Rongeurs
Tests de stratégies thérapeutiques pharmacologiques chez des modèles murins du syndrome d’Ondine, une maladie génétique rare.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux porteurs d'une mutation du syndrome d'Ondine, maladie qui interrompt la respiration pendant le sommeil, subissent des gavages, une injection intrathécale sur animal vigile et des mesures cardio-respiratoires répétées de la naissance à trois semaines. Le porteur signale une forte mortalité des souriceaux mutants à la naissance et une vulnérabilité à l'anesthésie qui le conduit à injecter sans anesthésier. Le projet teste deux pistes pharmacologiques pour une maladie sans traitement, en s'appuyant sur une recommandation de l'Agence européenne du médicament de tester sur rongeurs juvéniles.
Objectifs
Le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare, constatée dès la naissance : le nouveau-né́ diminue sa respiration jusqu’à l'arrêter pendant le sommeil. Une caractéristique majeure est l'absence d'un réflexe respiratoire important : l'augmentation de la respiration lorsque l'on inhale du CO2 (sensibilité́ à l’hypercapnie). La maladie est provoquéé par une mutation hétérozygote d'un gène déterminant dans le développement embryonnaire du système nerveux autonome qui contrôle les grandes fonctions vitales comme la respiration. Actuellement, il n'existe aucun traitement pharmacologique et le recours à une ventilation mécanique à vie pendant le sommeil est nécessaire. Ce projet vise à étudier deux pistes de stratégies thérapeutiques pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un traitement pharmacologique réduirait le recours à la ventilation mécanique, l’unique prise en charge actuelle pour cette pathologie et ainsi réduirait les risques dus à un arrêt accidentel pendant le sommeil ou à une ventilation inadaptée. Les retombées de ce projet sont ainsi directement utiles en termes de prévention et d’implications thérapeutiques. De plus, pour des médicaments à visée pédiatrique, l’agence européenne du médicament recommande des tests sur des rongeurs juvéniles pour garantir l’innocuité et l’efficacité du produit sur la population cible.
Procédures
- Gavage en lait réalisé en moins de 2 minutes, fréquence : toutes les deux heures sur les souriceaux dont la poche de lait est vide entre 7h et 19h de la naissance à sept jours de vie (P7) puis 3 fois par jour jusqu'à P14- Gavage en molécule réalisé une fois - Injection intrathécale (injection sous la membrane protégeant le cerveau) de molécule sur animal vigile, réalisé une fois - Mesures cardio-respiratoires répétées 3 fois espacées de 4 heures puis une fois à 4 jours après la seule injection aigue pour une cinétique ventilatoire (évolution de la ventilation après l'injection unique de médicament). Les mesures cardio-respiratoires réalisées une fois par jour à 7, 14 et 21 jour. La durée d'une mesure cardio-respiratoire est d'une heure maximum. A chaque fin d'enregistrement, les souriceaux retournent dans la portée avec leur mère- A noter qu'aucun prélèvement d'organes ou de sang n'est effectué sur animaux vigiles. Le génotypage des reproducteurs s'effectue par prélèvemnt de follicule pileux, une méthode non invasive. Pour les souriceaux, le génotypage est réalisé par prélèvement tissulaire au niveau de la queue vers 4 jors de vie.
Impact sur les animaux
Les mesures cardio-respiratoires sur les souriceaux sont toutes non invasives et la séparation maternelle pour les réaliser n’excède l’heure. Les apnées et l’hypoventilation des mutants avec la mutation constitutive sont accompagnées pour certains mutants d’un défaut de succion/déglutition qui expliquerait en partie leur perte de poids. Ces effets indésirables attendus sont pris en charge par le gavage en lait. Le gavage peut tout de même représenter une gêne pour le souriceau mais nécessaire pour les maintenir en vie. Les modèles dont la mutation est restreinte dans des tissus spécifiques font des apnées et ne répondent pas à l’hypercapnie (hypercapnie : la pression partielle en CO2 dans le sang est augmentée) à la naissance mais leur phénotype respiratoire ne compromet pas leur survie. Leur croissance pondérale est similaire à leurs congénères sauvages. L’administration de traitement par injection sans anesthésie peut induire un stress sur l'animal qui sera de courte durée car le geste est précis et maîtrisé. De plus, les mutants ont une vulnérabilité à l'anesthésie. Le recours à l'anesthésie pourrait conduire à une mortalité précoce ne permettant pas de vérifier l'effet des molécules testées. La nuisance par le génotypage des souriceaux par prélèvement tissulaire au niveau de la queue engendre une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, des prélèvements de sang ou de tissus auront lieu en post-mortem.
Remplacement
L’étude préclinique sur des animaux en développement est un préalable recommandé par l’Agence européenne du médicament pour les stratégies thérapeutiques pharmacologiques notamment pédiatrique, l’utilisation de l’animal ne peut être évitée. Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. De plus, des modèles in vitro ne sont pas adaptés car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge thérapeutique.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et de la forte mortalité des souriceaux mutants à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental (génotype ; dose ; génotype*dose) de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Nos méthodes de mesures étant non invasives, nous privilégions une étude longitudinale ce qui réduit l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Surveillance journalière des cages de souris expérimentées : boissons et nourriture à volonté des mères, papier doux de quantité suffisante pour le nid, vérification du comportement de la mère envers les petits de sa portée (regroupement de la portée), état de la portée – Suivi clinique : présence de lait dans l’estomac les premiers jours de vie, prise de poids, température corporelle et vérification des points limites à l’aide de grilles d’évaluation adaptées à l’âge de l’animal (état du pelage de la souris, sa posture, sa mobilité, l’absence d’automutilation, croissance pondérale). Fréquence de suivi clinique : journalier la première semaine, une fois par jour et en jours de semaine de la deuxième semaine puis deux fois par semaine jusqu'à la fin de la procédure. Les points limites choisis sont suffisament prédictifs pour éviter toute souffrance animale. En cas de point limite atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires par un personnel compétent.
Choix des espèces
Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique. Nous travaillons sur les pistes thérapeutiques pharmacologiques d'une maladie génétique congénitale dont les manifestations cliniques sont précoces et la prise en charge pharmaceutique est encore inexistante. A ce jour, la seule prise en charge des patients est la ventilation mécanique. Nous avons à disposition des modèles murins sur lesquels nous pouvons prendre en charge dès la naissance et tester les stratégies thérapeutiques pharmacologiques. De plus, les études précliniques sur des animaux en développement constituent une recommandation de l'agence européenne du médicament comme préalable à la recherche des médicaments pédiatriques.
Consolidation de la mémoire motrice dans un paradigme de réactivation des souvenirs pendant le sommeil
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
75 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 55 tués pour analyse du cerveau, 10 réutilisés et 10 placés à l'adoption. Quarante d'entre eux subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes de deux à quatre heures pour enregistrer leur activité cérébrale pendant le sommeil, avant d'apprendre à attraper une bille de lait sucré avec une patte. Le projet étudie la consolidation de la mémoire motrice réactivée par un son pendant le sommeil, une recherche fondamentale dont les applications en rééducation restent lointaines. Le porteur affirme qu'aucun organoïde ne reproduit les connexions entre aires corticales et que le rat est requis pour sa dextérité.
Objectifs
Les objectifs de cette étude sont 1- de mettre au point une tâche d’apprentissage moteur consistant pour le rat à utiliser uniquement une patte pour attraper une récompense (bille de lait concentré sucré) et de tester la réactivation ciblée de la mémoire par un stimulus sonore, 2- d’étudier les mécanismes neuronaux mis en jeu lors de la consolidation de la mémoire motrice en condition contrôle et en condition de réactivation ciblée. Plus précisément, notre hypothèse est que rejouer le stimulus sonore associé à la tâche comportemental pendant certaines phases du sommeil va favoriser l’apprentissage de la tâche motrice et que cela sera associé à une augmentation de l’émission d’ondes rapides dans l’hippocampe pendant le sommeil profond et à une augmentation de la fréquence des fuseaux et des oscillations lentes dans le cortex moteur contra-latéral à la patte utilisée pour attraper la bille de lait.
