Rongeurs

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par Staphylococcus aureus en intraveineuse, puis reçoivent des composés par voie intrapéritonéale chaque jour pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang répétés à la queue sur animal vigile, pour tester de nouvelles molécules antibactériennes. Le porteur suit la survie des animaux et indique que les injections et prélèvements provoquent une douleur légère et un stress lié à la contention. Il justifie le recours à la souris par un nombre croissant de souches résistantes qui font de la recherche de nouvelles molécules un "véritable challenge thérapeutique".

Objectifs

Staphylococcus aureus est une bactérie à la fois commensale et pathogène opportuniste. C’est l’une des bactéries le plus souvent isolée à partir de prélèvements sanguins et d’infections invasives. L’incidence annuelle des bactériémies à Staphylococcus aureus (BSA) dans la population générale est évaluée à 28 pour 100 000 en Europe avec un taux de létalité variant de 22 à 26%, et la BSA est un facteur de mauvais pronostic au cours des pneumonies nosocomiales à Staphylococcus aureus. Également, les infections ostéoarticulaires à Staphylococcus aureus sont caractérisées par un risque élevé d’échec thérapeutique, de séquelles, et de morbidité à long terme. En effet, si un traitement antibiotique existe contre les infections à Staphylococcus aureus, on observe un nombre croissant de souches résistantes (10 à 40 % des cas de BSA) faisant de la recherche de nouvelles molécules actives contre ce type d’infection un véritable challenge thérapeutique. Dans le cadre d’une collaboration, nous avons identifié un certain nombre de nouveaux composés de synthèse ayant une forte activité antibactérienne contre différentes espèces de bactéries parmi lesquelles Staphylococcus aureus. Le but de ce projet est donc de confirmer les résultats obtenus in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus dans un modèle murin d’infection.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est la recherche de nouveaux traitements contre les infections à Staphylococcus aureus. S’il existe un traitement antibiotique de référence contre ce type d’infection, de plus en plus de souches résistantes apparaissent, et la découverte de nouveaux traitements constituerait une avancée significative dans le traitement de ces infections.

Procédures

Les souris seront infectées une fois par voie intraveineuse, puis traitées une fois par jour pendant 5 jours par voie intrapéritonéale avec les composés à tester. Des prises de sang seront effectuées sur les souris vigiles par prélèvement de 5 microlitres dans la veine caudale, 4h, et 1, 2, 3, 5, 7 et 10 jours post infection. Nous utiliserons des doses infectantes déterminées par ailleurs. Les animaux infectés seront traités avec les composés chimiques sélectionnés et la survie des animaux sera suivie au cours du temps et comparée avec des animaux traités avec une solution saline.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront au cours de ce projet une injection intraveineuse et des injections intra péritonéales répétées (une fois par jour pendant 5 jours) ainsi que plusieurs prises de sang par incision de la veine caudale. Tous ces actes entrainent une douleur légère et un stress dû à la contention.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure. Ces animaux ayant été infectés, il n’est donc pas possible de les réutiliser, de les replacer ou de les adopter.

Remplacement

Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cultures de Staphylococcus aureus et les concentrations minimales inhibitrices déterminées pour chaque composé actif contre cette bactérie. Nous devons maintenant vérifier que cet effet observé sur des bactéries en culture se retrouve dans un modèle d’infection in vivo. Dans un souci de remplacement et de raffinement, des tests de toxicité sur cellules nous ont permis de déterminer les doses de chaque composé n'entrainant pas de mort cellulaire. Ce sont ces doses qui seront utilisées dans ce projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux le plus restreint possible nous permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre sera calculé en tenant compte de nos résultats précédents.

Raffinement

En termes de raffinement, les animaux seront réceptionnés à l’animalerie une semaine avant le début des expériences pour adaptation et hébergés par groupe de 5 dans un environnement enrichi (igloo et baguette en papier). Les animaux seront surveillés quotidiennement et à chaque intervention par les responsables du projet. En cas d’apparition de signes de souffrance et/ou de lésions, la surveillance serait renforcée et les plaies désinfectées. En cas de persistance de l’un ou l’autre de ces signes au-delà de 24h, le ou les animaux concernés serai(en)t immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis-à-vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour être dans les mêmes conditions que nos travaux antérieurs.

