Rongeurs
Motivation pour la nourriture chez la souris : analyses comportementales et moléculaires
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Soumises à une restriction alimentaire maintenant leur poids à 90 % pendant l'expérience, 288 souris vont être utilisées puis toutes tuées pour prélèvement de tissus cérébraux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont isolées, exposées de façon répétée au sucre et prélevées trois fois par voie sanguine, pour étudier la motivation alimentaire et la consommation excessive de saccharose. Le porteur indique que l'isolement et la restriction sont sources de stress et que les prises de sang peuvent causer douleur, infection voire nécrose. Il affirme qu'aucun modèle autre que "l'animal entier" ne permettrait cette étude, dont les retombées restent renvoyées à un futur projet.
Objectifs
Dans les pays développés, la consommation alimentaire est motivée par le plaisir plus que par le besoin de se nourrir. De ce fait, des dérives sont observées dans les comportements alimentaires, notamment une consommation excessive de nourriture appétissante peut devenir préoccupante puisque plusieurs pathologies y sont liées, comme l’obésité. Cependant, les adaptations comportementales et cérébrales associées à ces troubles de l’alimentation ne sont pas encore bien caractérisées. Ce programme de recherche vise à étudier la relation entre les prises excessives de nourriture appétissante et la motivation. En particulier, un protocole classique de mesure de la motivation chez la souris est utilisé pour de la nourriture normale ou de la nourriture appétissante comme le sucre. Les profils d’acquisition de la tâche seront comparés entre mâles et femelles. Ensuite, les effets d’une consommation excessive de sucre sur cette motivation seront évalués. Enfin, les changements d’expression de gènes et de protéines dans le cerveau seront étudiés pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents
Bénéfices attendus
En identifiant les mécanismes physiologiques, notre recherche permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes centraux impliqués dans les troubles alimentaires. Nous observerons notamment si des différences motivationnelles intersexuelles existent. Ce projet servira egalement de base à un futur projet visant à evaluer les alterations moleculaires associées aux troubles alimentaires
Procédures
Exposition au sucre pour l’apprentissage de la tâche au maximum 45j, avec une session de 45 min par jour maximum selon les conditions testées. Une privation de nourriture avec le maintien du poids à 90% du poids de départ sera effectuée pendant la durée de l’expérience (45 j max). Consommation excessive de saccharose : les animaux ont le choix entre de l’eau et du sucre tous les jours, pendant 4h ou 24h selon le groupe expérimental, pendant 2 ou 8 semaines, selon les résultats. Prise de sang à 3 reprises lors du protocole (semaines 1, 4 et 8).
Impact sur les animaux
L’isolement des animaux permettant la mesure individuelle de consommations de liquide et de nourriture peut être une source de stress ou d’anxiété pour les animaux. Une perte de poids est attendue avec la restriction alimentaire mise en place la veille du paradigme operant. La restriction alimentaire est poursuivie pendant toute l’expérience avec un maintien du poids à 90% du poids de depart. La prise de sang à 3 reprises lors du protocole de binge saccharose peut induire une douleur et un risque d'infection voir de nécrose.
Devenir
Les animaux sont tous mis à mort pour prélèvements de tissus et analyses moléculaires .
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur la caractérisation comportementale et moléculaire d’une consommation excessive d’aliment ou de la motivation pour ces aliments, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques avec les mêmes cohortes utilisées pour l analyse comportementale et l’analyse moléculaire. Les expériences seront menées sur les deux sexes.
Raffinement
La surveillance des animaux est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (nourriture/sucre/eau), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours accès à de l’eau, Pour le paradigme opérant, les souris sont mises en restriction alimentaire afin de maintenir les animaux à 90% du poids initial pendant la durée de l’expérience. Le poids des animaux est monitoré tous les jours et la quantité de nourriture ajustée en fonction . Le prélèvement sanguin est effectué sous analgésie locale. Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés sera mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. De plus, les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires
Enseignement pratique à la production d’anticorps monoclonaux chez la souris
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Pour apprendre à des étudiants la production d'anticorps monoclonaux, 50 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur rate. Elles reçoivent trois injections d'adjuvant de Freund dans l'abdomen, qui peut provoquer une inflammation avec dos voûté et baisse d'activité, puis une prise de sang sous anesthésie avant la mise à mort. Le porteur reconnaît qu'une séquence sur cellules figure aussi au programme, mais affirme que ce modèle cellulaire "ne peut pas remplacer" l'animal et juge la méthode des hybridomes "indispensable". La finalité reste pédagogique, 50 souris tuées pour un travail pratique.
Objectifs
Les anticorps monoclonaux thérapeutiques font partie de la stratégie d’accélération "Biothérapies et bioproduction de thérapies innovantes" lancée par le gouvernement Français le 7 janvier 2022, dont l’objectif est de produire davantage de biomédicaments contre les cancers et les maladies chroniques et de créer les dispositifs médicaux de demain. La technique de choix pour développer des anticorps monoclonaux est celle dites des hybridomes (Prix Nobel de Physiologie/Médecine 1984). Le but de ce projet est de transmettre aux étudiants le savoir-faire pour développer et produire des anticorps monoclonaux. Ce projet permettra également d’introduire les étudiants aux techniques de culture cellulaire appliquée aux cellules de l’immunité (lymphocytes). Ces savoir-faire sont couramment utilisés dans les laboratoires de recherche publiques ou privés ou dans l’industrie pharmaceutique.
Bénéfices attendus
Cette séquence de travaux pratiques permettra l’acquisition de compétences spécifiques du développement d’anticorps monoclonaux. Lors de ce projet, les étudiants seront formés par l’enseignant à la manipulation des animaux et seront sensibilisés aux bonnes pratiques d’utilisation d’animaux à des fins de recherche et développement (bien-être animal, intérêt des 3R).
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à des injections intrapéritonéales toutes les deux semaines (3 injections au total). Sous anesthésie générale, un échantillon de sang sera prélevé, avant mise à mort pour prélèvement de la rate.
Impact sur les animaux
L’exposition à des solutions adjuvantes, comme l’adjuvant complet de Freund, peut induire juste après son injection des signes apparents d’inflammation telle que le dos vouté et une diminution des mouvements de l’animal.
Devenir
La mise à mort des animaux est justifiée pour réaliser le prélèvement de la rate des souris.
Remplacement
Dans le cas d’anticorps thérapeutiques déjà développés, la production se fait majoritairement dans l’industrie pharmaceutique via des modèles cellulaires. Afin de sensibiliser les étudiants aux méthodes alternatives à l’expérimentation animale, l’enseignement dans lequel s’inscrit le présent projet d’expérimentation animal inclut également une séquence de travaux pratiques de bioproduction d’anticorps par un modèle cellulaire. De façon importante, ce système ne peut pas remplacer l’utilisation d’animaux pour développer de nouveaux anticorps thérapeutiques. Pour développer un nouvel anticorps monoclonal, il est indispensable d’utiliser la méthode dites des hybridomes qui repose sur la production par un organisme model (par exemple la souris) de cellules produisant des anticorps dirigés contre un antigène d'intérêt. La réaction immunitaire mise en jeu durant le processus d’immunisation fait intervenir un grand nombre d’acteurs cellulaires différents qu'il n'est pas possible de mimer in vitro. En amont de l’expérimentation animale, les étudiants suivent une séance de travaux dirigés présentant le cadre éthique de l’utilisation d’animaux (formation de l’enseignant à l’expérimentation animale, le dépôt de projet etc) et les principes de remplacement, réduction et raffinement.
