Rongeurs

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont piqués à la queue chaque semaine pour la glycémie et subissent trois prélèvements de moelle osseuse fémorale sous anesthésie sur deux mois, pour étudier l'effet du diabète de type 2 sur la production des cellules sanguines. Le porteur indique que l'état diabétique provoque une polyurie sévère imposant des changements de cage fréquents, et prévoit la mise à mort des rats perdant plus de 20 % de leur poids. Il affirme qu'aucune alternative de remplacement n'existe pour cette approche "physiologiste", les rats Wistar et GK étant présentés comme de bons modèles du diabète humain.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique, c'est-à-dire un taux de sucre dans le sang au-dessus des valeurs normales. Cette hyperglycémie est due à un déficit, dans le pancréas, des cellules β qui sécrètent l’insuline, seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Nous avons montré que l’inflammation des îlots de Langerhans, structures majoritairement composés par les cellules β, est impliquée dans le développement du DT2. Cette inflammation implique l’arrivée et linfiltration de cellules immunitaires dans les îlots diabétiques. Toutefois, les mécanismes à l’origine de l'expansion des cellules immunitaires dans les îlots DT2 ne sont pas encore bien compris. Notre hypothèse est que l’environnement diabétique entraîne dans la moelle osseuse (MO), le principal site de production des cellules du sang, un déséquilibre en faveur de la production des cellules immunitaires retrouvées dans les îlots.

Bénéfices attendus

Le bénéfice majeur de cette étude sera l'apport d'une preuve solide que l’hyperglycémie chronique induit des perturbations sur la différenciation et le lignage des cellules sanguines (aussi bien chez les mâles que chez les femelles). L’utilisation des 2 modèles de diabète – diabète induit et diabète spontané – permettra de montrer que respectivement l’hyperglycémie seule ou l’hyperglycémie couplée aux facteurs génétiques, induisent des modifications de l’hématopoïèse. En plus de mieux comprendre l’impact de l’état diabétique sur la moelle osseuse (lieu de fabrication des cellules sanguines), les résultats obtenus permettront d’établir les bases d’une étude sur le dialogue entre les îlots de Langerhans et la moelle osseuse.

Procédures

2 types d'interventions : - Une fois par semaine les rats seront piqués à la queue pour récupérer la goutte de sang (10µL) nécessaire à la mesure de la glycémie. Cette intervention dure une dizaine de secondes sur des animaux vigiles . - Cinétique de prélèvements de MO fémorale. 3 prélèvements sur une durée de 2 mois. Cette procédure est réalisée sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Une fois par semaine les rats seront piqués à la queue pour récupérer la goutte de sang (10µL) nécessaire à la mesure de la glycémie. Cette procédure ne nécessite pas de prise en charge analgésique. L'état diabétique des rats induit une polyurie sévère, ce qui nécessite un change des cages 2 fois par semaine.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront gardés en vie pendant une période de 2 mois. A l'issue des 2 mois, les animaux seront euthanasiés dans le but de récupérer les organes d'intérêt pour l'étude : les os longs (fémurs et tibias) et le pancréas.

Remplacement

Ce projet s'inscrivant dans une approche physiologiste, il n'y a, à ce stade, aucune alternative de remplacement à celle faisant appel aux modèles animaux. Ils sont les seuls à nous permettre d’analyser l’impact pathologique de l’hyperglycémie sur la synthèse des cellules sanguines. En outre, les rats Wistar et GK représentent de bons modèles d'étude pour les pathologies diabétiques, avec des caractéristiques assez proches de celles observées dans le diabète humain, et sont largement reconnus dans la littérature scientifique.

Réduction

Les groupes expérimentaux comporteront un nombre d'animaux réduit au maximum, mais permettant de prendre en compte la variabilité individuelle de l’impact du diabète sur l’hématopoïèse et de valider statistiquement, par t-test, les différences détectées entre les groupes. Un groupe de 40 rats Wistar STZ (20 mâles et 20 femelles) nous semble suffisant pour cette étude, en tenant compte des animaux qui seront écartés, faute de ne pas développer de diabète ou à l’inverse de développer une hyperglycémie trop sévère (> 5g/L) suite à l’injection de STZ. Au vu de l'expertise de l'équipe sur ce modèle, une perte de moins de 10% est à prévoir. Une réduction du nombre d'animaux du groupe Wistar contrôles (20 mâles et 20 femelles) sera appliquée en regard du nombre d'animaux Wistar STZ qui sortira de l'étude.