Bénéfices attendus
Le bénéfice direct de cette étude est l’amélioration des connaissances, dans deux domaines, 1- les mécanismes de base du sommeil profond, et 2- le rôle du sommeil profond dans les processus d’apprentissage et de mémoire. En plus de ce bénéfice direct, les bénéfices indirects de cette recherche fondamentale sont 1- mettre en évidence l’importance relative des différentes phases du sommeil pour l’apprentissage et la consolidation de la mémoire. 2 - d’approfondir les connaissances sur les mécanismes neuronaux qui sous-tendent la réactivation ciblée des souvenirs, une technique qui pourrait être employée dans la rééducation des patients ayant souffert d’un accident ayant eu un impact négatif sur leur capacité motrice ou encore chez les personnes âgées ayant des problèmes de sommeil et de consolidation de la mémoire. En effet, la population mondiale d'individus de plus de 60 ans devrait plus que doubler au cours de la première moitié du 21e siècle (Organisation mondiale de la santé ; http://www.who.int/ageing/about/facts/en/), ce qui entraînerait d’énormes défis économiques et sociétaux. Il est donc de première importance de comprendre le fonctionnement du sommeil en conditions physiologiques et pathologiques pour ajouter une corde à l’arc thérapeutique.
Procédures
40 rats subiront une chirurgie invasives (implantations d'électrodes d'enregistrements) qui permettront d'enregistrer leur activité cérébrale pendant le sommeil. La chirurgie dure entre 2 et 4 heures. Un traitement antalgique est donné avant la chirurgie, qui s'effectue sous anesthésie générale, et se poursuit pendant 5 jours en soins post-opératoires. Les rats ensuite feront un test de comportement qui consiste à attraper une friandise avec la patte à travers une fente dans le mur de sa cage.
Impact sur les animaux
La mise en place du protocole comportemental n’aura pas de nuisances. La tâche se base sur la gourmandise naturelle des rats qui adorent les billes de lait sucré. Néanmoins si les animaux manquent de motivation pour effectuer la tâche, une restriction légère de nourriture de 12h avant l’apprentissage de la tâche sera effectuée. Afin de réduire le stress dû à la restriction, les rats seront progressivement habitués à un jeûne de 12h. Les rats pourraient aussi être irritaté au niveau de la patte en frottant les parois de la boîte de test. Pour prévenir cela, les parois seront polie une crème apaisante (cycatril) sera appliquée.
Devenir
55 animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem. Pour 15 d’entre eux, leur cerveaux serviront à déterminer les régions cérébrales activées pendant l'apprentissage et la consolidation de la mémoire. Pour les 40 autres rast, les animaux seront mis à mort afin de vérifier l'emplacement des électrodes d'enregistrement.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude du comportement chez le rat pendant une tâche d’apprentissage moteur et enregistrement de plusieurs aires corticales simultanément. Il est à ce jour impossible de mimer un apprentissage mnésique dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques se basant sur des linear mixed models qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle et de test afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.
Raffinement
Le haut niveau de complexité des chirurgies effectué sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrements pendant des mois. Dans ce projet, nous combinerons les enregistrements électrophysiologiques à une tâche comportementale complexe ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux et d’obtenir des données riches. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les rats, nous avons donc raffiné les étapes d’habituation et de contention afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Les animaux implantés sont souvent isolés pour protéger les implants. Dans cette étude, les rats seront équipés d’un chapeau de protection en plastique solide afin de protéger les implants et de permettre de maintenir les animaux en groupe.
Choix des espèces
Ce projet requiert l’utilisation de rats du fait du haut niveau de dexterité requis pour la tâche. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. Les rats possèdent une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. D’autre part, le rat possède les capacités cognitives et les facultés de se concentrer sur une tâche qu’on ne retrouve pas chez la souris par exemple. Ils sont aussi très gourmand ce qui permet d’effectuer l’étude sans restriction alimentaire.
Elevage d’un modèle murin de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (projet Site 2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
6 020 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit expédiées, soit tuées. Il s'agit du deuxième site d'un élevage de la lignée C3-PMP porteuse d'une duplication du gène PMP22, modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, dont les souriceaux développent dès trois semaines une atteinte neuromusculaire. Le génotypage se fait par biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Le porteur décrit ces animaux comme produits pour un partenaire développant un traitement et affirme que le modèle in vivo ne peut être remplacé.
Objectifs
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) correspond à un groupe hétérogène de neuropathies périphériques chroniques héréditaires rares avec déficits moteurs et sensoriels. C’est l'un des troubles neurologiques dégénératifs les plus courants qui, tout en étant qualifié de rare, présente un taux de prévalence "élevé" (prévalence moyenne de 2,63 / 10 000 personnes). La CMT se caractérise par une diminution de la force musculaire et une fonte des muscles au niveau des extrémités, une déformation du pied, des douleurs musculo-squelettiques et neuropathiques, la perte de dextérité, la fatigue et la perte sensorielle. A ce jour, il n’existe aucun traitement pour inverser ou ralentir le processus de la maladie. Le but de ce projet est d’élever des modèles de rongeur pertinents pour l'étude de cette pathologie ; ces modèles peuvent développer spontanément un ou plusieurs caractéristiques du modèle ou être génétiquement altérés. Les animaux issus de ces developpements serviront à favoriser la compréhension des mécanismes pathologiques, cognitifs et comportementaux suite à ces altérations ciblées, à identifier des substrats moléculaires et biologiques caractéristiques et à développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certaines anomalies génétiques à l’origine de la CMT entraînent la démyélinisation des nerfs périphériques. A chacun des gènes mutés entrainant la démyélinisation, correspond un sous-type de CMT. Le but de cette étude est de produire des animaux pour un partenaire cherchant à développer un traitement pharmacologique capable de diminuer le stress cellulaire associé à la duplication du gène PMP22 afin de protéger les cellules de Schwann et ainsi palier au dysfonctionnement des nerfs périphériques.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ce modèle de souris C3-PMP, au plus proche de la maladie humaine, est donc très pertinent pour le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Les souris présentent un phénotype dommageable de troubles de la locomotion. Une biopsie caudale et/ou d'oreille est réalisée sur l'animal vigile pour son génotypage.
Impact sur les animaux
Ces animaux commencent à developper les premiers signes de la maladie à 3 semaines, ils développent une insuffisance neuromusculaire associée à une capacité motrice anormale, des défauts de coordination ainsi qu’une hypoactivité. Ces signes de locomotion perturbée sont observables principalement chez la femelle. Ils n'handicapent pas l'animal pour sa prise de nourriture, d'eau et ses interactions sociales. Par ailleurs, une douleur légère peut être induite lors de biopsies pour génotypage.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés soit mis à mort.
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ces hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie de CMT, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Un hébergement standard sera réalisé. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance afin de confirmer le degré de sévérité du phénotypage de la lignée. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Si, par exemple, une difficulté de locomotion apparait, cela entrainera une facilitation à l'accès à l'eau et la nourriture directement dans la cage d'hébergement (croquettes et gel dans la cage). Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. La souris est un modèle animal simple à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elle est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, de sa courte gestation, de sa durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d'ovocytes, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Évaluation de l’efficacité d’une nouvelle molécule, administrée par voie intranasale, dans des modèles murins infectés par Pseudomonas aeruginosa ou par le virus de la grippe.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
960 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal est infecté par le virus de la grippe ou par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par voie intranasale sous anesthésie, puis traité ou non par une molécule, l'infection pouvant provoquer perte de poids, hypothermie et léthargie pendant plusieurs jours. Le projet évalue l'efficacité antivirale et antibactérienne de cette molécule déjà active in vitro. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la tolérance d'un "organisme entier" et pourrait ramener le nombre de 960 à 384 souris si la première modalité fonctionne.
Objectifs
Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l’efficacité antivirale et antibactérienne d’une molécule que nous appelerons M, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées. Cette demande d’autorisation de projet est couplée avec une première demande qui évaluera au préalable la tolérance de la molécule M, in vivo, chez la souris saine.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à évaluer l’effet antiviral et antibactérien d’une nouvelle molécule prometteuse ayant une activité in vitro contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Avant d’être évaluées in vivo la molécule M a démontré son efficacité contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa in vitro à des doses non cytotoxiques. Au préalable, une étude de toxicité/tolérance sera réalisée (autre demande d'autorisation de projet). La dose la plus appropriée sera ensuite utilisée pour déterminer l’efficacité antivirale et antibactérienne, dans un modèle murin d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa, en traitement curatif. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa.
Procédures
Les souris seront infectées par le virus de la grippe ou P. aeruginosa, par voie intranasale, sous anesthésie générale, puis traitées ou non par la molécule M, administrée 1 à 3 fois, par voie intranasle, également sous anesthésie générale.La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes par souris jsuqu’à son réveil.