Réduction
Le nombre des animaux a été réduit à son minimum en considérant un nombre d’animaux suffisant pour permettre à chaque étudiant de pouvoir acquérir les bons gestes de manipulation les animaux. Avant la session d’expérimentation, les étudiants suivent un enseignement centré sur le calcul des effectifs d’animaux requis pour la comparaison des protocoles d’immunisation décrits dans ce projet. Cet enseignement vient en addition de l’enseignement en statistique dispensé lors des études de Pharmacie.
Raffinement
La taille des groupes de travaux pratique sera réduite à 5 personnes lors de la manipulation des animaux vigiles. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec de l'enrichissement et bénéficieront d'un suivi quotidien de leur état général. Le nombre d’immunisation et la quantité d’adjuvant injecté ont été diminué afin de limiter l’inconfort et la douleur des animaux. Les animaux présentant une dégradation de l’état général au-delà des points limites identifiés seront retirés de l'étude. L’ensemble des personnels intervenant sur les souris dispose d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale. En amont de l’expérimentation animale, les étudiants suivent une séance de travaux dirigés présentant le cadre éthique de l’utilisation d’animaux (formation de l’enseignant à l’expérimentation animale, le dépôt de projet etc) et les principes de remplacement, réduction et raffinement.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé pour le développement d'anticorps monoclonaux en recherche préclinique et dans l’industrie pharmaceutique. Ces travaux pratiques permettent de former les étudiants aux modèles avec lesquels ils seront amenés à travailler dans le cadre de leur activité professionnelle future. Les souris Balb/c seront utilisées à partir de 8 semaines afin que leur système immunitaire soit mature.
Production d’antigenes spécifiques à but de diagnostic medical de la toxoplasmose.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
9750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection de Toxoplasma dans l'abdomen, développe en trois jours une ascite riche en parasites, puis est mise à mort pour prélever cet antigène destiné à des tests diagnostiques commerciaux de la toxoplasmose. Le porteur décrit cette ascite comme "particulièrement bien supportée par les animaux", alors que la quasi-totalité des souris est classée en souffrance sévère, la complication infectieuse étant la source de cette gravité. Il justifie le recours à la souris par "l'absence d'alternative de bonne qualité" et l'échec des essais in vitro à atteindre les volumes et la sensibilité requis.
Objectifs
Le diagnostic de maladies infectieuses repose sur différents critères : signes cliniques, radiologiques, facteurs de risque associés… et sur les résultats de tests biologiques. L’utilité des tests biologiques est d’autant plus grande que certaines infections présentent peu ou pas de signes cliniques caractéristiques. Un large panel de tests biologiques existe de la culture de prélèvements à la recherche d’anticorps spécifiques dans le sang des patients. Cette recherche d’anticorps spécifiques est dans de nombreuses maladies infectieuses le seul moyen de diagnostiquer et secondairement de traiter certaines maladies. C’est dans ce but qu’une collaboration entre un laboratoire Hospitalo-Universitaire et une entreprise française a été mise en place avec l’objectif de développer des tests diagnostiques de maladies pour l’homme et/ou les animaux. Nous avons mis au point des tests fiables, spécifiques et sensibles de recherche d’anticorps de pathogènes parasitaires comme Toxoplasma gondii responsables de maladies graves et parfois mortelles chez l’Homme, et particulièrement chez les femmes enceintes et les patients immunodéprimés. L’utilisation d’antigènes de ces parasites est la clé de voute de la mise au point de tests sérologiques. En l’absence d’alternative de bonne qualité, l’obtention de tels antigènes passe par l’expérimentation animale. Suite à l’injection d’agents infectieux, l’animal va développer et produire une ascite de volume modéré (< 1 ml) riche en parasites en 3 jours. A noter que cette quantité d’ascite est très inférieure à celle obtenue pour la production d’Ac monoclonaux et est particulièrement bien supportée par les animaux. Ces ascites permettront de produire des antigènes de grande qualité pour développer des tests sérologiques permettant de faire le diagnostic de patients infectés. L’objectif de ce projet est donc de permettre la production de cet antigène spécifique pour pouvoir continuer de rendre accessible aux professionnels de santé les tests de diagnostic correspondants et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.
Bénéfices attendus
La production d’antigènes de toxoplasmose est un élément essentiel à la fabrication de nos tests de diagnostic médicaux. Ces tests, parce qu’ils sont reconnus comme des réactifs de référence, sensibles et spécifiques, sont utilisés par les laboratoires des CHU et des plateformes d’analyses médicales de France et du monde entier. Ils sont destinés aux professionnels de santé dans le cadre de diagnostic de dépistage et de confirmation de la sérologie parasitaire. Les bénéfices attendus du projet sont donc directs et immédiats : permettre de maintenir la production de tests de diagnostic de la toxoplasmose et ainsi améliorer la prise en charge et le bien-être des patients.
Procédures
Un seul geste technique sera réalisé sur animal vivant : il s’agit de l’inoculation inaugurale par voie intrapéritonéale. Cela nécessite la contention de l’animal de quelques secondes par un personnel qualifié afin d’éviter au maximum le stress et la douleur des animaux.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les nuisances possibles sur les animaux sont les suivantes : Peur et détresse engendré par le changement d’hébergement (arrivée à l’animalerie) (légère). - Peur, détresse, stress physique et/ou thermique engendrés par les conditions d’hébergement (légère). - Peur, détresse, stress physique, douleur causés par leur manipulation (légère). - Stress physique, douleur dus à une complication infectieuse (sévère). Le projet a été conçu de manière à minimiser les dommages causés aux animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’unique procédure expérimentale afin de réaliser des prélèvements post-mortem.
Remplacement
Pour pouvoir ainsi répondre à l’exigence qualitative et quantitative de la demande, l’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du présent projet et la souris reste le modèle le plus adapté. Les essais de production d’antigènes en modèles in vitro précédemment engagés au sein de nos laboratoires n’ont pas permis de retrouver les hautes performances en sensibilité et en spécificité caractérisant nos tests ni même de pouvoir assurer une production dans les volumes requis. Ainsi, pour ces raisons majeures de volume de production, de défaut de reproductibilité et de qualité médiocre de l’antigène obtenu, la culture in vitro ne permet pas une production d’antigène compatible avec le développement et la production d’un test de diagnostic présentant des performances au niveau des tests actuellement commercialisés, soumis au marquage CE, à la conformité avec la norme ISO 13485 et à l’attestation CE de conformité délivrée par un organisme notifié et devant répondre aux exigences du règlement européen. Certains fabricants se sont tournés vers l’utilisation d’antigènes recombinants. Malheureusement, ici aussi les performances des tests en sont fortement impactées tout comme leur spécificité. En conséquence, au regard de toutes ces analyses, ces expérimentations ne peuvent être conduites qu’in vivo.