Raffinement

Tous les rats seront surveillés quotidiennement (aspect global, signes de stress ou de douleur). De même pour les paramètres environnementaux des pièces d'hébergement : la température, les horaires des cycles jours/nuits, les taux d'hydrométrie. Pour les rats Wistar le change de litière est fait une fois par semaine avec un enrichissement sous forme de cubes de papier pour qu'ils puissent faire un nid et un bout de bois à ronger. Le changement de l'eau des biberons est fait 2 fois par semaine. Pour les rats Wistar STZ et les rats GK diabétiques qui ont une augmentation du volume et de la fréquence des urines, le change des biberons sera fait 3 fois par semaine. Pour ces rats, le change des cages est fait 2 fois par semaine dans une litière ultra absorbante pour leur apporter un maximum de confort ; nous éviterons le nid qui une fois souillé par l'urine entraine des mauvaises odeurs et de l'humidité ; sera disposé dans la cage un bout de bois à ronger. Les prélèvements de MO seront réalisés sous anesthésie à l'isoflurane et la prise en charge de la douleur prévue avant et pendant la procédure. Quant aux prélèvements sanguins, la douleur engendrée lors de la prise de sang de 10µL à la queue de l'animal ne nécessite pas de prise en charge analgésique. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine et les rats ayant perdu plus de 20% par rapport au poids initial seront euthanasiés. Une fois par semaine nous évaluerons par grille de score adapté, l'apparence, le comportement, et l'hydratation des animaux. Seront euthanasiés les rats ayant un score caractéristique de souffrances sévères.

Choix des espèces

Le choix du rat pour cette étude réside dans le fait que cette espèce présente de grandes similitudes dans sa physiologie et physiopathologie avec celles de l’humain. Les rats Wistar seront utilisés à l’âge adulte de 12 semaines. De même pour les rats GK qui à cet âge ont développé le diabète et voient leurs cellules β du pancréas fortement altérées. Les animaux seront maintenus en vie 2 mois après avoir développé le diabète (induit pour les rats STZ ou spontané pour les rats GK).

2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une inoculation de bactéries de peau humaine par voie sous-cutanée ou dans une plaie créée au poinçon de 4 mm, avec prélèvements de sang rétro-orbitaires, avant mise à mort par dislocation cervicale au cinquième jour d'infection. Le porteur indique que l'injection peut provoquer des abcès ou une infection systémique "possiblement douloureuses" et surveille la douleur au moyen d'une grille de score. Il affirme qu'un processus impliquant autant de types cellulaires est "impossible à reproduire in vitro" et que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet.

Objectifs

Il existe des maladies génétiques telles que les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton caractérisées par une fragilité de la peau (génodermatoses). Les patients atteints de génodermatoses présentent des plaies qui sont infectées par des bactéries du microbiote cutané s. Les patients atteints des formes les plus sévères d’epidermolyse bulleuse présentent de larges décollements cutanés et développent des plaies infectées chroniques qui peuvent entraîner des cicatrices et une fibrose. Il est probable que la multiplication des bactéries sur la plaie, appelée "colonisation critique" dans la pratique clinique, entrave la cicatrisation et favorise l’inflammation locale et générale. En outre, les infections cutanées répétées favorisent les carcinomes spinocellulaires agressifs sur les sites exposés à des blessures continues. Les protéines (cytokines, chemokines, facteurs de croissance) exprimées au niveau de la plaie par les différentes populations cellulaires de la peau (kératinocytes, fibroblastes, cellules immunitaires) sont essentielles au processus de guérison et sont susceptibles d'être influencées par la colonisation par les bactéries du microbiote cutané. L'impact des différents types de souches bactériennes adaptées à l'hôte sur les signaux pro-inflammatoires et profibrotiques dans le contexte des plaies est mal connu. Les Objectifs scientifiques sont (i) comprendre pourquoi et comment les souches bactériennes issues de la peau humaine parviennent à coloniser de façon chronique la peau des patients atteints de pathologies de la barrière cutanée (ii) identifier les liens entre l'infection cutanée et les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte. Les objectifs cliniques sont (i) tester l’impact de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes sur la colonisation bactérienne des plaies et sur les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte(ii) identifier les marqueurs de virulence bactérienne. AMENDEMENT : Les nouvelles souches de souris qui seront utilisées permettront de mieux déterminer les mécanismes pathologiques induits par des infections bactériennes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des infections chroniques de la peau chez les patients atteints d’altération de la barrière cutanée, comme les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton, en exploitant des souches bactériennes issues de la peau humaines. Nous comparerons 2 modes d’infection pour évaluer l’impact local des souches (infection de plaies) et leur capacité à disséminer à partir d’un abcès (infection sous-cutanée). Ceci nous permettra de mieux comprendre le rôle des bactéries dans les lésions localisées et dans les lésions compliquées d’infection disséminée. Il est fondamental de comprendre l'impact des infections. Notre projet vise à identifier des marqueurs de sévérité des infections chroniques de la peau pour une meilleure anticipation et gestion des complications chez les patients. Notre projet prévoit aussi de tester des molécules visant à inhiber l'inflammation et la fibrose de la peau ce qui pourra contribuer à mieux traiter les patients. En outre, notre projet peut aider à fournir une compréhension physiopathologique plus large des mécanismes complexes qui sous-tendent les dermatites chroniques également associées à des infections cutanées, comme la dermatite atopique et les plaies chroniques non cicatrisantes des diabétiques.

