Rongeurs
Amélioration de la greffe d’ilots par thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
65 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent un vecteur viral et des immunosuppresseurs, puis subissent une greffe de cellules pancréatiques dans le foie par voie portale, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires, pour tester une thérapie génique censée rendre le foie tolérant à la greffe. Le porteur indique un risque de saignement à l'injection dans la veine porte et une baisse d'immunité exposant aux infections. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'organisme receveur, tout en reconnaissant que le passage à l'humain supposerait d'abord un partenariat industriel et des validations chez le primate.
Objectifs
L'objectif du projet est de jeter les bases expérimentales d'une nouvelle approche de la greffe d'îlots de Langerhans en clinique humaine. Celle-ci s'effectue actuellement avec des îlots de donneur ou, dans les essais thérapeutiques en cours, avec des cellules pancréatiques issuées de cellules souches humaines. Dans les 2 cas, une immunosuppression importante est necessaire pour tolérer les cellules greffées. Comme les îlots greffés son transplantés dans le foie du receveur par voie portale, notre approche originale est de rendre le foie receveur tolérant aux cellules issues du donneurou cellules souches le cas échéant. Nous avons conçu une stratégie qui consiste à introduire dans les hépatocytes le gène d'une cytokine anti-inflammatoire (IL 10). Pour effectuer ce transfert, nous utiliserons un vecteur viral adéno-associé (AAV) employé actuelleent dans la grande majorité des thérapies géniques (+ de 200 essais de phase 1 ont utilisé/utilisent ces vecteurs pour véhiculer des gènes thérapeutiques). Le vecteur portant le gène de l'IL10 sera injecté au receveur avant la greffe d'îlots. Les cellules hépatiques capteront le vecteur et exprimeront le gène thérapeutiue dans les 2 semaines qui suivront. L'IL10 produite permettra de réduire, voire d'inhiber la réaction immunologique de rejet du greffon qui sera implanté un mois après l'administration du vecteur.
Bénéfices attendus
Après l’achèvement du projet chez le rat, nous aurons en cas de succès obtenu la preuve de concept d’un procédé permettant de rendre le foie d’un patient diabétique tolérant aux îlots (ou aux cellules souches qu’on lui greffera). Dans la mesure où la thérapie génique par vecteurs AAV étend actuellement ses applications à de nombreuses maladies humaines, la biodistribution et la tolérance de ces vecteurs ont été largement étudiées chez l’homme et ne représenteront aucune barrière inattendue dans notre projet clinique. On peut donc en cas de succès chez le rat anticiper une forte probabilité de transfert aux patients diabétiques de type 1, chez qui les greffes restent actuellement très restreintes du fait des limites et des complications de l’immunosuppression. Pour réaliser ce transfert, il faudra très probablement aborder un partenariat avec une société biotechnologique disposant des moyens financiers suffisants pour conduire des validations spécifiques chez le primate et aller vers l’homme.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirugicale, à savoir la greffe de cellules pancréatiques. De plus, les animaux recevront des administrations de médicaments immunosuppresseurs et d'adénovirus 4 semaine avant la greffe. Enfin, les animaux seront prélevés de sang de façon hebdomadaire (
Impact sur les animaux
La transplantation des ilots de Langerhans se faisant dans le systeme sanguin portal, cela peut engendrer des saignements +/- abondants localement. Ceux-ci seront controler par l'application d'eponge hemostatique au niveau du point d'instillation de la veine porte. Cependant, il est eventuellement possible qu'un leger signement persiste après suture et réveil de l'animal (peu probable). Egalement, du fait des traitements immunosuppresseurs, les animaux traités verront leur immunité diminuée. Ils pourraient être eventuellement plus sensible aux infections. Une vigilance accrue sera prévue.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.
Remplacement
Le projet a pour objectif général l'amélioration de la transplantation de cellules pancréatiques humaines. Il n'existe à ce jour aucune methode alternative efficace nous permettant de mimer l'organisme receveur. L'emploi d'animaux est essentielle dans un tel projet. Néanmoins, des manipulations in vitro préalables nous permettront de déterminer les meilleures concentrations cellules/virus.
Réduction
en fixant un niveau de confiance de 95%, une puissance statistique supérieure à 80%, il faut au minimum 4 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence statistique significative Le choix est donc orienté sur 5 animaux- receveurs par groupe pour pallier toute défaillance technique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement favorable à leur bien-être. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habitué à ce genre de geste. Pour la transplantation faite sous anesthésie, un traitement anti-douleur local sera pratiquée, et pour des douleurs plus globales, un traitement systémique est prévu. Afin de suivre le moindre inconfort, nous avons élaborer un arbre décisionnel afin d'adopter les bons gestes et soins suivant les cas (Comportement, Plaie, perte de poids). Si toutefois, ces soins étaient insuffisants pour améliorer la santé de l'animal concerné, nous procéderons à l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le choix s'oriente chez le rat pour plusieurs : - Taille compatible avec un chirurgie (transplantation intra-hépatique aisée et moins dommageable que chez la souris) - Capacité d'hébergement adapté
Suivi fonctionnel et biologique de souris Apc pré-cachectiques et cachectiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation qui provoque un cancer de l'intestin et une fonte musculaire, avec sang dans les selles et prolapsus, subissent des tests fonctionnels et des prélèvements de tissus, pour étudier l'activation de l'axe hormonal du stress lors de la cachexie cancéreuse. Le porteur classe le maintien de cette lignée en gravité sévère à cause de la souffrance liée à l'avancée de la maladie et prévoit une mise à mort dès l'apparition de ces signes. Il affirme qu'un système in vitro ne reproduit pas la complexité de ce processus et que seul le modèle murin le permet, les stratégies thérapeutiques restant à proposer.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en évidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez ces souris.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associée au cancer.