Impact sur les animaux
Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces. Par ailleurs, pour étudier l’efficacité de la molécule M vis-à-vis du virus de la grippe ou de P. aeruginosa, les souris seront infectées et feront donc l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids de chaque souris. Ces deux modèles d’infection peuvent conduire aux effets secondaires suivants : perte de poids, température, perte d’appétit, inactivité ou encore létargie, sur une durée allant jusqu’à 6 ou 7 jours post-infection pour la grippe. Le modèle d'infection pour P. aeruginosa est beaucoup plus court (48h). Afin d’éviter d’infliger une douleur et une souffrance à l’animal, nous avons établi plusieurs critères d’évaluation afin de déterminer très rapidement les points limites.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance et d'efficacité.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que les modèles murins d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa sont bien établis et maîtrisés par l’équipe. De plus, nous tenons à souligner que dans notre étude, la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antivirale contre le virus de la grippe et antibactérienne vis-à-vis de P. aeruginosa, à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.
Réduction
Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques. Ainsi, pour évaluer l’efficacité de la molécule M, vis-à-vis du virus de la grippe et de P. aeruginosa, un total de 960 souris au maximum sera nécessaire. Cependant, ce nombre sera réduit puisque 3 modalités de traitement sont envisagées, mais si la première modalité montre une efficacité antimicrobienne, les 2 autres modalités ne seront pas réalisés, réduisant le nombre de 960 à 384 souris.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.).
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons des souris parce qu’il s’agit d'une espèce animale appropriée pour étudier l’inflammation, les réponses immunitaires et qu’il s’agit d’un modèle bien établi pour l'infection par le virus de la grippe et pour l'infection par P. aeruginosa. D’autre part, le modèle d’infection grippale et le modèle d'infection par P. aeruginosa sont pleinement maîtrisés, chez la souris, au laboratoire et les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Il existe également de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, le choix de cette espèce limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant, et nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles pour rechercher un éventuel "effet sexe".
Etude de l’efficacité anticancéreuse de la synergie entre un traitement aux ultrasons, un traitement de référence en immunothérapie et une hormonothérapie dans un modèle de cancer du sein
- Recherche appliquée
- Cancers
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever les tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après greffe de cellules cancéreuses sous la peau, chaque animal reçoit jusqu'à quatre traitements par ultrasons sous anesthésie, susceptibles de provoquer une brûlure au niveau de la tumeur, plus des injections d'immunothérapie et un gavage d'hormonothérapie. Le projet teste si les ultrasons désorganisent l'environnement de la tumeur pour rendre le traitement plus efficace dans un cancer du sein. Les bénéfices sont annoncés pour la santé humaine "à long terme" et "en cas de succès".
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes dans le monde. L’hormonothérapie est un traitement efficace du cancer du sein mais pas pour tous les types de cancer ni pour toutes les patientes. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à un traitement combiné hormonothérapie et immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur de manière plus efficace.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie ultrasons + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patientes atteints de cancer du sein.
Procédures
- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 4 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine - 4 injections intrapéritonéales d'immunothérapie à raison d’un par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 4 injection sous cutanée d’antidouleur dans l’abdomen (30 secondes) - Au maximum 8 pesées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de deux par semaine – 5 gavage d’hormonothérapie, 30 secondes.
Impact sur les animaux
Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut rarement entrainer une gêne à la locomotion. Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine, les ultrasons pouvant induire une brûlure au niveau de la tumeur. Le traitement avec l’immunothérapie et l'hormonothérapie n’ont pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris (pas de réaction auto-immune).
Devenir
Suite à la procédure les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs pour analyses
Remplacement
Plusieurs informations ont été données via des études culture de cellules : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.
Réduction
Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé par un outil statistique et les résultats seront interprétés grâce à des tests statistiques. Cela nous a permis de déterminer qu'il nous faudra 8 animaux par groupe en suivi de l'efficacité et de la survie.
Raffinement
Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en leur faisant une contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. L’état général des souris sera aussi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation. Tous les animaux seront mis à mort au plus tard 60 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a pas été atteint avant ce délai. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseignent une grille de suivi basé sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos vouté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour se cacher et se reposer). En prévision d’éventuelles brûlures cutanées à cause de la cavitation, les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. Pour les composés administrés en gavage, des sondes de gavage flexibles et à usage unique seront utilisées.
Choix des espèces
La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. La souche est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature, et donc actif.
Elevage d’un modèle murin de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (projet site 1)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
6 020 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit expédiées à un partenaire, soit tuées. Ce projet consiste à élever une lignée porteuse d'une duplication du gène PMP22 reproduisant la maladie de Charcot-Marie-Tooth, les souriceaux développant dès trois semaines une atteinte neuromusculaire et des troubles de la coordination. Le génotypage passe par une biopsie de la queue ou de l'oreille sur animal vigile. Le porteur indique produire ces animaux pour un partenaire cherchant un traitement pharmacologique et affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer le modèle in vivo.
Objectifs
La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) correspond à un groupe hétérogène de neuropathies périphériques chroniques héréditaires rares avec déficits moteurs et sensoriels. C’est l'un des troubles neurologiques dégénératifs les plus courants qui, tout en étant qualifié de rare, présente un taux de prévalence "élevé" (prévalence moyenne de 2,63 / 10 000 personnes). La CMT se caractérise par une diminution de la force musculaire et une fonte des muscles au niveau des extrémités, une déformation du pied, des douleurs musculosquelettiques et neuropathiques, la perte de dextérité, la fatigue et la perte sensorielle. A ce jour, il n’existe aucun traitement pour inverser ou ralentir le processus de la maladie. Le but de ce projet est d’élever des modèles de rongeur pertinents pour l'étude de cette pathologie ; ces modèles peuvent développer spontanément un ou plusieurs caractéristiques du modèle ou être génétiquement altérés. Les animaux issus de ces developpements serviront à favoriser la compréhension des mécanismes pathologiques, cognitifs et comportementaux suite à ces altérations ciblées, à identifier des substrats moléculaires et biologiques caractéristiques et à développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Certaines anomalies génétiques à l’origine de la CMT entraînent la démyélinisation des nerfs périphériques. A chacun des gènes mutés entrainant la démyélinisation, correspond un sous-type de CMT. Le but de cette étude est de produire des animaux pour un partenaire cherchant à développer un traitement pharmacologique capable de diminuer le stress cellulaire associé à la duplication du gène PMP22 afin de protéger les cellules de Schwann et ainsi palier au dysfonctionnement des nerfs périphériques.
Bénéfices attendus
L’identification des mutations spontanées et l’amélioration des outils permettant les manipulations génétiques ont permis de créer et/ou d’identifier des modèles animaux de diverses maladies humaines provoquées par l'expression qualitativement ou quantitativement anormale d'un gène, modèles dont l'intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point d'éventuelles thérapeutiques est évident. Ce modèle de souris C3-PMP, au plus proche de la maladie humaine, est donc très pertinent pour le développement de traitements pharmacologiques.
Procédures
Les souris présentent un phénotype dommageable de troubles de la locomotion. Une biopsie caudale et/ou d'oreille est réalisée sur l'animal vigile pour son génotypage.
Impact sur les animaux
Ces animaux commencent à developper les premiers signes de la maladie à 3 semaines, ils développent une insuffisance neuromusculaire associée à une capacité motrice anormale, des défauts de coordination ainsi qu’une hypoactivité. Ces signes de locomotion perturbée sont observables principalement chez la femelle. Ils n'handicapent pas l'animal pour sa prise de nourriture, d'eau et ses interactions sociales. Par ailleurs, une douleur légère peut être induite lors de biopsies de génotypage.
Devenir
Les animaux sont soit expédiés soit mis à mort.
Remplacement
Les projets expérimentaux comportent classiquement une phase d'étude initiale in vitro qui permettent une sélection initiale des propriétés pharmacologiques et qui permettent de valider certaines hypothèses permettant l'obtention de données préliminaires et complémentaires. Les modèles murins proposés ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car une deuxième étape d'étude nécessite de consolider les résultats in vitro et valider ces hypothèses sur un modèle in vivo. Le projet actuel ne peut pas être envisagé sans étape in vivo donc sans modèle animal. En effet, avant de pouvoir envisager une étude clinique sur les patients souffrant de la maladie de CMT, il est nécessaire de démontrer que les molécules sélectionnées ont les effets pharmacologiques escomptés et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.
