Rongeurs
Evaluation de la biodistribution, du métabolisme et des voies d’excrétion de composés chimiques ou biologiques radiomarqués ou non chez le rat avec placement des animaux en cage métabolique et administration intracorticale
- Recherche appliquée
- Cancers
150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte des composés directement dans le cerveau sous anesthésie, puis on en place une partie jusqu'à cinq jours en cage à métabolisme, sur sol grillagé et isolés, pour mesurer le devenir de candidats médicaments dans l'organisme. Le porteur qualifie lui-même de sévères la douleur chirurgicale et le stress de la cage à métabolisme, et prévoit une mise à mort au-delà de 15 % de perte de poids. Il présente ces études comme "requises par les instances réglementaires" avant tout passage chez l'humain, en visant des cancers du cerveau comme le glioblastome pédiatrique.
Objectifs
En phase préclinique, le développement d’un médicament évalue différents paramètres dans le but de démontrer son efficacité ainsi que sa bonne tolérance et élimination par l’organisme. Parmi les données à apporter lors de la constitution d’un dossier en vue d’une demande de mise sur le marché, une évaluation de la pharmacocinétique comprenant les étapes d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’excrétion, du composé actif est nécessaire. L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, par voie intracorticale (dans le cerveau). Cette approche est en particulier justifiée dans le cas de l’évaluation d’approches thérapeutiques ciblant spécifiquement le cerveau, pour des pathologies – notamment en oncologie (par exemple glioblastomes pédiatriques) – pour lesquelles le besoin médical est critique. Certains paramètres d’absorption, de distribution, de métabolisme et d’élimination des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, avant l’évaluation plus exhaustive in vivo chez le rat. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La procédure de ce projet permettra d’étudier la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration par voie intracorticale de la molécule froide ou radioactive, des animaux contrôles seront traités par administration intraveineuse avec le même composé. Selon les objectifs d’étude, pour l’évaluation des excrétions (fèces et urine), une partie des animaux seront placés en cage à métabolisme en hébergement individuel pour d’une durée maximale de 120h (5 jours). Des prélèvements divers (notamment sanguins), pourront être effectués in vivo dans le respect des recommandations vétérinaires afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Les urines et fèces seront récupérés grâce aux dispositifs de la cage à métabolisme, sans intervention sur l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer chez le rat la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une administration chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 28 jours. Lors du développement d’un médicament, cette évaluation est requise par les instances règlementaires avant passage en phase clinique. Ainsi, le comportement de la molécule dans l’organisme, son métabolisme, sa distribution dans les tissus et son excrétion pourront être anticipés avant de réaliser les études chez l’homme. La voie d’administration des composées (intracorticale = dans le cerveau) adresse le cas de pathologies difficiles à traiter et pour lesquelles le besoin médical actuel est critique, notamment en oncologie (par exemple glioblastomes pédiatriques). Le bénéfice attendu du développement de nouvelles molécules thérapeutiques est donc particulièrement important.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie intracorticale, sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie.Les administrations intraveineuse (IV) dans la veine caudal (veine de la queue) seront réalisée si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane (cas de produit radiomarqué). Les traitements pre et post opératoire les administrations sous cutanée (SC) et intrapéritonéale (IP) seront réalisées sur animaux vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile. Le nombre et la fréquence des administrations sera déterminé en fonction de l’objectif de chaque étude. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à un maximum de 5 jours en cage à métabolisme ou 28j en cage standard. Des prélèvements de sang, d’organes, d’urine et de fèces pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages à métabolisme, au maximum 120h (5 jours). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des organes et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.
Impact sur les animaux
La chirurgie et la voie d’administration des composés génèreront une douleur opératoire et post opératoire de niveau sévère, justifiant la mise en place d’une analgésie, une perte de poids transitoire sera attendue sur un maximum de 7 jours. De plus, la chirurgie pourra induire d’autres effets indésirables de type neurologique, considérant le site de dépôt du produit. Deux à 3 jours avant le démarrage de l’étude, les animaux seront répartis en groupes homogènes (poids des animaux) et donc potentiellement mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et prélèvements entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Lorsque cela sera nécessaire, le placement en cage à métabolisme génèrera un stress sévère après administration intracorticale. Dans ces conditions d’hébergement dérogatoire (et justifiées scientifiquement pour le suivi individuel des excrétions), les animaux seront placés sur un sol grillagé, ce qui pourrait gêner leur locomotion. Ils seront hébergés individuellement, mais resteront en contact visuel avec leurs congénères. Aucune toxicité du produit n’est attendue dans les conditions prévues de dose de produit utilisées.