228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie provoquant un infarctus, des échographies cardiaques sous anesthésie et des injections intra-myocardiques et intraveineuses, avec des risques de perforation de l'oreillette et d'hémorragie oculaire, pour tester l'effet de lymphocytes T régulateurs sur une greffe de cellules cardiaques. Les retombées annoncées pour les personnes en insuffisance cardiaque restent renvoyées au conditionnel et à une étape préclinique. Sur le remplacement, le porteur affirme que les alternatives sont impossibles et conclut que le recours à la souris est "indispensable" pour étudier les interactions entre système immunitaire et cœur.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d’étudier des lymphocytes T régulateurs et des cellules progénitrices cardiaques dans le contexte de la transplantation de cellules cardiaques différenciées à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Nous cherchons à comprendre comment les Lymphocytes T régulateurs influencent la réponse immunitaire et la récupération cardiaque. Cette recherche est essentielle pour évaluer les avantages potentiels de la thérapie régénérative cardiaque et constitue une étape pré-clinique avant d'envisager des applications cliniques chez l'homme pour traiter l'insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'améliorer les traitements cardiaques en utilisant des cellules cardiaques progénitrices pour réparer le cœur endommagé. Pour y parvenir, nous explorons comment ces cellules peuvent devenir plus efficaces en renforçant la tolérance du système immunitaire. Pour ce faire, nous intégrons les cellules régulatrices T, qui jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'équilibre du système immunitaire. Nous comparons les cellules régulatrices T humaines et murines afin de déterminer la source la plus efficace. En utilisant des méthodes visant à favoriser la tolérance immunitaire, notre objectif est de réduire les risques de rejet des cellules progénitrices cardiaques et d'améliorer leur survie. En résumé, nous espérons renforcer la réparation du cœur endommagé, notamment dans un modèle animal d'insuffisance cardiaque (chez des souris), en utilisant ces cellules spéciales de manière mieux acceptée par le corps, ce qui pourrait entraîner une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Les animaux participant à ce projet seront soumis à plusieurs types d'interventions. Tout d'abord, une intervention chirurgicale sera réalisée pour induire un infarctus cardiaque, avec une durée de 15 minutes par souris. De plus, des échographies cardiaques sous anesthésie générale seront effectuées pour évaluer la fonction cardiaque, avec une durée de 5 minutes par souris. Les animaux recevront des injections intra-myocardiques quatre semaines après l'induction de l'infarctus, avec une durée de 10 minutes par injection. Les injections seront administrées par voie intraveineuse le même jour que les injections intra-myocardiques et à nouveau trois jours plus tard, avec une durée de 30 secondes par souris pour chaque injection. Ces interventions visent à évaluer les effets sur la récupération cardiaque. L'ensemble du planning expérimental s'étend sur sept semaines, avec des évaluations et des injections à des moments spécifiques pour suivre de près les effets sur la récupération cardiaque. Toutes les procédures sont conçues pour minimiser les souffrances des animaux et garantir leur bien-être.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues causées à la chirurgie cardiaque peuvent se manifester par divers symptômes, notamment des douleurs postopératoires, un risque accru d'infection et une réduction de la fonction cardiaque. De même, l'insuffisance cardiaque peut entraîner des symptômes tels que la fatigue, la dyspnée et la faiblesse. Par ailleurs, les injections de cellules et les procédures d'anesthésie peuvent générer des douleurs et du stress chez les animaux. Il est important de noter que les injections intra-myocardiques comportent des risques, tels que la perforation de l'oreillette. De plus, l'injection rétro-orbitaire peut entraîner une hémorragie oculaire. Toutes ces contraintes seront attentivement surveillées, et des mesures seront mises en place pour minimiser la souffrance des animaux et garantir leur bien-être.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'échographie post-traitement, sept semaines après la chirurgie d'induction de l'infarctus aigu du myocarde. Cette décision est prise afin de collecter et d'analyser plusieurs organes et le sang de chaque animal. Cette approche nous permettra d'obtenir des données plus complètes pour le objective de l'étude. La mise à mort à ce stade garantissant que les animaux ne souffrent pas inutilement et que toutes les données nécessaires sont recueillies pour atteindre nos objectifs de recherche.