Réduction
Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux après expédition. Le nombre d’animaux est calculé de manière à utiliser le minimum d’animaux par groupe permettant l’obtention de résultats homogènes. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles. Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Un hébergement standard sera réalisé. Une attention particulière sera apportée à chacun des animaux qui seront surveillés quotidiennement dès leur naissance afin de confirmer le degré de sévérité du phénotypage de la lignée. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Si, par exemple, une difficulté de locomotion apparait, cela entrainera une facilitation à l'accès à l'eau et la nourriture directement dans la cage d'hébergement (croquettes et gel dans la cage). Les animaux seront évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets. La souris est un modèle animal simple à élever, à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Elle est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, de sa courte gestation, de sa durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. L’âge des animaux est conditionné par les objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront hébergés dans nos locaux dès leur naissance et jusqu’à leur envoi ou leur mise à mort. Pour l’élevage, les accouplements seront réalisés à maturité sexuelle. Au moment de l’expédition, l’âge varie en fonction des besoins. Les animaux pourront être envoyés à nos partenaires dès le sevrage ou avec leur mère si les animaux ne sont pas encore sevrés. Des femelles gestantes pourraient également être expédiées avant le dernier tiers de la gestation. Pour la collecte de sperme et d'ovocyte, des adultes matures sexuellement seront utilisés.
Impact de l’administration de la flunarizine sur le développement de la SLA liée à FUS dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la flunarizine par gavage quotidien pendant 14 jours, subissent des tests moteurs et un test d'anxiété, un électromyogramme sous anesthésie et une biopsie de l'oreille pour génotypage. Le projet cherche à savoir si cette molécule déjà commercialisée pourrait ralentir une forme de sclérose latérale amyotrophique liée au gène FUS, maladie sans traitement. Le porteur pose ce repositionnement comme une hypothèse et affirme que seul un modèle souris reproduit la complexité comportementale et nerveuse recherchée.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la forme principale de maladie du motoneurone adulte (neurones localisés dans la moelle épinière et impliqués dans la transmission du signal moteur). La maladie du motoneurone principale chez l’enfant est l’amyotrophie spinale. Il existe des points communs au niveau génétique et fonctionnel entre ces deux maladies. Ces deux maladies entrainent une mort inévitable des patients et aucun traitement n’est actuellement disponible pour la SLA liée à la mutation du gène FUS. Des travaux récents ici d'une collaboration ont identifié une nouvelle molécule, la flunarizine, comme une molécule ayant un effet protecteur dans le contexte de l’amyotrophie spinale. La SLA et l’amyotrophie spinale partageant un certain nombre de points communs, y compris dans les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie, il est raisonnable de faire l’hypothèse que la flunarizine puisse aussi exercer une action protectrice dans la SLA-FUS. C’est ce que nous voulons tester dans ce projet. La flunarizine possède une autorisation de mise sur le marché et est utilisée essentiellement pour des traitements de courte durée mais peut entrainer à forte dose des effets néfastes. Nos objectifs sont donc : (i) de déterminer la dose de flunarizine ayant un effet bénéfique (expression de gènes cibles) mais sans effet secondaire chez des souris sauvages (ii) de caractériser l’effet de la flunarizine sur les défauts moteurs établis dans un modèle murin de SLA-FUS.
Bénéfices attendus
La SLA FUS est une maladie fatale, sans traitement à l’heure actuelle. La flunarizine est une molécule disposant d’une autorisation de mise sur le marché qui a fait ses preuves dans un modèle murin modélisant une maladie ayant des similitudes avec la SLA. Notre projet pourrait amener les arguments expérimentaux pour repositionner la flunarizine pour le traitement de la SLA-FUS.
Procédures
Les animaux recevront un traitement (administration par gavage sur animal vigil afin de limiter les risques de fausse route) durant 14 jours, à raison de 1 fois par jour. La durée du gavage est d’environ 20 secondes. Nous réaliserons un suivi mensuel des capacités motrices (force musculaire). Ce test se passe en 3 session de 3 minutes maximum chacune, entrecoupées de phases de repos de 5 minutes. Les animaux seront toujours remis en groupe. Nous réaliserons un test d’anxiété 2 fois au cours de la vie de l’animal (avant le début du traitement et un mois après). Ce test se déroule sur une session unique de 5 minutes. L’examen du fonctionnement des muscles (EMG) durera environ 20 minutes et sera réalisée en fin de procédure, sur les souris anesthésiées afin d’éviter toute souffrance. Nous réaliserons un prélèvement d’un petit bout d’oreille (1mm de diamètre) lorsque les souris auront entre 7 et 10 jours ce qui entrainera une douleur légère et de courte durée.
Impact sur les animaux
Nous pourrions observer chez les souris traitées des fausses routes liées à l’administration du traitement, raison pour laquelle nous avons développé une grille spécifique de scorage afin de suivre chacune des souris dès le début du traitement. La molécule utilisée peut entrainer des problèmes musculaires lorsqu’elle est administrée à forte dose. Nous avons développé une seconde grille d’évaluation afin de nous assurer que les doses choisies ne sont pas néfastes. Nous pourrions également observer un stress causé par la passation du test moteur et du test d’anxiété. Un temps de repos sera systématiquement appliqué pour le test moteur qui nécessitent plusieurs passages successifs. Si nous remarquons que les souris sont fatiguées, nous espacerons les différentes sessions. La procédure d’électro myo gramme qui permet d’observer la présence ou non d'atteinte des muscles sera réalisée sous anesthésie, les souris ne ressentiront donc aucune douleur. Le prélèvement d’un morceau d’oreille pour définir le génotype de nos souris entrainera une douleur légère et brève.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements et analyses.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer s’il est possible d’utiliser la flunarizine pour contre carrer, ou du moins ralentir, le développement des troubles moteurs observés dans la SLA. Pour étudier cela, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit à la fois la complexité comportementale (avec l’apparition possible des troubles de l’anxiété et des troubles moteurs) mais aussi une complexité structurelle du système nerveux, notamment avec les différents intervenants cellulaires retrouvés dans le système nerveux central chez l’Homme. La souris nous offre la possibilité de travailler avec ces deux niveaux de complexité.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à la bonne réalisation de ce projet a été calculé, d’après nos travaux préliminaires, de manière à obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Par ailleurs, pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici de réaliser les analyses histologiques et moléculaires sur les mêmes animaux que ceux chez qui auront réalisé le suivi longitudinal. Pour limiter le nombre total d’animaux générés et améliorer nos connaissances de la maladie, nous proposons d’utiliser les mâles et les femelles. Par ailleurs, nous avons décidé de réaliser une première étude pour 1. vérifier que la flunarizine soit utilisable dans nos conditions d’expérimentations, 2. déterminer la dose de flunarizine que nous utiliserons ensuite et 3. diminuer le nombre de souris impliquées dans l’étude longitudinale (nous n’étudierons plus qu’une dose de flunarizine au lieu de trois si nous ne faisions pas cette première étude).
Raffinement
L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, maisons de carton blanc), le maintien des interactions sociales (les souris sont gardées à plusieurs par cage tout au long de leur vie) et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer de leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Nous avons établi des points-limites clairs afin de pouvoir soustraire l’animal à la souffrance si nécessaire. Nous pourrons ainsi facilement déceler un éventuel comportement anormal. Toutes les approches expérimentales que nous souhaitons utiliser dans ce projet sont couramment réalisées dans notre laboratoire, ce qui limite fortement les risques de perte de tissus pour des raisons purement techniques. Par ailleurs, la procédure d’étude du muscle sera réalisée sous anesthésie gazeuse afin de réduire toute souffrance de l’animal et de réduire le stress lié à la manipulation.
Choix des espèces
Les modèles de souris transgéniques sont les plus appropriés à notre étude car ils présentent le niveau de complexité structurelle du cerveau et de la moelle épinière adéquat, une séquence de notre gène d’intérêt (Fus) bien concernée d’un point de vue phylogénétique et des capacités cognitives et motrices qui nous permettent d’évaluer des troubles retrouvés chez les patients. Les études seront réalisées sur des souris adultes (4 mois) car les patients souffrant de SLA liée à FUS présentent très rarement des formes juvéniles.
Évaluation des effets bénéfiques de candidats-médicaments sur la myéline dans un modèle de sclérose en plaques induit par l’injection stéréotaxique de lysophosphatidylcholine dans le corps calleux.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique pour injecter de la lysophosphatidylcholine dans le corps calleux et provoquer une démyélinisation, puis reçoit un traitement quotidien pendant sept jours et un prélèvement intracardiaque terminal. Le porteur, un prestataire travaillant pour des "clients", cherche à évaluer des candidats-médicaments pro-myélinisants dans un modèle de sclérose en plaques. Il indique tester la molécule sur "l'organisme entier" faute de culture cellulaire jugée assez représentative.