Devenir
Après la procédure , les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées à l’aide de tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes, etc.) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité, de leur propriété pharmacocinétique favorables et de leur absence de toxicité. Ces données sont insuffisantes pour avoir une bonne prédiction de la pharmacocinétique in vivo des molécules et d’autant plus pour permettre l’extrapolation de l’animal à l’homme. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules candidat devra donc être étudiée en premier lieu chez le rat.
Réduction
Ces études pré-règlementaires constituent une des dernières étapes des phases de développement préclinique, stade auquel les molécules évaluées auront déjà été sélectionnées en tant que candidat médicament parmi de nombreuses autres molécules. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 15 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires, sera utilisé afin de constituer plus facilement des groupes homogènes au moment de l’initiation de l’étude. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette procédure, il sera toujours proposé d’utiliser des prélèvements séquentiels d’un même animal.
Raffinement
Les animaux seront randomisés minimum 2 jours avant la chirurgie. Pour le groupe d’animaux devant être mis en cage de métabolisme une phase progressive d’habituation sera mise en place (sur 3 jours). Un enrichissement de l’environnement est utilisé dans toutes les cages et dans les cages à métabolisme l’enrichissement sera adapté. La procédure chirurgicale permettant le traitement intracortical (dans le cerveau) sera réalisée par des techniciens maitrisant les gestes chirurgicaux spécifiques. L’absence de conséquence neurologique a été démontrée dans des études préalables. La réalisation de la procédure sera suivie par la SBEA et toutes propositions seront étudiées. La procédure sera réalisée sous anesthésie générale combinant une anesthésie fixe et une anesthésie gazeuse avec une analgésie opiacée et un anti-inflammatoire non stéroïdiens. Une anesthésie locale sera également administrée en sous-cutané avant la chirurgie. L’analgésie sera renouvelée 4h et 6-8h après la chirurgie puis 2 fois le lendemain et le surlendemain de la chirurgie (couverture 72h). L’anti-inflammatoires non stéroïdiens ou un corticoïde sera renouvelé pendant 2 jours. Un soutien thermique (tapis chauffant ou armoire chauffante) sera mis en place durant toute l’anesthésie et la phase réveil. Les administrations IV et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress. Les expérimentateurs sont formés pour évaluer l’état de souffrance et les points limites. Une grille de scoring est mise en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites sont listés dans la procédure. Les scores cliniques les plus élevés et l’accumulation de scores intermédiaires constitueront un point limite. Après chaque manipulation lorsque cela est possible l’animal recevra une récompense (contact positif). • Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et pesés quotidiennement pendant les 7 jours suivant la chirurgie.Si perte du poids >10% : pesées quotidiennement et ajout de capsules d’eau gélifiées Poids entre 10 et 15% : réhydratation avec du Ringer Lactate (1mL) 1 fois par jour. Si perte de poids > 15% ou >10% pendant plus de 3 jours constituera un point limite. Le maintien des animaux en cage à métabolisme sera évalué quotidiennement par le vétérinaire ou la SBEA
Choix des espèces
La réglementation demande de réaliser les études précliniques sur plusieurs espèces différentes, or pour la réalisation de cette procédure chirurgicale, le rat en raison de sa taille, est l’espèce la plus adaptée. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour mieux supporter les effets de la chirurgie et les effets secondaires des composés à tester
Formation d’étudiants aux bonnes pratiques en expérimentation animale sur la souris dans le cadre de l’UE « modèles animaux en cancérologie » inclus dans le Master M1 Cancérologie.
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Oncologie
105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. On leur injecte des cellules d'un cancer du poumon puis on les tue, en principe avant l'apparition de signes cliniques, pour que des étudiants de master apprennent à manipuler les souris et à pratiquer des autopsies. Le porteur reconnaît qu'en cas de développement tumoral plus rapide les souris pourraient éprouver les douleurs de la tumeur. Il juge "indispensable" que ces étudiants, futurs responsables de projets, aient manipulé des souris vivantes.