Réduction
La volumétrie d’animaux utilisée pour la production d’antigènes sera fonction du volume de commercialisation des tests. Malgré une forte croissance de la demande des produits, la réévaluation du nombre d’animaux nécessaires à la production d’Ag par rapport au précédent projet est peu impactée. Ceci s’explique par les analyses réalisées par le laboratoire pour augmenter la qualité des échantillons récoltés et ainsi limiter ceux définis comme non conformes à l’utilisation requise. Une estimation a été réalisée sur la période 2018-2023 : une souris permet de produire suffisamment d’antigène pour la constitution de 1000 tests de confirmation ou de dépistage. Également, le laboratoire possède les compétences pour congeler la souche entre sessions de production d’antigènes. Le parasite n’est pas maintenu en permanence sur souris. De par les volumes de production actuellement nécessaires, cela permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée à l’animalerie, une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront hébergés par groupes d’individus compatibles, dans des conditions contrôlées et avec la mise en place d’un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Aucun des animaux ou groupe d’animaux ne sera traité différemment que ses congénères. Une fiche de suivi sera rédigée pour chaque cage avec un suivi de signes comportementaux, physiques et physiologiques. Chacun de ces critères étant évalué fréquemment, la détermination de point(s) limite(s) bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, permettra immédiatement de déterminer un animal en souffrance. Une fiche suivra le protocole tout au long de son séjour dans notre animalerie et permettra d’identifier l’arrêt du protocole (points limites). Ces points limites seront : souris prostrée et isolée, poils hérissés, manque de toilettage, léthargie, ventilation anormale, tremblements. Nous attacherons une grande importance à l’apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Les soins et les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel qualifié. Afin d’éviter que le suivi de leur santé ne devienne un stress supplémentaire pour eux, la familiarisation aux manipulateurs sera quotidienne pendant la période d’acclimatation (1 semaine minimum).
Choix des espèces
Cette souche parasitaire de toxoplasmes peut infecter aisément la plupart des animaux de laboratoire, à l’exception du rat qui est particulièrement résistant et qui ne développe jamais d’infection aiguë avec ascite. Néanmoins, la souris est l’espèce intermédiaire naturelle et celle qui présente une sensibilité importante avec une production très riche en parasites. Les souris utilisées seront de jeunes adultes (femelles) de 6 à 18 semaines (de 20 à 30g). Ces animaux sont peu agressifs et la familiarisation aux manipulateurs sera effective.
Evaluation sous-cutanée de la biocompatibilité et de la dégradation d’hydrogels injectables chez la souris C57BL/6
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie, chacune reçoit quatre injections d'hydrogels sous la peau du dos, avant une mise à mort échelonnée de 24 heures à 4 semaines pour prélever les matériaux et les tissus environnants. Le projet évalue la tolérance et la vitesse de dégradation de ces gels en vue d'applications allant de la régénération osseuse au comblement des rides. Le porteur affirme que les processus inflammatoires ne sont pas modélisables in vitro, ce qui justifie selon lui le recours à la souris.
Objectifs
L'étude de la littérature et nos études préliminaires in vitro ont montré l’intérêt de l'utilisation d'hydrogels comme nouveaux biomatériaux pour l'ingénierie tissulaire. De nombreuses études soulignent désormais l’importance de développer des matériaux ayant une vitesse de dégradation adaptée, et l’importance de la capacité des cellules à interagir et/ou à remodeler ces matériaux pour régénérer des tissus. L'objectif de ce projet est d'étudier la biocompatibilité de nouvelles associations d'hydrogels pour l’ingénierie tissulaire en conditions plus physiologiques que la culture in vitro. Le système inflammatoire et immunitaire joue en effet un rôle majeur dans la réponse de l'hôte dans le cadre des biomatériaux complexes. L'utilisation d'un modèle murin nous permettra de visualiser la réponse inflammatoire, paramètre majeur en vue d'une potentielle application chez l'Homme. Un deuxième objectif est d’étudier la vitesse à laquelle les hydrogels sont dégradés en conditions physiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre l’influence de différentes formulations d’hydrogels sur les processus inflammatoires qui interviennent suite à l’implantation de ces matériaux, mais également sur les processus mis en jeu pour les dégrader. Ainsi, les résultats de cette étude devraient permettre de choisir des formulations d’hydrogels pertinentes pour des applications précises de médecine régénératrice, telles que la régénération de l’os et du cartilage mais également pour les comblements de rides et le remodelage corporel.
Procédures
Sous anesthésie gazeuse, le dos des souris sera tondu, désinfecté, puis les souris recevront chacune 4 injections en sous-cutané au niveau dorsal de nos formulations en conditions d’asepsie. Chaque injection sera très rapide, environ 10 secondes. Les souris seront ensuite surveillées jusqu’à leur réveil qui aura lieu environ 5 min après le début de l’anesthésie. Elles seront observées quotidiennement les 2 premiers jours suivant l’intervention, puis 2 fois par semaine ensuite par les expérimentateurs en plus de la surveillance quotidienne réalisée par le personnel de l’animalerie, afin de vérifier qu’elles ne présentent pas de signes de douleur ou d’infection au niveau du site d’injection. Les souris seront ensuite euthanasiées 24 h, 72 h, 1 semaine ou 4 semaines après l’intervention. Les hydrogels et leurs tissus environnants seront ensuite explantés pour réaliser des analyses histologiques qui permettront d’évaluer la biocompatibilité et la vitesse de dégradation de ces biomatériaux.
Impact sur les animaux
L’injection sous-cutanée est un acte mini-invasif qui est déjà pratiqué par notre laboratoire depuis plusieurs années, et qui ne cause habituellement pas de douleur chez les animaux. Si tel était le cas les souris recevraient une dose d’analgésique pour pallier à la douleur. Les souris peuvent également ressentir une gêne dû à l’emplacement des hydrogels au niveau dorsal mais rien qui n’altererait leur alimentation ou leurs déplacements au delà de la simple gêne.
Devenir
Afin d’évaluer la vitesse de dégradation des matériaux et leur biocompatibilité, il est nécessaire de récupérer les matériaux ainsi que les tissus environnants. Pour cette raison, tous les animaux devront être euthanasiés à l’issue de la procédure.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro ont été réalisées pour simuler une dégradation enzymatique des hydrogels. Ces études ont permis de sélectionner un nombre limité de formulations pertinentes pour nos objectifs de contrôle de la dégradabilité. Pour ce qui est de la biocompatibilité, des études in vitro ont également été réalisées pour vérifier la compatibilité des cellules avec les différentes formulations. Le remplacement de l'animal pour cette expérimentation n’est toutefois pas réalisable car les processus inflammatoires et immunitaires sont complexes et font appel à des systèmes non modélisables in vitro.
Réduction
Quatre injections seront réalisées par animal, ce qui limite le nombre nécessaire de souris pour ces expérimentations. La réalisation de ces 4 injections a montré une très bonne tolérance dans les expérimentations précédentes réalisées au sein du laboratoire. Par ailleurs, plusieurs types d’analyses (analyses d’imagerie, histologie, immunohistochimie) seront réalisées sur un même échantillon pour répondre aux deux questions posées par cette étude en même temps, ce qui diminuera aussi le nombre d’animaux nécessaires. Nous réaliserons 8 injections par condition, ce qui nous permet depuis déjà de nombreuses années de mettre en évidence des résultats statistiquement différents, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour cette étude, nous avons choisi d'injecter les biomatériaux à l'aide d'une aiguille sous anesthésie gazeuse, ce qui permet de limiter le stress qui pourrait être causé par l’injection. De plus, l’injection est un procédé qui permet de limiter l'inflammation du site d'implantation, car c'est un acte mini-invasif. Après l’intervention, Les souris seront observées par les expérimentateurs quotidiennement 48h après l’intervention, puis deux fois par semaine ensuite pour s'assurer de leur bien-être. Si toutefois un signe de mal-être ou de douleur était observé, les animaux recevront une dose d’analgésique. Nous avons en effet mis en place des points limites adaptés, une grille de score et un arbre décisionnel nous permettant d’agir si le moindre signe de douleur venait à apparaître.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin immunocompétent est essentielle pour visualiser la réponse inflammatoire, paramètre majeur en vue d'une potentielle application chez l'Homme. Les études seront réalisées avec des souris adultes, c'est-à-dire, âgées de 12 semaines. Cela correspond à de jeunes adultes avec une croissance terminée, une maturation sexuelle et un potentiel de régénération conservé.