Objectifs
La sclérose en plaques demeure une maladie neurologique complexe, caractérisée par des attaques inflammatoires et démyélinisantes touchant le système nerveux central. Actuellement, il n'existe aucun traitement efficace et curatif pour la sclérose en plaques. Les options disponibles se concentrent plutôt sur des traitements de fond destinés à ralentir la progression de la maladie (immunomodulateur/immunosuppresseur), ainsi que sur des traitements symptomatiques visant à soulager les symptômes et à améliorer la qualité de vie des patients, mais ces traitements présentent des limites en termes d'efficacité et d'effets secondaires. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de plusieurs candidats-médicaments sur un modèle murin de sclérose en plaques induit par l'injection de lysophosphatidylcholine (LPC) dans le corps calleux , qui présente l’avantage d’être rapide et centré sur la démyélinisation ainsi que sur la remyélinisation spontanée et après traitement. Cette étude permettra de caractériser les atteintes motrices et les lésions histopathologiques de la myéline provoquées par la LPC, ainsi que d'évaluer les effets bénéfiques (protecteurs et/ou remyélinisants) de ces candidats-médicaments que nous comparerons à un composé aux propriétés pro-myélinisantes, à savoir, la clémastine.
Bénéfices attendus
La découverte de molécules favorisant la myélinisation revêt une importance capitale pour le développement de futurs médicaments destinés aux patients atteints de sclérose en plaques. Étant donné les options thérapeutiques limitées actuellement disponibles pour traiter cette maladie, ce projet vise à évaluer l'efficacité des candidats-médicaments. Les résultats obtenus orienteront les recherches de nos clients, les guidant soit vers des essais cliniques, soit vers un ajustement de leur stratégie de recherche et développement dans le traitement de la sclérose en plaques. De plus, l'identification de biomarqueurs spécifiques pourrait également contribuer à définir une approche plus personnalisée du traitement.
Procédures
L'ensemble des animaux de ce projet subiront la procédure décrite: une chirurgie stéréotaxique (1 fois, 1 heure maximum), sous anesthésie générale, et une analgésie systémique (buprénorphine en voie sous-cutanée, 1 fois) et une analgésie locale (lidocaïne en voie sous-cutanée 1 fois). Leur état clinique sera surveillé pendant cinq jours postopératoire pour détecter un effet indésirable ou des signes de souffrance. La procédure inclue des traitements chroniques (une fois par jour, pendant 7 jours, d'une durée de 30 secondes maximum) par voie intra-péritonéales. Les fonctions motrices seront évaluées avec un test de coordination motrice. Ce test sera rapide (maximum 5 minutes par jour, pendant 1 jour). Les animaux subiront un prélèvement intra-cardiaque sous anesthésie profonde juste avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique susceptible d'engendrer une souffrance post-opératoire. Les traitements quotidiens des souris peuvent induire du stress, en particulier lors des premières administrations. Le test de motricité peut également susciter du stress chez les souris, du fait de leur placement dans des environnements inhabituels. Les injections répétées peuvent éventuellement entraîner des inflammations ou des infections cutanées. L'administration de l'anesthésie à l'isoflurane peut accroître le niveau de stress chez les souris et influencer simultanément la fréquence cardiaque et la respiration.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'étude. Le projet nécessite d'évaluer la démyélinisation/remyélinisation par histologie. Nous aurons donc besoin de collecter des échantillons biologiques à la fin de la procédure.
Remplacement
Notre but est d'évaluer les effets protecteurs et régénérateurs de candidats-médicaments dans un modèle in vivo de sclérose en plaques. Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser de façon satisfaisante la complexité de la sclérose en plaques, en particulier la complexité des interactions entre les neurones, leurs axones et la formation de myéline par les oligodendrocytes. De plus, il est nécessaire de tester la molécule sur l'organisme entier afin de rendre compte des effets globaux de la molécule dans un contexte intégré, étant donné l'implication des oligodendrocytes et des neurones dans la maladie. Nous devons donc recourir à un modèle animal pour ce projet de recherche. L'utilisation d'un modèle animal est essentielle pour obtenir un degré de comparaison satisfaisant avec la biologie humaine et la souris partage de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains, cela permet d'obtenir des résultats pertinents pour la prédiction des réponses chez l'Homme.
Réduction
Le nombre de souris inclus dans l'étude a été optimisé pour garantir l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Un analyse de puissance démontre qu'un nombre de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il y aura donc 168 souris dans cette étude (7 groupes x 12 souris x 2). Nous avons choisi de mener notre étude en séparant les groupes expérimentaux selon le sexe, en commençant par les mâles. Cette approche vise à éliminer toute influence potentielle du cycle ovarien sur les résultats initiaux. Si les données obtenues avec les mâles s'avèrent encourageantes, nous réaliserons, par la suite, les mêmes tests sur les femelles. Cette stratégie est motivée par la connaissance des possibles impacts du sexe et du cycle ovarien sur les processus de démyélinisation/remyélinisation. De plus, en évitant de mélanger les sexes dès le départ, nous cherchons à minimiser la variabilité des résultats, ce qui nous permettra d'évaluer plus précisément l'efficacité des composés étudiés. En adoptant cette approche, nous souhaitons réduire le nombre d'animaux inclus dans l'étude, en n'impliquant les femelles que si les résultats préliminaires sur les mâles sont prometteurs, alliant ainsi efficacité scientifique et considérations éthiques.
Raffinement
Le protocole inclura la présence d'objets d'enrichissement tels que des papiers pour nids et des tunnels en carton, l'application d'approches analgésiques avant, pendant et après toute opération, et une anesthésie générale lors de toute intervention chirurgicale. Un contrôle rigoureux des besoins physiologiques des animaux, notamment la température corporelle, sera mis en place pendant et après l'opération pour assurer un rétablissement rapide. Pour atténuer l'anxiété lors des manipulations, une habituation quotidienne au personnel et aux traitements (solution saline) sera réalisée tout au long de la phase d'acclimatation des animaux, d'une durée minimale d'une semaine. De plus, avant le test de l'échelle, une phase préalable d'habituation sera effectuée après la phase d'acclimatation, la veille de la chirurgie. Les animaux auront au minimum une semaine d'acclimatation à leur nouvel environnement après leur arrivée au laboratoire. La souffrance des animaux sera réduite au minimum grâce à une surveillance quotidienne des signes indicateurs de détresse. En cas de perte de poids entre 10 et 15% par rapport au poids initial au début de l'étude, une préparation à base d'eau et de croquettes sera directement introduite dans la cage pour faciliter l'alimentation. Si des signes de détresse sont identifiés, le responsable de l'étude sera informé et un analgésique sera administré (buprénorphine par voie sous-cutanée à une dose de 0,1 mg/kg). Si le traitement analgésique se révèle inefficace, l'animal sera mis à mort. Le projet a établi des points limites, en cas d'atteinte de l'un de ces points, le responsable de l'étude sera informé et l'animal sera euthanasié par surdose d'isoflurane suivie d'une dislocation cervicale.
Choix des espèces
La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la sclérose en plaques. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines. Ce stade de développement chez la souris est approprié pour observer un processus de démyélinisation.
Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies génétiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 480
5 000 souris et rats vont être utilisé·es dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère, la plupart tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, une partie gardée pour la reproduction. Elles reçoivent des injections répétées par voie intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, orale, oculaire ou intracérébrale avec pose de canule, sur une durée pouvant atteindre 24 semaines, avant une mesure terminale de la contractilité musculaire sous anesthésie. L'objectif est de sélectionner des candidats de thérapie génique ou antisens contre la myopathie de Duchenne, les retombées pour les patients étant renvoyées au long terme. Sur le remplacement, le porteur teste d'abord les molécules in vitro mais affirme que le recours aux modèles animaux reste "indispensable" pour le développement préclinique.
