Rongeurs
Implication de l’hypothalamus dans l’altération de l’homéostasie glucidique induite par l’action centrale des triglycérides inter-estérifiés.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 720 d'entre elles. Elles reçoivent des injections d'huile de palme inter-estérifiée dans la carotide, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, et pour certaines des chirurgies dans le cerveau suivies de perfusions et d'un isolement de un à deux mois. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent entraîner perte de poids, prostration ou agressivité, et vise à préciser les conditions de sécurité alimentaire de ces graisses utilisées par l'industrie agroalimentaire. Il décrit des études sur cultures cellulaires menées en parallèle mais juge l'usage de la souris "encore nécessaire" faute de pouvoir reproduire in vitro les échanges entre organes.
Objectifs
La consommation d’aliments ultra-transformés riches en huile végétale hydrogénée est néfaste pour la santé des individus puisqu’elle contribue à l’obésité et au diabète de type 2 (DT2). Afin de remplacer les huiles végétales hydrogénées, l’industrie agroalimentaire commence à utiliser l’inter-estérification des graisses végétales. Des études récentes suggèrent que la consommation de ces graisses inter-estérifiés peuvent altérer l’homéostasie glucidique et donc favoriser le DT2. Il est donc important de comprendre les effets moléculaires de ces graisses inter-estérifiées sur la régulation de l'homéostasie glucidique. Des résultats préliminaires suggèrent que la consommation d’un régime contenant des graisses inter-estérifiées conduit à l’accumulation dans le foie, le tissu adipeux et l’hypothalamus de dérivés lipidiques comme les céramides. les céramides sont connus pour induire une résistance à l’insuline qui favorise l'installation d'un DT2. L'objectif de ce projet sera de déterminer l’implication du métabolisme des céramides dans la dérégulation de l’homéostasie glucidique induite par la consommation de graisses inter-estérifiées. Pour cela, la synthèse des céramides sera inhibée chez des souris (pharmacologiquement ou génétiquement) qui seront soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Les taux de céramides seront analysés par une approche lipidomique. La régulation de l'homéostasie glucidique sera étudiée chez ces souris soumises à un régime contenant de l’huile de palme inter-estérifiées. Une analyse transcriptomique des tissus sera réalisée afin d’identifier les gènes dérégulés par les graisses inter-estérifiées. Cette analyses permettra également de caractériser les cibles moléculaires des céramides dans la dérégulation de l'homéostasie glucidique induite par les graisses inter-estérifiées. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre l'implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du DT2 et ainsi d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Bénéfices attendus
Ce projet identifiera l’implication des graisses inter-estérifiées dans le développement du diabète de type 2 et permettra d’affiner les conditions de sécurité alimentaire nécessaire à leur utilisation par l’industrie agro-alimentaire.
Procédures
Les souris de la procédure 1 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. Les souris de la procédure 2 recevront des injections aigues intra-carotidienne d’huile de palme inter-estérifié pendant 30sec. La moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. L’autre moitié des souris de la procédure 2 subiront un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Les souris de la procédure 3 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les souris de la procédure 3, il s'en suivra, 28 jours plus tard d'une deuxième chirurgie pour poser un système de pompe et de canule pour réaliser des perfusions intracérébroventriculaires pendant 28 jours d'émulsions contenant les lipides inter-estérifiés d’intérêt. Les souris de la procédure 4 subiront des chirurgies d'injections stéréotaxiques intracérébroventriculaires (30min/souris) afin d'injecter des adénovirus dans le troisième ventricule. Pour les procédures 3 et 4, à la fin des expérimentations nous réalisons un test de tolérance à l’insuline (ITT) (120min/souris). Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. 3 jours plus tard nous réalisons un test de tolérance au glucose (IP-GTT) (120min/souris) à la fin de l’expérimentation, avant le sacrifice. Aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 min : prélèvements à la queue d'une goutte de sang afin de mesurer la glycémie et aux temps 0, 15, 30 et 120 min : prélèvements à la queue de sang afin de mesurer l'insulinémie. S'ajoutent aux nuisances expérimentales, l'isolement des souris des procédures 3 (28 jours pour 360 souris) et 4 (2 mois pour 360 souris).
Impact sur les animaux
Les procédures font intervenir des injections stéréotaxiques dans le troisième ventricule et des perfusions dans le ventricule latéral, chirurgies qui peuvent entrainer des effets indésirables sur les animaux tels qu'une perte de poids, des troubles alimentaires, un manque de toilettage, de la prostration, une agressivité lors de la manipulation, des douleurs ou gêne au niveau du crane.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les souris seront mises à mort afin d'évaluer l'incorporation des triglycérides inter-estérifiés depuis la périphérie vers le cerveau. A l'issue des procédures 2, 3 et 4, les souris seront mises à mort afin de collecter les tissus pour réaliser des RTqPCR, des immunohistochomies et des analyses lipidomiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. De plus, nous allons effectuer en parallèle de nos études in vivo des études in vitro sur des cultures cellulaires pour disséquer les effets de l'huile de palme interérifiée et identifier les mécanismes moléculaires les relayant.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons commencé des études in vitro sur des cultures cellulaires pour tester les concentrations d'huile de palme que nous pourrons utiliser in vivo. Nous avons aussi réalisé une étude in vivo pour tester les concentrations d'huile de palme inter-estérifiée à utiliser pendant les expériences. Ainsi nous utiliserons le nombre minimum de souris nécessaire à générer des données interprétables. Les échantillons prélevés sur chaque animal permettront de générer un grand nombre d'informations sur des marqueurs moléculaires (métabolites, transcripts, protéines inflammatoires). De plus, grâce aux données de la littérature et aux nombreux résultats obtenus lors de projets précédents (nous travaillons depuis plus de 20 ans sur des modèles murins d'obésité), nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace. En effet les groupes de souris sont générallement très homogènes en terme de tolérance au glucose, données physiologiques ou biochimiques.
Raffinement
Les souris des procédures 3 (360 souris, pendant 28j) et 4 (360 souris, pendant 2 mois) seront exceptionnellement maintenus en cage individuelle afin de contrôler individuellement la prise alimentaire et le poids corporel de chaque individu. Ils seront maintenus dans des milieux enrichis (nid, batons de bois, cotons) ce qui améliorera leur bien-être. Pour les procédures chirurgicales que nous utiliserons, nous avons instauré une médication et un suivi post-opératoire approprié permettant de réduire les possibles douleurs à leur minimum. Nous avons également mis en place une grille d'évaluation permettant au chercheur de suivre les signes de souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de souris obèses et insulino-résistantes partagent avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Le laboratoire travaille depuis de nombreuses années sur la souris en régime gras et a accumulé un grand nombre d'informations physiologiques et moléculaires qui seront utilisées pour interpréter les résultats obtenus. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines au début des procédures, âge à partir duquel toutes les structures cérébrales sont matures.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du foie grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de plasmides dans la veine de la queue pour déclencher des tumeurs du foie, certaines recevant aussi des molécules anticancéreuses, avec un suivi par imagerie tous les quinze jours. Le porteur affirme que la nuisance de la manipulation reste temporaire et qu'aucun signe de souffrance n'apparaît au stade précoce, tout en reconnaissant que la formation des tumeurs peut provoquer des souffrances. Il décrit des tests in vitro sur cellules et organoïdes de foie mais conclut que la validation chez la souris est "indispensable" pour confirmer l'implication des gènes candidats.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une pathologie complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance au traitement. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de cancérisation est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du CHC. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en CHC, ainsi que leur mode de coopération. Pour cela, nous envisageons d'injecter par voie intraveineuse des plasmides, qui s'intégreront dans les hépatocytes (cellules du foie). Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs dans un foie sain.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1x tous les 15 jours. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. La nuisance globale de l'ensemble de la manipulation n'est que temporaire (
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (p
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères : poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’hébergement). La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie de manière longitudinale par imagerie non invasive ("photon counting micro computed tomography" et/ou bioluminescence/fluorescence). En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches uitilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade adulte (2-8 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus adultes, comme la majorité des CHC.