Procédures
Les animaux subiront : 2 tests fonctionnels non invasifs et indolores d'environ 5 à 10 min chacun en fonction de la participation volontaire de l'animal, soit un prelèvement sous anesthésie gazeuse d'une durée de 5 min, soit 1 procédure invasive sous anesthésie générale et sans réveil d'une durée de 1h30; enfin les prélèvements tissulaires seront réalisés sous anesthésie chimique sans réveil.
Impact sur les animaux
Concernant les souris contrôles, aucune nuisance n'est attendue à l'exception du prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse. Concernant les souris spécifiques (s'agissant d'un génotype dommageable : suivi et entretien de la lignée), certaines nuisances peuvent apparaitre (sang dans les fèces, prolapsus). Compte tenu des risques de souffrance pouvant apparaitre en lien avec l'avancée de la maladie, le maintien et l'entretien de la lignée implose une classification de gravité sévère. Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de procéder aux différentes analyses et prélèvements de tissus.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal : surface de section transversale des fibres musculaires qui permet d'apprécier l'ampleur de la perte de masse musculaire Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères : le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
L'essentiel des études expérimentales consacrées à la cachexie associée au cancer a été réalisé en utilisant des modèles souris de cancer. En travaillant sur le modèle souris nous pourront donc comparer nos données à celles de la littérature scientifique. Par ailleurs notre expertise scientifique et technique sur le modèle souris, nous permettra de réaliser ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l’âge de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris mutées seront utilisées comme animaux contrôles.
Effet métabolique du semaglutide en comparaison ou en association aux chirurgies bariatriques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
75 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie bariatrique, sleeve gastrectomie ou bypass duodéno-iléal, des injections quotidiennes de semaglutide et des prélèvements sanguins par incision de la queue, pour comparer médicament et chirurgie de l'obésité. Le porteur annonce une mortalité postopératoire jusqu'à 30 %, des douleurs sur cinq jours et un risque de désunion de la cicatrice. Il affirme qu'il est "absolument nécessaire" de comprendre l'ensemble physiologique in vivo et qu'aucune méthode de remplacement n'existe en chirurgie bariatrique.
Objectifs
L'obésité morbide est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, la dyslipidémie et les maladies hépatiques. La chirurgie bariatrique apparaît comme l'alternative thérapeutique la plus efficace chez les patients souffrant d'obésité morbide. En plus de son efficacité pour diminuer le poids corporel, il améliore également les complications métaboliques associées. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ces effets bénéfiques restent parfois peu clairs mais impliqueraient plusieurs facteurs, notamment des changements dans la sécrétion des hormones gastrointestinales, tels que le GLP-1. Des analogues pharmacologiques de ces hormones ont été développés par l’industrie pharmaceutique et ce projet vise à mieux comprendre l’intérêt de ces médicaments dans le cadre d’une bi-thérapie couplée aux chirurgies bariatriques ou de comparer leurs effets par rapport à des procédures chirurgicales innovantes.
Bénéfices attendus
Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets des chirurgies de l’obésité associés aux effets des analogues de GLP-1, nous permettra de mieux cibler les indications opératoires de ces types de chirurgies selon le profil métabolique du patient et son environnement de vie
Procédures
Les souris recevront une injection quotidienne sous cutanée. 30μl de sang seront prélevés par micro-incision à l’extrémité de la queue à J-3, J+21 et J+35 après chirurgie (Dosage cholestérolémie, triglycéridémie, glycémie). A J+28, un test de tolérance au glucose sera réalisé et une mesure de la glycémie sera effectuée à T0, 15, 30, 60 et 120 minutes par micro-incision de la queue. Les temps opératoires moyens des chirurgies sont respectivement de 45 minutes pour la sleeve gastrectomie et de 65 minutes pour le SADI-S ((Single anastomosis duodeno-ileal bypass avec sleeve gastrectomie) ).
Impact sur les animaux
En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : -Une mortalité entre 0 (laparotomie), 10% (Sleeve Gastrectomie) et 30% (SADI-S: Single anastomosis duodeno-ileal bypass avec sleeve gastrectomie) après chirurgie -Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée -Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures afin de récolter des tissus utiles à la caractérisation métabolique et moléculaire des modifications induites par les traitements chirurgicaux et/ou médicamenteux.
Remplacement
Les chirurgies bariatriques induisent de profondes modifications du métabolisme énergétique qui font intervenir des conséquences entremêlées et en cascade sur de nombreux tissus tels que l’intestin, le foie, les tissus adipeux et le cerveau, etc… Les mécanismes moléculaires sont très mal connus et il est absolument nécessaire de comprendre l’impact physiologique dans son ensemble pour développer par la suite d’autres approches. Il n’existe pas à l’heure de méthodes ex vivo/in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
La procédure est classée sévère. Des protocoles péri-opératoire et post-oépratoires ont été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal et palier les risques d'anémie et les carences nutritionnelles. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse ( de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.