Objectifs
Notre équipe développe des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques. Nos efforts se focalisent essentiellement sur des pathologies neuromusculaires et en particulier sur la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement sur corps entier. Au-delà de l’atteinte purement musculaire nécessitant un traitement du corps entier par voie systémique, le système nerveux central (aspect cognitif) représente notamment aujourd’hui les cibles à traiter pour espérer un réel bénéfice thérapeutique. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques nous focalisons nos efforts sur des stratégies, des technologies et des outils moléculaires capables de répondre efficacement à ce défi.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de maladie neuromusculaire notamment la myopathie de Duchenne. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique ainsi que la voie d'administration la plus appropriée, permettant une biodistribution sur le corps entier et une amélioration significative chez les modèles animaux étudiés, et à plus long terme chez les patients traités.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections de molécules actives selon différentes voies (intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale ou sous cutanée) afin d’évaluer les meilleures voies pour la biodistribution. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthésie et le réveil, les injections intra péritonéale ou sous cutanée seront plus brèves de l’ordre de 1 à 2 minutes si elles sont réalisées sur animaux vigiles. Afin de permettre l’accumulation progressive, les injections systémiques pourront être répétées chaque semaine, sur une durée maximum de 24 semaines. Si nos molécules se révèlent efficace après analyse de la procédure 2, nous testerons la voie d’administration orale (intra-stomachal) moins invasives; afin de permettre l’accumulation progressive les administrations pourront être répétées 1 à 4 fois par semaine, sur une durée maximum de 12 semaines. Les administrations intra-stomachal sont brèves, de lors de 1 à 2 minutes par animaux. Afin de cibler plus spécifiquement certaines zones, nous testerons les voies d’injection oculaire et intracérébrale. Les injections se dérouleront sous anesthésie générale avec une durée maximum de 30 minutes entre l’anesthésie et le réveil. Les injections oculaires pourront être plus brèves de l’ordre de 5 à 10minutes, et les animaux ne seront injectés qu’une seule fois. Pour les animaux en procédure intracérébrale, les injections ne seront pas répétées sauf s’il y a implantation de canules où l’animal pourra recevoir des administrations 1 fois par semaine pendant 6 semaines via la canule après anesthésie gazeuse. Ces ré-administrations seront brèves de l’ordre de 5 minutes. Les animaux pourront également de façon optionnel être soumis à des prélèvements sanguins. après anesthésie générale et le sang sera prélevé sur une veine superficielle (veine de la queue, sinus retro-orbital ou sous maxillaire). Un volume sanguin maximum de 10% du volume total sera recueilli et jamais plus de 15% sur une période de 28 jours selon les normes en vigueur. Les animaux pourront de façon optionnelle être placés en cage métabolique pendant 24h afin de récolter l’urine. Les animaux ayant recus des injections pourront également suivre la procédure terminale sans réveil de mesure de la contractilité musculaire pour mesurer l’efficacité de notre traitement sur l’amélioration de la force après anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales de ce projet (anesthésies, administration de molécules, euthanasie) sont simples et peu ou pas douloureuses, les nuisances et effets indésirables sont donc faibles. Les animaux subissant la procédure d’administration intracérébrale pourraient présenter des difficultés d’alimentation et une potentielle douleur dans la première journée suivant la procédure. Leurs états seront donc particulièrement surveillés avec ajout de nourriture en gelée si besoin. Ils seront particulièrement suivis après la chirurgie avec un tableau de suivi quotidien pendant les 3 jours suivants la chirurgie, et observés bi-quotidiennement le jour de la chirurgie avec ré-administration d’analgésie 8h post opératoire si l’évaluation d’après la grille le justifie (score >6). Dans ce cas, une vigilance accrue et une observation biquotidienne sera maintenue. Concernant les modèles utilisés, il peut s’agir d’animaux altérés génétiquement classés « dommageable », car les gènes responsables des maladies génétiques étudiées sont invalidés. Ces modèles développent des phénotypes dommageables très légers et tardifs : mobilité réduite et problème cardiaque. Les points limites sont donc similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant en cas de protocole long allant jusqu’à 6 mois dans nos procédures, les animaux seront particulièrement surveillés afin d’être euthanasiés si ces symptômes devaient apparaitre prématurément.
Devenir
Ormis pour la procédure d’élevage où les animaux seront gardés en reproduction, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter l’ensemble des tissus d’intérêt et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos molécules actives font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques sur cellules, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses d’un point de vue efficacité mais également présentant une biodistribution au corps entier avec un profil toxicologique favorable. L’efficacité thérapeutique de nos molécules, seules ou en combinaison, est évaluée grâce à des modèles rongeurs appropriés.
Réduction
Toutes nos molécules sont préalablement testées in vitro afin de déterminer leurs potentiels thérapeutiques et leurs toxicités. Si ces molécules sont efficaces in vitro, et qu’elles ne sont pas toxiques sur cellules nous vérifions tout d’abord chez un petit nombre de rongeurs qu’elles présentent le même potentiel en injection locale (intra-musculaire). Les molécules ayant démontré une efficacité après injection locale en intramusculaire, seront évaluées par injection systémique pour évaluation moléculaire et tissulaire. Si et seulement si nos molécules sont efficaces par injection systémique, nous testerons les autres voies d’administrations à savoir l’administration par voie orale, par voie occulaire ou intracérébrale.
Raffinement
Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, les rongeurs auront 5 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement lors de leur arrivée. Ils seront stabulés sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement et de la nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (jour entre 6h et 18h). Le milieu est enrichi avec du coton compacté pour la nidification et des igloos en polypropylène sont disposés dans leur cage permettant les jeux et le repos des animaux. Une alimentation adaptée et enrichie est donnée à volonté et de l’alimentation en gelée pourra être disposés dans la cage pour des animaux jeunes ou ayant subi une procédure afin de faciliter l’accès. Les procédures se feront majoritairement sous anesthesie, avec analgésie post procédure si besoin. L’évaluation des points limites (poids, mobilité…) se feront selon la grllle de Morton et griffith. Concernant le phénotype de certains modèles pouvant être utilisés, il est classé « dommageable » car les gènes responsables des maladies génétiques sont invalidés. Cependant, ces modèles développent des phénotypes dommageables légers et tardifs, bien connus et documentés. Les points limites sont similaires à ceux définis pour des souris sauvages. Cependant ces animaux au phénotype dommageable font tout de même l’objet d’une procédure d’élevage (procédure 1). Tout au long du protocole, l’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de réduire tout inconfort ou douleur qui pourraient se développer. Nous avons plusieurs années de pratique de ces procédures et n’avons jamais observé de souffrance liée à sa pratique. Néanmoins, les rongeurs seront surveillés après la procédure pour vérifier leur réveil et le retour à un comportement normal.
Choix des espèces
Nous évaluerons l’efficacité et le profil toxicologique de nos molécules administrées sur modèle rongeurs, celui-ci étant le plus adapté (taille, disponibilité, lignée appropriée aux maladies génétiques étudiées) pour une évaluation thérapeutique préclinique. Nous travaillerons sur 2 espèces, à savoir sur les souris et les rats, cette condition de 2 espèces pouvant être exigée dans les études réglementaires (notamment de toxicité chronique) de produits destinés à un traitement pharmaceutique. La majorité des animaux utilisés seront des rongeurs d’âges adultes afin d’évaluer l’efficacité, ainsi que le profil toxicologique des molécules sur animaux adultes Afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement précoce ayant pour objectif d’empêcher ou de retarder l’apparition d’un phénotype pathologique, nous évaluerons également les molécules thérapeutiques sur des rongeurs plus jeunes (allant du stade nouveau-nés à 4 semaines).
Développement de nouvelles stratégies de thérapie génique d’édition du génome pour le traitement de la drépanocytose sur modèle murin
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour accepter des cellules humaines, elles reçoivent une chimiothérapie puis une greffe de cellules souches sanguines humaines corrigées, avec des prélèvements sanguins mensuels, avant d'être tuées pour analyser leur moelle osseuse et leur rate. Le porteur indique que la modification génétique affaiblit leur système immunitaire et que la greffe et les prélèvements sont sources de stress. Il affirme que la capacité de greffe et la reconstitution du système sanguin ne peuvent être reproduites en laboratoire, rendant selon lui l'usage d'un modèle murin "requis".