Rôle des tissus adipeux bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des prélèvements de sang répétés, des chirurgies d'ablation ou de greffe de tissu adipeux, des expositions au froid à 4°C ou à 30°C et des tests de comportement, pour étudier le rôle des tissus adipeux bruns dans le vieillissement. Le porteur signale comme nuisances la douleur post-chirurgicale, le stress des températures d'hébergement et de l'isolement, et fixe une mise à mort à 20 % de perte de poids. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. L'objectif actuel est de promouvoir le vieillissement en bonne santé en déterminant des paramètres biologiques permettant de mesurer et de prédire son évolution. Le métabolisme énergétique est un régulateur clé de la longévité et de l’allongement de la vie en bonne santé. Les tissus adipeux (TA) jouent un rôle très important dans le maintien de l’homéostasie énergétique de l’organisme et leur dysfonctionnement pourrait contribuer à l’altération des fonctions de l’organisme au cours de l’âge. Alors que les TA blancs sont spécialisés dans le stockage et la libération de l’énergie, les TA bruns et beiges (ces derniers résultant de la transformation de certains dépôts de TA blancs en TA de type brun lors de différents stress comme l’exposition au froid) dissipent l’énergie sous forme de chaleur. Alors que leur activité est associée à la santé cardio-métabolique chez l’homme, les mécanismes par lesquels les TA bruns et beiges protègent l’organisme des désordres métaboliques associés au vieillissement restent encore mal compris. Le métabolisme redox correspond à l’ensemble des réactions de transfert d’électrons et constitue ainsi le socle du métabolisme énergétique. Plusieurs travaux ont montré que les adipocytes bruns et beiges sont activés suite à une l'altération de l'état redox cellulaire. Nous posons l’hypothèse selon laquelle les TA bruns et beiges permettraient de gérer des stress redox à l’échelle systémique et ainsi de protéger l’organisme contre les désordres métaboliques associés au vieillissement. Nous utiliserons le modèle murin chez lequel les TA bruns et beiges ont été très étudiés. Nous mesurerons la réponse des souris présentant des TA bruns et beiges activés ou inactivés à des stress redox systémiques en mesurant l’état redox plasmatique en cinétique au cours du stress. Les stress redox seront induits par des injections de métabolites ayant un impact fort sur l’équilibre redox (lactate, pyruvate et glucose). Par ailleurs, le rôle des TA bruns et beiges sur la trajectoire de vieillissement des animaux sera étudié. Le syndrome de fragilité et la perte de fonctions cognitives, indicateurs cliniques d’un vieillissement en mauvaise santé, seront étudiés à l’aide de tests comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’étudier le rôle des TA bruns/beiges dans le maintien de l’homéostasie redox systémique au cours de l’âge. Ces données permettront de mieux comprendre les processus médiés par les TA bruns/beiges qui contribuent à la perte de l’homéostasie énergétique de l’organisme au cours de l’âge et de mettre en évidence des biomarqueurs et/ou des cibles thérapeutiques d’intérêt pour restaurer l’homéostasie énergétique.
Procédures
Dans certaines procédures, des prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles, au maximum 10 prélèvements pendant une heure, juste avant la mise à mort. Dans certaines procédures, une injection sera réalisée sur souris vigiles : soit une seule injection (≤15 secondes par souris), soit une injection par jour pendant 5 jours consécutifs suivi d’une dernière injection 7 jours après. Dans certaines procédures, des procédures chirurgicales (ablation ou greffe de tissu adipeux) seront réalisées sous anesthésie générale, avec deux injections (≤15 secondes par souris) le jour de la chirurgie (analgésique avant et anti-inflammatoire après la chirurgie), puis une injection (≤15 secondes par souris) par jour pendant les deux jours suivant la chirurgie d’un anti-inflammatoire. Dans certaines procédures, les souris seront soumises à des tests comportementaux. Les tests pourront durer de quelques minutes à 45 minutes, la durée dépendra des capacités de l’animal ou sera de 5 à 8 minutes selon les tests.
Impact sur les animaux
Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - des problèmes liés à l’anesthésie, - une perte de poids et une douleur à court terme suite à la chirurgie (ablation de tissu adipeux et transplantation), - le stress lié à l’isolement et à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux températures d’hébergement de 30°C ou de 4°C - le stress lié à la contention nécessaire pour les injections dans la cavité intra-péritonéale. Les souris invalidées génétiquement ne présentent pas de phénotype dommageable dans les conditions standard ainsi que dans les conditions d’hébergement utilisées dans cette étude.
Devenir
Au terme de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Notre projet consiste à étudier la régulation du métabolisme redox systémique par les tissus adipeux bruns et beiges. Bien que des modèles d’organoïdes de différents tissus soient actuellement développés, étudier les interactions métaboliques in vitro entre différents organoïdes présente encore beaucoup de limites. La réalisation de notre projet nécessite un modèle intégré permettant une étude à l’échelle de l’organisme entier, impliquant des échanges entre différents tissus ayant des spécificités bien distinctes. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.
Réduction
Au regard de la bibliographie, compte tenu de la variabilité interindividuelle observée dans le contexte de vieillissement et de la variabilité de certaines mesures que nous effectuerons, des groupes de 10 souris par condition seront formés afin de mettre en évidence des différences statistiques. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit au minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisant pour réaliser les tests statistiques et avoir des données fiables. Mettre moins d’animaux dans chaque groupe serait prendre le risque de devoir refaire ces expériences pour pouvoir obtenir des différences significatives entre les différents groupes. Pour comparer deux groupes, des tests paramétriques ou non paramétriques en séries non-appariées seront réalisés ; pour des comparaisons multiples, des tests appropriés avec post-tests seront utilisés. Les tissus et organes prélevés seront utilisés non seulement pour les analyses métaboliques (par spectrométrie de masse et résonnance magnétique nucléaire) mais aussi pour des analyses transcriptomiques, protéomiques et biochimiques (mesures d’activités enzymatiques par exemple). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation et pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Par ailleurs, chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et de partager les prélèvements le cas échéant.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …), ainsi que surveillées et pesées une fois par semaine par une personne impliquée dans le projet. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle pour minimiser toute douleur. Les chirurgies seront réalisées par le personnel compétent et un suivi post-opératoire sera réalisé une à deux fois par jour. Les points limites sont : perte de poids (20% par rapport au poids initial), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique jugé par le zootechnicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance. Une grille de score comprenant les différents points limites a été établie et dès lors que le score atteindra une valeur de 9 sur 12, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et du vieillissement et dans lequel la biologie des tissus adipeux bruns et beiges a été particulièrement bien étudiée. De plus, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients et des défauts d’utilisation de certains métabolites dans les tissus adipeux. Enfin, la cinétique du vieillissement est bien décrite chez la souris, et cette espèce permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (2 à 3 ans) que celle du rat (2 à 3.5 ans) ou encore du cobaye (4 à 8 ans). Pour cette étude, nous utiliserons des souris contrôles et présentant des tissus adipeux bruns et beiges déficients à différents âges (2, 5, 12 et 24 mois) afin de caractériser le rôle des tissus adipeux bruns et beiges dans le métabolisme et dans la mise en place de la fragilité et du déclin cognitif au cours de l’âge. Ces âges ont été sélectionnés grâce à des données qui montrent des changements progressifs et spécifiques à chacun de ces temps dans différents organes. La réponse des souris présentant des défauts d’utilisation de certains métabolites sera évaluée chez des souris jeunes âgées de 2 mois. L’exposition à 30°C sera réalisée chez des souris de 2 mois, soit pendant 2 mois (temps efficace pour inactiver les tissus adipeux bruns et beiges), soit pendant 16 mois (pour étudier les conséquences à long terme sur la fragilité et le déclin cognitif des animaux). L’exposition à 4°C sera réalisée chez des souris âgées de 4 ou 18 mois, afin de déterminer si l’âge impacte la capacité de réponse des animaux au froid. L’ablation du tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 2 mois tandis que la greffe de tissu adipeux brun sera réalisée chez des souris âgées de 18 mois (du tissu adipeux brun de souris âgées de 2 mois sera greffé).
Effets de bactéries anti-inflammatoires dans un modèle murin d’inflammation de la muqueuse intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Pendant onze jours, elles reçoivent des gavages quotidiens et une injection d'un agent anticancéreux qui enflamme la muqueuse intestinale, avec pesées et prélèvements répétés, pour tester des bactéries probiotiques contre cette mucosite. Le porteur décrit une perte de poids, des diarrhées, un pelage hérissé et une apathie comme dommages attendus, et tue les souris en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que l'animal reste "le seul moyen" de reconstituer les interactions entre le microbiote et le système immunitaire.
Objectifs
La mucosite est une inflammation et/ou une ulcération de la muqueuse du tractus digestif, en particulier buccale et intestinale. Elle est un problème majeur rapporté chez 50 à 80 % des patients subissant une chimiothérapie, affectant significativement leur qualité de vie. Cette inflammation peut être provoquée par l´agent anti-cancéreux utilisé. Plusieurs études ont montré qu’elle était associée à une modification du microbiote sain et induisant une aggravation des effets de la chimiothérapie (diarrhée, saignement dans les selles, douleurs abdominales, perte de poids). Dans ce contexte, il est nécessaire de trouver des traitements qui restaurent un microbiote intestinal sain. De nombreuses bactéries probiotiques ont été décrites comme des outils prometteurs pour le traitement et la prévention des inflammations intestinales. Ceci a été démontré dans de nombreux modèles précliniques. Le but de ce travail est d'étudier les effets anti-inflammatoires d’une famille de bactéries probiotiques, sur la mucosite murine expérimentale induite par un agent anticancéreux particulier. L’emploi de ces bactéries comme agent préventif et thérapeutique contre la mucosite constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de l’inflammation intestinale chez les patients sous traitement par l´agent anti-cancéreux. Dans ce modèle, l’agent anticancéreux induit une inflammation des tissus semblable à celle retrouvée chez des patients présentant des effets secondaires. La réponse immunitaire développée suite au traitement peut être étudiée en détail. Le projet sera réalisé en 2 étapes : • Validation du modèle de mucosite dans nos conditions expérimentales • Evaluation des effets préventifs et thérapeuthiques des bactéries ou de composés qui en dérivent sur l’inflammation intestinale ; Analyser l'effet de ces administrations sur la composition du microbiote intestinal avant, pendant et après mucosite ; Evaluer l'action des bactéries ou composés dans l'amélioration des signes cliniques en cas de mucosite due à l´agent anti-cancéreux. Ces bactéries ainsi que leurs composés ont été testées précédemment lors d’essais in vitro et in vivo sur un modèle d’inflammation aigüe reproduisant les symptômes des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Suite à des résultats positifs concernant leur effet anti-inflammatoire sur une inflammation aigüe, nous souhaiterions évaluer leur efficacité sur une inflammation due à l’agent anti-cancéreux.