Choix des espèces
Les conséquences physiologiques et métaboliques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et dans les pathologies hépatiques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale. A 8 semaines, les souris seront mises sous un régime hyperlipidique pour atteindre (après 12 à 16 semaines) un poids supérieur à 40g compatible avec une bonne tolérance aux chirurgies bariatriques
Potentiel thérapeutique de l’immunoblocage de l’interaction entre l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) lors des traumatismes crâniens
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur inflige un traumatisme crânien, suivi d'IRM, d'évaluations neurologiques et d'une perfusion intracardiaque létale au trentième jour, pour tester un anticorps censé bloquer une interaction moléculaire aggravant les lésions. Le porteur indique une perte de poids, une hypothermie, des douleurs et des déficits cognitifs, et prévoit une mise à mort si le poids chute de plus de 15 % ou si le score de douleur dépasse un seuil. Il affirme que ces procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées, la stratégie thérapeutique pour les patients restant à proposer.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) endogène joue un rôle critique aussi bien dans la circulation sanguine que dans le parenchyme cérébral, notamment en interagissant avec les récepteurs du glutamate de type N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Dans ce projet, nous allons définir la participation de cette interaction entre le tPA et le récepteur NMDA dans le cadre des traumatismes crâniens (TC), qui restent mal pris en charge sur le plan clinique. Nous testerons aussi le potentiel thérapeutique d’un anticorps que nous avons produit au laboratoire et qui bloque cette interaction. Nous évaluerons à la fois le bénéfice histologique (inflammation, hémorragie, lésion cérébrale) et le bénéfice fonctionnel à long terme (suivi longitudinal).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie des traumatismes crâniens, et de proposer une stratégie thérapeutique au bénéfice des patients.
Procédures
Traumatisme crânien (J0) (Durée : 15min ; n=80) + traitements (n=40) + IRM (J3, J15, J30 ; Durée : 60min/Session) + évaluation neurologique (J3, J15, J30 Durée : 30min/Session) + perfusion intracardiaque (J30) (n=80) (total d’environ 5h réparties sur 4 jours, de J0 à J30).
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 7 jours avant le début des procédures pour minimiser leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, une hypothermie (lors des phases d’anesthésies), des douleurs post-opératoires, du stress (notamment lors des phases de tests comportementaux), des déficits fonctionnels et/ou cognitifs.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ou in vitro ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité et ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement des TC chez l’homme.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, données disponibles dans nos publications et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et les consommables utilisés seront neufs (comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyés et désinfectés (pour le matériel réutilisable comme les pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale. Les yeux seront couverts afin de ne pas éblouir les animaux avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post opératoires chauffées avant d’être remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage ou bien encore de la nourriture gélifiée pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation pendant la période post-opératoire. Des gommettes de couleurs seront collées sur les étiquettes des cages afin d’assurer une surveillance adaptée (ex : rouge après une procédure chirurgicale pour une surveillance plus importante).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les TC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ce modèle.
Coopération fonctionnelle du facteur de transcription Ikaros avec les protéines Aiolos ou Foxo1 dans la biologie des lymphocytes T.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2280 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur supprime une ou plusieurs protéines des lymphocytes T, par manipulation génétique ou par injection sur trois jours, avant de les mettre à mort pour prélever thymus, rate et ganglions, afin d'étudier la régulation des cellules T impliquées dans les maladies auto-immunes. Le porteur indique que l'absence de ces protéines peut provoquer un lymphome T et prévoit une mise à mort si le poids chute de 5 %. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer l'animal car les cellules T naïves doivent rester dans un environnement in vivo, les retombées thérapeutiques restant au stade des bases moléculaires.
Objectifs
Notre équipe travaille sur des protéines jouant un rôle crucial dans le développement et la fonction des cellules du système immunitaire. Ces protéines intéragissent avec d'autres protéines pour moduler la fonction des cellules T. Cependant, jusqu’ici, aucune étude n’a déterminé l’impact de l’absence cumulée de ces différentes protéines dans le devenir des cellules T. L’objectif de ce projet est de déterminer la coopération fonctionnelle entre différentes protéines dans les mécanismes qui contrôlent la génération et la maintenance des cellules T inflammatoires. Nous génèrerons différentes combinaisons de souris ne possédant plus ou partiellement ces protéines, soit de manière chronique dans les cellules T, soit de manière inductible après injection d'un composé spécifique. Après mise à mort, les organes lymphoïdes (thymus, rate, ganglions lymphatiques) seront récupérés et des expériences in vitro seront réalisées.
Bénéfices attendus
L’utilisation de ces modèles murins nous permettra de comprendre comment un réseau de protéines peut contrôler la génération, la maintenance, l’activation des cellules T, qui sont des acteurs principaux dans différentes pathologies autoimmunes telles que la sclérose en plaque ou l’arthrite rhumatoïde. Comprendre les mécanismes sous-jacents permettra de poser les bases moléculaires pour le développement de nouveaux traitements pour ces pathologies.
Procédures
Les injections du produit permettant la suppression de nos protéines se font sur animaux vigiles. Après une contention de la souris, le produit sera injecté à raison d'une injection par jour, pendant 3 jours consécutifs. La procédure prend 20 secondes maximum à partir du moment où l'animal est pris en main.
Impact sur les animaux
L'absence des protéines que nous étudions peut conduire à un développement d'un lymphome T. Nous effectuerons une étude pilote pour déterminer si ces souris sont susceptibles de développer un lymphome et à quel âge. Nous surveillerons les souris étroitement afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration. L'injection du produit permettant l'élimination de nos protéines ne prendra que quelques secondes et le site d’injection sera surveillé chaque jour et désinfecté si besoin.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d'organes
Remplacement
Nous travaillons sur le devenir des cellules T naïves, qui ont la particularité de ne jamais avoir rencontré de pathogène. Jusqu’à ce jour, les lignées cellulaires disponibles ne récapitulent pas les caractéristiques des cellules T naïves. Dans l’état actuel de notre projet, les cellules T näives ne peuvent être remplacées par un autre modèle animal, une lignée cellulaire ou des expériences in vitro que nous avons déjà réalisées. Ces cellules doivent être maintenues dans un environnement in vivo pour maintenir leur caracéristiques spéciales. C'est pourquoi notre projet nécessite d'utiliser un modèle in vivo et qu'il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux dans ce projet. Cependant, au cours de notre expérimentation, nous nous réservons la possibilité d’employer des méthodes alternatives et des modèles in vitro, dès que cela est possible, afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le but de ce projet sera de récupérer les organes lymphoïdes afin d’étudier le devenir des différentes populations des cellules T ex vivo et d’étudier la biologie des cellules T naïves in vitro. Nos prélèverons le maximum d’organes (ganglion, rate, thymus) pour chaque animal afin de collecter le plus d’informations au cours d’une procédure. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs. Un test statistique sera effectué pour comparer les groupes.