Hydrogénothérapie et mesure de la biodistribution chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
200 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie unique pouvant durer jusqu'à trois heures, avec l'implantation de sondes destinées à mesurer la répartition du dihydrogène dans les organes, et le porteur signale des risques de détresse respiratoire et d'hémorragie. Le projet cherche à décrire la distribution et l'élimination du H2 selon la voie d'administration, présenté comme un candidat médicament. Le porteur affirme qu'aucun modèle sans animaux ne peut remplacer la complexité du corps et qualifie cette étape d'"incontournable".
Objectifs
Le dihydrogène (H2) est un candidat médicament très intéressant de par ses effets bénéfiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore du cancer. La petite taille de l'H2 lui permet de diffuser facilement dans les tissus et les organes. Lors de précédentes études, l'évolution de la concentration en H2 dans le coeur et dans le sang, pendant une administration par inhalation, a été explorée chez le rat. Au cours de ce projet, l'évolution de la concentration en H2 sera mesurée grâce à une sonde implantée dans différents tissus cibles. La présente étude permettra de déterminer la distribution et la vitesse d'élimination de l'H2 dans les différents organes suite à son administration par différentes voies et de qualifier chaque voie d'administration sur un plan qualitatif et quantitatif.
Bénéfices attendus
Ce projet est une étape incontournable pour la mise au point de nouvelles thérapies basées sur l'H2 qui permettront de soigner des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore le cancer.
Procédures
Chaque animal subira une intervention chirurgicale unique d'une durée maximale de 3 heures. Un même animal sera soumis à une anesthésie complémentée avec une analgésie, suivie d'une administration d'H2 par différentes voies possibles. La quantité d'H2 distribuée dans différents tissus sera mesurée à l'aide d'une sonde. Au terme de la mesure ou des trois heures, l'animal sera mis à mort sans réveil préalable.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de détresse respiratoire ou des hémorragies.
Devenir
La procédure proposée est en classe "sans réveil", la mise à mort des animaux est donc incluse dans cette procédure et inévitable du fait du caractère lésionnel des abords chirurgicaux et de l'utilisation des sondes de mesure.
Remplacement
La présente étude a pour objectif de caractériser précisemment la distribution de l'H2 dans les différents organes et son élimination suite à un traitement à l'H2. Actuellement, il n'est pas possible de remplacer la complexité du corps humain par des modèles n'utilisant pas d'animaux, d'où la nécessité de leur utilisation dans ce projet.
Réduction
Un maximum de 200 rats sera utilisé dans ce protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux il est prévu d'effectuer les mesures d'H2 dans plusieurs organes par animal car nous disposons de plusieurs sondes. Il est envisagé qu'une dizaine de modes d'administration d'H2 seront testés, chaque groupe expérimental sera constitué de 20 animaux (10 contrôles et 10 traités ; prenant en compte une éventuelle mortalité due à l'opération d'environ 10%). Ce nombre d'animaux permettra de réaliser un test statistique afin de valider nos résultats. De plus, des animaux venant d'autres protocoles de contrainte légère à modérée pourront être utilisés.
Raffinement
Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. L'ensemble des personnels impliqués est à jour des formations réglementaires exigibles pour les manipulations sur des animaux vivants. Le rat correspond à l'espèce animale la plus pertinente dans ce type d'étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. L'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale complémentée par une analgésie.
Choix des espèces
Les similitudes d'anatomie et de physiologie entre le rongeur et l'Homme permettront d'obtenir une comparaison fiable des données obtenues et une meilleure compréhension de la distribution de l'H2 dans l'organisme. De plus, le diamètre des sondes utilisées (1,1-1,6 mm) est compatible avec la dimension des organes cibles de l'étude. Nous utiliserons des rats adultes de minimum 7 semaines pour les mâles et 10 semaines pour les femelles (d'un poids corporel supérieur à 300g). Ce sont les animaux les plus couramment utilisés en pharmacologie de sécurité.
Impact d’une pneumonie à Influenza sur les fonctions des macrophages pulmonaires : mise au point et validation chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent le virus de la grippe par le nez ou par la trachée sous anesthésie, avec une perte de poids que le porteur décrit comme transitoire et inférieure à 10 %. Le projet vise à mettre au point ce modèle d'infection pulmonaire et à étudier la réponse des macrophages du poumon. Le porteur affirme que la complexité des interactions cellulaires rend le modèle animal "indispensable", sans détailler la justification de l'effectif de 3 900 animaux.
Objectifs
Notre projet vise à développer un modèle murin d’infection pulmonaire induit par le virus de la grippe, et à utiliser ce modèle pour explorer les conséquences d’une inflammation sévère sur la fonction des macrophages alvéolaires (Cellules retrouvées dans les alvéoles des poumons). Les objectifs de notre projet sont : 1-De mettre en place un modèle murin de pneumonie induit par un virus de la grippe 2-D’évaluer l’évolution temporelle des cellules immunitaires (macrophages, neutrophiles, cellules dendritiques) au cours de la phase inflammatoire et de sa résolution. 3-D’appréhender les conséquences de l’infection virale sur les fonctions des macrophages (phagocytose, activation, production de cytokines). 4-De définir le rôle du recrutement des macrophages inflammatoires dans la physiopathologie de la pneumonie et l’impact sur la cicatrice immunitaire post-inflammatoire.
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’évaluer le rôle d’une inflammation virale pulmonaire sur le rôle et la fonction des cellules myéloides, notamment les macrophages alvéolaires, première ligne de défense contre les pathogènes respiratoires.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une instillation nasale. Cette instillation sera réalisée sur animaux vigile. Une partie des animaux de ce projet sont soumis à une adminsitration intra-trachéale sous anesthésie générale. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Ces interventions sont de courte durée (1 min environ)
Impact sur les animaux
Modèles d’infection : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendre pas de douleurs résiduelle ainsi que de stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage est préalablement enduite d'un antalgique afin d’anesthésier localement la trachée.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Evaluation de l’impact de l’électrostimulation du nerf splénique sur la fonction des lymphocytes T CD4+ dans un modèle d’encéphalite aigue expérimentale (EAE)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de modéré à sévère. Une partie subit l'implantation chirurgicale d'une électrode sur le nerf de la rate, puis une induction de sclérose en plaque expérimentale provoquant une paralysie partielle des membres et une perte de poids, d'autres recevant un transfert de lymphocytes. Le projet évalue si l'électrostimulation du nerf splénique agit sur des cellules immunitaires impliquées dans la maladie. Le porteur affirme que ce type d'étude ne s'envisage que sur des "organismes entiers".