Bénéfices attendus
Actuellement, une grande majorité des patients cancéreux traités par cet agent anti-cancéreux développe des effets secondaires au niveau intestinal tels qu’une inflammation de la muqueuse appelée mucosite, due principalement à la réponse inflammatoire. Ceci induit des modifications tissulaires et favorise l’altération du microbiote et de l’équilibre intestinal. L’ensemble de ces modifications participe au développement de diarrhée et d’hémorragies intestinales. Ces effets, en plus des contraintes liées au traitement et à la maladie, contribuent très souvent à une baisse de moral des patients combinée à une importante perte de poids. De plus, à l'exception des traitements palliatifs (anesthésiques ou antibiotiques dans les cas graves), il n'existe aucune option thérapeutique connue pour prévenir la mucosite intestinale induite par la chimiothérapie. Il est donc important de développer d’autres approches complémentaires qui préservent les effets thérapeutiques de cette chimiothérapie mais qui protègent contre ses effets secondaires au niveau intestinal. Parmi ces nouveaux traitements se trouvent les probiotiques, qui sont des micro-organismes (bactéries ou levures) vivants ayant des effets bénéfiques sur l’organisme. Beaucoup de bactéries déjà utilisées comme probiotiques, sont des candidates potentielles car leurs effets anti-inflammatoires au niveau intestinal ont déjà été prouvés sur d’autres pathologies, sans effet secondaire. Des bénéfices en termes de connaissances sur l’interaction hôte - microorganisme, plus particulièrement microbiote intestinal - santé intestinale pourront être obtenus au cours de ce projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Nous aimerions savoir si les bactéries testées sont capables d'améliorer les signes cliniques de la mucosite et quels changements induisent-elles au niveau de la réponse immunitaire et histologiques pour y parvenir. Pour les nouveaux microorganismes n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera plus longue mais constitue un objectif d’amélioration du bien-être (réduction des effets secondaires au niveau intestinal du traitement et amélioration de la qualité de vie des patients sous traitement).
Procédures
- Pesée quotidienne pendant 11 jours, une pesée dure environ 5-10 secondes, animal vigile, 448 animaux. - Gavage intra gastrique quotidien de 10 secondes maximum pendant 11 jours, animal vigile, 448 animaux. - Isolement des souris pendant 10 minutes maximum dans des pots transparents pour prélever des crottes fraiches. 3 fois pendant les 11 jours , animal vigile, 448 animaux. - Injection intrapéritonéale unique de 10 secondes d’un agent anti-cancéreux (ou de son solvant pour contrôle), animal vigile, 448 animaux. - Isolement quotidien des souris pendant 10 minutes maximum pour réaliser le score clinique. 4 fois pendant les 11 jours (2 de ces isolements seront communs à ceux réalisés pour la collecte de feces). Animal vigile, 448 animaux - injection unique pour l’anesthésie de 10 secondes pendant le 11 jours (avant le prélèvement de sang). Animal vigile, 448 animaux - Prélèvement de sang de 30 secondes après l´administration d’un traceur fluorescent (par gavage) une fois pendant le 11 jours. Animal anesthésié, 448 animaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole viennent du traitement par l´agent anti-cancéreux qui provoque une inflammation des muqueuses. Les dommages principaux liés au traitement peuvent se manifester par une perte de poids, une diarrhée légère (crotte molle) ou une déshydratation due à la diarrhée. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voutée, yeux clos ou mi-clos, apathie. Lors du prélèvement de crottes et lors de la réalisation du score clinique, les animaux seront isolés pendant 10 minutes maximum, cela peut induire un stress le temps de l’isolement. Les animaux conservent cependant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres animaux. Aussi, les gavages des bactéries et des composés bactériens ainsi que l’injection intrapéritonéale et le prélèvement de sang peuvent entrainer un stress et/ou une douleur le temps de la manipulation.
Devenir
A l’issue de chaque prodédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes pour de futures analyses.
Remplacement
Le présent projet vise à étudier l’effet du microbiote intestinal, plus particulièrement d´une espèce bactérienne en particulier, sur la réponse immunitaire des animaux, principalement son effet anti-inflammatoire lors d’une inflammation due à un agent anti-cancéreux précis (et déjà employé en médecine humaine). A l’heure actuelle, l’utilisation des animaux reste le seul moyen qui permet de reconstituer l’environnement et les interactions complexes que l’on retrouve entre le microbiote et le système immunitaire d’un être vivant.
Réduction
Nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données issues de la littérature et acquises les années précédentes sur des modèles similaires comparables ont permis de calculer les tailles de groupes. Le nombre obtenu correspond au maximum d’animaux qui peuvent être utilisés par groupe. Au total, nous utiliserons 448 animaux.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où nous injectons l’agent anti-cancéreux aux animaux, un score clinique individuel est établi chaque jour. Les critères observés seront l’aspect des fécès (diarrhée), l’aspect du pelage, la posture, la réponse face au stimulus, la locomotion et la déshydratation de chaque animal. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Des traitements seront mis en place si les animaux présentent des signes de douleur ou stress. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux seront hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton ou en polycarbonate. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. La surveillance, les injections, prélèvements et manipulations seront réalisés par des expérimentateurs formés et maitrisant ces gestes afin de réduire au maximum le temps de manipulation et donc le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie. Elle est le modèle d’étude dans le cadre de l’étude de pathologies inflammatoires intestinales, car leur développement intestinal est relativement similaire à celui de l'intestin humain et elles possèdent un grand nombre de réponses immunitaires, de microbiomes et de gènes identiques aux l´homme. Il est possible d’induire une mucosite chez la souris avec différents produits chimiques. Les réponses cliniques, tissulaires et immunitaires générées sont comparables à celles observées chez l’humain. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 7 semaines. Les souris adultes possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour étudier les effets anti-inflammatoires de nos produits bactériens sur une mucosite induite. De plus, cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos propres données.
Elevage d’animaux avec un phénotype dommageable.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 910 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour l'élevage de lignées au "phénotype dommageable", surtout des souris immunodéficientes ou issues de croisements transgéniques. Elles subissent une biopsie de l'oreille pour le génotypage et un hébergement stérile strict, une rupture de stérilité pouvant, selon le porteur, les contaminer jusqu'au décès du fait de leur immunodéficience. Les souris dont le génotype n'a pas d'intérêt sont tuées, les autres gardées pour la reproduction ou pour entrer dans d'autres procédures. Le porteur décrit ces lignées transgéniques comme des modèles "unanimement validés" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif du projet est d’élever des animaux au sein d’une plateforme animalière agrée, en particulier des souris, avec des phénotypes dommageables. Ces animaux sont, pour la majorité, des souris immunodéficientes qui sont utilisées dans nos projets de recherche. Ces souris sont dépourvues totalement ou partiellement de système immunitaire adaptatif. Ces animaux ayant un phénotype dommageable peuvent être aussi des souris issues du croisement de deux souches de Souris transgéniques. La surveillance du bien-être des lignées au cours de l’élevage exigera des contrôles quotidiens et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Ces animaux issus du croisement de deux souches de souris transgéniques seront utilisés dans des modèles communs : les modèles d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, d’arthrite, de maladies chroniques de l’intestin, d’inflammation cutanée et pulmonaire. Enfin, les modèles expérimentaux de cancérogénèse sont des modèles de greffe de tumeurs murines ou humaines comme les leucémies, différentes lignées de cancer du côlon ou du pancréas. Ces différents modèles permettent d’adresser un mécanisme d’action, ou des approches thérapeutiques avec des produits biologiques humains. Aujourd’hui, il n’y a pas de données scientifiques publiées sur ces croisements. Les données obtenues avec des nouvelles lignées permettront d’enrichir les données scientifiques dans les modèles étudiés. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable au cours de la génération de ces lignées transgéniques dans nos conditions d’hébergement. Ce n’est que lors de nos expérimentations suite à l’injection de tamoxifène qu’un caractère dommageable sera observable ou non. Si un phénotype dommageable apparait, nous définirons des points limites et une intention particulière sera porté au bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’elevage de ces animaux au sein de notre animalerie est bénéfiques pour les animaux et donc nos expérimentations. Les animaux, lorsqu’ils seront utilisés dans nos expériences, seront déjà habitués aux conditions environnementales de l’animalerie, ainsi qu’aux soigneurs et aux expérimentateurs Ce qui pourra limiter très fortement le stress de ceux-ci.
Procédures
L’animal présentant un phénotype dommageable suite au croisement des 2 souches de souris transgéniques pourra ressentir, du fait de son statut génétique, une douleur, une souffrance, une angoisse ou un risque d’infection . La surveillance du bien-être de chaque animal au cours de l'expérience exigera des contrôles quotidiens de routine et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Des conditions d’hébergement pour ces élevages seront strictes dans des portoirs ventilés avec de la litière autoclavée ainsi que des poches d’eau stérile. Tout ceci est mis en place afin de maintenir les animaux en bonne santé et de veiller au bien-être des animaux. Hormis le change des animaux, l’autre intervention sur ces animaux sera une biopsie d’oreille servant à vérifier le génotype des animaux et servant également à l’identification des animaux pour un bon suivi de l’élevage.