Procédures

Au cours de l’ensemble des procédures, les interventions réalisées sur les animaux seront : (i) Procédure 1 : Inoculation bactérienne sous-cutanée (1minute par animal). (ii) Procédure 2 : Lésion artificielle et inoculation bactérienne (15minutes par animal). (iii) : Anesthésie (3 fois au cours de chaque procédure, 5minutes par animal). (iv) Prélèvement sanguin rétro-orbitaire (2 fois au cours de chaque procédure, volume de 30 à 60ul de sang, 3 minutes par animal). (v) mise à mort par dislocation cervicale (quelques secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances infligées chez la souris sont (i) inoculation par injection sous – cutané, réalisée sous anesthésie gazeuse peut provoquer une infection profonde pouvant provoquer des abcès ou une infection systémique possiblement douloureuses (ii) la réalisation d’une plaie artificielle de 4mm par punch biopsy sous anesthésie peut entrainer une douleur. (iii) les prélèvements de sang rétro-orbitaire, réalisé sous anesthésie, à J2 et J5 peuvent engendrer une douleur. Pour le respect du principe des 3R la durée et les doses des infections seront réalisées selon les protocoles préétablis pendant une période d’infection de 5 jours ou la perception du stimulus qui causent la douleur sera surveillée par les critères relatifs au bien-être animal, selon une grille de score.

Devenir

Tous mis à mort à J5 de l'infection pour analyse histologique de la peau et quantification du nombre de bactéries.

Remplacement

Des expériences in vitro seront réalisées lorsque cela est possible pour démontrer le rôle précis de certains types cellulaires (keratinocytes, neutrophiles). Toutefois, les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d’obtenir des modèles d’infection impliquant de nombreux types cellulaires interagissant les uns avec les autres et impossible à reproduire in vitro. En effet, au cours de l’infection les interactions entre les cellules de la peau (keratinocytes et fibroblastes) et les cellules immunitaires (neutrophiles, cellules de Langerhans, lymphocytes..) ont un rôle fondamental dans la capacité de l’hôte à éradiquer les bactéries pathogènes. De plus, l’infection est caractérisée par des symptômes uniquement observables chez l’animal (abcès). Il est donc impossible de reproduire efficacement un processus biologique aussi complexe impliquant le système immunitaire uniquement par des études in vitro. L’expérimentation animale est donc un élément clé de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous utiliserons des souris femelles adulte s. Le nombre de souris qui sera inclus dans chaque groupe sera le plus faible possible pour pouvoir assurer la reproductibilité des expériences et répondre aux questions scientifiques . Le nombre d'animaux sera de 12 souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs. L’application de tests statistiques efficaces sur le nombre des échantillons collectés réduira l’utilisation des animaux dans les différentes conditions expérimentales. Le nombre d'animaux a été détermié par une approche statistique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation du décret n°2013-118 et adaptées. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement des animaux par la mise à disposition de la nidification, de maisonnette et de bâtonnets en bois à ronger. Les animaux disposent de nourriture, d’eau et de litière. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux et de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance journalière et une durée limitée à 5 jours. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est sensibilisé à la détection des signes de souffrance des animaux et qualifié sur le plan réglementaire, technique en continu. Pendant la période de quarantaine les animaux seront familiarisés par la prise en main et la contention par l’expérimentateur. Pour limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le test des réflexes à la douleur (pincement du coussinet de la patte), les prélèvements sanguins rétro-orbitaire sont réalisés sur souris anesthésiées à l'isoflurane. La fréquence est de 2 prélèvements à J2 et J5 de l’infection en alternant les prélèvements des yeux. Afin de limiter la souffrance infligée lors des prélèvements sanguins, de l’ocry-gel sera appliqué en préventif sur l’œil prélevé, 5 min avant le prélèvement rétro-orbitaire. Des antalgiques sont prévus en pré-opératoire et en cas de souffrance en post -opératore si le score est égal à 2 (injection sous cutanée de 50ul de buprénophine à 0,05mg/kg). En cas d’atteinte de point limite égal à 3 , nous procèderons immédiatement à la mise à mort par une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Au cours des quarante dernières années, la recherche sur les maladies infectieuses a fait de la souris un modèle de choix pour les maladies infectieuses humaines, permettant la mise au point de traitement efficaces et de réponses scientifiques. La pathologie de la peau développée suite à l’injection de bactérie chez la souris est très similaire à celle développée chez l’homme. Un autre facteur important la petite taille de l’animal, la courte gestation et la grande taille des portées rendent les souris facile à élever que tout autre mammifère actuellement utilisé pour la recherche sur les maladies infectieuses. Les souris adultes seront utilisées afin que le système immunitaire soit mature.

