Rongeurs

2 000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les cellules tumorales sont injectées par voie carotidienne pour provoquer des métastases cérébrales, suivies de traitements par diverses voies, de rayons ionisants, parfois d'un implant hormonal et de prélèvements répétés. Le porteur indique que la tumeur peut entraîner perte de poids, faiblesse musculaire et troubles de la coordination, la perte de poids servant de point limite. Cette société de recherche préclinique décrit une "demande de plus en plus importante" pour ces modèles et affirme que les méthodes 3D restent marginales et difficilement transposables.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie (Centre international de recherche contre le cancer). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, les cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente aux traitements. D’énormes progrès ont été réalisés en clinique sur les tumeurs dites primaires. En revanche, le pronostic vital des patients peut être énormément dégradé en cas de métastases. On parle de métastases cérébrales lorsqu’un cancer d’un autre organe (cancer primitif) s’est propagé au cerveau. Des métastases s’y développent fréquemment en cas de cancer du sein, de la peau ou du poumon. Parmi les cancers chez les femmes, celui au sein est le plus répandu dans les pays développés. Environ 20 % des cancers du sein développent des métastases cérébrales. Malheureusement, les traitements actuels, par radiothérapie, chimiothérapie et chirurgie, sont majoritairement vains. La présence de métastases au cerveau entraîne un mauvais pronostic de survie (6 mois en moyenne), même si le cancer primitif répond bien aux traitements. En effet, le diagnostic est généralement tardif. Pour répondre à ce besoin de nouvelles approches thérapeutiques l’objectif de ce projet est d’induire directement des métastases dans le cerveau en mimant le cheminement des cellules tumorales jusqu’au cerveau par la voie carotidienne. Ces modèles, permettront de refléter la pathologie humaine et d’évaluer des nouveaux médicaments destinés à traiter les métastases cérébrales chez l’homme. Nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison chez l’animal avant de les tester chez l’homme. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale. Nous estimons le nombre de projet à 5 par an soit 25 projets sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Notre société, spécialisée en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Une demande de plus en plus importante se fait pour le traitement des métastases. Plus particulièrement ces demandes sont accès sur les métastases cérébrales qui reste à ce jour sans traitement. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Grace à ces modèles, il sera possible d’étudier les mécanismes d’expansion ou de nidification des métastases avec des traitements prophylactiques ou de croissance des métastases avec des traitement de deuxième ligne dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme. Il sera possible aussi, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre la progression des métastases.

Procédures

L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie avec administration d’un anesthésique local et d’un anti inflammatoire (

Impact sur les animaux

La greffe des cellules nécessitera une chirurgie qui pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2 jours et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une perte de poids, des difficultés à se mouvoir, une faiblesse musculaire et des soucis de coordination. La perte de poids sera le premier symptôme observé et constituera un point limite. Pour les expériences d’activités antitumorales, les animaux recevront des traitements et/ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Il pourra aussi être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1 jour. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress pendant 1-2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme pour étudier les modèles de métastases.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie (risque inférieur de 5% de mortalité chirurgie par des personnels entrainés) et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. En fonction du succès des études pilotes et une fois le modèle totalement acquis, ce nombre d’animaux surnuméraire sera réduit. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 6 à 15 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement relevant. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).

Raffinement

Au cours de l’expérimentation, les animaux seront maintenus dans leurs cage avec un enrichissement adapté et dans les conditions standard d’hébergement en terme de surface de cage et de nombre. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et un suivi adapté (observations, pesées, signes cliniques) sera mise en place post chirurgie avec évaluation des lésions neurologiques 1h post chirurgie et soins post opératoire et antalgie pendant 48h post chirurgie. Cette fréquence sera augmentée pour tous les animaux dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès qu'une perte de poids de plus de 10% sera observée sur certains animaux. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, la pose d’implants hormonaux seront réalisés sous anesthésie avec incision cutanée et Injection locale d'antalgique. Pour la greffe, une analgésie locale avec dépôt d’anesthésiques locaux en sous-cutané au niveau de l’incision de la peau sera réalisée et les animaux recevront un opiacé et un anti inflammatoire non stéroïdien. Le lendemain, les animaux seront traités avec un antiinflammatoire). En fonction du suivi clinique et sous avis vétérinaire, le traitement à l’antiinflammatoire pourra être prolongé. La greffe sera réalisée en conditions d’asepsie. Les points limites définit par la SBEA seront appliqués.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales.

1 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation puis de une à neuf injections, avec induction de tumeurs, pour étudier le rôle de sous-types de cellules dendritiques dans l'immunothérapie du cancer. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent entraîner une perte d'appétit et de poids et que l'irradiation peut causer amaigrissement et diarrhée. Il qualifie d'"indispensable" le recours à la souris et renvoie les retombées thérapeutiques pour les patients à un horizon futur.