Remplacement

Nous utilisons des souris dans notre projet pour des raisons essentielles qui rendent les alternatives impossibles. Notre modèle de l'infarctus du myocarde reproduit fidèlement les caractéristiques cliniques de cette pathologie cardiaque, ce qui est crucial pour des résultats pertinents applicables en clinique. En outre, l'observation à long terme des effets de l'insuffisance cardiaque nécessite une période prolongée, difficile à réaliser en laboratoire. Les modèles animaux permettent un suivi détaillé de la maladie et des interventions thérapeutiques sur une période prolongée. Enfin, pour étudier les interactions complexes entre différents systèmes biologiques, comme le système immunitaire et cardiovasculaire, nous avons besoin d'organismes vivants. Bien que nous effectuerons certaines étapes in vitro pour évaluer les effets immuno-inhibiteurs des lymphocytes T régulateurs, l'utilisation d'animaux est indispensable pour atteindre nos objectifs de recherche et développer de nouvelles approches thérapeutiques pour l'infarctus du myocarde.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d'animaux requis en utilisant une méthode statistique (calcul de la taille de l'échantillon) pour assurer des résultats significatifs et fiables, en se basant sur des tests visant à démontrer l'efficacité de nos traitements. En prenant en compte aussi des facteurs tels que la mortalité après l'infarctus pouvant atteindre 30% et le risque de perte des animaux, y compris après les injections intra-myocardiques, nous avons abouti à la décision d'inclure 57 animaux par groupe. Cela nous donnera un total de 228 souris pour notre étude. De plus, pour optimiser l'utilisation des animaux et réduire le nombre nécessaire, nous prévoyons de collecter et d'analyser plusieurs organes de chaque animal. Cette approche nous permettra d'obtenir des données plus complètes tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans l'étude.

Raffinement

Pour limiter la douleur et la souffrance des animaux, l’ensemble des procédures sera effectué sous anesthésie générale et les souris seront surveillées via une grille d’évaluation, avec des points limites définis, afin de pouvoir prendre en charge précocement toute douleur ou souffrance selon les scores obtenus. Des antalgiques sont prévus et un niveau de souffrance trop élevé entraînerait la mise à mort anticipée de l'animal sous anesthésie profonde. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté c’est-à-dire avec des congénères et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (abris et substrats pour la construction de nids).

Choix des espèces

Pour évaluer le potentiel thérapeutique des lymphocytes T régulateurs et des cellules cardiaques progénitrices sur la fonction cardiaque, nous devons utiliser un modèle animal. Les souris, en raison de leur système cardiovasculaire similaire à celui de l'humain, sont couramment utilisées pour les tests précliniques évaluant l'effet des traitements. Notre projet constitue une étape essentielle avant toute application clinique chez l'homme de ces approches thérapeutiques. Les souris de la souche plus couramment utilisée C57BL/6J, sont introduits dans notre animalerie vers l'âge de 10 semaines et y restent pendant une semaine pour s'acclimater. Nous réalisons nos expérimentations sur des animaux âgés de 11 à 12 semaines. Cette période a été choisie car, à cet âge, le cœur des rongeurs est suffisamment développé pour supporter des procédures chirurgicales telles que la thoracotomie et l'induction de l'infarctus du myocarde. De plus, le cœur des rongeurs de cet âge présente des capacités limitées de régénération spontanée, contrairement à celui des très jeunes rongeurs qui peuvent régénérer complètement leur cœur.

201 souris vont être utilisées, dont 153 tuées à l'issue et 48 transférées vers d'autres projets, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale sous anesthésie, précédée pour certaines d'une biopsie de la queue, avec des risques chirurgicaux, d'hypothermie et de douleur. Le projet évalue une nanomolécule contre la neuro-inflammation d'une leucodystrophie infantile. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier l'effet sur un "cerveau entier" symptomatique.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une dégradation très rapide dans les 6 mois suivant les premiers symptômes et un décès des patients dans les deux ans au maximum. De nos jours la majorité des patients atteints de leucodystrophie metachromatique sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques. Une composante particulière de la MLD est la neuro-inflammation que développe les patients et qui est présente aussi dans le modèle murin de la pathologie. Dans ce contexte, nous proposons de mener ce projet de recherche qui a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la neuro-inflammation chez les patients MLD symptomatiques. L’évaluation de l’efficacité de la thérapie sera conduite In vivo dans un modèle de souris préclinique de MLD déjà connu. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec mise en place de critères précis d’interruption. Au total le projet utilisera 201 souris au maximum.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle nanomolécule développé par un collaborateur sur la neuroinflammation dans un modèle symptomatique de la leucodystrophie métachromatique pour pouvoir par la suite proposer une mise à disposition chez les patients atteints de leucodystrophie métachromatique.