Raffinement
Une étude pilote permettra de déterminer si les souris ne possédant plus ou partiellement les deux protéines étudiées sont susceptibles de développer un lymphome et à quel âge. Pour la suite de l'étude, les animaux seront utilsés avant apparition d’un phénotype dommageable. Les souris seront élevées dans une zone d'élevage spécifique, protégeant les souris de pathogènes spécifiques et établissant un statut sanitaire de souris en bonne santé. Les souris seront étroitement surveillées afin de veiller à ce qu’elles ne montrent aucun signe de souffrance comme par exemple le poil hérissé, le dos vouté, une prostration. Les animaux seront élevés en groupe dans des cages ventilées avec le matériel nécessaire pour qu'elles créent leur nid et leur permettre des conditions d'hébergement optimales. Si une diminution du poids corporel de 5% sur une semaine est observée, l’animal sera sorti du lot et mis à mort. Lors de l’injection du produit permettant la suppression des protéines d'intérêt, le risque d’infection dans la zone d’injection sera pris en considération.
Choix des espèces
Les souris présentent l’avantage de pouvoir être modifiées génétiquement, ce qui permet de contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes soit dans un type de cellule spécifique, soit dans toutes les cellules. Le système immunitaire de la souris se rapproche de l’Homme et représente un modèle de référence pour l’étude des cellules T et de certaines pathologies comme les maladies auto-immunes associées à une dérégulation des cellules T, ce qui est l’objet de notre recherche. Nous étudions le devenir d'une population de cellules T très spécifiques qui a la particularité de ne pas avoir rencontré de pathogène. Cette population est plus abondante chez les souris jeunes. De ce fait, nous utiliserons les souris qui auront une suppression des protéines spécifiquement dans les lymphocytes T entre 4 et 8 semaines et celles qui auront une suppression des protéines aigüe entre 4 et 15 semaines.
Inhibition de la cathepsine C dans un modèle murin de la Dysplasie Bronchopulmonaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
120 souris, mères et souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont exposés dès la naissance à 75 % d'oxygène pendant quatorze jours pour reproduire une dysplasie bronchopulmonaire, puis reçoivent deux injections intrapéritonéales par jour, avant d'être mis à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'hyperoxygénation provoque une insuffisance respiratoire et peut léser les intestins, les yeux et le cerveau, et vise à tester l'inhibition d'une enzyme, la cathepsine C. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit une réponse immunitaire complète, les retombées pour les enfants prématurés restant formulées au conditionnel.
Objectifs
Les nouveaux nés atteints de la dysplasie bronchopulmonaire ont une inflammation chronique dans les poumons, liée à la présence d’enzymes qui sont délétères. Leur inhibition pourrait donc être bénéfique d’un point vue thérapeutique. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de l’inhibition indirect de toutes ces enzymes, via l’inhibition de la cathepsine C, dans un modèle murin de la dysplasie bronchopulmonaire.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre l'identification d’un nouveau traitement préventif et/ou curatif pour les enfants prématurés sous ventilation mécanique. Un traitement préventif ou qui diminue les conséquences de la pathologie pourrait améliorer l’espérance et la qualité de vie à l’âge adulte de ces patients.
Procédures
Hyperoxygénation pour les mères et leurs souriceaux : 75% d'oxygène pendant 14 jours, ou 75% d'oxygène 1 heure par jour pendant 14 jours. Injection intrapéritonéale 2 fois par jours pendant 14 jours pour les souriceaux.
Impact sur les animaux
La première nuisance est l’exposition à l’oxygène qui entrainera la pathologie pulmonaire, qui chez les humains se traduit par une insuffisance respiratoire. L’exposition à l’O2 peut également entrainer des dommages au niveau des intestins, des yeux et du cerveau. Les autres nuisances seront les douleurs liées aux injections et le stress lié aux manipulations.
Devenir
Les mères et les souriceaux soumis à l'hyper-oxygénation seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses.
Remplacement
La dysplasie bronchopulmonaire est une pathologie inflammatoire qui fait intervenir le système immunitaire et notamment les neutrophiles. A ce jour il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de mettre en place une réponse immunitaire complète et l’effet qu’un traitement pourrait avoir dessus. Cette pathologie atteint la morphologie pulmonaire au niveau des alvéoles, et du système vasculaire notamment ; il n’existe pas de modèle pulmonaire in vitro permettant d’avoir une bonne représentation de la maladie. Ainsi l’efficacité du traitement ne pourra être réalisée que sur un modèle in vivo.
Réduction
D'après des expériences réalisées par d'autres laboratoires avec de la fumée de cigarette ou de l'ozone, les lots devront être constitués d'au moins 8 animaux pour atteindre des différences statistiques.