Impact sur les animaux
Concernant les animaux immunodéficients, les conditions d’hébergement strictes permettent de maintenir les animaux en bonne santé. Dans le cas où une rupture de la stérilité aurait lieu, les animaux pourraient être contaminés par des micro-organismes opportunistes qui seraient pathogènes pour ces animaux. Du fait de leur immunodéficience, ces animaux subiraient de graves effets indésirables qui se manifesteraient par une inactivité, une perte de poids pouvant aller jusqu’au décès. Pour les modèles CreLox inductible, les phénotypes dommageables des souris obtenus sont difficile à prévoir à l’avance Le bien-être animal sera évalué selon les principes suivants : Des données seront recueillies durant au moins 2 cycles de reproduction après la génération considérant la lignée stable (après 2 générations) avec un nombre d’animaux scientifiquement et statistiquement justifiés (jamais moins de 14 animaux issus d’au moins 2 portées/pontes différentes) en prenant en compte le sexe sur le phénotype : à défaut 7 mâles et 7 femelles. Les observations seront faites à un âge représentatif et un génotype pertinent. Les animaux contrôles seront de même fond génétique que les lignées générées.
Devenir
Les animaux dont le génotypage n’est pas d’intérêt, seront euthanasiés. A l’inverse, les animaux ayant un génotypage d’intérêt seront conservés, soit pour continuer les élevages, soit pour rentrer dans une procédure d’expérimentation.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes lors de greffes ou de thérapies anti-cancéreuses. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste. L’élevage des animaux est réalisé à la demande des expérimentateurs. En fonction de la procédure concernée, le nombre d’animaux par groupe est défini de façon à obtenir une différence statistique (Tests paramétriques et non-paramétriques) en fin d’expérience en ayant pris en compte les animaux nécessaires (couples parents et portées non utilisées) et la toxicité associée à chaque modèle. A cause des variabilités inter‐animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et donc la nécessité de répéter inutilement l’expérience. Si un phénotype dommageable est observé avec ces souches, le nombre d’animaux utilisé dans nos expériences sera adapté en conséquence (dimunition du nombre d’animaux par groupe).
Raffinement
L’élevage des animaux au sein de l’animalerie est réalisé dans des conditions strictes de stérilité et de suivi. Les Souris sont hébergées dans des cages en portoirs ventilés, ce qui assure une non contamination par des pathogènes pouvant être présents dans l’air ambiant des pièces d’hébergement. Les cages contenant la litière sont autoclavées préalablement au change. L’eau de boisson est distribuée via des poches d’eau stériles à usage unique. Le change des animaux est réalisé sous hotte de change, le transfert des animaux de la cage sale à la nouvelle est réalisé à l’aide d’une paire de pince trempée dans l’alcool permettant au maximum de limiter les risques de contamination entre les cages. Entre chaque cage le soigneur désinfecte ses gants. Les animaux sont suivis quotidiennement par les soigneurs afin de prendre en charge les animaux pouvant montrer des signes de mal être et ainsi protéger ces congénères. Ce suivi accru limite aussi le risque de propagation potentielle de pathogènes.
Choix des espèces
La Souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’Homme, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques cellulaires. Les modèles transgéniques utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. Tous les animaux produits seront utilisés dans différentes procédures autorisées dans notre établissement. Ces animaux seront utilisés soit à partir de 8 semaines pour renouveler les couples reproducteurs, soit pour être utilisés dans les différentes procédures et cela à partir de 5 semaines. Cinq semaines est l’âge à partir duquel les animaux peuvent subir une greffe de cellules hématopoïétiques humaines ou de tumeurs sans alterer leur croissance et leur bien-être.
Travaux pratiques de pharmacologie expérimentale
- Enseignement supérieur
Rats : 60
180 rongeurs, 120 souris et 60 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour des travaux pratiques de pharmacologie destinés à des étudiants. Chaque animal reçoit des injections par plusieurs voies, une incision de la queue pour doser la glycémie et passe des tests de comportement, les mêmes animaux servant à quatre séances espacées d'au moins une semaine. Le porteur indique que ces gestes et un jeûne de douze heures avant les séances peuvent provoquer stress et douleur. Il présente ces séances comme une découverte de l'expérimentation in vivo, les animaux étant réutilisés puis, pour ceux qui ne le sont pas, tués.
Objectifs
Ce projet a pour objectif pédagogique de faire découvrir aux étudiants l’expérimentation in vivo. Il vise à proposer des TP de pharmacologie expérimentale aux étudiants inscrits dans 3 parcours universitaires différents. Ces parcours universitaires peuvent destiner les étudiants vers les métiers de l’industrie pharmaceutique ou de la recherche dans lesquels des connaissances sur l’expérimentation animale sont nécessaires. L’ensemble des TP sont réalisés avec des souris swiss et/ou des rats wistar qui sont des modèles communément utilisés pour la recherche. Il s’agit également de souches calmes qui pourront être plus facilement manipulées par les étudiants. Afin de respecter le bien-être animal, les TP sont réalisés en accord avec les exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (3R) : le nombre d’animaux est réduit au minimum et les mêmes animaux sont réutilisés pour les 4 travaux pratiques. De plus, les TP seront encadrés par des enseignants qualifiés avec le niveau concepteur.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche éducative. En effet, l’objectif est de faire découvrir l’expérimentation in vivo à des étudiants destinés à des métiers où des connaissances sur l’expérimentation animale sont nécessaires. Pour ce faire, différents travaux pratiques vont être réalisés afin de présenter aux étudiants plusieurs protocoles qui peuvent être réalisés en expérimentation in vivo. L’ensemble des TP seront réalisés dans le respect de l’éthique en expérimentation animale et les enseignants veilleront au bien-être des animaux tout au long des travaux pratiques.
Procédures
Contention de l’animal. Sur chaque animal (souris et rats) et au maximum 2 fois par séance, une injection intra-péritonéale (3 min) une administration par voie orale (1 min) et une injection sous-cutanée (3 min) seront réalisées. Une incision à l’extrémité de la queue après application d'une crème anesthésiante sera effectuée afin de prélever une goutte de sang à 4 temps différents. Pour le comportement (uniquement chez la souris), chaque animal recevra une unique injection intra-péritonéal (3 min) puis réalisera 4 tests de comportement différent (20 min pour les 4 tests). Pour la mesure de la pression artérielle, les rats seront placés dans un tunnel de contention quelques minutes afin de placer le brassard gonflable. Les mêmes animaux seront réutilisés pour les TP en respectant un intervalle d'une semaine au minimum entre chaque TP pour le bien-être des animaux.
Impact sur les animaux
Lors des travaux pratiques, les animaux recevront des administrations par voie orale, intra-péritonéale et/ou sous-cutanée. Ces injections peuvent engendrer un stress chez les animaux. Lors d'un TP, les rats seront placés dans un tunnel de contention quelques minutes afin de réaliser la mesure de la pression artérielle. Cette contention peut engendrer un stress. Lors d'un autre TP, une incision est réalisée à l’extrémité de la queue de l’animal pour récupérer une goutte de sang et cela peut entrainer une douleur. De plus, les animaux seront privés de nourriture 12h avant la séance de TP. Cela peut engendrer un stress.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront proposés au sein de l’EU et potentiellement réutilisés. Les animaux non réutilisés seront euthanasiés
Remplacement
Ces TP visent à sensibiliser les étudiants aux bonnes pratiques de l’expérimentation animale en conformité avec la réglementation et dans le respect du bien-être animal et de la règle des 3R. Pour cela, il est important que l’étudiant soit en contact avec l’animal. Cet enseignement pratique vient en complément de cours magistraux dans lesquels sont abordés la règlementation, l’éthique, la règle des 3R, les méthodes alternatives, les différents types d’animaleries, la conception de projets). Il vient aussi en complément de TP réalisés in vitro. L’objectif de cette formation est de préparer les étudiants à leur insertion professionnelle dans les laboratoires pharmaceutiques dans le domaine de la R&D.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum pour l’ensemble des TP, mais sera suffisant pour que chaque étudiant puisse manipuler un animal. Deux parcours universitaires réalisent les TP à la même période de l’année donc les mêmes animaux seront utilisés (12 rats et 12 souris au total). Les étudiants du troisième parcours universitaire réalisent les TP à une autre période de l’année donc les animaux ne pourront pas être réutilisés mais afin de réduire le nombre d’animaux, les TP seront réalisés uniquement sur des souris (12 souris au total).
Raffinement
Lors des TP, les animaux recevront des administrations par voie orale, intra-péritonéale et/ou sous-cutanée. Au maximum, deux administrations seront réalisées pour chaque voie et les volumes administrés seront largement inférieurs aux volumes maximaux autorisés. Les administrations seront espacées dans le temps du TP afin de minimiser le stress lié à cette procédure. Lors d'un des TP, après l’application d’une crème anesthésiante, une incision sera réalisée à l’extrémité de la queue de l’animal afin de doser la glycémie. A l’issue de la manipulation, de la biseptine sera appliquée pour éviter toute infection. Les jours suivants, les animaux seront surveillés pour s’assurer de la bonne cicatrisation. Les séances de TP seront espacées au minimum d’une semaine afin de réduire au maximum le stress occasionné lors de la manipulation des animaux. Entre chaque séance, les animaux seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces animales les plus couramment utilisés pour l’enseignement et la recherche. Les souches choisies sont calmes et adaptées aux travaux pratiques avec les étudiants. Les animaux seront âgés de 7 à 8 semaines au démarrage du premier TP. Ensuite les procédures se dérouleront sur une période de minimum 2 semaines et maximum 4 semaines. Réaliser les expériences sur des animaux âgés de 7 à 11 semaines permet d’avoir des jeunes animaux en bonne santé et facilement manipulable tout au long des travaux pratiques.