Objectifs
La drépanocytose, maladie génétique du sang la plus répandue, altère la structure des globules rouges, posant un problème de santé mondial avec près de 300 000 nouveaux cas diagnostiqués annuellement. Une mutation génétique affectant la production d'hémoglobine, composant essentiel des globules rouges, provoque leur déformation, entraînant coagulation, obstruction vasculaire et dommages multi-organiques, réduisant sévèrement l'espérance de vie. Les traitements actuels, tels que les transfusions sanguines ou les greffes de cellules souches hématopoïétiques, ne sont accessibles que pour une fraction des patients et présentent des résultats insatisfaisants, se concentrant sur la gestion des symptômes. Ce projet permettrait d'apporter aux patients un traitement curatif afin de supprimer leurs symptômes tout en réduisant le coût de la prise en charge de leur maladie. En effet, grâce à une greffe unique de cellules souches hématopoïétiques modifiées, prélevées directement chez la personne atteinte de la maladie pour éviter les risques de rejet associés aux greffes issues de donneurs, les globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet. Notre laboratoire travaille sur une nouvelle approche thérapeutique axée sur la récupération et la correction des cellules affectées chez les patients souffrant de drépanocytose. Cette méthode vise à corriger de manière permanente le défaut génétique dans les cellules souches sanguines afin d'obtenir une hémoglobine fonctionnelle. Ces dernières se trouvent dans la moelle osseuse et sont capables de générer toutes les cellules nécessaires aux fonctions sanguines. En utilisant une technique basée sur des outils et des ciseaux moléculaires, nous avons réussi à corriger l’erreur génétique responsable de la drépanocytose. Notre stratégie a été développée, en laboratoire, sur des cellules souches hématopoïétiques humaines. Ce projet a donc pour but d’évaluer les caractéristiques fonctionnelles des cellules modifiées après transplantation. Ainsi, une fois les cellules souches hématopoïétiques corrigées par notre traitement, il sera nécessaire de vérifier leur capacité à se greffer dans la moelle osseuse dans un organisme entier et à re-fabriquer ensuite différents types de cellules. Pour ces raisons, le recours à un modèle murin permettant la greffe de cellules souches humaines est désormais nécessaire pour valider ces protocoles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les effets bénéfiques du traitement chez la souris devraient permettre aux cellules humaines de retrouver une hémoglobine fonctionnelle, tout en s’assurant que notre traitement permet une greffe stable et efficace au cours du temps. Le projet s’effectuant directement sur des cellules humaines (et non murines), l’efficacité de notre traitement reflètera directement l’applicabilité aux patients. Seules la dose de chimiothérapie et le nombre total de cellules à transplanter seront à adapter. Ce projet permettrait d'apporter aux patients drépanocytaires un traitement curatif permettant de supprimer définitivement leurs symptômes tout en réduisant significativement le coût total de la prise en charge de leur maladie tout au long de leur vie. En effet, grâce à une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques modifiées (permettant d’éviter les rejets observés lors des greffes issues de donneurs), leurs globules rouges seront, in fine, capables de remplir leur fonction de véhiculer l’oxygène vers tous les organes, le tout sans risque de rejet.
Procédures
Les souris recevront une injection de traitement chimiothérapeutique pour les préparer à recevoir des cellules souches sanguines humaines. Après la transplantation de ces cellules, un prélèvement sanguin sera réalisé chaque mois pour surveiller la réussite de la greffe. Enfin, une injection d'un médicament favorisant la production de globules rouges sera administrée.
Impact sur les animaux
Les animaux possèdent une modification génétique, afin de faciliter la transplantation de cellules souches humaines, ce qui affaiblit leur système immunitaire. Pour prévenir les infections, les souris seront logées dans des cages dotées d'une ventilation, contribuant ainsi à réduire la présence de pathogènes dans leur environnement. Pendant ces procédures, deux actes peuvent causer du stress: l'injection de cellules modifiées et le prélèvement de sang.
Devenir
Les animaux seront mis à mort. En effet, il sera nécessaire de récolter notamment les informations suivantes dans les organes suivants : - Le sang des souris sera récupéré, afin d’analyser la quantité et la qualité de ces globules rouges humains. - La moelle osseuse et la rate seront récupérées. Ces organes, cruciaux pour le fonctionnement du système sanguin, seront analysés afin d'évaluer la prise de greffe et leur capacité à produire toutes les cellules présentes dans le système sanguin.
Remplacement
Le projet consiste à évaluer notre stratégie thérapeutique sur un organisme entier car il n’est pas réalisable de reproduire en laboratoire, la complexité d’un organe comme la moelle osseuse, ainsi que la complexité du système sanguin, notamment en termes de prolifération et de différenciation en différents types de cellules sanguines.
Réduction
Dans le but de limiter l'utilisation d'animaux dans ce projet, nous avons évalué diverses stratégies visant à corriger ce défaut génétique sur des cellules souches sanguines humaines en laboratoire. Les quatre meilleures stratégies ont été retenues pour leur efficacité et seront testées sur modèle animal. Afin de minimiser le nombre de souris utilisées, nous avons estimé le nombre minimal d'animaux permettant de tester et de conclure sur l'efficacité de nos stratégies. Cette démarche s'appuie sur les taux de réussite de la prise de greffe issus d'une référence établie. Notre objectif est d'atteindre une prise de greffe similaire à ce modèle mentionné. Afin de viser ces résultats, les calculs statistiques conduisent à estimer que 8 souris par groupe sont nécessaires. Ainsi, notre plan prévoit l'utilisation de 8 souris par groupe, totalisant 400 souris sur 5 ans, tout en visant des résultats scientifiquement robustes.
Raffinement
Les souris, présentant un système immunitaire affaibli, seront placées dans un environnement exempt de pathogènes. Après le traitement chimiothérapeutique et la greffe des cellules, l'état général des souris (apparence, posture, comportement...) ainsi que leur poids seront surveillés tous les deux jours pendant 20 jours. Les procédures expérimentales potentiellement inconfortables (greffe des cellules corrigées et prélèvement sanguin pour suivre la prise de greffe) seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de minimiser le stress et l'inconfort des animaux. En cas d’inconfort trop important, les procédures seront interrompues.
Choix des espèces
Pour évaluer l’efficacité de nos stratégies, nous sommes obligés de réaliser des études sur l’animal, car la capacité de greffe ainsi que la reconstitution et la différenciation complète du système sanguin en différentes cellules sanguines ne peuvent pas être reproduites par des modèles cellulaires en laboratoire. De plus, seule l’utilisation d’animaux peut nous permettre d’observer les éventuels effets secondaires sur le long terme de notre traitement au niveau de l’ensemble des organes. Pour ce faire, l’utilisation d’un modèle murin permettant la greffe de cellules humaines est requis. Les animaux seront greffés à l’âge adulte, de plus de 8 semaines. L'âge des animaux receveurs pour obtenir et conclure sur une efficacité optimale de la greffe des cellules souches sanguines dans la moelle osseuse se situe à 16 semaines.
Etude des effets d’un traitement par immunothérapie sur la croissance tumorale et le microbiote dans un modèle murin de cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques développent spontanément un cancer du foie et reçoivent des injections d'immunothérapie ainsi que plusieurs anesthésies pour un suivi par scanner, avant d'être tuées pour prélever leur tumeur et analyser leur microbiote. Le porteur décrit des injections sur animal vigile sources de stress et de douleur au point de piqûre. Il justifie le recours à ces souris par le besoin d'un organisme vivant pour relier la composition du microbiote à la réponse au traitement.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95% des cancers du foie. Il est le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde (nombre de nouveaux cas par an) et le deuxième plus mortel. De plus, le nombre de cas est en augmentation constante. Le CHC apparaît à la suite d’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) ou C (VHC), ou de maladies hépatiques chroniques non virales, dues à la consommation d’alcool, à l’obésité ou au diabète. Il est trois fois plus fréquent chez l’homme que chez la femme. Pendant 15 ans, un seul médicament était préconisé pour les patients dont le CHC était non opérable. Il ralentissait l’évolution de la maladie, mais permettait rarement la guérison complète. Récemment, l’utilisation de l’immunothérapie a permis d’augmenter considérablement la survie des patients, mais pour un tiers d’entre eux seulement. De nombreux articles montrent que la composition du microbiote a une influence sur la réponse des patients à l’immunothérapie. D’autre part, notre laboratoire a mis en évidence des différences dans la composition du microbiote entre mâles et femelles, chez des souris transgéniques développant un CHC. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de l’immunothérapie sur le développement du CHC chez les souris mâles et femelles. Nous suivrons la croissance tumorale au cours du traitement, par imagerie scanner et nous analyserons les modifications de la composition du microbiote au cours du traitement.
Bénéfices attendus
L’immunothérapie est utilisée comme traitement dans un grand nombre de cancers, dont le CHC, mais elle n’est efficace que chez une proportion restreinte de patients. D’autre part, il a été montré que la composition du microbiote influence la réponse des patients à cette thérapie. Traiter nos souris qui développent un CHC par immunothérapie devrait nous permettre de mieux comprendre son mécanisme d’action et le rôle joué par le microbiote dans son efficacité. En outre, nous pourrons déterminer si le sexe influence la réponse au traitement. Appliqués à l’homme, nos résultats pourraient permettre d’envisager de modifier le microbiote chez des patients non-répondeurs à l’immunothérapie, pour rendre leur tumeur sensible au traitement.