378 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des injections intraveineuses ou intrapéritonéales répétées, jusqu'à seize sur soixante jours, avec prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie, pour évaluer une stratégie de ciblage des chimiothérapies vers la tumeur. Le porteur indique une nécrose tumorale possible et un stress lié aux manipulations, sans détailler de test comportemental. Il décrit des travaux préalables in vitro et sur organoïdes humains, tout en affirmant que le modèle animal reste un "prérequis obligatoire" avant tout essai clinique.

Objectifs

Le cancer colorectal, au niveau mondial, est le 3ème cancer le plus diagnostiqué après le cancer du poumon et du sein (plus de 1,8 million de nouveaux cas par an) et le 2ème cancer le plus mortel après le cancer du poumon (plus de 900 000 décès par an). Selon les estimations, ces chiffres devraient encore augmenter et atteindre plus de 2,2 millions de nouveaux cas et 1,1 million de décès par an d'ici 2030. Comme pour la plupart des cancers, l’une des limitations actuelles dans la prise en charge de ce cancer est la toxicité des traitements dont les effets délétères sur la qualité de vie du patient peuvent conduire jusqu’à imposer un arrêt de la thérapie. Afin de surmonter cette limitation nous avons développé une stratégie qui devrait permettre de cibler les chimiothérapies dans la tumeur sans affecter les tissus sains. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo le potentiel thérapeutique de cette stratégie.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’établir une preuve de concept à visée clinique (au-delà de la portée du présent projet). Les enjeux sont, in fine, de mettre à la disposition des cliniciens oncologues une stratégie de délivrance sécurisée de médicaments pour la prise en charge du cancer colorectal. Les bénéfices attendus sont d’améliorer l’efficacité des traitements, de diminuer leurs effets secondaires et d’améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les procédures impliquent au maximum une injection sous-cutanée (en début d’expérience) et soit des injections intraveineuses ou intrapéritonéales uniques avec prélèvement sanguin, soit des injections intraveineuses ou intrapéritonéales répétées tous les 4 jours (maximum 16 sur 60 jours). Lors des études de biodistribution, les animaux subiront également des prises de sang répétées sur 24h (maximum 3) ainsi que des analyses par imagerie (maximum 4) sous anesthésie gazeuse légère.

Impact sur les animaux

Nous n’avons pour l’instant aucune donnée expérimentale permettant de prédire quels seront les effets toxiques liés à l’injection des composés. En revanche, on peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux lors des injections, de la xénogreffe et/ou de la mesure de la taille des tumeurs pour le suivi de la croissance tumorale. Nous n'attendons pas d'autres nuisances ou effets indésirables sauf nécrose éventuelle de la tumeur chez les animaux xénogreffés : il n’est pas attendu qu’une tumeur située sur le flanc de l’animal, altère la locomotion ou soit à l’origine de contraintes mécaniques chez la souris. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et ne devrait pas occasionner non plus de nuisance particulière chez l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés au terme de chaque procédure afin d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem.

Remplacement

La mise au point de la stratégie (efficacité et sélectivité de ciblage de la cellule tumorale) a été réalisée sur des modèles in vitro (cultures de cellules tumorales et non tumorales colique). Des tests ex-vivo (organoïdes générés à partir de résections chirurgicales humaines normales et tumorales) font également partie intégrante du projet. Cette stratégie de remplacement a permis d’optimiser et d’orienter le choix des composés à tester sur les modèles pré-cliniques in vivo tout en limitant considérablement le nombre d’animaux. Cependant, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique de nouvelles stratégies de traitements dans des modèles animaux, murins notamment, est un prérequis obligatoire pour, in fine, justifier l’investigation clinique et la première administration chez l’homme. Ces expériences sont en effet difficilement modélisables dans d’autres systèmes et ont une valeur prédictive bien supérieure à celles réalisées in vitro ou ex-vivo. En particulier, il n’existe pas à l’heure actuelle, de systèmes alternatifs pour caractériser de façon fiable l'efficacité anti-tumorale et évaluer les effets secondaires (toxicité) de nouvelles stratégies de traitement.

Réduction

La stratégie de réduction est basée sur un mode d’incrémentation des procédures qui, étape par étape, permettra d’optimiser le protocole thérapeutique (posologie, système de ciblage, voie d’administration). La sélection progressive d’une voie d’administration, d’une stratégie de ciblage et d’une concentration de produit à administrer permettra en particulier de limiter le nombre de conditions expérimentales (et donc le nombre d’animaux) à tester au fil des procédures. D’après notre expérience, un nombre de 6 souris par groupe expérimental permet de garantir un nombre minimum de 4 animaux pour obtenir des résultats statistiquement valides, compte tenu de possibles aléas expérimentaux (prise de greffe défaillante, perte de poids trop importante voire décès).