Raffinement
Pour le confort des souris les dispositions suivantes sont prévues : manipulation des animaux à l'aide d'un tube, présence de dôme, de papier pour nidation, de nourriture et eau ad libitum, de jeux type rouleaux en de carton et de récompense comme des fruits secs ou des graines après chaque manipulation. Les animaux seront observés quotidiennement. Leur poids sera contrôlé. Le comportement de la mère et des souriceaux sera observé, ainsi que leur aspect physique : poil, oreille. En ce qui concerne le raffinement pour les femelles gestantes : massage abdominal, réchauffement de la femelle sur couverture chauffante, tentative de sortie manuelle de l’embryon coincé.
Choix des espèces
Il y a deux raisons à l’utilisation du modèle murin pour ce projet. La première concerne la mise en place du modèle de dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. Cela permet d’utiliser les souriceaux à leur naissance, alors que l’on devrait pratiquer une césarienne sur d’autre modèle. La seconde raison est la disponibilité de souris déficiente en cathepsine C, qui nous permet de faire notre preuve de concept. Les souris adultes (8 semaines) seront utilisées pour la reproduction et pour le sevrage des souriceaux dans le cas de la mère. Les souriceaux seront utilisés dès leur naissance pour la mise en place du modèle de la dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. La mise en place du modèle dure 14 jours, les jeunes souris seront euthanasiées à ce moment-là pour la récupération des échantillons.
Approche CRISPR/Cas9 pour l’étude de l’expression des protéines astrocytaires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau sous anesthésie, puis est mis à mort deux semaines plus tard pour analyse histologique, afin de suivre par CRISPR/Cas9 l'expression de marqueurs fluorescents dans les astrocytes. Le porteur indique des douleurs postopératoires modérées, atténuées par des antalgiques, et une douleur légère liée à la biopsie d'oreille. Il affirme qu'un système in vitro ne peut pas reproduire les interactions entre astrocytes, neurones et vaisseaux, et qualifie ce travail d'"indispensable" pour de futures cibles thérapeutiques.
Objectifs
Les astrocytes sont les cellules gliales majoritaires du cerveau. Ils possèdent une interface vasculaire qui consiste en des prolongements ou "pieds" qui vont au contact des vaisseaux sanguins cérébraux. A cette interface, appelée l’unité gliovasculaire, les astrocytes régulent les fonctions vasculaires cérébrales. Cependant les modalités de ces régulations astrocytaires sont très mal connues alors même qu'elles sont altérées dans un grand nombre de pathologies cérébrales. Dans une étude récente, nous avons identifié de nouveaux répertoires moléculaires des interfaces astrocytaires. Le but de notre projet est de caractériser l’expression de ces nouveaux marqueurs au cours du développement des astrocytes par la technique CRISPR Cas9 permettant d’intégrer un marqueur fluorescent dans les gènes candidats pour suivre leur expression dans les astrocytes du cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau le répertoire moléculaire des astrocytes du cerveau qui est encore mal connu. Il est indispensable de faire progresser ce domaine de recherche car les astrocytes sont de plus en plus considérées comme des cibles thérapeutiques pour les pathologies neurologiques. Cependant sans une connaissance accrue de leur fonctionnement moléculaire ces pistes ne pourront pas être développer.
Procédures
Concernant le génotypage sur biopsie, cette procédure est validée dans une autre DAP. Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale qui durent 30 minutes. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Ils seront mis à mort 2 semaines après la première intervention.
Impact sur les animaux
Douleurs post opératoire de gravité modérée minorées par des antalgiques et douleur légère de courte durée liée à la biopsie d’oreille.
Devenir
L euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour le prélèvement et l'analyse histologique des tissus.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.
Réduction
Cependant, le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entre les différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la sur-utilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 4 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité possible entre les animaux en général.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les opérations seront faites sous anesthésie générale. Les souris subissant une opération feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. L'intervention pouvant générer de l'inconfort et de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. En particulier, les points limites intermédiaires permettant la mise en place de soins des animaux sera mise en place évitant l'euthanasie des animaux. Des analgésiques sont prévus et co-administrés pour limiter la souffrance pendant et après la chirurgie.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous avons identifié 60 marqueurs à étudier lors d'une étude transcriptomique menée au laboratoire, à tester au cours du développement de l’unité gliovasculaire au jour postnatal 15, à 2 mois, à 4 mois et à 1 an. Ces différents stades permettre de suivre l’évolution de l’expression des marqueurs au cours de la maturation des astrocytes ce qui est essentiel pour comprendre leur fonction.
Mécanismes des récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement chez la souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
2104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, dont 752 en gravité sévère. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau, implantation d'électrodes de deux à six heures et injection de virus, puis des enregistrements neuronaux pendant l'éveil et le sommeil et des tests comportementaux aversifs, pour étudier des récepteurs du glutamate liés à la mémoire de la peur et à l'anxiété. Le porteur qualifie ces procédures comportementales de "modérément aversives et brèves" sans détailler les tests, et signale des douleurs postchirurgicales, des risques anesthésiques et un isolement. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne préserve un réseau neuronal intact, les retombées contre les troubles anxieux étant renvoyées au long terme.