Procédures
Pour pouvoir étudier le microbiote fécal, chaque souris sera mise deux fois dans sa vie dans une cage vide jusqu’à obtention d’une crotte (10 minutes au maximum). Concernant le traitement, elles recevront une injection intraveineuse dans la veine de la queue (durée maximum cinq minutes, comprenant le temps de contention et de préparation de la veine) et six injections intrapéritonéales (durée maximum une minute par injection), à raison de trois injections par semaine. Chaque injection sera précédée d’une anesthésie gazeuse d’une durée de 7 à 10 minutes pour réaliser l’imagerie de la tumeur par scanner.
Impact sur les animaux
A l’âge de 3 semaines, les animaux seront identifiés par la pose d’une bague à l’oreille. Seuls les reproducteurs auront l’extrémité de la queue coupée pour vérifier le génotype. Lorsqu’ils entreront dans le protocole (procédure 2), les animaux recevront une injection de produit de contraste dans la veine caudale (environ trois minutes, comprenant la contention et la préparation de la queue), puis 3 injections intrapéritonéales par semaine, pendant deux semaines, de l’anticorps d'intérêt ou de l’anticorps contrôle (une minute par injection). Toutes les injections se feront sur souris vigiles, ce qui engendrera du stress et une douleur au point d’injection. Néanmoins, les injections étant rapides, elles ne devraient pas entraîner plus de stress que l'anesthésie gazeuse. Enfin, les souris subiront trois anesthésies gazeuses au total pendant la durée du traitement pour réaliser l'imagerie par scanner.
Devenir
A la fin du traitement, les souris seront mises à mort, pour prélever leur tumeur et étudier l’effet du traitement.
Remplacement
Un nombre croissant de publications montrent un lien entre la composition du microbiote intestinal et la réponse des patients atteints de cancer à l’immunothérapie. Pour mieux comprendre ce lien, nous avons besoin d’un organisme vivant. C’est pourquoi, nous utilisons des souris transgéniques qui développent un cancer du foie.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique qui a permis de déterminer qu'il fallait au minimum 9 mâles et 9 femelles pour chacun des deux groupes (un groupe recevant le traitement et un groupe contrôle), soit 36 animaux, pour que les résultats soient statistiquement significatifs. Comme nous utilisons le nombre minimum, nous conserverons deux mâles et deux femelles supplémentaires, au cas où une des souris entrées dans l’expérience décède. D’autre part, grâce au suivi par imagerie, nous pourrons homogénéiser les groupes en terme de taille de tumeur au début du traitement et être sûrs de ne traiter que des souris ayant développé un CHC, ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum de souris permettant d’obtenir des résultats solides.
Raffinement
Les cages contiennent du coton pour permettre la formation d’un nid. Les femelles gestantes sont isolées avant la mise bas et jusqu’au sevrage des petits. A partir de deux semaines avant l’apparition supposée de la tumeur, l’observation minutieuse de l’état général des animaux sera effectuée 2 à 3 fois par semaine, pour détecter tout signe de souffrance lié au développement de la tumeur, en particulier un gonflement abdominal.
Choix des espèces
Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose pour se rapprocher au mieux du développement du cancer chez le patient. Dans le cas du CHC, il est possible d’utiliser des rats traités avec un cancérogène chimique, mais le traitement chimique est plus douloureux. De plus, il risque d’avoir des effets sur le microbiote qui masquent ceux dus au développement de la tumeur. Comme nous souhaitons suivre l’effet du traitement lorsqu’une tumeur est présente, nous utiliserons des souris à partir de 20 semaines (âge auquel une tumeur est détectable par scanner). Nous utiliserons des animaux des deux sexes, pour étudier les différences éventuelles dans la composition du microbiote et la réponse au traitement entre mâles et femelles,.
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire, influence de l’âge et du sexe.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un gavage, des injections de tamoxifène, des frottis vaginaux répétés et un isolement de cinq à dix-neuf jours, avant une perfusion de fixateur dans le cœur sous anesthésie profonde pour prélever le cerveau, afin d'étudier l'inflammation cérébrale qui suit un repas gras selon l'âge et le sexe. Le porteur indique un stress et une douleur modérés liés aux injections et aux frottis, et une mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 % persistant trois jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier la faim et la satiété de façon intégrée et que la souris constitue un "modèle de référence".
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (ou postprandial inflammatory reaction, PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. De même, les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR ne sont pas tous élucidés. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, l’équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau. Ceci a été observé chez la souris. La PIR cérébrale se caractérise notamment par une activation des cellules microgliales chez l’individu mâle, sain, jeune adulte, en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas, et elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les mécanismes biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables d’activer directement les cellules microgliales de l’hypothalamus. Dans ce projet, nous allons étudier l’influence de l’âge et du sexe sur la PIR cérébrale. La stratégie consiste à comparer premièrement l’installation de la PIR cérébrale chez les mâles et les femelles en fonction de l’âge : stade jeune adulte, adulte mature et individu âgé. Deuxièmement, il s’agit de comparer l’installation de la PIR cérébrale chez des individus femelles catégorisées ou non selon leur cycle œstral. Les résultats seront comparés aux données obtenues dans des études précédentes sur des mâles. Par ailleurs, nous chercherons des corrélations entre développement de la PIR cérébrale et comportement alimentaire, ainsi qu‘un lien entre hypertriglycéridémie postprandiale et induction de la PIR cérébrale. La PIR cérébrale sera étudiée par histologie post mortem. Ainsi, les cerveaux des animaux seront étudiés après mise à mort de manière à analyser la réactivité microgliale dans les différentes conditions expérimentales (en fonction de l’âge et en fonction du sexe). Ce projet prévoit une étude sur 432 souris.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les déterminants biologiques de la PIR cérébrale chez la souris, et donnera des informations nouvelles sur l’impact des lipides nutritionnels sur le cerveau. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont : -Un unique gavage 3 heures avant la mise à mort (durée
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont le stress et la douleur, à un niveau modéré, pour les injections intrapéritonéales de tamoxifène (procédure 6), le frottis vaginal (procédures 4, 5 et 6), le gavage (procédure 1) et la contention et l’injection intrapéritonéale d’anesthésique pour tous les animaux. L’isolement de tous les animaux (de 5 à 19 jours selon les procédures) est source de stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de toutes les procédures afin de prélever : - le cerveau en vue d’analyses histologiques et/ou biochimiques - et/ou le sang en vue d’analyses biochimiques plasmatiques
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire
Réduction
La mise en place de conditions prandiales définies a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Le nombre d’individu par lot (n=6, 8, ou 12 pour les analyses histologiques, biochimiques, et comportementales, respectivement) a été défini précédemment. Ces effectifs sont appropriés pour réaliser des études statistiques suffisamment robustes. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux sur des effectifs réduits.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé, adapté pour étudier le comportement des animaux pendant leur phase d’éveil. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Des points limites ont été mis en place pour chaque procédure. Un point limite sera la perte de masse corporelle pendant l’expérience. Dans le cas d’une perte supérieure à 10% ou en présence d’un signe clinique qui nous alerte, le suivi de la masse corporelle sera alors réalisé quotidiennement. Dans le cas d’une perte de masse corporelle supérieure à 20%, persistante sur 3 jours, sans signe de reprise de poids, l’animal sera écarté de l’étude pour une mise à mort par inhalation progressive de CO2. De plus, les animaux présentant 3 signes de souffrance manifeste (prostration permanente, yeux mi-clos ou oreilles rabattues, perte de poids) seront mis à mort par inhalation progressive de CO2. En ce qui concerne la mise à mort des animaux, l’euthanasie sera réalisée sous anesthésie dissociative (par injection intrapéritonéale d’un mélange de Kétamine et Xylazine à 100 et 10 mg/kg respectivement).
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Pour l’influence de l’âge et du sexe, les expériences seront réalisées sur des souris (mâles et femelles) jeunes adultes (2 mois), adultes matures (7 mois) et âgées (20 mois), afin de comparer les réponses cérébrales en fonction de l’âge et selon le sexe. Ces stades ont été bien établis par la communauté scientifique. Pour les expériences réalisées sur les femelles, les expériences seront réalisées sur des souris jeunes adultes (