Raffinement

Les procédures ont été optimisées au cours d’études précédentes dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et la surveillance de l’état clinique des animaux se fera au quotidien, y compris les week-ends et jours fériés. Une fiche de soins permettra également d’assurer la prise en charge et le suivi des animaux. Les observations et l’évolution de l’état général des animaux conditionneront les prises de décisions permettant d'assurer leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence (y compris les nôtres) dans le domaine de la cancérologie (modèles précliniques de tumeurs intestinales induites et tests de principes actifs) sont nombreuses, bien documentées et bien validées. Les souris seront âgées de 7 semaines en début d’expérimentation (souris adultes).

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose un cathéter veineux sous anesthésie pour administrer une formulation injectable de mitotane et réaliser un prélèvement sanguin quotidien pendant sept jours, afin d'établir le profil pharmacocinétique de la molécule avant un passage chez l'humain. Le porteur indique que le traitement peut provoquer diarrhées, vomissements et anorexie, et précise avoir réduit les doses par rapport à la littérature. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, les modèles cellulaires ne permettant pas selon lui d'établir un tel profil.

Objectifs

Le but de ce projet est de réaliser les premières étapes d’un essai pré-clinique dans le but de développer une formulation injectable de mitotane, qui aura pour objectif de réduire drastiquement de délais d’action de la molécule, de réduire les effets indésirables par la diminution des posologies efficaces, et donc à terme d’améliorer l’efficacité du traitement et la qualité de vie du patient.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet Atteinte de l’intervalle thérapeutique du mitotane compris entre 14 et 20mg/L en une semaine avec libération du mitotane principalement dans les glandes surrénales chez les Rats bénéficient de la formulation optimisée. Cela permettra la validation d’un modèle pré-clinique et de passer à des essais cliniques de phase chez l’Homme. Les bénefices sont une meilleure prise en charge des patients et une baisse des effets indésirables.

Procédures

Les animaux auront un catheter veineux de posé (temps de pose évalué à une demi-heure), afin de pouvoir leur administrer un traitement avec une nouvelle formulation, ainsi que pour les prélèvements (1 prélèvement par animal et par jour , pour une durée de 7 jours, intervention quotidienne de cinq minutes).

Impact sur les animaux

Troubles Gastro-intestinal fréquemement obervés et troubles psychologiques observès -pour les troubles digestifs : diarrhées, vomissements -pour les troubles psychologiques : anorexie -afin de réduire ces troubles, le dosage utilisé pour réaliser les études de pharmacocinétique sont bien plus faible que ceux décrient dans la littérature.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements et les les organes.

Remplacement

Il est indispensable pour notre étude d’avoir recours à l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne permettent pas la réalisation d’un profil pharmacocinétique. Il est donc primordial avant de passer sur un modèle Humain de définir la pharmacocinétique chez l’animal.

Réduction

Des recherches sur la DL 50 ont été effectuées, afin de ne pas sacrifier inutilement des animaux. Seuls deux groupes seront utilisés, de 10 Rats chacun, ce qui nous semble le strict minimum pour établir la pharmacocinétique de notre formulation et afin d’éviter les variabilités inter-individuelles. Le nombre d'animaux a été obtenu, afin d'avoir une approche statisitique idéale.

Raffinement

Une chirurgie est réalisée à J0 (sous analgésie et anesthésie générale (buprecare 0.1 mg/kg et isofurane 2%), afin de poser un cathéter veineux aux animaux, afin de limiter les prélèvements sanguins répété au niveau de la queue de l’animal. Tous les prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale (ISOFLURANE). La chirurgie et les prélèvements sanguins sont réalisés dans une pièce isolée, calme avec seulement un seul ou deux manipulateur expérimentés présents. Les doses utilisées dans ce projet sont considérablement plus faibles que ce qui est décrit dans la littérature.

Choix des espèces

Le Rat est un modèle couramment utilisé et reconnu pour sa pertinence pour étudier la pharmacocinétique d’une molécule Les animaux utilisés sont au stade adulte, la taille à cet age permet une réalisation facile de la partie opératoire (pose du catheter) et de plus , correspond à un age habituel dans la littérature scientifique.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une irradiation cérébrale à forte dose sous anesthésie sur trois jours, puis cinq mois de tapis de course, des prélèvements sanguins en contention et des séances d'IRM sous anesthésie, pour tester si l'activité physique et de faibles doses de rayonnements limitent les lésions dues à la radiothérapie. Le porteur décrit une batterie de tests comportementaux répétée quatre fois (fatigue, locomotion, anxiété, mémoire, apprentissage spatial) et indique que l'irradiation provoque fatigue, perte de poids et érythèmes cutanés, présentés comme transitoires. Les retombées pour les patients sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal pour une analyse intégrée.