Objectifs
Le projet se déroulera dans deux EU différents. La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet vise à l’étude des récepteurs ionotropiques du glutamate, qui font partie d’une grande famille de récepteurs aux neurotransmetteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le cerveau des vertébrés. Ces récepteurs du glutamate jouent un rôle central dans la communication entre neurones et dans les processus cognitifs tels que l’apprentissage et la mémoire. Les récepteurs du glutamate étant impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’une sous-population de récepteurs du glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux et le comportement, dans un cadre physiologique et pathologique. Il s’agira notamment de comprendre l’importance de ces récepteurs dans la formation et la stabilisation des souvenirs associant un contexte à une émotion donnée et leur implication dans les comportements liés à l'anxiété. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à la réactivation et la coordination de plusieurs structures cérébrales pendant l'exécution et la consolidation des souvenirs aversifs dépendante du sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements in vivo chez des souris libres de leurs mouvements et endormies. L'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur les mécanismes et la diversité des récepteurs du glutamate, sur la régulation des signalisations neuronales et des fonctions cérébrales et comportementales associées. Notre travail ouvrira de nombreuses perspectives tant avec des implications importantes sur notre compréhension de la neurotransmission et le développement de nouveaux agents protecteurs contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Ainsi des retombées sont attendues tant dans le domaine fondamental qu’appliqué (développement de nouvelles stratégies thérapeutiques).
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 pourcent de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Les animaux provenant de notre établissement seront impliqués dans 2 transports (aller et retour). Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr) avec ou sans comportement (1h maxi / jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) comportement 2) injection de virus + comportement 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones + comportement. Seule l'injection de virus sera réalisée dans notre EU(2). L'ensemble des autres procédures est réalisé dans l'EU1. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui, selon les besoins, pourra permettre des prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes (hors enregistrement de l’activité neuronale et comportement) est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement nécessaire à la préservation des électrodes (stress modéré) ; comportement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress) ; identification génétique des animaux réalisés par prélèvement de quelques millimètres à l’extrémité de la queue (douleur légère et stress de courte durée).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure, au sein de l'établissement d'origine des animaux, afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ce projet est réalisé sur deux établissements et a déjà été autorisé pour l'établissement n°1. Aucun animal supplémentaire n'a été ajouté.
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 2104 animaux: dont 1920 impliquées sur ce site.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5jrs (5min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des souris non génétiquement modifiées et des souris génétiquement modifiées dans le cadre de ce projet. Ces souris se développent normalement et ont un comportement général sans anomalies évidentes. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Etude expérimentale d’une biothérapie innovante dans les maladies mucosales inflammatoires chez des modèles de souris transgéniques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
520 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur induit une colite ou une cholangite, avec diarrhées et saignements, avant des injections répétées d'un anticorps candidat, certaines subissant une chirurgie avec ligature du canal cholédoque, pour évaluer un futur traitement des maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur indique que l'induction de la colite peut entraîner une mortalité et une perte de poids, et prévoit une euthanasie précoce si un score clinique se dégrade. Il affirme que la souris est un "passage obligatoire" avant l'humain et un "prérequis indispensable", les bénéfices médicaux restant renvoyés à une éventuelle entrée en clinique.
Objectifs
Mettre au point un anticorps thérapeutique spécifiques susceptibles d'exercer des effets anti-inflammatoires et /ou régénératifs applicables à l'homme .
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude sont doubles : 1- valider expérimentalement l’effet thérapeutique de l’anticorps candidat sur les maladies inflammatoires intestinales et sur la cholangite. Cette étape cruciale quant à l’efficacité du traitement, sera le point de départ du second bénéfice à savoir la production à visée médicale de l’anticorps et à plus long terme son entrée en phase clinique.
Procédures
Effet curatif d'un anticorps sur la colite : Injection intrapéritonéale quotidienne d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Effet curatif des anticorps sur la colite : Instillation par voie anale avec une sonde de gavage souple 1 minute une seule fois. Injection intrapéritonéale quotidienne d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Effet pro-régénératif de l'anticorps sur la reconstruction de l'épithélium intestinal post colite : Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection pendant 14 jours ou 21 jours. Effet anti-fibrosant de l’anticorps candidat dans un modèle de fibrose intestinale induite par une colite chronique : Injection intrapéritonéale de l'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection pendant 28 jours et 66 jours 3 fois par semaine. Effet de l'anticorps sur la cholangite : Cholangite induite par l’alimentation : Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection. Cholangite induite par la ligature du canal cholédoque : Chirurgie comprenant laparotomie et ligature du canal cholédoque 20 minutes. Injection sous cutanée d’analgésie 2 secondes 1fois à deux fois par souris en fonction de la récupération des animaux post opératoire. Injection intrapéritonéale tous les deux jours d'anticorps d'intérêt ou d'isotype pour les groupes concernés 2 secondes par injection.
Impact sur les animaux
Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation et/ou injection lors des administrations. Stress lié à la contention lors de la chirugie et lors des suivis clinique (Perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les effets des produits induisant la colite ou la cholangite (diarhée, saignement).
Devenir
Lorsque les points limites sont dépassés ou lorsque les temps définis sur les différentes procédures sont atteints nous nous procédons au prélevement des organes afin de réaliser des analyses immunohistologiques
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
L’effectif proposé tient compte de la mortalité possible liée à l’induction de la colite et du fait qu’un effectif plus faible ne permettrait pas de démontrer une différence statistique significative.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être). Les effets du traitement seront contrôlés par des pesées et une surveillance selon un score standardisé de colite clinique. Ce score correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'anesthésiant pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux : l’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
Le modèle murin de colite inflammatoire dans les conditions de ce protocole est largement validé et décrit dans la littérature. Son utilisation est un prérequis indispensable à l'élaboration d'un anticorps à visée thérapeutique de la maladie de Crohn. L'effet thérapeutique potentiel d'anticorps spécifiques susceptibles d'exercer des effets anti-inflammatoires et /ou régénératifs applicables à l'homme ne peut être évalué qu'in vivo sur des modèles validés de colite. L'efficacité des anticorps (spécificité, affinité, etc...) sera préalablement testée in vitro afin de sélectionner les plus performants dans la reconnaissance de leur cible et leur effet bloquant anti-inflammatoire. Les protocoles seront réalisés avec des souris de 6-7 semaines. Notre expérience des traitements pour une colite inflammatoire ou de la cholangite montre que l'âge des animaux influe fortement sur leur réactivité et sur la reproductibilité de la colite induite. L'inflammation colique génère des diarrhées qui participent à la perte de poids des animaux. Des souris utilisées à un âge trop jeune sont plus sensibles et sont susceptibles d'atteindre très rapidement les points limites que nous nous sommes fixés avant la fin de l'expérience. Des souris plus âgées sont moins sensibles et de facto déclenchent des colites plus contrôlables limitant, pour des résultats similaires.