Objectifs

La mort cellulaire immunogène est un processus de mort cellulaire qui déclenche une réponse immunitaire. Lorsqu'une cellule meurt de manière immunogène, elle libère des signaux moléculaires qui attirent les cellules du système immunitaire, comme les cellules dendritiques qui jouent un rôle central. Actuellement, différents sous-groupes de cellules dendritiques ont été identifiées mais, à ce jour, leur rôle n’est pas encore clair. Les objectifs de ce projet sont : 1) Découvrir et comprendre quels sous-types de cellules dendritiques sont les plus importants pour garantir un meilleur effet avec la thérapie immunogène anticancéreuse. 2) Etudier comment les chimiothérapies immunogènes et l’immunothérapie affectent les bons sous-types de cellules dendritiques et montrent un meilleur traitement contre le cancer que les autres. Cette recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour améliorer l'efficacité des approches thérapeutiques immunogènes contre le cancer par amorçage du potentiel des cellules dendritiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Les recherches dans ce projet peuvent avoir un impact significatif sur le développement de traitements plus personnalisés et efficaces contre le cancer en exploitant le potentiel des sous-populations spécifiques de DC dans la thérapie immunogène. Voici quelques-uns des avantages attendus de ce projet : 1) En étudiant comment la déplétion sélective de certaines sous-populations de DC affecte la réponse immunitaire, nous pourrions parvenir à une compréhension plus approfondie du rôle spécifique de ces cellules dans la thérapie immunogénique du cancer. Cela permettrait de mieux cibler les interventions thérapeutiques pour maximiser leur efficacité ; 2) En comprenant comment les différentes sous-populations de DC interagissent avec la chimiothérapie et l'immunothérapie, nous pourrions optimiser la combinaison de ces approches pour une meilleure réponse immunitaire et une plus grande efficacité dans le traitement du cancer ; 3) Ces recherches pourraient révéler des sous-populations spécifiques de DC qui sont essentielles pour une réponse immunitaire efficace. Cela ouvrirait la voie à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront une irradiation (durée 14 minutes) suivie d'une injection (durée 2 minutes) sous anesthésie locale. Suivant les lots, les souris pourront avoir entre 1 et 9 injections (durée 2 minutes) sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations (préhension, injections) peuvent induire du stress chez l'animal. La croissance tumorale et les traitements (la chimiothérapie et l'immunothérapie) peuvent entraîner une perte d'appétit et une perte de poids. L’irradiation peut induire des atteintes modérées de la santé avec amaigrissement et diarrhée transitoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaire.

Remplacement

L'utilisation de la souris dans la recherche sur la chimiothérapie et l'immunothérapie est indispensable car les maladies traitées par perfusion et immunothérapie, particulièrement le cancer, sont des affections complexes impliquant des interactions entre de multiples voies biologiques et des cellules. Les souris sont des modèles animaux qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec les humains, permettant ainsi de comprendre les mécanismes biologiques et les réponses aux traitements dans un système vivant complet. Les DCs sont d'une complexité biologique considérable, et leur fonctionnement et leurs interactions avec d'autres cellules immunitaires sont encore en cours de découverte. Donc l'utilisation de modèles in vivo dans la recherche sur la biologie des cellules dendritiques est indispensable pour obtenir des informations approfondies sur leur fonction, leur rôle dans la réponse immunitaire, leur contribution aux maladies et leur potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés ; nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail comme expliqué dans chaque procédure. De plus, toutes les expériences reposant sur la reconstitution de la moelle osseuse seront réalisées avec des moelles osseuses cryoconservées au lieu de les extraire de nouveaux animaux donneurs, ce qui réduit de moitié le nombre d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront en environnement enrichi et stimulant pour les animaux en expérimentation, avec suffisamment d'espace, de matériel et d'interactions sociales, pour améliorer leur bien-être (sizzlenests, tunnels, maisons). Les protocoles expérimentaux sont rigoureux, optimisés et validés, et minimisent la souffrance animale et les manipulations inutiles, tout en fournissant des résultats scientifiquement valides. Le personnel de recherche est formé en continu afin de réduire le stress et l'inconfort des animaux. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Un suivi quotidien est mis en place pour s'assurer de la santé des animaux et mettre en place des mesures correctrices quand c'est nécessaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions seront réalisées sous anesthésie locale ou générale et raffinées (utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...).

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, et pratiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

1 191 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation suivie d'une greffe de moelle osseuse, quatre gavages, des prélèvements de sang et l'implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie, pour reproduire une myélofibrose que 100 % des animaux développent. Le porteur indique que la maladie provoque une splénomégalie, une perte d'appétit et un amaigrissement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut réunir ces paramètres et conclut à la nécessité de la souris pour étudier la maladie dans un "organisme dans sa globalité".