Objectifs

La radiothérapie (RT) est un traitement de référence pour traiter les tumeurs cérébrales, mais celle-ci peut induire des déficits cognitifs et une fatigue altérant la qualité de vie des patients. Les travaux de recherche actuels soutiennent l'implication concomitante de plusieurs processus interconnectés (dommages vasculaires, modifications de la matrice extracellulaire, neuroinflammation, neurodégénerescence, démyélinisation) contribuant au développement du déclin cognitif. Proposer une stratégie thérapeutique pour remédier aux déficits cognitifs observés après RT est essentiel pour améliorer la prise en charge des patients et représente un enjeu sociétal majeur face à l’augmentation du nombre de patients survivants après un cancer. Bien que les irradiations ionisantes appliquées à fortes doses utilisées pour la RT soient délétères pour les cellules, une exposition à de faibles doses de rayonnements ionisants (FDRI) pourrait promouvoir la protection et la réparation tissulaire, par leurs effets antioxydants, anti-inflammatoires et anti-apoptotiques. Récemment, il a été proposé l'existence d'un effet hormétique des FDRI sur le cerveau, suggérant que les FDRI pourraient être une thérapie prometteuse dans le cadre de diverses pathologies cérébrales. Parmi les traitements proposés pour la prise en charge de la radiotoxicité cérébrale, l’activité physique adaptée (AP), outil de réadaptation non invasif et non médicamenteux, semble pertinente. Plusieurs études cliniques menées sur différents types de cancer ont montré un bénéfice de l’AP sur le pronostic et la qualité de vie des patients. Des études épidémiologiques et interventionnelles suggèrent que l’AP améliore des processus cognitifs liés aux processus mnésiques et aux fonctions exécutives. De plus, la pratique d’une AP permettrait de réduire le déclin cognitif associé au vieillissement à la fois normal et pathologique, notamment dans des conditions neurodégénératives. Dans ce contexte, le projet proposé vise à étudier l’intérêt d’une exposition aux FDRI et de l’AP, seules ou combinées, pour réduire les lésions cérébrales et les déficits cognitifs consécutifs à la RT cérébrale.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique doit permettre de 1/ d’apporter des preuves expérimentales robustes pour évaluer l'intérêt thérapeutique des FDRI et de l’AP sur les effets délétères induits par une irradiation cérébrale à fortes doses de rayonnements ionisants et 2/ de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux bienfaits des FDRI et de l’AP dans un contexte de radiotoxicité cérébrale. A la fin du projet, les résultats seront accessibles sous la forme d’articles scientifiques. De plus, des biobanques de tissus cérébraux et de sang seront établies lors de ce projet et seront mises à disposition de la communauté scientifique. A long terme, une transposition à la clinique pourrait être envisagée pour atténuer le déclin cognitif des patients traités par RT et améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes procédures : - irradiation cérébrale à fortes doses de rayonnements ionisants qui sera délivrée sur 3 jours consécutifs et qui durera 10 minutes pour chaque fraction d’irradiation, réalisée sous anesthésie générale des animaux. - exposition cérébrale aux faibles doses de rayonnements ionisants (traitement FDRI) qui sera délivrée sur 3 jours consécutifs et qui durera 10 minutes pour chaque fraction d’irradiation, réalisée sous anesthésie générale des animaux. - pratique régulière de l’activité physique via l’utilsiation d’un tapis de course (traitement AP). Chaque session d'activité physique durera 30 minutes et sera réalisée 3 fois par semaine pendant 5 mois. - tests comportementaux : fatigue, activité locomotrice et comportement de type anxieux, mémoire à court-terme, mémoire à long-terme et apprentissage spatial et mémoire de référence. Chaque animal réalisera 4 fois cette batterie de tests comportementaux (3 semaines, 5 semaines, 2 mois et 6 mois post-irradiation). L’ensemble des tests comportementaux seront échelonnés sur 2 semaines avec 1 seul test par jour. La durée de chaque test sera comprise entre 10 et 20 minutes. - prélèvements sanguins : ils seront réalisés sur animaux vigiles, en utilisant une boîte de contention, à 5 semaines et 2 mois post-irradiation cérébrale. La durée totale de la procédure (temps maximal pour réaliser le prélèvement) ne dépassera pas 5min. - examens en IRM cérébral qui seront réalisé à 2 mois et 6 mois post-irradiation. Ces examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale des animaux et l’examen durera 60 minutes pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Suite à l'irradiation cérébrale, les animaux seront fatigués, présenteront une perte de poids et pourront présenter des signes de dégradation de leur état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, érythèmes cutanés sur la tête) accompagnés d'une diminution de la prise alimentaire et hydrique. Cependant, ces effets indésirables sont transitoires et réversibles(de 5 jours à 14 jours après irradiation), comme cela est décrit chez les chez les patients traités par radiothérapie.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l’étude afin de mener des études post mortem sur le sang et le tissu cérébral.