Objectifs
L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer l'effet de l'électrostimulation du nerf splénique la fonction de cellules immunitaires appélées lymphocytes T CD4+ dans un modèle murin de sclérose en plaque, l’encéphalite autoimmune expérimentale (EAE). Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrotimulation en clinique. La sclérose en plaque est une maladie neuro-dégénerative inflammatoire chronique caractérisée par une atteinte du système nerveux central. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable obligeant à changer souvent de molécule. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement le développement de l’encéphalite autoimmune expérimentale (EAE), modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur la fonction des lymphocytes T CD4, cellules fortement pathogéniques dans ce modèle d'EAE, n’a jamais été évalué. Nous cherchons donc à évaluer l'effet de l'électrostimulation du nerf splénique sur la fonction des lymphocytes T CD4+. Le projet consiste à : 1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique); 2- puis induire une sclérose en plaque expérimentale (modèle d’EAE par injection sous-cutané d’un antigène dérivé de la myéline et d’un adjuvant) ; 3- puis évaluer la fonction des lymphocytes T CD4 de souris électrostimulées ou non en les transférant par injection intraveineuse (= transfert adoptif) dans des souris receveuses atteintes d'EAE. L'évaluation du score clinique sera effectuée tous les jours suivants l'induction de l'EAE. Cette étude comparative chez la souris apportera les éléments nécessaires pour déterminer l’impact sur les fonctions inhibitrices ou pathogéniques des lymphocytes T CD4+.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation du nerf splénique la fonction des lymphocytes T CD4+ dans un modèle murin de sclérose en plaque. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules pathogéniques impliquées dans la sclérose en plaque pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
L’ensemble des animaux seront rasés et l’EAE sera induite par immunisation. Pour ce faire, deux injections d'adjuvant complet de Freund (CFA) et d’un peptide dérivé de la Myéline Oligodendrocyte Glycoprotéine seront administrées par voie sous-cutanée à la base de la queue sous anesthésie générale à l’isoflurane . Le CFA est composé à 50% d’huile minérale et à 50% d’eau. De la toxine pertussis (PTX) sera également injectée par voie intra-péritonéale . La PTX permet la perméabilisation de la membrane hémato-encéphalique. Deux jours après l’immunisation,de la toxine pertussis sera injectée par voie intrapéritonéale sous anesthésie générale à l’isoflurane . Transfert adoptif (300 animaux): Les groupes faisant l’objet d’un transfert adoptif (300 animaux) recevront une injection intra-veineuse d’un million de cellules ou non sous anesthésie générale. Implantation électrode : 120 animaux les animaux recevront un analgésique (Buprénorphine® par voie intra-péritonéale , 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale à l’isoflurane . Après rasage et désinfection, une ouverture de l’abdomen sera réalisée. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique. La paroi abdominale sera suturée avec du monofils résorbable puis le plan cutané sera suturé avec des fils non résorbables. Les fils connectant cette électrode aux connecteurs seront acheminés par voie sous-cutanée jusqu'à la tête de l’animal. Une incision sera pratiquée à l'arrière du crâne permettant l'exposition de la boîte crânienne. Un ciment dentaire sera alors utilisé pour fixer les connecteurs au crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain de l'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire non stéroïdien (Metacam sirop dans l’eau de boisson) maintenu pendant les 3 jours suivants. Animaux classés sans réveil : 60 animaux (Groupes temoins naifs ). Pas de prélèvement sur animaux vigiles
Impact sur les animaux
1- Nuisances associés à l’EAE : L’EAE consiste en l’injection d’un adjuvant avec un peptide de la myéline (petide MOG). Cette injection provoque chez l’animal une réaction auto-immune dirigée contre la myéline du système nerveux central, conduisant à une démyélinisation des fibres nerveuses et un dommage axonal. Entre 8 et 12 jours après l’injection, les premiers déficits moteurs apparaissent, touchant principalement les membres inférieurs. Ces déficits sont caractérisés par une paralysie partielle des membres et sont donc associés à une mobilité réduite et à une perte de poids. Le pic de la pathologie est atteint aux alentours du jour 14 post induction puis les symptômes associés à la maladie vont décroitre progressivement jusqu’à la fin de l’expérimentation. 2- Nuissance associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. Une douleur d’une durée estimée à 48 heure est par contre engendrée par la procédure chirugical permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requière une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 14 ou 21 jours (risques de rognage de fils). 3-Nuissances associées au transfert adoptif des lymphocytes T CD4 L’injection de lymphocytes T CD4 isolés de souris électrostimulées ou non se fera en intraveineuse sous anéthésie gazeuse. Le transfert de lymphocytes T CD4 dans le modèle d’EAE a été largement décrit dans la littérature et peut être associé à une augmentation du score clinique de lordre de 15% au maximum (dans le cas de lymphocytes T CD4 fortement pathogéniques).
Devenir
Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera mis à mort.
Remplacement
Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.
Réduction
Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par par une approche statistique.
Raffinement
Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique et une grille d’observation préétablie prévoyant des mesures correctives et la mise en œuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’EAE a été la mieux caractérisée. Le projet portera sur des souris femelles C57Bl/6 âgées de 8 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20 et 25 gr). De plus, à 8 semaines les souris ont atteints leur maturité. Cet age correspondent à un jeune adulte, qui est l’âge auquel la sclérose en plaque est généralement révélée chez l’homme
Interactions douleur et prise excessive de sucre ou d’alcool chez la souris : analyses comportementales et moléculaires
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de modéré à sévère. Elles sont isolées pour mesurer leur consommation de sucre ou d'alcool, subissent des prélèvements sanguins répétés et une chirurgie induisant une douleur neuropathique, le porteur indiquant renoncer à tout antalgique pour ne pas fausser ses mesures. Le projet étudie les liens entre douleur, prise excessive de sucre ou d'alcool et addiction. Le porteur affirme que ce travail comportemental et moléculaire n'est possible que sur "l'animal entier".
Objectifs
Dans les pays développés, la consommation alimentaire semble être motivée par le plaisir plus que par le besoin de se nourrir. Ce phénomène, qui consiste à consommer un aliment pour son goût agréable (appétissant), apparaît préoccupant puisqu’il peut devenir la cause de maladies comme l’obésité. Les adaptations comportementales et cérébrales associées à ces troubles de l’alimentation pourraient partager des similitudes avec celles mises en place dans l’addiction à l'alcool. Notre programme de recherche vise à étudier la relation entre les prises excessives de nourriture appétissante et la consommation d'alcool. En particulier, l’apparition de douleur chez des patients souffrant d’addiction à l’alcool a été décrite mais n’est pas bien comprise. Nous faisons l’hypothèse que les troubles de l’alimentation pourraient jouer un rôle dans le développement de douleur, et nous étudions les mécanismes sous-jacents. Les objectifs sont donc dans un premier volet de (1) mesurer les réponsesà la douleur dans nos modèles, et d'effectuer des mesures du bien-être ; (2) caractériser les changements d’expression de gènes et de protéines dans le cerveau. Dans un deuxième volet, nous souhaitons (3) étudier les effets d’une douleur neuropathique sur la consommation de sucre ou d’alcool.
Bénéfices attendus
En identifiant les mécanismes physiologiques, notre recherche permettra d’améliorer la compréhension des mécanismes centraux impliqués dans les troubles alimentaires et dans l’addiction en général, et en particulier dans le cadre de douleur neuropathique.
Procédures
-Prise de sang à 3 reprises lors du protocole de binge saccharose en PE1 (semaines 1, 4 et 8); Prélèvement sanguin, au maximum tous les 15j, après le début des régimes, en PE2, PE3 et PE5; -Chirurgie, PE5, Modèle douleur neuropathique, 1 fois pour chaque animal, suivi sur 8 semaines maximum
Impact sur les animaux
Nous utilisons des modèles de consommation excessive qui nécessitent l’isolement des animaux pour une précision des mesures. Nous surveillons les animaux quotidiennement. La prise de sang à 3 reprises lors du protocole de binge saccharose peut induire une douleur et un risque d'infection voir de nécrose. Un modèle de douleur neuropathique sera utilisé dans le deuxième volet de l’étude, pour lequel une chirurgie est effectuée sous anesthésie générale. Dans ce modèle, les souris présentent des seuils nociceptifs abaissés, qui sont aussi des symptômes de neuropathie observés en clinique. Cependant nous ne pouvons pas utiliser de moyens pharmacologiques pour réduire la souffrance des animaux car cela risquerait d’interférer avec les mécanismes que nous étudions.