Prélèvement de tissus pour caractérisation d’animaux génétiquement altérés dans les domaines cardiovasculaire et oncologique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
3000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit un prélèvement du bout de la queue de moins d'un millimètre, sans anesthésie avant l'âge de quinze jours, pour un génotypage servant à trier les lignées d'élevage destinées à des projets cardiovasculaires et oncologiques. Le porteur indique que les animaux jugés non utiles seront mis à mort après le résultat, environ 300 étant maintenus en vie pour la reproduction ou d'autres expériences. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible pour ce prélèvement et décrit une méthode transitoire, en attendant la validation d'un génotypage sur poils présenté comme moins douloureux.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la cause la plus fréquente de décès en Europe et dans le monde. Elles sont associées au vieillissement, à l’obésité, au diabète, et à l’inflammation chronique qui accélèrent ainsi le vieillissement cardiovasculaire et contribuent à la mortalité et à la morbidité chez les patients âgés. Nous utilisons pour les projets concernés des souris pour lesquelles certins recepteurs sont absents. Dans l'objectif de comprendre la survenue du psoriasis paradoxal sous traitement avec des médicaments qui diminuent le facteur de nécrose tumorale. Nous utilisons pour ces études des souris génétiquement modifées pour lesquelles il est necessaire de réaliser la caractérisation et donc procéder à des prélévements de tissus pour analyse génétique.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique permet d'optimiser la gestion de l'élevage et de produire les animaux d'intérêt.
Procédures
Pour chaque individu, 1 prélèvement de bout de queue inférieur à 1 mm sans anesthésie . Extrêmement rarement, pour vérifier des résultats, un prélèvement de bout d'oreille (
Impact sur les animaux
Les risques de saignement prolongé, de cicatrisation lente ou de rejet par la mére sont extrêmement rares.
Devenir
Dés résultat de génotypage, les animaux non utiles seront mis à mort. Les animaux utiles pour les projets ou l'élevage seront maintenus en vie et seront en utilisation continue pour des expériences qui seront décrites dans des DAP spécifiques
Remplacement
Pas de remplacement possible sur le projet de prélévement de tissus. L’approche de remplacement est prise en charge dans chaque projet autorisé.
Réduction
La reproduction n’est utilisée que pour produire le nombre d’animaux prévue dans les projets considérés. Les caractéristiques de reproduction propres à chaque lignée (nombre de petits par portée, nombre de modifications génétiques,…) sont pris en compte pour planifier la fréquence et le type de croisements. Les lignées qui ne seraient plus utilisés (fin de projet) ne seront pas maintenues respirantes, et seront congelés. Cette méthode de prélèvements de tissus sera utilisée jusqu’à validation des méthodes de caractérisation génétique à partir de prélèvement de poils moins douloureux.
Raffinement
Les prélèvements sont réalisés par des personnels expérimentés, selon une méthode éprouvée, précise, rapide et standardisée, limitant stress, douleur et saignement. L'anesthésie est prévue sur les animaux de plus de 15 jours. Une surveillance et un suivi de la cicatrisation est réalisé dans les jours suivant le prélèvement.
Choix des espèces
Les lignées en élevage sont définies par les besoins des projets autorisés. Les prélèvements sont réalisés avant ossification de la queue pour limiter douleur et stress.
Rôle du récepteur au LDL cholestérol dans les effets hypocholestérolémiants du bypass gastrique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit un génotypage par biopsie de la queue, une chirurgie de bypass gastrique ou une simple laparotomie sous anesthésie, des prélèvements sanguins hebdomadaires puis une mesure létale de l'absorption du cholestérol, pour étudier le rôle d'un récepteur intestinal dans les effets de la chirurgie bariatrique. Le porteur indique une mortalité postopératoire de 0 à 30 %, des douleurs sur cinq jours, un risque de désunion de la cicatrice et une dénutrition. Il affirme que ce système biologique intégré ne peut pas être "substitué" par des approches in vitro et ne retient que les expériences jugées "indispensables".
Objectifs
L’obésité, problème majeur de santé publique concernant actuellement plus d’un adulte sur 20 dans le monde, est associée de manière significative à de nombreuses complications métaboliques. La chirurgie bariatrique est le traitement de référence de l’obésité. L’objectif de ce projet est d’étudier la fonction intestinale d’un récepteur présent à la surface des cellules intestinales sur les effets hypocholestérolémiants de ces chirurgies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus d’un tel projet s’inscrivent dans la réflexion, d’actualité, autour des chirurgies métaboliques et de leur indication chez des patients obèses présentant des comorbidités variées. Les retombées attendues d’un tel projet seront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques du bypass gastrique. Ces données pourront permettre, à l’avenir, de mieux adapter le type de chirurgie au profil métabolique des patients, voire de développer des molécules pouvant cibler ces mécanismes pour le traitement des dyslipidémies.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie caudale à l'âge de 5-6 jour pour déterminer par PCR leur génotype. Les animaux subiront tous une chirurgie de type By-pass gastrique Roux en Y (RYGB) ou laparotomie seule (Sham) sous anesthésie générale et analgésie appropriée. Du sang sera prélevé à l’extrémité de la queue après anesthésie cutanée locale chez les animaux vigiles avant la chirurgie puis une fois par semaine. A J21 après la chirurgie, une mesure de la tolérance au glucose sera réalisée par gavage d’une solution glucosée. Du sang sera prélevé à la queue chez les animaux vigiles 0, 15, 30, 60 et 120 min après le gavage. Les animaux seront ensuite euthanasiés par ponction cardiaque (prélèvement de 1mL de sang) après mesure de l’absorption et de l’excrétion du cholestérol sous anesthésie générale et analgésie appropriée.