Procédures

Une partie des souriceaux produits pour nos lots expérimentaux auront un prélèvement de 2mm de queue pour génotypage, l'acte est réalisé une fois, sur animal vigile, et dure environ 1minute par animal. Les animaux des lots expérimentaux recevront une injection intracérébrale (durée 40min) sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront euthanasiés 5 ou 15jours après l’injection, par une methode reglementaire.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : - une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage - un risque cardio-respiratoire et hypothermique durant l’anesthésie - un risque chirurgical (anesthésie, hypothermie, déshydratation, hématome, douleur, non récupération de la vigilance,) lors de la procédure d’injection intracérébrale par stéréotaxie (craniotomie ciblée avec ouverture minime au site d’injection, d’un unique trou limité à un diamètre d’une aiguille 26G). - un stress de l'animal lors de la contention. La mutation génétique du modèle n’entraîne que des modifications motrices tardivement dans des conditions de tests comportementaux particuliers, l’animal paraitra avoir un comportement normal dans l’enceinte de sa cage.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux injectés seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données de d’efficacité. Les animaux d’élevage seront maintenus au cours du projet jusqu’à l’âge de 12 mois maximum. Les animaux supplementaires générés pourront etre transférés pour d'autres projets pour respecter le principe de réduction.

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro pour étudier l’effet thérapeutique de ce composé sur un cerveau entier symptomatique. Ce composé a déjà été validé dans plusieurs pathologies par nos collaborateurs. Choisir la souris permet de collecter des données d’intérêt en terme d’efficacité dans ce modèle particulierement car il reproduit la neuroinflammation développée chez les patients.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 201 souris sera nécessaire pour l’évaluation de l’effet du composé dans ce projet. De façon général nos résultats seront analysés statistiquement avec un seuil de 5 pourcent.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et des soins adaptés. Les animaux seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité de mâles les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge) avec des maisonnettes rajoutées dans ce cas en plus de l’enrichissement classique. En terme de raffinement pour les croisements nous privilégions aussi les croisement entre homozygotes qui ne nécessitent pas de prélèvements pour le génotypage. Au moment de l'euthanasie, un sédatif sera administré à l'animal avant d'injecter le composé euthanasiant. La chirurgie réalisée au cours de ce projet sera faite sous anesthesie générale et locale, avec un protocole d’analgesie et un suivi quotidien post opératoire. . Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. La lignée que nous utilisons dans ce projet développe des modifications motrices après l’âge de 18 mois, ainsi afin d’éviter l’apparition de ces signes nous euthanasierons nos animaux avant l’âge de 16 mois.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la leucodystrophie métachromatique (MLD) et surtout pour évaluer l’effet thérapeutique d’une nanomolécule. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car il s’agit de la seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD déficient. Ce modèle génétiquement modifié est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Les souris seront utilisées entre 12 et 15 mois pour les traitements à un stade symptomatique.

648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de maladie neurodégénérative, elles reçoivent un candidat médicament pendant plusieurs mois, par une pompe posée sous la peau ou un régime spécifique, avec des prélèvements sanguins mensuels et des tests comportementaux imposant isolement et jeûne. Le projet cherche à définir un schéma de traitement transposable à l'humain. Le porteur qualifie les atteintes de "nuisances légères" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les traits comportementaux de la maladie.

Objectifs

Notre projet vise à développer une thérapie contre une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié, et responsable de nombreux dérèglements physiologiques et moléculaires dans les neurones. En utilisant un système in vitro innovant, nous avons identifié qu’une molécule était capable de restaurer un des défauts moléculaires dans les neurones d’un modèle souris de la maladie. Cette étude a permis de démontrer que le traitement améliore les défauts moteurs et cognitifs de l’animal après 1 mois de traitement. Cette première étude nous a également permis de caractériser précisément le mécanisme d’action cellulaire et moléculaire du candidat médicament. Le projet, divisé en 2 procédures, a pour objectif d’identifier un schéma de traitement transposable à l’homme confirmant l’intérêt thérapeutique du candidat médicament.

Bénéfices attendus

Grâce à un système in vitro innovant, nous avons mis en évidence qu’une molécule était capable de restaurer un des défauts moléculaires dans les neurones de souris et de patients atteints par notre pathologie d’intérêt. Nous avons démontré avec des premiers résultats preuve de concept l’intérêt thérapeutique de la molécule dans un modèle souris mimant notre pathologie d’intérêt. Nous cherchons maintenant à définir les bénéfices d’un traitement long terme chez des animaux à différents stades d’avancement de la maladie, reflétant la situation chez les patients et permettant de définir le meilleur schéma de traitement à envisager dans des études cliniques. En parallèle, nous travaillons à la caractérisation du mode et du mécanisme d’action moléculaire associé au candidat médicament. Ces études sont fondamentales pour la construction d’une stratégie clinique cohérente puisqu’elles nous permettront de décider s’il est pertinent ou non d’initier le traitement avant le développement des symptômes chez les patients, mais aussi de définir une durée de traitement et une posologie (dose, nombre prise par jour) adaptées.