Développement d’anticorps monoclonaux
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit quatre à sept injections d'un antigène et plusieurs prélèvements de sang, avant d'être tuée pour prélever sa rate et produire des anticorps servant à des kits de diagnostic. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer une sensibilité locale, voire un affaiblissement et un mal-être selon l'antigène. Il précise que la production se fait ensuite in vitro, le recours à l'animal se limitant à l'immunisation, et signale des technologies alternatives "en cours d'étude" mais jugées encore insuffisantes.
Objectifs
Le diagnostic de plusieurs maladies graves chez l'homme ou animal comme les hépatites, des maladies tropicales nécessite l'utilisation de kits de diagnostic fabriqués avec des anticorps monoclonaux qui sont produits in vitro dans des bioréacteurs. Cependant, pour le démarrage de ces productions, une phase animale qui utilise très peu d'animaux permet d'initier le développement de ces anticorps monoclonaux. En effet, la première étape consiste à immuniser un petit nombre de souris avec la molécule d'intérêt (Antigène). La souris sera la seule espèce utilisée pour ce projet. Cette espèce reste l'un des modèles référence pour le développement d'anticorps monoclonaux dans les Immunoessais, il est très documenté. A l'issue de la procédure, les organes lymphoides (rate) sont prélevés. C'est la seule étape qui nécessite un recours à l'animal. Toutes les étapes ultérieures sont réalisées in vitro, tri des cellules spléniques, obtention des hybridomes, production des anticorps (bioréacteur).
Bénéfices attendus
L'utilisation des anticorps monoclonaux dans des applications de diagnostic in vitro permet d'améliorer la prise en charge des patients dans différents domaines en santé humaine notamment dans les maladies infectieuses. La réponse des tests Immunoessais est rapide et va aider à l'orientation des choix de traitement.
Procédures
La phase d'immunisation est réalisée par des injections répétées de l'antigène par différentes voies sur animaux vigiles. 4 à 7 injections peuvent être réalisées sur un animal dans une procédure selon une séquence bien définie. Chaque injection dure moins de 2 minutes. Des prélèvements sanguins sont également réalisés pour suivre la réponse immunitaire de l'animal. Un maximum de 3 à 4 prélèvements sanguins sont réalisés sur un animal dans une procédure, la durée est de 2 minutes environ.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent générer une sensibilité au point d'injection du fait de la piqure. L'injection par voie intraveineuse plus délicate peut selon l'antigène injecté générer des nuisances plus importantes comme un affaiblissement, un mal être général. Les prélèvements sanguins sont générateur de stress et de douleur au site de prélèvement. Ils sont réalisés sous anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Dans un lot d'animaux, ceux qui ont développé une réponse satisfaisante sont mis à mort pour prélèvement des organes lymphoides (rate). Les autres animaux du lot s'il en reste sont également mis à mort sans prélèvement d'organes.
Remplacement
Le recours à l'animal se limite exclusivement à la phase d'immunisation afin de pouvoir disposer des cellules spléniques qui sécrètent les anticorps d'intérêt. Depuis de nombreuses années, la production des anticorps se fait complètement in vitro à l'aide de bioréacteurs. Des technologies alternatives sont en cours d'étude et de développement dans l'objectif de s'affranchir de l'animal. Aujourd'hui, les premières tentatives ne permettent pas encore d'obtenir des anticorps avec totalement les performances attendues pour des applications de diagnostic in vitro.
Réduction
Depuis 10 ans, le nombre d'animaux utilisés pour cette phase d'immunisation a été diminuée de 70%. L'optimisation de nos procédures liée à l'expérience du laboratoire a permis la réduction du nombre de lots d'animaux utilisés. A ce jour, seulement un lot de 3 à 5 animaux est utilisé dans une procédure afin de limiter le nombre d'animaux tout en s'affranchissant de la variabilité biologique individuelle. Un lot d'animaux va permettre d'obtenir environ 20 à 50 anticorps qui seront ensuite sélectionnés en fonction de leurs performances. La demande pour ce projet est de 250 souris. Ce nombre permet d'envisager le développement de plusieurs centaines d'anticorps monoclonaux différents.
Raffinement
A leur arrivée à l'animalerie, les souris s'acclimatent pendant une durée minimale de 7 jours avant tout geste technique. Les animaux sont hébergés en nombre (3 à 5 souris) dans des cages conformes aux recommandations de la directive en vigueur et placées dans des enceintes ventilées. Les cages sont agrémentées de divers enrichissements tels que tunnel pour se cacher, buchettes à ronger, coton pour la nidification. Les animaux sont visités quotidiennement et examinés chaque semaine lors du changement de la litière. Les gestes techniques (injections et prélèvements) sont réalisés par le personnel formé. Les volumes des injections respectent les recommandations faites pour l'espèce selon les voies utilisées, il en est de même pour les prélèvements sanguins qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse pour limiter la nuisance du geste. Des délais sont systématiquement respectés entre 2 injections et entre chaque prélèvement sanguin. Des points limites adaptés à l'espèce ont également été établis selon des critères de comportement, d'aspect physique et physiologique. Pour chaque critère, plusieurs niveaux et un point limite sont définis. Si nous observons un affaiblissement, un mal être de l'animal, la surveillance est augmentée durant 24 heures à intervalle régulier de 4 heures dans la journée, l'animal est hydraté et de la nourriture est placée à proximité. Si l'état de l'animal continue à se dégrader et qu'un point limite est atteint, l'animal est euthanasié.
Choix des espèces
La souris reste l'un des modèles référence pour le développement d'anticorps monoclonaux, il est très documenté notamment pour la mise en oeuvre de la technologie de développement d'un hybridome qui permet d'obtenir une lignée cellulaire stable produisant un anticorps unique spécifique d'une molécule donnée. De jeunes adultes entre 4 et 6 semaines permettent d'obtenir une meilleure réponse immunitaire, ce qui limite le nombre de rappels et donc d'interventions sur l'animal.
Étude de la machinerie de synthèse des protéines chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
128 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris reçoit un antalgique puis une anesthésie profonde, avant l'ouverture de la cage thoracique et une perfusion cardiaque qui fixe les tissus, pour étudier la composition des ribosomes dans différents organes. Le porteur indique n'attendre qu'un léger stress et une légère douleur liés aux injections. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité de travailler sur "organisme entier", les protéines identifiées devant ensuite être étudiées in vitro.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale. Il vise à élucider les mécanismes complexes qui régissent l’expression des gènes, un processus essentiel dans le fonctionnement cellulaire. Les ribosomes, les machines moléculaires qui synthétisent les protéines, jouent un rôle central dans ce processus. Historiquement, les ribosomes ont été décrits comme étant identiques dans toutes les cellules. Cependant, des études récentes ont mis en évidence une grande hétérogénéité dans la composition des ribosomes et ont émis l’hypothèse de l’existence d’une multitude de ribosomes différents, décrits comme ribosomes “spécialisés”, chacun avec une activité spécifique. Afin d’étudier ces ribosomes “spécialisés” dans différents organes (le foie, le cerveau ou la rate par exemple) et comprendre leur fonctionnement, nous avons mis en place une approche innovante permettant de déterminer la nature des différentes protéines qui les composent. Nos premiers résultats obtenus dans des cellules en culture, nous ont permis de mettre en évidence près de 600 protéines qui se lient directement aux ribosomes. Cela ouvre de nouveaux champs de recherche pour la compréhension des mécanismes fondamentaux du fonctionnement cellulaire qui sont contrôlés par les ribosomes. Actuellement, nous souhaitons étendre notre étude en caractérisant la composition de ribosomes spécialisés dans différents organes chez la souris. Pour cela, nous avons généré une souris qui nous permet de marquer tous les ribosomes de chaque cellule et de les purifier. Cette lignée de souris est viable et n’a pas de phénotype dommageable. Elle n’a pas non plus d’immunodéficience connu ou de phénotype immunologique. Pour effectuer nos analyses, nous devons fixer les tissus (aussi appelés organes) avec un produit chimique chimique afin de stabiliser les interactions entre les ribosomes et les protéines qui interagissent avec eux. . Nos résultats indiquent que si la fixation des organes récupérés a lieu après la mise à mort des souris alors la fixation n’est pas homogène et cela introduit des biais expérimentaux dans l’analyse de la composition des ribosomes. Pour réaliser des analyses fiables, les organes seront donc fixés sur les animaux sous anesthésie profonde sans réveil. Les tissus seront ainsi figés avant la mise à mort des animaux. Cette procédure garantit que les interactions entre les ribosomes et d'autres protéines restent inchangées, reflétant ainsi la situation réelle dans les cellules vivantes.
Bénéfices attendus
La réalisation de notre projet aura des apports importants pour la connaissance fondamentale sur les rôles spécifiques des ribosomes spécialisés présents dans chaque organe et permettra d’ouvrir une nouvelle voie de recherche afin de caractériser le rôle fonctionnel de l’interaction entre certains détecteurs de virus et les ribosomes, dans le cadre de la réponse immunitaire innée. En outre, les protéines identifiées comme associées aux ribosomes spécialisés dans les différents organes seront une ressource d’intérêt pour des chercheurs dans différents domaines de la biologie.