Objectifs

Les néoplasmes myéloprolifératifs sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération excessive des cellules myéloïdes tels que les globules rouges, les mégacaryocytes (donnant naissance aux plaquettes) et des granulocytes et peuvent aboutir au développement de leucémies, dont la plus grave est caractérisée par les mutations dans des gènes régulant la production de plaquettes. Elle conduit à une amplification anormale de plaquettes dans la moelle osseuse qui vont s’activer et libérer différents cytokines et facteurs de croissance. Ces derniers vont agir sur les cellules stromales de la moelle osseuse ce qui conduira à la production de collagène en excès et à une dégénerescence par fibrose. Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace dans cette maladie, à l'exception de la greffe de moelle osseuse. Chez les patients atteints de cette maladie, les meiilleurs traitements sont inefficaces.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace de la myélofibrose. Ici nous proposons un nouveau modèle préclinique au développement de la MF rapide et homogène (100% d'animaux développent la maladie contre 60% avec les modèles précédemment décrits) qui nous permettra non seulement de décrypter les mécanismes physiopathologies de la maladie mais aussi de tester des drogues identifiées pendant une pédiode courte et sur un nombre d'animaux diminué car ce nouveau modèle est très reproductible. Les bénéfices potentiels sont le développement de traitements pour cette pathologie grave.

Procédures

Gavages 4 fois, durée 1 minute. Irradiations: 1 fois (13 minutes) et greffes (durée 5 minutes), sous anesthésie générale. Prélèvements de sang (nombre 3), durée 2 minutes sous anesthésie générale. Injections des médicaments (1 ou 2 injections) durée 1 minute, anesthésie locale. Implantation de pompes osmotiques, durée 8 minutes, une fois, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le gavage induit une contrainte légère. Les irradiations suivies de greffe induisent une contrainte modérée pour les animaux: fatigue transitoire, possibilité de diarrhée transitoire. Les injections et les prélèvements de sang induisent une contrainte légère et transitoire du fait de la préhension des animaux. L'implantation de pompes osmotiques est une peite chirurgie légère qui est très bien tolérée. Le modèle proposé conduit au développement de la myélofibrose accompagnée de la diminution de cellules hématopoïétiques au niveau de la moelle osseuse et leur augmentation au niveau de la rate (splénomégalie). Les animaux peuvent présenter des signes cliniques du fait de la perturbation de la formule sanguine, avec perte d'appétit et amaigrissement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les organes hématopïétiques.

Remplacement

Le développement de la myélofibrose survient dans un environnement qui nécessite la présence de différentes cellules, les cellules hématopoïétiques porteuses de la mutation causale de la maladie, différents types de cellules de l'environnement qui seront activées après la libération de cytokines par les cellules hématopoïétiques et le confinement de la moelle osseuse. Il est impossible de réunir ces paramètres in vitro. De plus, la maladie ne touche pas uniquement la moelle osseuse, on observe la splénomégalie et la fibrose au niveau de la rate. Seuls les traitements de souris mimant les symptômes hématologiques des patients atteints de NMP permettront d’analyser leur efficacité dans l’organisme dans sa globalité, incluant la réponse immunitaire contre les cellules mutées.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot a été minimisé et s'est basé sur la littérature et l’expérience du laboratoire sur ce modèle de maladie. Le nombre indiqué ne sera atteint que si tous les médicaments présentent un effet sur la myélofibrose. Si un médicament n'a pas d'effet, le test sera arrêté précocément.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance clinique quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Une alimentation adaptée sera ajoutée dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites précoces seront strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...).

Choix des espèces

L'utilsiation de souris nous permets dans un temps très court l'obtention d'un nombre d'animaux à expérimenter. Nos modèles miment parfaitement les pathologies humaines (Thrombocytémie Essentielle et Polyglobulie De Vaquez) qui mènent à la myélofibrose. Ce sont donc de bons modèles, statistiquement solides et probant pour les études proposées. Ces souris modèlisent au plus près les conditions pathologiques humaines. Le modèle conduit à un développement rapide de la myélofibrose et ceci de façon très homogène ce qui permet de réduire le nombre d'animaux et le temps de traitement.

75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur sectionne le nerf sciatique droit sous anesthésie, avant de le réparer par colle biologique ou manchonnage veineux, puis ils subissent des tests fonctionnels à 15, 30 et 90 jours et une évaluation électrophysiologique finale sans réveil. Le porteur indique que la section du nerf provoque une perte des fonctions motrices et sensitives du membre, des douleurs postopératoires et un risque d'automutilation. Il affirme que ce mécanisme nerveux intégré ne peut pas être reproduit de façon satisfaisante in vitro ou in silico et écarte les modèles sur invertébrés.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de la réparation nerveuse. Actuellement, la technique de suture associée au manchonnage veineux est considérée comme la technique de référence en termes de réparation nerveuse. La technique de suture associée à l’enveloppement par colle biologique se veut plus simple, puisque moins de points de suture sont à réaliser (seulement deux versus quatre pour la technique de référence). De nombreuses colles biologiques sont utilisées neanmoins, meme si cette technique est admise dans les pratiques, les colles biologiques n’ont pas l’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) pour une utilisation en chirurgie nerveuse peripherique. De plus il n’a jamais ete prouve, dans la litterature, que la colle biologique permettait de prévenir l’apparition de nevrome en post-operatoire. Le névrome correspond à une prolifération anarchique des neurones qui interfère avec la récupération fonctionnelle et peut engendrer des douleurs. Cette étude pré-clinique a pour objectif de déterminer si la colle biologique est aussi efficace que le manchonnage veineux pour prévenir l’apparition de névrome, tout en permettant une bonne repousse nerveuse sur le nerf sciatique droit chez le rat. Il s’agira d’évaluer de façon clinique, électrophysiologique, et histologique la repousse axonale selon les deux groupes : suture/manchonnage veineux et suture/enveloppement par colle biologique.

