se substituer à l'étude du microenvironnement tumoral dans un organisme entier.

Objectifs

Le traitement du cancer demeure un défi nécessitant de trouver de nouvelles solutions de traitement pour améliorer l’espérance de vie des patients. L’objectif principal de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements (chimiothérapies) couramment utilisés pour le cancer colorectal. Pour cela nous proposons d’associer aux traitements existants un autre médicament. Certaines tumeurs cancéreuses peuvent libérer des facteurs suite à la chimiothérapie pour se protéger de leurs effets ce qui diminue l’efficacité du traitement. Le médicament étudié a la particularité d’éliminer les cellules cancéreuses lorsqu’il est en présence de ces types de facteurs. Des travaux préliminaires ont montré, dans un modèle de cancer colorectal chez la souris, que ces facteurs augmentaient en réponse au traitement par certaines chimiothérapies utilisées pour le traitement du cancer colorectal. Dans ce contexte, l’ajout du médicament après la chimiothérapie, en présence de ces facteurs, ralentirait le développement de la maladie. L’étude sera structurée en 2 parties qui permettront (1) d’étudier précisément le rôle des facteurs d’intérêts dans l’effet de la combinaison chimiothérapies/médicament contre la tumeur dans un modèle de cancer colorectal chez la souris ; (2) d’étudier l’effet de la combinaison chimiothérapies/médicament dans un autre modèle d’étude du cancer colorectal chez la souris. Les cancers colorectaux étant des pathologies très hétérogènes, l’utilisation du modèle animal souris est majeur en cancérologie car il permet de reproduire les caractéristiques de la pathologie cancéreuse humaine. Ce projet vise à démontrer que l’administration du médicament en question après les chimiothérapies (lorsque ces facteurs sont présents) peut s’appliquer à différents modèles de cancers colorectaux.

Bénéfices attendus

Les deux modèles d’étude du cancer colorectal chez la souris que nous proposons d’utiliser dans ce projet se distinguent par la capacité des cellules immunitaires à infiltrer la tumeur. Les tumeurs sont qualifiées de « froides » lorsqu’elles sont peu infiltrées par les cellules du système immunitaire. Au contraire, les tumeurs sont qualifiées de « chaudes » lorsqu’elles sont fortement infiltrées par les cellules immunitaires. Grâce aux deux modèles d’étude du cancer colorectal chez la souris que nous proposons d’utiliser dans cette étude, nous pourrons mimer deux microenvironnement tumoraux différents, proches de la pathologie humaine. Nous nous attendons à valider l’hypothèse initiale de notre stratégie de traitement qui repose sur l’administration du médicament sur la base de la présence des facteurs d’intérêts faisant suite au traitement par chimiothérapies. Ainsi, au travers de ce projet nous nous attendons (1) à démontrer le rôle charnière de ces facteurs pour l’utilisation du médicament dans une stratégie de traitement à base de chimiothérapies (2) à démontrer que la stratégie de traitement peut être appliquée à un autre type de cancer colorectal. A long terme ce projet a pour bénéfice d’améliorer l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies standards utilisées chez les patients atteints de cancers colorectaux. Ce projet s’inscrit dans le développement d’une thérapie anticancéreuse innovante.

Procédures

Anesthésie générale Inhalation d’anesthésiant pendant 5 minutes. Puçage Une puce sera injectée à l’aide d’un injecteur de puce en 3 secondes sous anesthésie générale, une seule fois au début de l’expérience. Rasage Le flanc droit de l’ensemble des souris sera rasé à l’aide d’un rasoir vétérinaire pour injecter les cellules tumorales et mesurer le volume tumoral au cours du temps. L’intervention durera environ 1 minute et sera réalisée une seule fois sur souris vigile au début de l’expérience. Injection des cellules tumorales Les cellules resuspendues dans du sérum physiologique seront injectées en sous cutanée sur le flanc droit de l’ensemble des souris sous anesthésie générale. L’injection des souris durera environ 5 secondes et sera réalisée une seule fois au début de l’expérience. Injection en intra-péritonéale Les injections de chimiothérapies, sérum physiologique, ou d’inhibiteurs d’un des facteurs étudié seront injectés individuellement. Les injections seront réalisées sur souris vigile et dureront environ 3 secondes. Injection en sous cutanée Le médicament/sérum physiologique seront injectés en sous-cutané au niveau du cou. Une seule injection de 3 secondes sera réalisée deux fois par semaine en vigile pendant environ 4 semaines. Mesure des tumeurs Un suivi de la croissance tumorale sera réalisé 3 fois par semaine pendant 4 semaines en vigile à l’aide d’un pied à coulisse. L’intervention durera environ 1 minute par souris. Prélèvement de sang en mandibulaire Le sang sera prélevé au niveau de la veine mandibulaire après anesthésie générale. Les souris seront maintenues endormies à l’aide d’un masque libérant l’anesthésiant pendant tout le temps du prélèvement. Le prélèvement durera environ 1 minute par souris et sera suivi du réveil de l’animal. Prélèvement de sang en intra-cardiaque Le sang sera prélevé en intra-cardiaque après anesthésie générale. Les souris seront maintenues endormies à l’aide d’un masque libérant l’anesthésiant pendant tout le temps du prélèvement. Le prélèvement durera environ 5 minutes par souris et sera suivi d’une euthanasie sans réveil préalable. Euthanasie des souris Les souris seront euthanasiées après anesthésie générale. L’intervention durera 3 secondes par souris et sera suivi du prélèvement des tumeurs.