Procédures

Une partie des animaux seront traités pendant un mois grâce à un dispositif vétérinaire assurant une délivrance continue de la molécule sans douleur ni atteinte du bien-être animal. L’installation de ce dispositif nécessitera une chirurgie sous-cutanée de 5 minutes maximum par animal. L’autre partie sera traitée grâce à un régime à façon spécialement formulé correspondant au régime habituel des animaux dans lequel la molécule est intégrée. Toutes les souris seront traitées avec le régime à façon sur une durée maximale de 10 mois. Pendant toute la durée du traitement, un prélèvement mensuel de sang (5min/animal) sera effectué après le début du régime afin de vérifier que le médicament est bien passé dans le sang (entre 3 et 10 prélèvements au total en fonction des groupes). Enfin, des tests comportementaux (tests de 30 min max hormis pour 1 test réalisé sur 48h) destinés à étudier l’effet du traitement sur les comportements anxio-depressif et locomoteurs des animaux seront effectués.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé dans cette étude est un modèle largement utilisé dont le phénotype évoluera avec l’âge, occasionnant l’apparition de symptômes cognitifs et moteurs qui sont uniquement décelés à l’aide de tests comportementaux fins conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnement pas de perte d’autonomie, et pas de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer d’altérations significatives de la qualité de vie, ni de mort prématurée chez ces animaux dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères : 1/ une potentielle douleur de nature interventionnelle : induction potentielle d'une légère inflammation due à la mise en place d'une mini-pompe. 2/ une légère douleur due aux prélèvements sanguins mensuels. 3/ une gêne potentiellement attendue sur les animaux lors de l’expérimentation, à savoir l’induction d’un stress léger lors de certains tests comportementaux impliquant soit un isolement prolongé de 48h afin d’analyser l’activité et le métabolisme de l’animal, soit une mise à jeun de 24h afin d’analyser l’anxiété de l’animal.

Devenir

​​La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études immunohistochimiques et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.​

Remplacement

Nous avons précédemment démontré sur un modèle cellulaire in vitro que le candidat médicament permettait de restaurer les défauts de transports neuronaux, caractéristiques de la maladie neurodégénérative que nous étudions. Ces résultats nous ont permis de démontrer le potentiel thérapeutique de notre molécule. L’étape actuelle consiste donc à démontrer que ces restaurations du transport neuronal se traduisent en amélioration des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle in vitro ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.

Réduction

La procédure 2 sera réalisée uniquement si la procédure 1 est validée. Dans nos deux axes d’étude, nous prévoyons une analyse du comportement des animaux, suivi d’analyses post- mortem des cerveaux. Puisque nous avons observé que les résultats comportementaux pouvaient varier en fonction du sexe dans le modèle souris, tous les groupes seront composés de 50% d‘animaux mâles et 50% d’animaux femelles afin de pallier de potentielles disparités dans les résultats. Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’un test statistique d’estimation de la taille d’échantillon optimale grâce aux variances déterminées dans des études préliminaires de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Pour chacun des axes, dans l’éventualité où aucune différence significative n’est observée entre mâles et femelles, les animaux des deux sexes seront regroupés au sein d’un même groupe de traitement lors de l‘analyse des données afin d’augmenter la puissance des tests statistiques. Dans notre étude visant à caractériser l’efficacité du traitement à long terme à différents stades d’évolution de la maladie, nous ne prévoyons pas de traiter avec notre composé les animaux sains. En effet, nous avons déjà testé précédemment l‘effet de notre composé sur un nombre réduit d’animaux sains et nous n‘avons observé aucune toxicité, et aucune altération du comportement. Cela permet donc d‘éliminer plusieurs conditions expérimentales, dans un principe de réduction du nombre total d‘animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les cages seront équipées d’une litière stérile et d’un enrichissement permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard ou contenant le traitement, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec enrichissement et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Lors de la pose de mini-pompes sous-cutanées, la chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue pendant et après l’opération (administration d’analgésique et procédure sur tapis chauffant). Un supplément d'alimentation hypercalorique et hydratée fourni par l'animalerie sera ajouté lors du temps de récupération. Bien que la chirurgie soit peu invasive et très rapide (5 min), des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place. La formulation du régime à façon présente l’avantage majeur de ne pas avoir à manipuler les animaux pour les traiter limitant grandement le stress classiquement associé aux autres voies d’administration. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Après la chirurgie, la surveillance sera renforcée dans les heures suivant le réveil et le poids des animaux sera évalué chaque jour durant une semaine pour s’assurer que les souris récupèrent bien de la chirurgie.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de notre pathologie d’intérêt. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la protéine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les maladies neurodégénératives se développent dans la majorité des cas à l’âge adulte chez l’Homme. Le candidat médicament que nous développons est donc destiné à des adultes raison pour laquelle nous réalisons notre étude sur des animaux à l’âge adulte. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 ou 12 mois car c’est à partir de 6 mois qu’ils commencent à développer des troubles moteurs et cognitifs observables en étude de comportement.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une section chirurgicale du nerf facial suivie de la pose d'un conduit de régénération, ce qui provoque une paralysie faciale durant au moins un mois, avant une seconde anesthésie sans réveil pour prélever le nerf. Le projet évalue la capacité d'un conduit issu du cordon ombilical à réparer le nerf facial. Le porteur indique un risque de douleur, d'inflammation et d'abcès, et présente le rat comme un "modèle privilégié" en raison de sa proximité anatomique avec l'humain.