Bénéfices attendus

Les lesions nerveuses representent une part importante de la traumatologie de la main, environ un million de cas par an dans le monde. Il est decrit de nombreuses techniques pour les reparer. Il existe des risques non negligeables de complications malgre la reparation realisee, et plus particulierement de nevrome. Les nevromes correspondent a une proliferation de tissu nerveux avec une repousse axonale desorganisee, engendrant des douleurs pas exces de nociception, pouvant s’associer a des dysesthesies. Ces nevromes, lorsqu’ils sont constitues, necessitent un second geste chirurgical pour en faire l’exerese, avec risque de perte de sensibilite definitive en aval. Il est admis que l’ajout d’un manchon veineux autour de la suture nerveuse permet l’absence de nevrome dans les suites post-operatoire. Une etude pre-clinique sur le manchon veineux sur le nerf sciatique de chien, ainsi qu’une etude clinique sur le manchonnage veineux sur les nerfs collateraux des doigts, etaient toutes deux en faveur de l’absence de nevrome dans les suites operatoires. A ce jour, certains chirurgiens pratiquent la technique : suture + colle biologique. Cette technique se veut plus simple, avec moins de points de suture et d’apprentissage plus rapide. De nombreuses colles biologiques sont utilisees, neanmoins meme si cette technique est admise dans les pratiques, les colles biologiques n’ont pas l’AMM pour une utilisation en chirurgie nerveuse peripherique,. De plus il n’a jamais ete prouve, dans la litterature, que la colle biologique permettait de prevenir l’apparition de nevrome en post-operatoire. Ainsi, nous espérons que notre étude permettra de prouver que la colle biologique est aussi efficace que le manchonnage veineux dans la prévention des névromes. Si l'étude tend vers une preuve d'efficacité, nous souhaiterions réaliser dans les suites une étude clinique chez l'Homme, afin de développer davantage cette technique et obtenir si cela est possible une autorisation de mise sur le marché (AMM) dans cette indication.

Procédures

Il y a 3 interventions : - La première intervention est la chirurgie de lésion du nerf sciatique droit (J0). Chaque chirurgie sera sous anesthésie générale sous ventilation durera 40 minutes. - La deuxième intervention correspond aux tests fonctionnels sensitivomoteurs, ils seront réalisés à trois temps différents (J15, J30 et J90), chaque test durera environ 20 minutes. - La troisième intervention est l’évaluation électrophysiologique du nerf sciatique droit avec abord chirurgical, réalisée sous anesthésie générale sous ventilation et qui ne devra pas excéder 15 minutes ; suivi du prélèvement du nerf sciatique afin de réaliser l’analyse histologique sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La section du nerf sciatique droit entraîner une perte des fonctions motrices du membre inférieur ainsi qu’une perte sensitive allant jusqu’à la patte. Il y aura ainsi des difficultés à se mouvoir avec perte de fonction du biceps fémoral et du muscle gastrocnémien, engendrant des difficultés pour se déplacer, un stress, une possible atrophie du membre inférieur, ainsi qu'une douleur post-opératoire. Théoriquement, il est aussi possible que l'animal ressente une gêne locale liée à des paresthésies. Il est également possible que dans les suites post-opératoires, les animaux s'infligent une automutilation, du fait de la douleur mais également par la gêne occasionnée par une membre non fonctionnel. Néanmoins il n'est pas possible de quantifier la durée de ces effets. Les tests comportementaux pouvant également engendrer un stress à l'animal, nous placerons les rongeurs dans la pièce afin de s'y acclimater, et il sera réalisé des tests d'habituation pour chacun des tests comportementaux lorsque les animaux ne seront pas lésés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sans réveil afin de récupérer leur nerf sciatique droit. Le nombre total de fibres myélinisées par coupe ainsi que la taille moyenne des fibres et de la gaine de myéline sera mesuré et comparé selon les différents groupes afin de voir les différences entre les traitements. On effectuera différents marquages afin de comprendre la modulation de la cicatrisation nerveuse.

Remplacement

mécanisme physiopathologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. La preuve de la qualité de la restitution de la fonction nerveuse ne peut être attestée qu'en analysant un comportement sensori-moteur : le nerf sciatique est un nerf mixte dont la section représente très bien la complexité d'un rebranchement nerveux (problématique de la syncinésie). Une méthode alternative telle que le "nerve-on-chip" permettrait de tester l'activité de transmission du nerf mais pas de la fonction de transmission sensori-motrice. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammofères (i.e. invertébrés) ne permettrait pas d'obtenir des données permettant d'envisager une transition clinique directe. Le modèle utilisé ici présente une chirurgie très similaire à la chirurgie clinique de réparation (e.g. chirurgie de la main).