Impact sur les animaux

Nuisances dues à l’anesthésie générale pour le puçage, l’injection des cellules tumorales et le prélèvement sanguin mandibulaire : - Stress au moment de l’endormissement dans la boite d’anesthésie - Diminution de la chaleur corporelle - Douleur au point d’injection de la puce Nuisances dues aux injections des chimiothérapies et du Nitronal : - Stress de la manipulation et de l’injection - Douleur au point d’injection - Effets indésirables dus aux traitements (perte de poids éventuelle) Nuisances dues au suivi de la croissance tumorale : - Stress de la manipulation lors de la mesure du volume tumoral Gêne occasionnée par la tumeur (gêne au niveau de la patte arrière, perte de mobilité)

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant pendant 5 minutes puis euthanasiés. En effet, tous les animaux étant porteurs de tumeurs colorectales, aucun ne pourra être réutilisés, replacés ou adoptés. De plus, même en cas de guérison, l’ensemble des souris auront reçu des traitements (chimiothérapies et/ou médicament) ce qui pourrait altérer leur état général en cas d’adoption ou les résultats de nouvelles expériences en cas de réutilisation.

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire in vitro ne peuvent pas se substituer totalement aux expérimentations in vivo étant donné que nous cherchons à étudier l’impact des traitements, d’une part sur le taux des facteurs d’intérêts issus de l’hétérogénéité du microenvironnement tumoral et d’autre part sur la croissance des cellules cancéreuses au sein de son microenvironnement, ce qui nécessite pour ces deux points un organisme vivant entier.

Réduction

Ce projet nécessitera l’utilisation de 618 souris sur une période de 5 ans. La maîtrise du modèle animal chez la souris au laboratoire permet de réduire le nombre d’animaux utilisé au minimum nécessaire pour les expérimentations envisagées afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Des études préliminaires ont été réalisées afin de définir les conditions de traitement et les doses de chimiothérapies et du médicament à utiliser. Ces études préliminaires ont également permis d’éliminer certains groupes témoins pour lesquels les effets des traitements seuls sont suffisamment connus pour ne pas avoir à les refaire. Une étude pilote sera réalisée pour déterminer la dose optimale et la fréquence d’injection d’un inhibiteur pour l’un des facteurs étudiés. Ces mises au point préalables permettent donc de réduire au maximum le nombre de groupe de souris utilisé. De plus, les expériences seront réalisées sur des groupes de souris randomisés pour limiter au maximum les biais expérimentaux et éviter de recommencer les expériences plus de fois que nécessaire.

Raffinement

Pour limiter au maximum les nuisances causées aux animaux et détecter le plus précocement possible toute forme de souffrance ou de mal-être potentiel, quotidiennement de façon à vérifier leur bien-être (absence de perte de poids, d’appétit, de déshydratation ou d’immobilité). Les animaux seront toujours hébergés en petits groupes pour limiter l’angoisse/le stress. De plus un enrichissement sera ajouté (matériel de nidification, petit récipient en verre) visant à améliorer la zone de confort tout au long de leur hébergement. Les manipulations (injections des cellules, prélèvements sanguins, puçage) pouvant générer un inconfort pour l’animal seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille de score regroupant les point limites a été mise en place (Annexe V) de manière à déterminer les critères d’arrêt. Dans tous les cas, un animal sera anesthésié puis euthanasié si 1) le volume tumoral atteint 2 centrimètre cube, 2) s’il présente une baisse de la masse corporelle ou des signes (comportementaux/posture) indiquant une souffrance ou une douleur significative qui ne peut pas être supprimée, 3) si la tumeur présente une plaie.

Choix des espèces

Les expériences que nous avons préalablement réalisées in vitro ont été menées sur des lignées cellulaires (cancéreuses) de souris. Nous utiliserons les espèces de souris dont sont issues les cellules préalablement utilisées in vitro. Les souris seront âgées d’environ 8 semaines de manière à ce qu’elles aient un système immunitaire suffisamment mature pour étudier les facteurs d’intérêts en réponse au traitement, sur la croissance tumorale.