Objectifs

Le nerf facial (NF) est responsable de la motricité de l’hémiface correspondante. Il joue un rôle majeur fonctionnel dont l’atteinte est responsable d’une paralysie faciale entrainant des séquelles précoces (fonctionnelles et esthétique) et tardives (contractures musculaires, syndromes sécrétoires…). A ce jour, plusieurs techniques chirurgicales de réhabilitation sont utilisées dont le but est la récupération motrice des muscles de la face via une réinnervation après remise en continuité nerveuse. On peut citer les sutures péri nerveuses directes ou l’autogreffe de nerf périphérique. L'objectif est d'évaluer la capacité d'un conduit issu du cordon ombilical à permettre une régénération nerveuse du nerf facial.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont une récupération de la fonction faciale la plus optimale, dont l’analyse est basée sur des critères objectifs, grâce à la stimulation de la régénération nerveuse par conduit de régénération nerveuse issu de vaisseaux ombilicaux. L’objectif est d’obtenir des résultats sur le rat avant d’élaborer un programme de recherche clinique sur l’Homme.

Procédures

La procédure prévoit une première intervention de 45 minutes consistant en une section/résection chirurgicale du nerf facial et interposition d'un conduit de régénération nerveuse entre les deux sections de nerfs par suture directe sous anesthésie générale. Les rats seront ensuite réveillés et surveillés quotidiennement à l'animalerie avec accès libre à l'eau et la nourriture pour une durée de 8 semaines pour les 20 premiers et une durée de 16 semaines pour les suivants (nombre calculé sur la base de la 1ère phase d'expérimentation). Une seconde anesthésie générale permettra la réalisation de tests evaluant la récupération de la fonction du nerf facial. Le nerf facial régénéré sera ensuite prélevé pour analyse. Les rats seront ensuite euthanasiés, au cours de la même anesthésie générale.

Impact sur les animaux

- Anesthésie générale d'une durée de 45min nécessaire pour l'exposition du nerf facial, sa section et sa réparation. - Isolement des animaux pendant 3h après l'intervention pendant le temps du réveil et afin d'éviter toute mutilation de la cicatrice avec un congénère avant d'être remis à 2 par cage. - Paralysie faciale du rameau buccal du nerf facial induite par la procédure d'une durée minimale d'un mois, et dont la rapidité de récupération sera évaluée. - En cas de trouble de la cicatrisation de l'incision de la joue, les conséquences pourront être une douleur et un état inflammatoire local (rougeur, oedème, suintement, chaleur local), et pouvant aller jusqu'à l'abcès local.

Devenir

A l'issu de la première intervention, les animaux seront maintenus en vie et hébergés dans l'animalerie avec libre accès à l'eau et la nourriture. Cette période est nécessaire afin d'évaluer la récupération clinique de la fonction faciale au cours du temps par un score de mouvement des vibrisses. A la fin de la procédure, une anesthésie générale sans réveil sera réalisée puisque le prélèvement du nerf est nécessaire aux analyses histologiques.

Remplacement

Le principe de remplacement a été utilisé pour mettre au point la technique opératoire de suture du conduit de régénération sur le nerf facial. Ces conduits ont été utilisés et manipulés au préalable pour vérifier leur capacité de résistance aux fils de suture via des expérimentations préliminaires sur fil de silicone. La composition optimale de l'hydrogel a pu être déterminé au préalable afin d'éviter des échecs au cours des procédures chirurgicales sur les animaux. Afin d'évaluer la régénération nerveuse d'un point de vue fonctionnel clinique (score de mouvement des vibrisses), electrophysiologiques (enregistrement de l'activité nerveuse) et histologique (sur prélèvement complet de nerf), le modèle animal est nécessaire. Le rat est choisi du fait de sa proximité anatomique avec l'Homme concernant le nerf facial.