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante. Le nombre d’animaux a tout d’abord été évalué à partir des études précédemment réalisées au sein du laboratoire et retrouvé dans la littérature, et dont les statistiques avaient été établies pour réduire au minimum le nombre d’animaux opérés. Les tests fonctionnels seront réalisés à différents time point pour un suivi longitudinal de la cicatrisation nerveuse sans mise à mort des animaux. L'opération est très bien tolérée par les animaux et n'occasionne pas de mortalité. Les protocoles ont été déterminés de manière à réaliser une étude longitudinale afin que chaque animal réalise un maximum d’analyses, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Les statistiques ont été réalisées via un logiciel. Le calcul du nombre de sujets nécessaires a été réalisé en comparant deux proportions binomiales, selon une proportion théorique de 0,30 (soit 30% de névrome observé chez l’homme), et une proportion observée supposée de 0,50, avec un test unilatéral. On considère un risque de première espèce alpha de 5% et une puissance de 90%. De plus, la technique chirurgicale étant déjà acquise via l’obtention du diplôme de microchirurgie réalisé sur les rats, cela permet de s’affranchir de la procédure d’apprentissage et donc de réduire au maximum le nombre de rats à utiliser dans ce protocole.

Raffinement

L’ensemble des procédures chirurgicales se déroulera sous anesthésie générale accompagnée de dérivés morphiniques. Une analgésie avec application locale de xylocaïne sera réalisée avant toute incision de la peau. Les rats seront hébergés par trois dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE), placés sous un cycle jour/nuit 12/12h avec accès illimité à l'eau et la nourriture, et avec un milieu enrichi. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire, de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, ...) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales, seront minutieusement surveillés et permettront de contrôler l’absence de souffrance, en complément de l’examen du comportement de l’animal (agitation, prostration). Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux biquotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Dans le cas de l'atteinte d'un point limite, une mise à mort anticipée sera réalisée. L’injection d’antalgiques sera effectuée à titre systématique dans les premiers jours suivant la chirurgie considérée comme algogène. Des compléments seront effectués en fonction de l’évaluation de la douleur selon les éléments suscités. Les conditions d'hébergement, de soins, d’antalgie et les méthodes utilisées seront adaptées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse durables que pourraient ressentir les animaux. Avant chaque expérimentation, chirurgicale ou comportementale, les animaux sont placés dans la pièce dédiée afin de s'y acclimater. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrières.

Choix des espèces

Le rat appartient au groupe mammifère le plus proche phylogénétiquement des primates : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies nerveuses et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux est similaire à celle de l’Homme. Le nerf sciatique du rat est un modèle proche des nerfs digitaux chezl'Homme et un animal résistant sur le plan physique (résistance aux infections, survie) permettant un moindre risque de pertes en cours de projet et donc de mise à mort supplémentaire d’animaux versus perte de puissance statistique. Les techniques de lésion de nerf sciatique sont aujourd'hui bien définies pour le rat et les études fonctionnelles sont facilement mises en place. Les études actuelles sur la régénération axonale du nerf sciatique sont essentiellement réalisées sur modèles murins, permettant à notre étude d’être comparable à celles de la littérature. Selon les données de la littérature et les études réalisées précédemment dans le laboratoire sur la régénération nerveuse, les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 2 mois, ce qui correspond à un stade adulte ayant déjà atteint une maturité de leur structure nerveuse.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite de la leishmaniose viscérale par injection intrapéritonéale, puis reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours de molécules candidates. Le porteur indique que la voie d'administration peut provoquer des réactions au point d'injection et prévoit de tuer toutes les souris pour prélever leur foie et leur rate. Il affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la leishmaniose dans sa complexité, ce qui rend selon lui l'expérimentation animale 'incontournable'.