Devenir
PE1 à PE5: Les animaux sont tous mis a mort ( lots détaillés dans chaque PE) pour prélèvements de tissus et analyses moléculaires
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur la caractérisation comportementale et moléculaire d’une consommation excessive d’aliment ou d’alcool, ou d’une douleur, il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques pour l’analyse comportementale et l’analyse moléculaire. L’effectif est plus important pour l’expérience de neuropathie, pour prévenir des aléas expérimentaux ainsi qu'une éventuelle variabilité. Les expériences seront menées sur les deux sexes.
Raffinement
La surveillance des animaux est journalière (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture) et une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (sucre ou alcool), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours le choix de consommation (sucre ou alcool) avec de l’eau. Les souris, habituées au dispositif expérimental avant le début des mesures, peuvent se soustraire à la stimulation nociceptive. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Le prélèvement sanguin est effectué sous analgésie locale. Un suivi spécifique à chaque procédure avec des points limites adaptés sera mis en place pour éviter toute souffrance éventuelle. Les procédures regroupent plusieurs tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire l’effectif. De plus, les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires et l’addiction. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires et de la dépendance aux drogues.
Etude du remodelage des neurones à parvalbumine dans l’hippocampe de souris modèles de la maladie d’Alzheimer soumises à un enrichissement environnemental
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 570 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de léger à modéré, 1 456 étant mises à mort pour prélèvement de tissus et 114 gardées vivantes pour d'autres projets. Modèles d'Alzheimer, elles subissent des chirurgies d'une à deux heures et demie avec injections et pose d'électrodes, des enregistrements cérébraux en cage isolée et des tests de mémoire spatiale et sociale. Le projet cherche à relier l'effet d'un environnement enrichi sur la mémoire au remodelage de certains neurones de l'hippocampe. Le porteur affirme qu'étudier des comportements complexes rend "indispensable" le modèle animal.
Objectifs
Dans le cerveau, certains neurones jouent un rôle clé dans le contrôle de l’activité des autres neurones et dans la formation et le maintien des souvenirs. Après un apprentissage, ces neurones subissent des modifications qui leur permettent d'assurer la stabilité des souvenirs nouvellement acquis. Or, ces neurones fonctionnent de façon anormale dans le cerveau de souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) ainsi que celui de patients atteints par cette pathologie. Chez l'humain, les études épidémiologiques indiquent qu'une vie riche en expériences diverses, que ce soit sur le plan intellectuel, sportif ou social par exemple, permet de former une réserve cognitive qui permettrait de diminuer les risques ou de ralentir la progression des maladies neurodégénératives. Cette ressource repose sur le fait que le cerveau peut compenser différentes lésions ou affections cérébrales en utilisant des réseaux neuronaux préexistants, ou en activant de nouvelles connexions neuronales. En accord avec cette idée, les souris modèles de la maladie d'Alzheimer placées dans un environnement enrichi (EE) qui comporte des expériences sensorielles et sociales stimulantes (cages plus grandes, avec plus de congénères, et des objets changés régulièrement) ont des capacités d’apprentissage et de mémoire améliorés au moins pendant plusieurs mois. Ce projet vise à démontrer que les améliorations comportementales observées chez les souris Alzheimer sont directement liées aux modifications subies par les neurones impliqués dans la formation et le maintien des souvenirs suite à ces stimulations. Il cherchera également à évaluer si les changements subis par ces neurones suite au séjour dans l’EE s’accompagne d’un rétablissement de l’activité électrique dans la région cérébrale clef dans la formation des souvenirs, l’hippocampe.
Bénéfices attendus
Ce projet se place dans le contexte général de la compréhension des substrats neuronaux à l’amélioration comportementale et cognitive observée suite à des stimulations sensorielles et sociales dans la maladie d’Alzheimer (concept de réserve cognitive). Précisément, l’objectif de ce projet est de montrer le lien causal entre le remodelage d'une population de neurones et l’amélioration de la mémoire après le séjour dans un environnement enrichi (EE) chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Dans un premier objectif, nos expériences nous permettront de déterminer si c’est l’activation de ces neurones qui sous-tend l’amélioration de la mémoire des souris, ou s’il s’agit de la modification de ces neurones, ou si les deux sont nécessaires. Le deuxième objectif permettra d’étudier si les changements subis par ces neurones suite à un séjour dans un EE s’accompagnent d’un rétablissement de l’activité électrique cérébrale. Le troisième et dernier objectif permettra d’évaluer si la stimulation de ces neurones, en dehors de toutes stimulations environnementales, et suffisante pour obtenir des bénéfices comportementaux et d’activité cérébrale chez les souris modèles de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale d’une durée variant de 1h à 2h30 en fonction des gestes réalisés : ils pourront recevoir des injections (entre 1h et 1h30 par animal), des poses d'électrodes (environ 1h par animal), ou la combinaison des deux gestes précédemment cités (entre 2h et 2h30 par animal). Une partie des individus sera soumise à trois enregistrements de l’activité cérébrale, espacés dans le temps, et qui dureront de 72h à 24h. Durant ces phases d’enregistrements, les animaux seront placés dans des cages individuelles. Enfin les souris sont soumises à des tests comportementaux afin d’évaluer leur mémoire spatiale (3x10 min par animal) et leur mémoire sociale (90min par animal).
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale peut induire une douleur modérée au stade post opératoire (environ 12h). De plus, durant les enregistrements de l’activité cérébrale, les souris seront placées individuellement dans des cages isolées les unes des autres ce qui peut induire un stress durant les premières heures (3 sessions d’une durée totale de 120h). Par ailleurs, toutes les manipulations liées aux tests comportementaux peuvent engendrer un stress léger. Enfin, dans le cadre de leur suivi à l’aide d’une grille de scoring par le personnel de l’animalerie, les animaux sont pesés deux fois par semaine, ce qui peut engendrer un léger stress dû à leur manipulation.
Devenir
1456 souris seront mises à mort pour réaliser des prélèvements de tissus et effectuer des observations anatomiques et histologiques nécessaires à la validation scientifique de ce projet. 114 souris seront maintenues en vie et pourront être réutilisées dans d’autres projets.
Remplacement
L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes et les activités cérébrales associées à la maladie d'Alzheimer, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider une stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum pour nous permettre de comparer statistiquement les groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d'animaux, la mémoire sociale et la mémoire spatiale seront étudiés sur les mêmes individus.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe de 2 à 5 individus dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Après réception, un temps d'habituation d'une semaine est respecté avant le début des expériences. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin et des points limites ont été définis à partir d’une grille de scoring. En cas de blessure ou de souffrance, les animaux recevront un traitement analgésique adapté. Tous les signes de souffrance détectés lors de l’observation quotidienne tels qu’un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos voûté, une expression faciale modifiée, une altération du pelage, une perte de poids > 20% conduiront à la mise à mort de l’animal en accord avec le vétérinaire référent. Concernant les chirurgies, elles seront réalisées sous anesthesie générale dans des conditions aseptiques et accompagnées d'une analgésie.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris car il existe des souris modifiées génétiquement présentant des symptômes similaires à la maladie d’Alzheimer humaine. Elles seront utilisées à l’âge de 5-6 mois car à cet âge, les souris présentent un stade modéré́ de la maladie. En ce qui concerne les souris démonstratrices pour les tests de mémoire sociale, elles seront toutes des femelles non-transgéniques, âgées entre 3 et 9 mois. Cette tranche d'âge correspond à des souris adultes. En effet, il est préférable d'utiliser des souris démonstratrices ni juvéniles (moins de 8-10 semaines), ni âgées (plus de 9-10 mois), ce qui pourrait entrainer des comportements sociaux différents.