Procédures
Tous les animaux de notre protocole seront soumis aux interventions suivantes : changement d'animalerie 7 jours avant le début des expériences, injection sous-cutanée pour la livraison d’antalgiques : 1 fois par animal 30 minutes avant l'injection d'anesthésiques, durée de l’injection : 10 secondes puis 1 injection dans l'abdomen pour anesthésie profonde : 1 fois par animal, durée de l'injection : 10 secondes ; puis la cage thoracique sera ouverte par chirugie (temps de l'intervention 5 minutes) et une perfusion cardiaque sous anesthésie profonde (durée de la mise en place de la perfusion : 5 secondes, temps de perfusion : 12 minutes.
Impact sur les animaux
Cela entrainera donc un léger stress dû au changement d'animalerie, un léger stress dû à la contention puis une légère douleur due aux injections de l'antalgique et de l'anesthésique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort puis les organes d'intérêt seront prélevés afin d’analyser les ribosomes spécialisés et de les comparer entre les différents organes.
Remplacement
L’objectif de ce projet étant de connaitre les partenaires des ribosome in vivo et de comparer la liste de ces partenaires entre plusieurs organes il est nécessaire de travailler sur organisme entier. Les protéines identifiées dans notre étude pourront ensuite être validées et leur fonction cellulaire étudiée dans des modèles cellulaires in vitro.
Réduction
Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base de données préliminaires. Le nombre d'animaux dans chaque lot a été réduit au maximum et sera composé de 8 souris contrôles non transgéniques et de 8 souris transgéniques.
Raffinement
Les souris utilisées dans notre projet n’ont pas de phénotype dommageable. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée). Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, la perfusion des souris sera réalisée sous anesthésie profonde. Aussi, des antalgiques seront administrés aux souris avant l’anesthésie afin d’éviter d’éventuelles douleurs liées à la procédure de perfusion. Pendant toute la durée de l’anesthésie profonde, les animaux seront placés sur un tapis chauffant, afin de limiter les risques d'hypothermie, et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d'éviter les risques de sècheresse oculaire. En cas de problème non anticipé lors de la perfusion intracardiaque, la souris sera immédiatement mise à mort par dislocatoion cervicale.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier la composition des ribosomes notamment dans les cellules du système immunitaire présentes dans les organes du système immunitaire car il permet d’avoir accès à suffisamment de matériel biologique pour pouvoir réaliser des analyses biologiques. Par ailleurs, le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir réaliser, à terme des expériences d’infection par divers virus dans des animaux génétiquement modifiés afin de valider nos premiers résultats obtenus sur des lignées cellulaires. Nous utiliserons dans notre projet des animaux adultes afin d’étudier les fonctions des ribosomes dans des conditions physiologiques chez l’adulte.
Caractérisation en modèle murin de la pathogénèse de virus respiratoires humains et évaluation de vaccins
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des virus respiratoires humains administrés dans les narines sous anesthésie, avec pesées quotidiennes et prélèvements de sang répétés, jusqu'à un prélèvement terminal par ponction cardiaque, pour caractériser de nouveaux candidats vaccins. Le porteur indique une perte de poids, une accélération respiratoire et une perte d'activité après administration du virus. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" et renvoie aux "guidelines" de l'Agence européenne du médicament pour justifier le modèle murin.
Objectifs
Les virus respiratoires provoquent des infections respiratoires aigües entraînant des pathologies légères à sévères chez l’Homme et constituent la première cause de mortalité chez les jeunes enfants. Les possibilités de traitements ou de vaccinations contre ces virus restent limitées et/ou peu efficaces et le développement et l’approbation de nouveaux vaccins sont freinés par des efficacités de protection faibles et un manque de connaissances des réponses immunitaires induites. Pour les vaccins vivants atténués, la réponse immunitaire locale des muqueuses respiratoires (réponse mucosale) est encore peu décrite à ce jour mais elle contribuerait aussi à limiter la transmission des virus respiratoires. Aussi, de nouveaux candidats vaccins vivants atténués modifiés génétiquement sont en développement et permettraient d’avoir une couverture vaccinale plus large, protégeant contre plusieurs familles de virus respiratoires, à partir d’un seul vaccin. Sur la base de ces constats, ce projet vise à caractériser et valider l’efficacité de nouveaux candidats vaccins vivants atténués pour protéger contre deux familles de virus respiratoires humains, à l’aide d'un modèle expérimental de pneumonie virale chez la souris. Ce projet vise aussi à étudier de manière plus approfondie l’impact de ces candidats vaccins sur l’immunité, avec un focus particulier sur la réponse immunitaire des muqueuses respiratoires.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces études seront utiles pour approfondir la compréhension de l'infection par les virus respiratoires et des réponses immunitaires et inflammatoires induites par ces infections. Cette étude permettra aussi de participer au développement et à la caractérisation de nouveaux candidats vaccins innovants contre ces infections respiratoires, pour lesquelles il n’existe aujourd’hui que peu d’option efficace disponible sur le marché.
Procédures
(1) 80 animaux subiront des prélèvements de sang au niveau de la joue : prélèvement sur animal vigile, jusqu’à 3 prélèvements par animal, 3 semaines d’intervalle entre chaque prélèvement. Durée du geste (contention comprise) : 1 minute ; (2) Tous les animaux (soit 80) seront pesés tous les jours : pesée d’animaux vigiles, une fois par jour pendant 63 jours consécutifs. Durée du geste : 30 secondes ; (3) 80 animaux subiront une injection d’un mélange d’anesthésiques avant chaque administration de virus : injection sur animal vigile, jusqu’à 3 injections réalisées à 3 semaines d’intervalle par animal. Durée du geste (contention comprise) : 30 secondes ; (4) 80 animaux subiront une administration de virus ou vaccin : administration sur animal anesthésié (anesthésie liquide), administration au goutte à goutte sur les narines de l'animal tenu en position dorsale, jusqu’à 3 administrations sur le même animal avec 3 semaines d’intervalle entre chaque administration. Durée du geste : 1 minute ; (5) 20 animaux subiront une injection intramusculaire (cuisse) de vaccin : injection sur animal anesthésié (anesthésie liquide), jusqu’à 2 administrations sur le même animal avec 3 semaines d’intervalle entre chaque administration. Durée du geste : 1 minute ; (6) 24 animaux subiront une injection sous-cutanée d’analgésiques 30 minutes avant anesthésie générale gazeuse et prélèvement de sang terminal (par ponction cardiaque). Analgésie + anesthésie + prélèvement de sang réalisé 1 fois en fin de procédure sur chaque animal. Durée du geste : 40 minutes ; (7) 32 animaux subiront une injection de pentobarbital : injection sur animal vigile, 1 injection par animal. Durée du geste (contention comprise) : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoires : une perte de poids sur une durée de 1 à 10 jours après administration de virus (jusqu'à 3 administrations pendant une étude d’efficacité vaccinale) + une accélération du rythme respiratoire + une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration de virus. Les souris pourraient aussi subir des effets indésirables après la réalisation des gestes techniques de prélèvements sanguins ou d’injections éventuelles de vaccins, d’injection d’anesthésiques ou d’analgésiques. Ces effets indésirables seraient des douleurs locales et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales pour le prelevement de sang total et organes (évaluation de la réponse immunitaire et protection vaccinale).
Remplacement
Toutes les étapes du présent projet et la caractérisation des nouveaux candidats vaccins en modèle murin font suite à des études effectuées et validées auparavant en laboratoire. Malgré le progrès des dernières années dans le développement de modèles d’études alternatifs, l’interaction entre les virus et le système immunitaire d’un individu est beaucoup trop complexe pour être réduit à l’utilisation de lignées cellulaires et requiert l’utilisation du modèle animal. A cet égard, le recours indispensable à l'animal de laboratoire pour la caractérisation de la pathogénèse des souches virales, de la réponse immunitaire globale face à l’infection, ainsi que le niveau de protection induit par un vaccin, figure dans les "guidelines" édictées par l'Agence Européenne du Médicament.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés par groupe expérimental tiendra compte du nombre minimal d'animaux pour atteindre une relevance expérimentale, réaliser des tests statistiques et maintenir des groupes sociaux au sein de chaque cagée, en tenant compte des animaux consacrés aux prélevements terminaux. Dans la mesure du possible, les groupes contrôle d'animaux seront mutualisés pour réduire le nombre total d'animaux.
Raffinement
Après anesthésie générale, un suivi accru sera fait jusqu’à réveil et reprise d’activité de chaque animal. Après chaque administration de virus ou de vaccin, chaque animal fera l'objet d'une surveillance pendant 14 jours au rythme de 1 fois par jour, accrue à 2 fois par jour au besoin, pour réaliser un suivi de poids et de signes cliniques. Pour limiter les effets indésirables dûs aux prélevements de sang au niveau de la joue, le volume de sang prélevé sera limité pour faciliter la compensation de la perte de sang en quelques heures. Pour réduire la douleur provoquée par le prélevement de sang par ponction cardiaque, l’administration d’analgésiques sera réalisée 30 min avant anesthésie gazeuse. Les potentielles nuisances identifiées lors de la réalisation des procédures seront prises en compte pour le raffinement des prochains protocoles incluant d’éventuelles analgésies et anesthésies supplémentaires pour des prélevements douloureux.
Choix des espèces
Bien que les modèles expérimentaux animaux pour l’étude des infections respiratoires se soient diversifiés ces dernières décennies (furets, rat des cotonniers, hamsters, bovins, primates non humains), aucun de ces modèles ne réflètent complètement la pathologie et la réponse immunitaire chez l’humain. La souris reste cependant le modèle sur petits animaux le mieux caractérisé pour l’étude des infections respiratoires virales. A ce stade de notre projet, il n’y a pas de justification à l’utilisation d’un autre modèle animal sans une validation au préalable chez la souris. Nos précédentes expérimentations ainsi que celles d’autres équipes ont montrés que des souris sevrées âgées de 4 à 8 semaines au début du protocole sont bien adaptées aux besoins de ce projet, puisque ce modèle permet non seulement l’observation de signes cliniques liés à l’évolution de la pathologie respiratoire mais aussi de réaliser aisément diverses analyses. De plus, le modèle murin est parfaitement maitrisé depuis plusieurs années par les responsables et manipulateurs.