Objectifs

Leishmania infantum est un de agents majeurs des leishmanioses viscérales (avec L. major). Les leishmanioses viscérales (LV), également appelées kala-azar, sont mortelles dans plus de 95% des cas en absence de traitement. Elles se caractérisent par des poussées irrégulières de fièvre, une perte de poids, une hépatosplénomégalie et une anémie. La plupart des cas sont observés au Brésil, en Afrique de l’Est et en Inde. On estime que 50 000 à 90 000 nouveaux cas de LV surviennent chaque année dans le monde et que seuls 25% à 45% de ces cas sont notifiés à l’OMS. Les LV demeurent l’une des principales maladies parasitaires à haut potentiel d’épidémie et de mortalité. En 2018, plus de 95 % des nouveaux cas signalés à l’OMS provenaient de 10 pays : Brésil, Chine, Éthiopie, Inde, Iraq, Kenya, Népal, Somalie, Soudan et Soudan du Sud. La leishmaniose viscérale est endémique dans la Région Européenne (au sens de l’OMS), en 2018, plus de 200 cas y ont été signalés (pour l’essentiel sur le pourtour méditerranéen). Ce nombre augmente, en parallèle aux pressions migratoires et au réchauffement climatique et par ailleurs une forte prévalence est retrouvée chez les canidés domestiques dans le pourtour méditerranéen. Le traitement de la leishmaniose dépend de plusieurs facteurs, parmi lesquels la forme de la maladie, les affections concomitantes et l’espèce parasitaire. La leishmaniose est une maladie qui peut être traitée et guérie, mais qui requiert un système immunitaire compétent car les médicaments n’éliminent pas entièrement le parasite de l’organisme, ce qui induit un risque de rechute en cas d’immunosuppression. Par ailleurs, les traitements de choix ont une forte toxicité. Des résistances aux traitements courants se développent progressivement dans les zones d’endémie. Les besoins pour de nouvelles molécules actives sont donc pleinement justifiés. Avant toute tentative de maturation de telles molécules vers un nouveau médicament à usage humain ou vétérinaire, il est indispensable, au-delà des essais in vitro, d’avoir des données de bases sur leur activité in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet envisagés à long terme sont de : - Permettre le développement d’un médicament vétérinaire capable de traiter les animaux de compagnie (leishmaniose canine en particulier), servant de réservoir parasitaire et présentant donc un risque zoonotique de transmission humaine opportuniste, particulièrement dans les départements français de l’arc méditerranéen. - Permettre le développement d’un médicament à usage humain permettant d’améliorer le traitement de maladies parasitaires rares et négligées. - Permettre de mettre à jour une molécule tête de série pour le développement de dérivés d’hémisynthèse (molécules naturelles modifiées par synthèse chimique afin d'améliorer leurs propriétés pharmacodynamiques et/ou pharmacocinétiques) encore plus actifs, à l’instar de la benzyl pénicilline, tête de série de toutes les pénicillines et céphalosporines utilisées comme antibiotiques humains et animaux depuis des décennies.

Procédures

Tous les animaux infestés recevront l'inoculum de parasites par voie intrapéritonéale (100 microL) en 1 seule injection sur environ 1 min d'intervention. Tous les animaux traités le seront par injection intrapéritonéale (100 microL) à raison d'1 injection par jour durant environ 1 min et ce, pendant 10 jours. Les animaux témoins, c'est-à-dire non infestés et non traités, ne subiront aucune intervention.

Impact sur les animaux

La voie d'administration, intrapéritonéale, est susceptible d'engendrer des réactions au niveau du point d'injection (dépôts de fibrine).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leur foie et leur rate postmortem.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude est envisagé après de nombreuses études réalisées in vitro sur ces 2 molécules (tests sur lignée d'amastigotes axéniques de Leishmania infantum, modèle in vitro de leishmanies intramacrophagiques, tests sur macrophages, et lignées cellulaires cancéreuses (HepG2) et non cancéreuses (cellules VERO). Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la leishmaniose dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour l’analyse statistique appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Par ailleurs, uniquement 2 molécules (1 molécule naturelle et 1 molécule de synthèse) actives in vitro, sélectionnées à partir de 2 projets de recherche différents, seront testées afin de mutualiser les groupes de souris contrôle (1 groupe non traité non infesté, 1 groupe infesté non traité et 2 groupes infestés et traités par 2 doses de traitement de réference, soit au total une réduction de 20 souris comparativement à 2 essais in vivo indépendants). De plus, le fait de tester le traitement de référence sur ce modèle lors de la phase préliminaire, permettra, en cas d'inefficacité dudit traitement, d'avorter l'essai in vivo des molécules à tester.

Raffinement

Les méthodes d’analyses choisies permettent l’étude simultanée d’un grand nombre de paramètres (paramètres cliniques (scores de poids, et de comportement) et charge parasitaire mesurée par 2 techniques). Ceci conduit à réduire la variabilité expérimentale et le nombre de techniques à réaliser, donc le nombre d’animaux à utiliser. Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit. Le bien-être animal sera donc une priorité mise en oeuvre par le suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de zootechnie qui évaluera l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, comportement, prostration, perte de poids, piloérection, présence de blessures). L'enrichissement et le développement de l'aspect social du groupe seront ménagés. L'expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé de l'animal selon les points limites et les critères d'arrêt définis dans les procédures afin de limiter la douleur, la souffrance ou l'angoisse de l'animal. Par ailleurs, le modèle proposé (évaluation de l’activité des molécules 18 jours après l’inoculation), permet de ne pas entrainer l’apparition de symptômes (hépato-splénomégalie, anorexie, asthénie) douloureux pour les animaux. En effet, en l'absence de traitement, les symptômes apparaissent 30 à 45 jours après inoculation, la leishmaniose étant une parasitose chronique. Lors du sacrifice, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours, ainsi que le matériel traité non consommé, seront conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible au collectif, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Par exemple, les prélèvements sanguins effectués pourront servir à l'évaluation pharmacocinétique des molécules testées.