Etude de faisabilité : induction d’une réaction inflammatoire intestinale chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
8 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles reçoivent trois injections dans l'abdomen destinées à déclencher une inflammation intestinale que le porteur reconnaît douloureuse, avant un prélèvement des intestins. Le projet se limite à tester la faisabilité de cette induction avant une étude plus large, et le porteur précise recourir à des souris "produites en excès" dans ses élevages. Il affirme que la réponse inflammatoire, jugée trop complexe, ne peut se modéliser hors d'un organisme vivant.
Objectifs
L’inflammation est une réponse normale du corps qui nait, s’amplifie et s’éteint. Elle est consécutive à une agression interne (comme un cancer) ou externe (comme une infection). Lorsque le corps n’arrive plus à maîtriser l’inflammation, celle-ci peut engendrer des maladies diverses comme le diabète, le cancer ou devenir chronique comme l’arthrite, la maladie de Crohn par exemple. Les mécanismes de la phase d’initiation de l’inflammation sont maintenant bien compris. En revanche, les mécanismes de la phase d’arrêt de l’inflammation le sont moins. Ces dernières années, des travaux ont permis de comprendre cette phase appelée résolution caractérisée par l’arrêt de la réponse inflammatoire, la réparation du tissu enflammé pour permettre finalement le retour à l’état initial du tissu appelé homéostasie. In vitro, nous avons trouvé une stratégie permettant d’augmenter le nombre de cellules impliquées dans la résolution de l’inflammation. Il est impossible de définir si nos observations in vitro sont pertinentes in vivo. C’est pourquoi, nous souhaitons mener une étude de faisabilité de l’induction d’une inflammation intestinale chez la souris par un protocole simple et rapide. Si les résultats sont concluants, une étude plus vaste sera menée.
Bénéfices attendus
Si les résultats sont convaincants et permettent en effet d’induire une inflammation intestinale, alors nous proposerons un projet visant à valider nos données obtenues in vitro pour améliorer la résolution de l’inflammation.
Procédures
Les animaux vont être soumis à 3 injections intrapéritonéales le lundi, mercredi et vendredi de 15 secondes connues pour ne pas être particulièrement douloureuses.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être soumis à 3 injections intrapéritonéales de 15 secondes connues pour ne pas être particulièrement douloureuses mais la manipulation des animaux peut induire un stress. L’inflammation intestinale induite peut s’avérer douloureuse.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les intestins
Remplacement
Nos données obtenues in vitro montrent le rôle d’un récepteur aux signaux de danger dans la balance entre les cellules inflammatoires ou non inflammatoires. La réponse inflammatoire étant un phénomène complexe faisant intervenir beaucoup de cellules, de molécules et leurs interactions, il est impossible de la modéliser en dehors d’un organisme vivant.
Réduction
Dans un souci de réduction, notre demande d’expérimentation vise à évaluer la faisabilité de cette expérience avant de proposer une étude plus large. Afin d’avoir une réponse fiable quant à l’induction de l’inflammation, nous n’utiliserons que 8 souris. Quatre d’entre elles permettront de réaliser une analyse par cytométrie et les 4 autres feront l’objet d’une analyse par histochimie. De plus, cette expérience sera réalisée sur des souris de nos élevages produites en excès.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à raison de 10 animaux par cage dans un environnement adapté et enrichi. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Chaque animal sera examiné quotidiennement tout au long de l’expérimentation. L’inflammation intestinale cause des douleurs. En cas de signes de douleur ou de souffrance prolongée et/ou trop intense, les souris seront mises à mort. Afin de mieux les apprécier une grille de score sera utilisées. En cas de problèmes de mobilités induits par la douleur, nous ajouterons des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible.
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à partir de 8 semaines, c’est-à-dire possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de part l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Ainsi, si cette étude pilote s’avère concluante, nous envisagerons un projet faisant intervenir des animaux transgéniques.
Etude de la réponse physiologique chez une souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt lors d’une altération pharmacologique de la fonction cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une mini-pompe implantée sous la peau du dos sous anesthésie, subissent des échographies cardiaques répétées et une induction pharmacologique d'hypertension qui peut entraîner une mortalité dans les jours suivants. Le projet étudie le rôle d'un gène dont l'inactivation altère la fonction cardiaque, dans un contexte d'hypertension, et teste un traitement. Le porteur affirme qu'aucune autre approche ne permet d'étudier ce gène dans un organisme vivant et que la souris est la "meilleure approche disponible".
Objectifs
Nous souhaitons étudier le rôle d'un gène d’intérêt dont l'inactivation entraîne une anomalie de la fonction cardiaque. Plus particulièrement, nous souhaitons étudier le rôle de ce gène dans le cadre d'une hypertension. Ce projet vise ainsi à comprendre si la suppression de ce gène pourrait modifier les réponses du système cardiaque lors d'une hypertension. Ces travaux sont une étape nécessaire dans le développement de traitements potentiels des troubles cardiaques observés chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque ou d'hypertension. Dans ce projet, nous prévoyons donc d'analyser des animaux génétiquement modifiés, porteurs d'une délétion totale du gène d’intérêt. Afin de déterminer l'impact de l’inactivation du gène d’intérêt sur la fonction cardiaque, dans un contexte d'hypertension nous utiliserons un modèle pharmacologique. De plus, nous testerons l’effet d’un traitement qui a pour but de réduire l’hypertension. Ainsi, nous tenterons de comprendre d’une part le rôle de la mutation dans la réaction à l'hypertension d'origine cardiaque et d’autre part l’effet du traitement sur cette hypertension.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur le gène étudié, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux médicaments dans le cadre des troubles cardiaques observés chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque ou d'hypertension.
Procédures
3 prélèvements sanguins qui durent quelques minutes. 4 injections intrapéritonéales ( uniquement pour les groupes avec traitement) qui durent environ moins d'1 minute. 3 évaluations cardiaques avec une anesthésie gazeuse de 45 minutes environ. 1 implantation sous-cutanée de mini-pompe avec une anesthésie gazeuse d'une durée de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une implantation sous-cutanée au niveau du dos de mini-pompes sous anesthésie gazeuse. Cette implantation entrainera une douleur locale post-opératoire qui sera couverte par des antalgiques. Suite à cette implantation, les animaux subiront une anesthésie gazeuse pour effectuer des échographies cardiaques. Celle-ci dure environ 45 minutes et les animaux se réveillent spontanément. Une mortalité peut se présenter dans les jours suivant la mise en place de l'hypertension. Des points limites adaptés permettent d'anticiper ce risque pour éviter toute souffrance animale
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Nous ne disposons pas d'une autre possibilité d'étudier la fonction de ce gène dans un organisme vivant. Cette étude in vivo est nécessaire pour permettre les analyses physiologiques qui nécessitent des interactions entre plusieurs organes. Dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque et en particulier dans la mise en place d’une hypertension, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour pour cela.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué de 12 animaux, cet effectif a été calculé par étude de puissance et est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables dans les protocoles d'analyse prévus (échographie cardiaque et électrocardiogramme). De plus d’après nos connaissances sur le modèle d’induction d’hypertension des groupes de 12 animaux sont nécessaires. Nous souhaitons donc employer un total de 144 souris pour ce protocole, correspondant à 12 groupes de 12 animaux. Le projet vise à définir les paramètres régissant la réponse au test pharmacologique, en comparant des animaux exprimant ou non le gène d'intérêt, dans des conditions physiologiques ou avec le protocole d'hypertension, traités ou non avec l’anticorps et chez les deux sexes (12 conditions au total).