Étude de la modulation de l’inflammation aiguë par induction de la senescence.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour une partie et sévère pour la majorité, 192 sur 228. Elles reçoivent des injections du vaccin anticovid de Pfizer pour induire des cellules sénescentes, puis des lipopolysaccharides ou une irradiation gamma pour déclencher une inflammation aiguë. Le porteur indique que ces agents peuvent provoquer un choc septique, de la fièvre, des tremblements et une prostration entre 15 et 48 heures après le traitement. Il affirme que la sénescence et l'immunité impliquent trop d'organes pour être reproduites en culture, ce qui rend selon lui le recours à l'animal "indispensable".
Objectifs
En vieillissant, l’organisme accumule des cellules potentiellement toxiques appelées « cellules sénescentes » ou CS. Leur impact sur le corps réduirait l’espérance de vie en favorisant l’apparition de différentes pathologies liées à l’âge. Il est généralement considéré que leur délétion diminuerait les comorbidités associées au vieillissement. Néanmoins, il a également été montré que la délétion de certains types de CS est néfaste pour certains organes, en particulier si les CS concernées font partie du système vasculaire. Leurs rôles et fonctions restent donc largement incompris et controverse. Ces CS s’accumulent soit lentement tout au long de la vie, soit au contraire apparaissent massivement à la suite d’un stress induit par une pathologie. Dans les 2 cas, il semble que ces cellules sénescentes puissent impacter le système immunitaire et notamment avoir des propriétés anti-inflammatoires. Des résultats récents laissent entendre que les cellules immunitaires sénescentes pourraient ainsi inhiber l’inflammation aiguë. L’objectif de ce projet est de déterminer si l’induction de la senescence a des effets protecteurs contre l’inflammation aiguë, permettant ainsi de diminuer les dommages tissulaires qui lui sont généralement associés. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des modèles murins ou nous induirons, dans un premier temps l'apparition des CS en exposant nos souris au vaccin anticovid BNT162b2 de Pfizer. Puis, dans un second temps, nous exposerons les souris à des agents biologiques (lipopolysaccharides ou LPS) et physiques (rayonnement gamma) induisant une l’inflammation et des dommages cellulaires. Nous rechercherons ensuite dans les tissus de ces souris des signes de dommages cellulaires issus de l’inflammation aiguë.
Bénéfices attendus
L'inflammation et la détérioration des tissus qui lui est associée est une pathologie grave. Elle peut être causée par plusieurs facteurs, notamment une infection bactérienne ou virale, des maladies auto-immunes, plusieurs maladies associées au vieillissement comme le diabète ou des interventions cliniques comme la radiothérapie. L'inflammation est causée par une réponse incontrôlée ou prolongée du système immunitaire qui finit par produire des lésions tissulaires. Si nous pouvons trouver une nouvelle façon de contrôler ce processus, comme l’induction de cellules immunitaires sénescentes, nous pouvons établir de nouveaux protocoles pour combattre certains des symptômes les plus agressifs de certaines maladies comme l’infection par le SRAS-CoV-2 (covid) ou la septicémie. De plus, cela peut offrir une protection aux personnes qui subissent une radiothérapie pendant un traitement contre le cancer, en évitant les effets secondaires qui en découlent induits par les dommages tissulaires produits par l'irradiation. En outre, les patients atteints d'une maladie auto-immune comme le lupus peuvent être traités pour réduire ou retarder les symptômes de la maladie. En résumé, les bénéfices que la société recevra de ce projet pourraient avoir un impact sur la vie de nombreuses personnes.
Procédures
Injection intraperitoneale (maximum de 2 par souris, necessite quelques secondes), Irradiation (1 seule, necessite quelues minutes).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans la premiere des cinq procédures, sauf l’injection intrapéritonéal nécessaire pour traiter les souris avec le vaccin BNT162b2. En effet, celui-ci a déjà été testé sur différentes espèces animales aux doses indiquées sans compromettre le bien-être animal, et est couramment utilisé sur des patients humains lors d’essais cliniques dans différents pays. Trois procédures nécessiterons des injections IP de lipopolysaccharides. Les LPS sont de puissants agents inflammatoires pouvant notamment induire un choc septique, de la fièvre et une baisse de la pression artérielle. Nous attendons donc à une possible détérioration de l’état sanitaire de la souris entre 15 et 20 heures après l’injection de LPS. Cela pourrait se traduire par une prostration, des tremblements et une apathie de la souris. Afin de pouvoir intervenir rapidement et limiter au maximum leur souffrance si les souris atteignent un point limites, elles seront suivies au moins une fois par heures de 15H à 24H apres le traitement. Deux procédures nécessitant une exposition ont des rayons gamma induiront des symptômes similaires, mais décalé de 24 à 48H dans le temps.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement de tissus.
Remplacement
La senescence et le système immunitaire sont des processus impliquant une communication entre de nombreux tissu et organes différents, il est ainsi impossible de mimer leur interaction en culture cellulaire ou a l'aide d'un ordinateur. Pour ce projet, le recours à l’animal reste donc indispensable.
Réduction
Le nombre d'animaux proposés à utiliser au cours de ce projet a été déterminé pour garantir une population représentative permettant d'effectuer une analyse statistique valide.
Raffinement
Ce projet nécessite d’exposer nos modèles animaux à des traitements qui impacteront leur bien-être. Pour limiter au maximum leur souffrance, les souris seront suivies par les expérimentateurs à l’aide de fiches de scores adaptées aux procédures expérimentales qu’elles subiront, et permettant d’identifier précocement les animaux en souffrances. En effet, tant les signes de mal-être que leurs cinétiques d’apparition varieront suivant qu’on injecte des LPS ou qu’on expose les souris a des rayons gamma. Ces fiches comprennent des points limites qui correspondent à un score maximum prenant en compte les différents paramètres (comportement, état général, neuromusculaire, poids) et seront remplies tout au long de l'expérimentation. On notera en particulier un suivi chaque heure dans le cas des injections de LPS entre 15 et 24 heures post-traitement. Un soin particulier sera aussi apporté au suivi de leurs poids : une baisse de poids ≥15% par rapport au poids de la précédente pesée ou de ≥25% par rapport à la pesé avant traitement entraîneront une mise à mort. D'autre part, nous avons prévu un suivi sanitaire journalier par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnelles techniques). Nous nous assurerons que les souris ont un accès ad libitum a l’eau et la nourriture, qu’elles puissent satisfaire les besoins propres à leur espèce (abris pour souris, papier utilisable pour se faire un nid, petit bout de bois à ronger), litière en copeaux de bois. De plus, par souci de respect de la hiérarchie de l’espèce, les groupes expérimentaux seront formés au moment du sevrage et conservés intacts.
Choix des espèces
Il s’agit d’une étude exploratoire et innovante avec l’utilisation de modèles murins récents qui n'existent pas chez d'autres espèces. La souris, qui est l'animal le plus largement utilisé en recherche fondamentale, est particulièrement bien connue à tous les niveaux, a un cycle de reproduction court permettant une optimisation dans la sélection des génotypes d’intérêts. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. La sénescence est un phénomène complexe impliquant plusieurs types cellulaires, voire plusieurs organes différents, comme le prouve sa composante immunitaire. Elle correspond à un processus impliquant une communication intra- et inter- cellulaire et tissulaire, qui nécessite une étude au niveau de l’organisme entier. Les souris seront des adultes de 2 mois.
Crises épileptiques induites par une substance chimique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2630
5 010 rongeurs, 2 380 souris et 2 630 rats, vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes ou de canules dans le cerveau, puis l'induction de crises d'épilepsie par une substance chimique, et des tests de nage, pour évaluer de nouveaux candidats médicaments. Le porteur décrit des convulsions, une hypersalivation et une perte d'équilibre, et indique que les animaux sont tués dès l'apparition d'une convulsion tonique ou en fin d'observation. Il revendique que la recherche de nouvelles thérapies est "nécessaire" et "indispensable" face à l'épilepsie pharmaco-résistante.
Objectifs
L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour lutter contre les épilepsies généralisées ou partielles. A l'heure actuelle, il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients épileptiques. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". La recherche de nouvelles thérapies est donc nécessaire pour améliorer la qualité et l'espérance de vie des patients. Les crises généralisées correspondent à des décharges électriques anormales au niveau cérébral (où les 2 hémisphères sont touchés), qui se traduisent par des convulsions tonico-cloniques. Les crises partielles sont liées à une décharge électrique anormale dans une région cérébrale spécifique. Les symptômes de la crise dépendent de la zone atteinte.Les épilepsies peuvent être non-convulsives, on parle alors de crises d'absence. Elles affectent principalement les enfants et correspondent à une perte de conscience (avec un regard dans le vide). Le projet consiste en l'évaluation de l'innocuité et/ou l'efficacité de substances pharmacologiques en développement, par l'utilisation de tests dans des modèles de crises épileptiques induites par des substances chimiques.