Choix des espèces

Dans le cadre de la confirmation, in vivo, de l’efficacité de molécules actives sur les leishmanies, l’utilisation de souris, qui ne sont pas l’hôte usuel de ces parasites, est consensuelle dans la collectivité scientifique. Les souris utilisées seront des souris balb/c femelles en raison de leur moindre agressivité, diminuant ainsi le stress des animaux. Les souris sont utilisées entre 6 et 10 semaines d’âge (ou environ 20-25 g pour une souris). C’est le meilleur compromis pour la qualité de l’inoculation et la présence d’un système immunitaire mature.

1500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant huit semaines, elles subissent chaque jour un stress de contention, olfactif, social, environnemental ou une perturbation de leur rythme circadien, pour reproduire un état dépressif et tester des molécules. Le porteur présente le projet comme une prestation offerte à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques pour la validation in vivo de leurs molécules, et prévoit de tuer les souris par dislocation cervicale afin d'analyser leur intestin et leur cerveau. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire l'état dépressif.

Objectifs

Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte environ 12% des hommes et presque 20% des femmes. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables (troubles du sommeil par exemple). De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression est associée une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu'une dysbiose du microbiote intestinal. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.

Procédures

Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le groupe G2 subira ces stress pendant 8 semaines. Le groupe G3 subira le protocole de stress pendant 8 semaines associé à un traitement antidépresseur connu. Les souris du groupe G4 subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple).

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu sur le groupe contrôle (non-CUS - G1). Les souris des groupes CUS (G2, G3 et G4) seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Le groupe G3 aura en plus un traitement antidépresseur. Ce groupe devrait avoir un aspect du poil bien entretenu. Ce traitement antidépresseur chez la souris n'est pas connu pour engendrer d'effet indésirable quelconque. Les souris du groupes G4 qui seront traitées avec des molécules à tester seront des molécules de type probiotiques ou prébiotiques ou compléments alimentaires ne faisant pas l'objet d'une quelconque dangerosité pour l'animal.

Devenir

Les souris seront ensuite euthanasiées par dislocation cervicale afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.

Remplacement

Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris C57BL/6J est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. L'accumulation de ces stress qualifie cette procédure de modérée. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.

Choix des espèces

La souris C57BL/6J est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).

Selon les lots, des souris reçoivent deux fois par semaine dans l'abdomen un agent qui provoque une fibrose du foie, un régime gras de 4 ou 12 semaines, une injection de bactéries, une injection de virus pour rétablir l'expression d'un gène ou une chirurgie pour injecter des cellules dans un vaisseau, et presque toutes une prise de sang de 500 microlitres sous anesthésie, "avec ouverture de la souris". 5 235 souris vont être utilisées, dont des souris de 20 à 24 mois, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la déclaration les classe toutes en souffrance modérée, y compris le lot opéré "sans réveil". Le porteur cite une prise de poids qui peut limiter la mobilité des souris soumises au régime gras et une perte de poids sous l'agent qui agresse le foie, puis affirme que la fibrose, la cirrhose et le foie gras ainsi provoqués sont "indolores" et "n'affectent pas l'état général des souris". Pour les infections bactériennes, il juge les périodes d'observation "trop courtes pour causer des souffrances".

Objectifs

Le vieillissement de la population mondiale est un problème de santé publique majeur. À mesure que les gens vieillissent, de nombreux organes de leur corps commencent à fonctionner moins bien, ce qui augmente le risque de maladies liées à l'âge. Une des choses qui se passe lorsque nous vieillissons, c'est que la paroi de notre intestin devient plus perméable, ce qui provoque une inflammation dans tout notre corps, un phénomène que l'on appelle "inflammaging". Cette inflammation est impliquée dans de nombreuses maladies qui surviennent avec l'âge, notamment les problèmes de foie et les infections. Le foie joue un rôle essentiel dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité, car il filtre le sang provenant de l'intestin et contient des cellules spéciales qui combattent l'inflammation. Cependant, le foie lui-même peut être affecté par le vieillissement, ce qui peut contribuer à l'inflammation générale dans le corps et au développement de maladies liées à l'âge. Des recherches récentes ont montré que, chez la souris, le foie est l'organe qui accumule le plus de cellules "vieillissantes" au fil du temps. Parmi les cellules du foie, les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins semblent être particulièrement touchées par ce processus de vieillissement. L'objectif de ce projet de recherche est d'étudier comment le vieillissement des cellules du foie affecte les maladies liées à l'âge, en mettant l'accent sur les infections et les problèmes de foie comme la stéatohépatite non alcoolique (NASH, maladie du foie gras) et la fibrose. À terme, cette recherche pourrait aider à développer de nouvelles thérapies qui ciblent spécifiquement le foie pour lutter contre l'inflammation liée à l'âge et prévenir certaines maladies liées au vieillissement.