Raffinement
Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal dominé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Le cas échéant, des soins locaux seront appliqués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Le suivi post-implantatoire des pompes osmotiques délivrant le traitement pharmacologique déclenchant l'hypertension comprendra une surveillance de l'incision, du poids de l'animal, de son état général. Un tapis chauffant permettra aux animaux de maintenir leur température corporelle durant l'anesthésie. Les pompes osmotiques sont mises en place pour réduire la douleur et le stress sur le long terme en évitant des injections et des manipulations nombreuses et répétées Durant la pose des minipompes, ainsi que les échographies, les animaux seront anesthésiés et recevront une couverture analgésique appropriée.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement du modèle porteur de la modification génétique sur le gène d'intérêt, ce qui en fait un modèle de choix. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Enfin, dans le cadre d'atteintes de la fonction cardiaque, le modèle souris constitue la meilleure approche disponible à ce jour. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 7 semaines. A cet âge la fonction cardiaque est bien développée.
Régulation de la machinerie Polycomb dans le développement embryonnaire.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Le porteur indique qu'aucun geste douloureux n'est pratiqué sur les animaux et que la sévérité tient à la létalité embryonnaire de la mutation étudiée, les embryons étant prélevés au 15e jour de gestation après mise à mort des femelles gestantes. Le projet porte sur la machinerie Polycomb, qui régule l'identité des cellules, et son rôle dans le développement et diverses pathologies dont le cancer. Le porteur affirme que la variabilité des effets d'une cellule à l'autre rend l'étude difficile in vitro et que le rôle hématopoïétique de la protéine impose un modèle mammifère.
Objectifs
Les organismes complexes tels que les mammifères sont composés d’une très grande variété de cellules, chacune ayant des propriétés particulières, on parle d’identité des cellules. Etablir et maintenir ces identités cellulaires est un enjeu crucial en biologie. Un ensemble de protéines, regroupé sous le nom de « Polycomb », participe activement à ce processus, son rôle est de s’assurer que les gènes qui ne doivent pas être utilisés dans un type cellulaire donné ne le soit pas. Pour cela, les protéines du groupe Polycomb régulent la structure de la chromatine (c.a.d. le repliement de l’ADN) de façon à moduler l’accessibilité des gènes (dans le cas présent les rendre peu accessibles). Les altérations de l’activité des protéines du groupe Polycomb peuvent avoir des conséquences très délétères sur les organismes et sont fréquemment observées dans diverses pathologies dont le cancer. Pour mieux comprendre le mécanisme d’action de cette machinerie et sa régulation, nous étudierons des mutations ciblées d’une des protéines polycomb en analysant en particulier leur impact sur la capacité des cellules à conserver leur identité. L'objectif de ce projet est de déterminer comment une régulation anormale de la machinerie Polycomb peut impacter le développement, et de façon plus générale l'identité des cellules comme observé dans une variété de pathologies.
Bénéfices attendus
Les protéines du groupe Polycomb ont un rôle très important lors de la différentiation cellulaire et ensuite pour le maintien de l’identité cellulaire. Leur mutation ont souvent des conséquences majeures sur le développement embryonnaire. Il a, par ailleurs, été montré que des mutations de membre de la machinerie polycomb sont à l’origine de certaines maladies génétiques (par exemple weaver syndrome) tandis que des altérations de cette machinerie sont récurrentes dans les cancers. Le contrôle de l’activité de cette machinerie est donc un enjeu crucial. A court terme, cette étude vise à mieux comprendre le fonctionnement d’un de ces acteurs du groupe polycomb dans le développement embryonnaire. A plus long terme, cette étude pourrait éclairer sur la contribution des protéines polycomb dans un contexte pathologique et informer sur les conséquences que pourraient avoir la manipulation pharmacologique de ces protéines sur les patients (des composés inhibant l’activité d’un membre de la machinerie polycomb sont déjà approuvés pour l’usage en clinique).
Procédures
Il n'y aura pas de procédure externe créant des douleurs chez les souris. Toutefois, la mutation homozygote du gène d'intérêt entraine une létalité au stade embryonnaire des souris. Les embryons seront prélevés au 15ème jour de gestation, après mise à mort des femelles gestantes, pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
La mutation complète de notre protéine d’intérêt, sur la base de la littérature, est létale vers le stade embryonnaire 18.5 (18,5 jours post accouplement). Nous avons généré des mutations partielles qui devraient donc avoir un phénotype équivalent ou moindre. Nous savons que nous ne récupérons pas de souris homozygote à la naissance, nous estimons donc la létalité de ces modèles entre le stade embryonnaire 18.5 et la naissance. Les souris hétérozygotes n’ont pas de phénotypes apparents.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Les mutations de notre protéine d’intérêt ont d’abord été générées dans une lignée cellulaire permettant d’avoir une première estimation de leur conséquence fonctionnelle. Nous avons sur cette base sélectionnée les mutations dont le phénotype est le plus informatif que nous souhaitons maintenant analyser dans un modèle murin. Les protéines du groupe Polycomb sont essentielles pour le maintien de l’identité des cellules toutefois les conséquences de leur altération sont très variables d’une cellule à une autre. Il est, de ce fait, difficile d'évaluer leur activité de façon compréhensive dans des modèles cellulaires. Par ailleurs, notre protéine d’intérêt ayant un rôle spécifique dans la régulation hématopoïétique, cette étude ne peut pas facilement être réalisée dans un organisme non-mammifère.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux à utiliser pour cette étude, deux mesures principales seront implémentées : 1) Dans un premier temps, les mutants de notre protéine d'intérêt sont générés dans une lignée cellulaire et nous essayons de caractériser les conséquences de ces mutations de façon la plus exhaustive dans ces modèles in vitro. 2) Par ailleurs, nous optimiserons nos expériences afin de réaliser plusieurs expériences en parallèle sur un même embryon mutant. Ainsi, bien que notre étude soit plus focalisée sur le développement hématopoïétique, nous récolterons également d'autres organes dans lesquels notre protéine d'intérêt est susceptible d'altérer le développement. Ne connaissant pas précisément la sévérite des phénotypes, mais estimant sur la base de la littérature que la létalité embryonnaire due aux mutations de notre protéine d’intérêt devrait avoir lieu autour de 18.5 dpc, nous étudierons le stade 15.5 en étudiant 14 embryons issus d’au moins deux portées (recommandation IMPReSS).
Raffinement
Aucun geste technique ne sera effectué sur les animaux. Seul le phénotype de la mutation de notre protéine d'intérêt peut entrainer un phénotype dommageable chez les embryons. Pour le réduire au maximum, nous analyserons les embryons mutants au temps le plus précoce possible (avant l’apparition du phénotype dommageable) permettant une évaluation robuste du phénotype. A noter que les lignées utilisées sont élevées à l’état hétérozygote, sans phénotype dommageable.
Choix des espèces
La souris est un mammifère très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude des pathologies humaines comme le cancer et les maladies génétiques du développement. Par ailleurs, la connaissance du génome murin, sa forte homologie avec le génome humain et l’existence de divers modèles génétiquement modifiés murins rendent ce modèle puissant. Ainsi, ce modèle animal est le meilleur compromis entre l’étude d'un modèle animal mammifère et l’obtention de réponses pertinentes aux questions posées. Toutes les analyses se feront durant le dernier tiers du développement embryonnaire. La délétion complète de notre protéine d'intérêt étant létale autour du stade embryonnaire 18,5 et de nombreuses étapes de la différentiation hématopoïétique se faisant à ce stade.