Remplacement

Les effets délétères de l’irradiation cérébrale sur l’organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau ne sont pas seulement dus à des effets directs sur le cerveau, mais aussi à des phénomènes humoraux (stress oxydatif, inflammation, exosomes, hormones) et nerveux (dommages des voies nerveuses périphériques) qui ampflient les dommages cérébraux, les déficits cognitifs et la fatigue induits après l’irradiation cérébrale. Ainsi, il est indispensable d’avoir recours à l’expérimentation sur des animaux pour permettre une analyse intégrée des phénomènes complexes induits par l’irradiation cérébrale, d’évaluer l’intérêt des FDRI et de l’AP, et d’avoir des preuves expérimentales suffisamment robustes pour, à terme, tester ces traitements chez l’Homme.

Réduction

Grâce à l'utilisation au préalable de tests statistiques appropriés et à l'utilisation de techniques d'investigation non invasives (imagerie IRM et tests comportementaux), le nombre d'animaux nécessaire pour permettre une puissance des résultats sera réduit au minimum. Chaque animal subira ces examens non invasifs de façon séquentielle (suivi longitudinal pendant 6 mois post-irradiation), ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. A partir de données du laboratoire obtenues sur ce modèle animal de radiotoxicité cérébrale, nous estimons que le nombre d’animaux nécessaire à cette étude est N=20 rats/groupe pour les 4 groupes expérimentaux. Au total, 80 rats seront nécessaires pour réaliser l’ensemble du projet. Par ailleurs, l’ensemble de ce projet sera réalisé sur plusieurs cohortes d’animaux successives avec des effectifs par groupe plus réduit afin de réaliser une analyse statistique séquentielle des données obtenues en IRM et comportement, ce qui permettra si des différences significatives sont observées de ne pas atteindre le nombre maximal d’animaux par groupe fixé. Cette méthode d’analyse statistique séquentielle permettra éventuellement de réduire le nombre d’animaux initialement prévu dans ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en animalerie conventionnelle aux normes requises. Le personnel participant au projet est formé aux procédures en expérimentation animale. Des inspections du bien-être des animaux sont réalisées quotidiennement. De plus, toutes les mesures visant à réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux seront entreprises, notamment en appliquant une anesthésie et une analgésie appropriées. Concernant les effets indésirables liés à l’irradiation cérébrale qui peuvent affecter de façon transitoire l’état général des animaux, des mesures sont déjà mises en place dans le laboratoire et connues par les personnes impliquées dans ce projet. Pour limiter ces effets indésirables survenant uniquement pendant les 2 premières semaines après irradiation, le poids des animaux est relevé quotidiennement, une alimentation particulière est donnée aux animaux : croquettes mouillées dans une coupelle déposée directement dans la cage ainsi que de la gelée hyperprotéinée. Des injections intrapéritonéales de sérum physiologique sont réalisées 2 fois par semaine, pour éviter une éventuelle déshydratation. Concernant les érythèmes cutanés sur le haut de la tête, celles-ci sont bien connues et prises en charge selon les recommandations du vétérinaire de l’animalerie. Dès que la peau est bien sèche, une crème hydratante et cicatrisante est appliquée tous les 2 jours jusqu’à la cicatrisation cutanée. De plus, une échelle d’évaluation de l’état général des animaux (score défini par plusieurs items visuels) a été mise en place par le laboratoire sur ce modèle animal pour surveiller finement l’état général des animaux. Enfin, des points limites spécifiques et de critères d'arrêt de souffrance seront utilisés afin de réduire toute souffrance ou douleur chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat possède un cerveau dont la taille est supérieure à la souris et qui est compatible avec les appareils permettant une irradiation encéphalique ciblée ainsi qu’une imagerie de haute résolution. D’autre part, plusieurs tests comportementaux visant à évaluer les déficits moteurs et cognitifs sont bien décrits chez le rat. Enfin, nous avons développé au sein du laboratoire un modèle de radiotoxicité cérébrale chez le rat, pour lequel nous avons déjà très bien caractérisé les dommages cérébraux ainsi que les modifications comportementales (fatigue, locomotion, mémoire, comportements de type anxiété et de type dépression) jusqu’à 6 mois après irradiation encéphalique. Ainsi, nous maitrisons très bien ce modèle animal que ce soit dans le décours temporel de sa physiopathologie mais aussi en termes de prise en charge du bien-être animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront âgés de 5 mois (correspondant à un poids d’environ 350 g) lors de leur arrivée à l’animalerie. Lors du 1er mois, les rats seront acclimatés dans leur nouvel environnement, habituer aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux (tests comportementaux et tapis de course pour l’AP). L’irradiation cérébrale sera réalisée sur des animaux âgés de 6 mois. . L’âge de 6 mois a été retenu puisqu’il correspond à l’âge adulte mature chez le rat et est équivalent à l’âge de 18 ans chez l’Homme. A ce stade de développement chez le rat, la substance blanche est complètement mature, ce qui représente un critère très important pour modéliser les atteintes cérébrales observées chez le patient adulte traité par radiothérapie.