Bénéfices attendus

L’impact du vieillissement du foie, en particulier des cellules endothéliales et des hépatocytes (cellules majoritaire du foie), sur les maladies liées à l’âge, n'a pas encore été étudié. Les maladies chroniques du foie sont très courantes, avec environ 700 000 cas de maladie hépatique sévère (cirrhose) estimés en France. La stéatohépatite non alcoolique (maladie du foie gras) est l'une des principales causes de ces maladies, mais il n'existe actuellement aucun traitement efficace. De manière plus générale, les mécanismes sous-jacents à l'évolution des maladies du foie vers la cirrhose et ses complications, notamment le cancer du foie, demeurent mal compris. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques. Ce travail se distingue par son choix de se concentrer sur les deux populations cellulaires les plus touchées par le vieillissement dans le foie. Le foie joue un rôle clé dans la gestion des agents pathogènes circulants du système digestif, les interactions avec le système immunitaire et la régulation de l'inflammation générale. En identifiant les altérations des processus immunitaires résultant du vieillissement et susceptibles d'augmenter la vulnérabilité aux infections et aux maladies du foie, il devient possible d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. De plus, le foie étant un organe facilement accessible, cela ouvre des perspectives prometteuses en termes de futurs traitements.

Procédures

Les procédures seront réalisées sur des lots d’animaux : - Un lot d’animaux subira une chirurgie sans réveil avec anesthésie générale afin de récupérer les cellules du foie et de les analyser. (15 minutes). - Un lot d’animaux subira une chirurgie avec anesthésie générale et réveil afin d'injecter des cellules dans un vaisseau (20minutes). - Un autre lot d’animaux subira une inoculation de virus afin de rétablir l'expression d’un gène (10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris recevra une injection de bactéries afin d'étudier l'effet du vieillissement du foie sur la lutte contre l’infection.(10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris sera soumis à un régime gras pendant 4 ou 12 semaines. - Un lot de souris subira des injections 2 fois par semaine dans le ventre d’un agent induisant une fibrose hépatique (10 secondes avec contention de la souris). Pour presque toutes les procédures, les animaux auront un prélèvement de sang (500 µl) sous anesthésie générale. (10 minutes avec ouverture de la souris et prélévement de sang)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : * Pour les modèles d'infections bactériennes, il est important de noter que les périodes d'observation sont trop courtes pour causer des souffrances aux animaux, comme cela a été démontré dans de récentes études. Cependant, en cas d'effets indésirables, ils se manifestent généralement par une légère fièvre. * Dans le modèle de régime riche en graisses (modèle de la maladie du foie gras), les effets sur les souris incluent une prise de poids importante, ce qui peut limiter leur mobilité, ainsi qu'une croissance accrue des dents. De plus, le changement initial de régime alimentaire peut causer du stress aux souris pendant les premiers jours. * En ce qui concerne le traitement avec un agent agressant le foie, il peut initialement entraîner une perte de poids chez les souris, suivie d'une reprise de poids. Parmi les autres effets indésirables possibles, on peut citer des douleurs temporaires lors de l'injection intrapéritonéale (dans le ventre) et un éventuel stress initial lié à la nouveauté de la procédure, qui devrait diminuer avec le temps. * Il est essentiel de noter que la fibrose hépatique ou la cirrhose induite par l'agent agressant le foie et la maladie du foie gras induite par le régime riche en graisses sont indolores et n'affectent pas l'état général des souris, comme cela a été confirmé dans d'autres études, en accord avec notre propre expérience.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'étudier les organes et notamment le foie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier l'impact du vieillissement du foie sur l'ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui touchent les personnes âgées, qui sont plus sensibles que les personnes jeunes (infections virales telles que la COVID-19 ou la grippe, ou infections bactériennes telles qu'E. Coli). Des expériences in vitro (sur des cellules) seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. En revanche, pour étudier l'effet du foie sur le développement des infections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal. Les modèles animaux permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, comme celles que nous proposons.

Réduction

Malheureusement, il n'existe pas de cellules saines commerciales à prolifération illimitée (cellules immortalisées) permettant de se passer du modèle animal. Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables grâce à des outils statistiques. Les groupes seront mixtes (autant de mâles que de femelles). Travailler sur des souris provenant d'une même lignée permettra d'éviter les différences de réaction dues à la variation entre chaque individu et ainsi permettra de limiter le nombre de souris.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par le personnel technique de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (bâtonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien-être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. Des points limites représentant un seuil de douleur inacceptable adapté à chaque procédure ont également été définis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce (ici, la souris) permet d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence le rôle ou l'implication d'un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l'âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps...) nécessaires à cette étude. Enfin, les infections bactériennes et les maladies hépatiques étant des maladies multifactorielles, la proximité de la souris vis-à-vis de l'Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables inhérentes à l'espèce animale utilisée. S’agissant d’un projet sur le vieillissement, les souris non mutées seront utilisés à deux âges : - entre 20-24 mois pour être représentatif de patients de plus de 75 ans = « âgés » - des souris de 3 mois pour les controles « jeunes ». Pour les modèles génétiquement modifiés, ils reflétent un vieillisement accélérés seulement dans les cellules que l'ont souhaite étudier et le début des protocoles se fera à partir de 6 mois car il a été montré dans la littérature que ces souris montrent un vieillissement acceleré à partir de 6 mois.