Impact sur les animaux
La biopsie caudale initiale de génotypage induit une douleur légère de courte durée. En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : - Une mortalité entre 0 et 30% après chirurgie - Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée - Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale - Une dénutrition qui nécessite une supplémentation ferrique et vitaminique quotidienne
Devenir
La mesure de l’absorption intestinale et de l’excrétion du cholestérol est une procédure létale.
Remplacement
Les conséquences physiologiques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Il n’existe pas malheureusement à l’heure actuelle de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.
Raffinement
Des protocole péri-opératoire et post-oératoire ont été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal, et palier aux risques d'anémie et de carences nutritionnelles. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse ( de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront placées en couveuse pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.
Choix des espèces
Les conséquences physiologiques et métaboliques des chirurgies bariatriques impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et dans les pathologies hépatiques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale. A 8 semaines, les souris seront mises sous un régime hyperlipidique pour atteindre (après 12 à 16 semaines) un poids supérieur à 40g compatible avec une bonne tolérance aux chirurgies bariatriques
Effets d’une série de composés à visée thérapeutique en développement sur l’athérosclérose chez la souris ApoE -/- nourrie avec une alimentation enrichie en graisses
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever cœur et aorte, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris ApoE, prédisposées à l'athérosclérose et nourries au régime gras, reçoivent deux injections intrapéritonéales par semaine pendant douze semaines, des prélèvements sanguins à la queue et une anesthésie terminale. Le projet teste quatre candidats-médicaments sur le développement des plaques d'athérome. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal ne permet d'étudier cet effet.
Objectifs
L'athérosclérose est un phénomène caractérisé par la formation de plaques d'athérome, constituées de lipides, sur la paroi des artères, induisant un durcissement et une perte d'élasticité de ces dernières. L'athérosclérose constitue un facteur de risque cardiovasculaire majeur. En effet, la rupture des plaques d'athérome peut conduire à une mauvaise oxygénation des organes, notamment le cerveau et le cœur et favoriser la survenue de complications graves telles que l'infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Ainsi, du fait de ces complications, et malgré l'existence de traitements ralentissant son évolution, l'athérosclérose demeure l'une des principales causes de mortalité dans le monde. Le développement de médicaments permettant un meilleur contrôle du développement de l'athérosclérose fait ainsi l'objet d'intenses recherches par les laboratoires pharmaceutiques. Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de 4 candidats médicaments sur le développement des plaques d'athérome chez un modèle de souris génétiquement modifié développant spontanément de l'athérosclérose, notamment lorsque ce dernier est soumis à une alimentation enrichie en graisses. Les candidats médicaments seront administrés 2 fois par semaine par voie intrapéritonéale pendant 12 semaines. L'effet de ces traitements sera observé principalement par analyse des plaques au niveau de l'aorte et des vaisseaux sanguins du coeur (coronaires).
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement de composés visant à prévenir et traiter l'athérosclérose. Cette pathologie restant l'une des cause principales de mortalité dans le monde, il existe un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir, à terme, à la mise sur le marché d'un nouveau médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis : 1) à des pesées régulières (une par semaine, soit 14 pesées; durée : 2 minutes/pesée) _ 2) à deux administrations intrapéritonéales par semaine pendant 13 semaines (1 semaines d'habituation et 12 semaines de traitement; durée : 2 minute par administration) - 3) à trois prélèvements sanguins pratiqués à la veine de la queue (durée: 5 minute/prélèvement) - 4) à une anesthésie pour administration IV d'une sonde fluorescente (durée : 10 minute) - 5) à une anesthésies terminale avant euthanasie (durée : 10 minute).
Impact sur les animaux
En termes de nuisances, les animaux seront soumis à du stress du fait des manipulation lors des pesées régulières de poids corporel ou des injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Par ailleurs les animaux seront soumis à des douleurs aiguës lors des administration intrapéritonéales, et des prélèvements sanguins.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes (tronc aortique, coeur) sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur la formation et le développement des plaques d'athérome.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé et rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt mesurés sur le modèle de souris utilisé, soumis à une alimentation enrichie en graisses. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Les données seront analysées par des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les traitements par voie intrapéritonéale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (3 animaux par cage) afin de satisfaire leurs besoins sociaux. Un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésiante sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. L'administration intraveineuse de la sonde fluorescente sera pratiquée en rétro-orbital sur animal anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent notamment une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques.
Choix des espèces
La souris ApoE est un modèle génétique présentant une déletion du gène codant pour l'apolipoprotéine E, une protéine constitutive des lipoprotéines, structures chargées du transport des triglycérides et du cholestérol dans le sang. Cette mutation induit chez ces souris une propension à développer spontanément des plaques d'athérome, en faisant un modèle de choix pour les études précliniques. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.