Bénéfices attendus
Les modèles de crises généralisées et partielles aigues ou spontanées induites par une substance chimique sont recommandés pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou de l'inefficacité des traitements (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux anti-épileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet anti-épileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.
Procédures
Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments sont administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat médicament. Ces procédures peuvent nécessiter une phase chirurgicale pour l'implantation d'une canule cérébrale (60 minutes, 1 fois), d'électrodes cérébrales (2h, 1 fois) ou des 2 simultamément (2h30 à 3h, 1 fois). Une substance réactive est administrée de 1 à 3 bolus rapides qui durent quelques secondes ou par une perfusion de 12 minutes maximum. Une substance réactive est administrée au maximum 3 fois par bolus rapide suivie d'une substance anti-épileptique administrée de la même manière. Le comportement de l'animal sera évalué soit immédiatement après (pendant 30 minutes à 2 heures) soit dans les semaines suivant l'induction de l'état épileptique en le touchant doucement ou en le prenant dans la main (2 sessions par semaine x 5 minutes sur 3 semaines). Après une période de récupération, les mesures électroencéphalographiques sont réalisées par télémétrie sur quelques heures à plusieurs jours consécutifs en fonction des modèles. Des tests comportementaux peuvent aussi être réalisés au lieu de mesures électoencéphalographiques. Les rongeurs sont placés dans une piscine 4 à 5 fois par jour pendant maximum 2 minutes sur 5 à 7 jours ou dans un nouvel environnement pendant 2 essais de 3 à 15 minutes. Des prélèvements sanguins ou d'organes peuvent également être envisagés avant le test (a minima 24 heures avant la stimulation) ou en fin d'étude pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les phases d'administration ou de prélèvement peuvent induire un stress chez l'animal en raison de la contention de ce dernier. Les crises partielles conduisant à l'apparition d'un état épileptique permanent, caractérisé par une hypersalivation, des mouvements de la tête et des pattes avant, un redressement de l’animal et perte d’équilibre dans certains cas. Dans les tests modélisant des crises généralisées, des convulsions toniques peuvent être observées. Ces crises correspondent à un raidissement du corps de l’animal avec perte de conscience dont la durée n’excède pas 2 minutes. Chez les animaux opérés, des problèmes de cicatrisation peuvent être observés, notamment lorsque l'animal se gratte. Les animaux sont parfois hébergés seuls pendant toute ou partie de l'étude ce qui peut causer un stress bien qu'ils conservent un contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères.Un test comportemental est basé sur la nage de l'animal, pouvant conduire à un stress sur de courte durée.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés immédiatement en cas d'apparition de convulsion tonique ou d'un état épileptique permanent pour les tests aigus ou immédiatement après la fin des observations si aucune convulsion n'est notée. Pour l'induction de crises récurrentes convulsives, les animaux recoivent une substance antiépileptique pour stopper les convulsions. Si la substance ne permet pas l'arrêt des convulsions, l'animal est euthanasié. Pour les procédures induisant des crises non convulsives, les rongeurs sont euthanasiés en fin d'expérience. Ceci car les crises épileptiques (convulsives ou non) peuvent conduire à la mort de l'animal ou affecter durablement leur qualité de vie.
Remplacement
Il existe des techniques alternatives in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et les paramètres physiologiques (température corporelle par exemple).
Réduction
Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données : variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques. Il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.
Raffinement
Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique ou la persistance d'un état épileptique ou administré avec un traitement anti-épileptique. Pour les études incluant une chirurgie, une analgésie est assurée par l’administration d'analgésiques injectés par voie systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Un gel ophtalmique est également appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement oculaire. La température corporelle est surveillée pendant toute la durée de l'anesthésie jusqu'au réveil de l'animal. Un suivi des animaux est assuré suite à la chirurgie avec des soins adaptés (prise pondérale, désinfection le cas échéant). Les animaux sont hébergés en groupe dès que possible, et systématiquement avec un enrichissement (bois à ronger, frisure et tunnel si l'animal n'est pas implanté).
Choix des espèces
Les modèles de crises convulsives ou non-convulsives induites par une substance chimique sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur après sevrage jusqu'à l'âge adulte (souris et rat) car les crises chez l'humain sont également détectées chez des sujets jeunes et adultes. Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer l'innocuité et/ou l'efficacité de nouveaux candidats médicaments (efficacité) dans le cadre de l'épilepsie.
Évaluation de probiotiques pour contrebalancer les effets négatifs des antibiotiques administrés pendant la période périnatale.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
1 522 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Nouveau-nés puis adultes, elles reçoivent jusqu'à vingt-deux gavages, des prélèvements de sang et de fèces, et sont soumises à une colite induite chimiquement puis à des infections par des bactéries pathogènes, pour tester des probiotiques contre les effets des antibiotiques pris tôt dans la vie. Le porteur indique une perte de poids, un pelage hérissé et des diarrhées comme signes attendus. Il justifie la mise à mort de toutes les souris par le fait que leur survie est "incompatible" avec les prélèvements effectués.
Objectifs
Le microbiote intestinal est une communauté dynamique, composée par différents types de microorganismes (dont des bactéries, champignons et virus), et influencée par de multiples facteurs tout au long de la vie d’un individu. La transmission du microbiote par la mère est le facteur le plus important qui conditionne le schéma de colonisation microbienne chez le nouveau-né (primocolonisation). L’administration d’antibiotiques dans la périnatalité induit des perturbations majeures au niveau de la primocolonisation de l’intestin du nouveau-né. Au cours du développement précoce du nouveau-né, des perturbations dans les interactions entre le microbiote et l'hôte pourraient nuire de manière irréversible et durable à la maturation du système immunitaire, prédisposant l'hôte à développer des maladies inflammatoires et une altération de la fonction de la barrière intestinale. Cette fonction correspond à la capacité de la muqueuse intestinale à confiner des éléments indésirables (typiquement des bactéries pathogènes) dans la lumière intestinale, tout en conservant sa capacité d’absorption des nutriments. Par ailleurs, la prise d’antibiotiques est l’un des nombreux facteurs intervenant dans l’apparition de certaines maladies inflammatoires comme la maladie de Crohn, de l’obésité, et à une plus importante sensibilité aux infections Dans ce contexte, des interventions ciblées au tout début de la vie pourraient constituer des stratégies faciles à mettre en œuvre et à contrôler pour compenser les perturbations du microbiote dues à la prise des antibiotiques tôt dans la vie. Dans ce projet, nous nous proposons d´utiliser un modèle souri de prise d´antibiotiques précoce et d’étudier la capacité d’une supplémentation avec différents probiotiques candidats, c’est-à-dire des microorganismes ayant des effets bénéfiques sur la santé, à restaurer le microbiote intestinal. Pour évaluer si cette restauration est bien fonctionnelle, nous allons utiliser un modèle de colite induite chimiquement et un modèle d’infection par des agents pathogènes bactériens intestinaux ou non-intestinaux (2 pathogènes différents).
Bénéfices attendus
Le bénéfice essentiel de ce projet est d’évaluer la capacité de 5 souches potentiellement probiotiques à améliorer la résilience du microbiote intestinal et les conséquences physiologiques liés à la prise périnatale d’antibiotiques. Il s’agit donc d’améliorer les connaissances fondamentales et les perspectives potentielles d’utilisation de bactéries probiotiques pour aider à la restauration d’un microbiote altéré par des traitements antibiotiques survenus précocement.
Procédures
Contentions et gavage sur animal vigile: 21 contentions et gavages pour 1522 souris + 1 contention avec gavage pour 918 souris (les animaux subiront donc ce geste 21 ou 22 fois, selon les cas) ; chaque contention/gavage dure environ 15 secondes. Prélèvement de fèces : 1 fois pour 1522 animaux + 2 fois pour 432 souris + 7 fois pour 486 souris (les animaux subiront donc ce type de prélèvement 1 fois, 3 fois ou 8 fois selon les cas) ; chaque prélèvement dure quelques minutes. Anesthésies : 1 fois pour 915 animaux ; Une anesthésie = une piqûre réalisée en 15-20 secondes environ. Administration intra-rectale sur animal anesthésié : 1 fois pour 432 animaux. Une administration = 20 secondes, par un manipulateur expérimenté. Administration intra-veineuse sur animal anesthésié : 1 fois pour 486 animaux. Une administration = 20 secondes, par un manipulateur expérimenté. Prélèvement de sang submandibulaire : sur animal vigile, 1401 animaux concernés (concerne une seule fois chaque animal). Un prélèvement = une durée totale de 1 minute environ.
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole proviennent majoritairement de l’inflammation induite ou des infections. Les principaux symptômes visibles attendus sont : une perte de poids et des signes cliniques tels que pelage hérissé, posture voûtée. Les traitements par antibiotiques pourraient générer des altérations du transit intestinal, de type diarrhée légère.
Devenir
La survie des animaux est incompatible avec les différents prélèvements et procédures effectués.
Remplacement
Les rongeurs sont utilisés pour les études des interactions microbiote-hôte, car de telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes.
Réduction
Les bactéries testées seront issues d’un programme préalable de criblage in vitro afin de ne conserver , pour les études sur les animaux, que des bactéries ayant montré un potentiel dans ces modèles. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fèces dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel utilisé est adapté pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads, avec une température stabilisée de 37°C, seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques seront aussi utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie et un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines. La lignée retenue pour ce projet a été sélectionnée car elle a de fortes performances de fertilité et une bonne taille de portée (12 souriceaux en moyenne). Les souris seront utilisées du stade du nouveau-né au stade adulte.