Réduction

Le principe de réduction est utilisé via la réalisation d'un protocole Go-no Go. En effet, à l'issue du premier "round" de 20 animaux, si une condition est jugée d'emblée innefficace, elle ne sera pas réutilisée lors du second "round", et le nombre de sujets nécessaires aura pu être calculé afin d'utiliser le nombre de rat minimal. Par ailleurs, les deux rameaux buccaux du nerf facial seront utilisés afin de réduire le nombre d'animaux utilisé. Une section et suture directe "enveloppée" par le conduit sera réalisée du côté droit. Une résection de 4mm de nerf facial et suture du conduit aux deux extrémités libres du nerf sera réalisée du côté gauche.

Raffinement

L'expérimentation sera réalisée dans le respects des textes réglementaires relatifs à la protection et à l'utilisation des animaux de laboratoire. Le projet s'inscrit dans une démarche éthique suivant la règle des 3R en optimisant les conditions de vie, d'hébergement et de soins des animaux. En post-opératoire immédiat les animaux seront isolés 3h le temps du réveil et afin d'éviter toute mutilation de la plaie opératoire avec un congénère. Puis, pour leur bien-être, les animaux opérés seront remis à deux par cage. Les soins prodigués aux animaux ainsi que les conditions d'hébergement (température, dimension cage, luminosité, bruit, enrichissement...) seront conformes à l'arrêté du 1er fevrier 2013 fixant les conditions d'hébergement des animaux utilisés à des fins scientifiques. Une évaluation des points limites selon l'échelle validée et transmise au comité éthique sera effectuée à 3h, 12h, 24h, 36h et 48h puis de manière quotidienne durant toute la durée de l'expérimentation. Un score supérieur ou égal à 7 implique la mise à mort de l'animal afin d'éviter toute souffrance inutile. Pour chaque rat, une analgésie locale en sous cutanée sera réalisée durant l'intervention puis en post opératoire toutes les 4h durant 5 jours.

Choix des espèces

L’anatomie du nerf facial du rat est comparable à celle de l’Homme. Par ailleurs, le rat possède un nerf facial de taille relativement importante compte tenu de sa taille, facilitant les procédures chirurgicales. L'accessibilité de ce nerf, chirurgicalement, est aisée puisque la branche buccale est située sous le tissu cutané. La paralysie engendrée par la section de la branche buccale du nerf facial n'empêche pas le rat de se nourir et est facilement évaluable cliniquement par le mouvement des vibrisses. Ce modèle animal en fait un modèle privilégié des travaux de recherche de la régénération nerveuse.

22 souris vont être utilisées, dont 20 tuées à l'issue et 2 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Partiellement immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome humain sous la peau puis deux examens d'IRM, avant que la tumeur ne soit prélevée après mise à mort. Le projet vise à valider des séquences d'IRM pour évaluer les tumeurs sans biopsie. Le porteur justifie la mise à mort par le risque infectieux lié au statut immunodéprimé et affirme que la mesure du flux sanguin est "impossible" sur cultures cellulaires.

Objectifs

Dans les sarcomes des tissus mous, pathologie rare, de mauvais pronostic, et touchant les humains et les animaux à tout âge, il n’existe aucun marqueur pronostic ni prédictif de réponse à la radiothérapie. Ce projet permettra de valider in vivo à la fois de nouvelles techniques IRM permettant une évaluation de la biologie tumorale et de son hétérogénéité, et de valider des méthodes de traitement d’image pour isoler des sous-populations tumorales et ainsi mesurer des marqueurs endogènes. Ces thématiques de recherche sont celles de l’équipe. Les résultats de ce projet préclinique seront directement utilisables chez l’Homme sans nécessité d’autre expérimentation animale, dans le cadre d’un protocole approuvé. De même, une translation ultérieure en soins vétérinaires chez le chat et le chien est envisagée dans le cadre d’un projet. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs, un établissement pour l’hébergement et l’autre pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra par ailleurs de relier les données d’IRM avec l’observation au microscope. Il est le préalable de projets cliniques chez l’Homme et en médecine vétérinaire afin d’utiliser ces mêmes séquences IRM, dans le but de prédire la réponse aux traitements et pouvoir poser des diagnostics sans avoir besoin de biopsie.

Procédures

Les souris sont des animaux partiellement immunodéprimés pour permettre une greffe de cellules tumorales d'origine humaine sans rejet. Les conditions d'hébergement et de soins sont adaptées au statut immunodéprimé des animaux. Dans l’EU1, les souris seront xénogreffées. L'injection sous la peau du flanc de cellule tumorale de sarcome humain, geste d'une durée de 20 secondes, comportera 2 lignées tumorales disponibles, déjà utilisées et validées. Un IRM sera réalisé dans l’EU2 un examen IRM d'une durée de 1h30 n’engendre pas de douleur. La seconde IRM d'une durée de 1h30, dans l’EU2, est précédée d’une injection intrapéritonéale d'un marqueur d'hypoxie. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie et après antalgie dans l’eau de boisson. Après la seconde IRM, les animaux seront mis à mort et les tumeurs seront prélevées dans l’EU2 pour analyse histologique.