3 228 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections répétées, une infection chronique par le parasite Toxoplasma pouvant provoquer "un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à sept jours" et une perte de poids, des chirurgies stéréotaxiques et des tests cognitifs, pour étudier la neuro-inflammation dans la maladie d'Alzheimer. Les organes, dont le cerveau, sont prélevés après mise à mort. Le porteur affirme que les études in vitro "ne permettent pas" d'étudier le comportement et la cognition.

Objectifs

Une inflammation à bas bruit tout au long de la vie contribuerait aux mécanismes du vieillissement et même pourrait fortement peser dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer et des démences associées. Au niveau du cerveau, des médiateurs de l’inflammation, les cytokines, qui circulent en grande quantité dans le cerveau au cours des infections ou lors des maladies neurodégénératives pourraient perturber les mécanismes de réponses physiologiques du neurone. Il est donc important de mieux comprendre comment les processus de neuro-inflammation affectent le comportement et la cognition. Ici, il est proposé d'utiliser des modèles de souris dans lesquels il est possible d’induire la suppression de l’expression d’un récepteur à une cytokine à la fois, et cela seulement dans les neurones. Cela permettra d’étudier l’importance de cette cytokine dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans des processus pathologiques. Ces derniers sont la neuroinflammation chronique ou des infections du système nerveux central. L'étude utilisera un modèle transgénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, ou une infection par Toxoplasma ou l'expression isolée de médiateurs de l'inflammation. Le recours à un modèle animal est donc irremplaçable pour cette étude, puisqu'elle vise à déterminer les effets de la suppression de la signalisation de cytokines sur la physiologie de neurones, le comportement et la cognition.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle des signaux pro-inflammatoires reçus par les neurones au cours des infections du système nerveux central et la réponse neuro-inflammatoire et la neurodégénérescence, permettra, sur le plan fondamental d'élucider les mécanismes clés mis en jeux dans les neurones et leur importance pour la fonction cognitive. Sur le plan médical, ces recherches pourraient déboucher sur l'identification de nouvelles cibles, pour des stratégies thérapeutiques contre des maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer, pour laquelle aucun remède n'est connu.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections intrapéritonéales répétées journalièrement pendant 5 jours, sur animaux vigiles (2904 souris, 5 jours, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection intrapéritonéale d'un parasite, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (2796 souris, une injection de quelques secondes); iii) deux types de chirurgies sous anesthésie générale: une de moins de 15 minutes (chirurgie cutanée, 432 animaux), ou/et une de moins de 40 minutes par animal (injection intracrânienne bilaterale, 960 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), la force (une session de 5 minutes au total par animal, à raison deux 3 essais de 5 secondes chacun et 30 secondes au minimum entre chaque groupe de 3 essais) et les processus cognitifs ( toutes les souris (3228), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), labyrinthe de Barnes ( chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde terminale (sans réveil, 3228 animaux, moins de 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées ne présentent aucun symptômes apparents de maladie et n'ont donc pas de phénotype dommageable, ce que nous avons confirmé lors de leur utilisation dans le cadre du premier protocole APAFIS autorisé pour ces lignées. Dans le cas d'infection par Toxoplasma ou l'infusion chronique de cytokines pro-inflammatoires par implantation de pompes sous cutanées, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies stéréotaxiques peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Du fait que les animaux sont acclimatés à l'environnement des tests comportementaux et sont habitués aux expérimentateurs par manipulations régulières des animaux dans les semaines précédant les tests, aucune nuisance n'est constatée durant les tests comportementaux. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes; où les souris doivent être hébergées individuellement, l'hébergement pourrait devenir anxiogène mais des mesures d'enrichissement du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

Les 3228 animaux seront en fin de procédure euthanasiés. L'euthanasie est nécessaire afin de prélever les organes en post-mortem (dont le cerveau) des animaux pour comprendre ensuite au niveau cellulaire et moléculaire, les causes et mécanismes des changements observés au niveau comportemental, et limiter le double-emploi au maximum. Ces prélèvements post-mortem sont aussi nécessaires afin de confirmer l'efficacité de la procédure.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant la neurodégénérescence. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires (12 pour les groupes contrôles témoins). En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 3 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. L'utilisation d'implants sous-cutanés permettront de délivrer des molécules de manière chronique ce qui évitera de devoir recourir à des injections journalières répétées. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). La maitrise des interventions qui pourraient s'avérer douloureuses sera effectuée par l'utilisation d'analgésiques en péri-opératoire. Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux .

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel du parasite Toxoplasma gondii, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques la signalisation de médiateurs de l'inflammation dans les neurones dans le cadre d’une infection naturelle. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés (modèles invalidés pour un gène contribuant à la maladie ou exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux déficients pour la protéine étudiée n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.