Impact sur les animaux

Au plan du bien-être animal, les animaux ne présentent aucun déficit moteur ou social lié à cette injection sous la peau. Ils continuent donc d’être hébergés dans des conditions adaptées aux animaux immunodéprimés. La pousse tumorale peut se traduire par une protubérance au niveau du flanc. Celle-ci peut créer un inconfort et une gêne mais sans entraver la mobilité de l'animal.

Devenir

Du fait du phénotype athymique, ces souris seraient à risque infectieux local et systémique majeur après la chirurgie de retrait de greffe. Par ailleurs, une chirurgie carcinologiquement satisfaisante ne serait techniquement pas réalisable, et le risque de dissémination microscopique local et à distance rend ces souris à la fois à risque de récidive et inéligibles à des protocoles ultérieurs. La mise à mort s’avère donc nécessaire. Les animaux sont mis à mort pour pemrttre le prélèvmeent del a tumeur. compte tenu des risques liés à leur statut immunitaire et à la difficulté de l'intervention chirurgicale, l'extraction de la tumeur ne seriat pas bénéfique aux animaux.

Remplacement

Il s’agit dans un premier temps de mettre au point un protocole expérimental et de tester de nouvelles méthodes d’acquisition en IRM très haut champ magnétique, préalablement validés in vitro avant d’être appliqué à l’animal. L’autre objectif est une corrélation des données IRM avec des données biologiques. Il est nécessaire de passer par une expérimentation in vivo du fait de la mesure absolument nécessaire d’un flux sanguin (condition impossible sur cultures cellulaires) et d’une comparaison aux données microscopiques. L'examen IRM est basésur la détection de flux de liquides, dont le sang, ce qui est difficelement envisageable sur desm odèles non vivants et d'autre part, le projet s'intéresse non seulement à la tumeur mais aussi à son environnement et à sa vascularisation, lesquels sont encore à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro.

Réduction

L’IRM est une technique non-invasive et non-irradiante. Elle nous permet de réutiliser les animaux et donc de réduire leur nombre. Un total de seulement 22 souris sera utilisé pour obtenir suffisamment de données et pour valider la technique de mesure. Afin de pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux tout en permettant de tirer des conclusions statistiquement significatives, le nombre d’animaux (2 groupes de 11) nécessaire a été calculé sur les bases de tests non paramétriques et sur la base de données de prise de greffe lors de précédentes expérimentations. Par ailleurs chaque animal sera imagé 2 fois.

Raffinement

Afin que l'injection soit mieux supportée, elle sera effectuée en situation sous-cutanée, chez des souris déjà suffisamment développées, avec ajout d’antalgique dans l’hydratation, et avec un suivi rapproché. Le projet a été pensé pour obtenir des résultats à la fois fiables et dans un délai le moins étendu possible. Les deux examens IRM seront réalisés sous anesthésie générale et n’engendreront pas de stress pour l’animal. Les animaux seront récompensés sous forme alimentaire à leur réveil après l’anesthésie. Lors du transport entre les deux animaleries, 50m environ, les cages seront placées dans un chariot en prenant soin de les protéger de l'environnement extérieur qui pourrait les refroidir. Les cages seront recouvertes par une bâche. L'apparition de grosseur fera l'objet d'une surveillance régulière. Une évaluation de la souffrance de l’animal sera mise en place, avec adaptation de la prise en charge selon le score calculé, et en cas d’atteinte des points limites les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est à la fois proche de l’Homme, accessible, et peut être analysée sur l’IRM à très haut champ. La résolution spatiale de l’appareil sera suffisante pour permettre une validation précise. Puis les souris immunodéficientes avec xénogreffe de sarcome des tissus mous humain permettront une validation technique de la méthode d’imagerie, une première confrontation entre les données de tissu tumoral d’origine humaine (xénogreffe) et l’anatomopathologie, et un suivi longitudinal. Nous utiliserons des sarcomes des tissus mous dont la lignée tumorale a déjà été utilisée plusieurs fois sur modèles animaux. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé pour le développement de modèles pathophysiologiques et les outils d’analyse immunologiques sont bien maîtrisés à la fois dans le monde et dans notre équipe. Par ailleurs les résultats obtenus pourront être confrontés aux données existantes dans la littérature.