Objectifs
Ce projet constitue la partie pratique d’un programme de Master (formation Bac + 5) destinée à former des chercheurs dans le domaine de la cancérologie. Au cours de cette formation, ils apprennent les techniques les plus récentes permettant le développement de traitements et de méthodes de diagnostic des cancers. Par la suite, ces étudiants s’intégreront dans des équipes de recherche du secteur public et de l’industrie pharmaceutique, en tant que responsables de projets. Les techniques qu’ils doivent connaître font appel à plusieurs disciplines scientifiques : la physiologie, l’endocrinologie, l’anatomo-pathologie, l’immunologie, l’imagerié médicale… Les recherches en cancérologie peuvent ponctuellement faire appel à des modèles animaux. L’apprentissage des principes de base dans l’utilisation des animaux à des fins scientifiques est donc indispensable pour ces étudiants. Ils abordent ce sujet en découvrant les techniques in vitro et es techniques in vivo qui peuvent être utilisées, en parallèle. La règles des 3R est le directeur de la formation. Dans une partie pratique, les étudiants apprennent l’abord et la manipulation des souris. Au cours de travaux pratiques, ils sont sensibilisés aux difficultés techniques et éthiques que représente l’utilisation des animaux. Même s’ils ne seront pas toujours amenés à manipuler eux-mêmes les animaux, ils devront prendre la responsabilité d’en utiliser dans des programmes de recherche. Il est donc important que tous les aspects, les contraintes, les avantages, les biais éventuels liés à l’utilisation d’animaux vivants leur soient présentés. Dans notre projet, les étudiants manipuleront des souris saines pour s’initier aux techniques de base, sur des gestes peu invasifs. Chez d’autres souris, des tumeurs seront provoquées par injection de cellules cancéreuses, dans le but de montrer aux étudiants l’évolution des tumeurs et la nature des lésions. Dans ce cas, la vitesse de croissance des tumeurs étant très bien connue, les animaux seront suivis quotidiennement et ils seront euthanasiés selon une méthode non stressante avant que la tumeur ne provoque de souffrance.
Bénéfices attendus
Il est pertinent que les étudiants de ce Master apprennent à autopsier et effectuer des prélèvements adéquats sur des souris porteuses de tumeur, car il s’agit d’une pratique usuelle qui sera utile à une bonne partie d’entre eux pour leurs travaux futurs (plus de la moitié des étudiants envisagent des études in vivo l’année suivant leur formation). Ceci conduira à une meilleure compétence, au profit de la fiabilité des études et donc à terme à la réduction des effectifs expérimentaux.
Procédures
Les animaux recevront une injection 100μl de cellules tumorales en intra-veineux au niveau de la veine de la queue. Cette administration sera réalisé sur animal vigile. La contention durera moins d'une minute et l'injection environ 10 secondes. En théorie, l'euthanasie est programmée avant que le développement de la tumeur induite ne provoque des signes cliniques.
Impact sur les animaux
Nous inoculons des cellules d'une souche de cancer du poumon de la souris. On peut donc considérer l'injection comme une nuisance, qui dure entre 1 et 2 minutes. Nous connaissons cette souche et la cinétique de développement du cancer. Les souris seront euthanasiées en théorie avant l'apparition des signes cliniques mais en cas de développement plus rapide, les souris pouraient éprouvé les douleurs associées au développement de la tumeur.
Devenir
A l'issue des procédures les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement d'organes pour des analyses macroscopiques et histologiques.
Remplacement
Ce projet correspond à un enseignement pratique sur des souris pour des étudiants en M1 cancérologie. Ces étudiants se destinent à la recherche en cancérologie et seront amenés au cours de leurs stages à manipuler des modèles murins. Cette formation a donc pour but de familiariser les étudiants avec ce modèle, notamment l’importance après sacrifice des animaux, de réaliser des examens anatomopathologiques de qualité. Il n’est pas possible de sensibiliser et former correctement des étudiants qui n’ont jamais manipulé de petits rongeurs sans les confronter à quelques spécimens vivants. Ces travaux rpratiques sont très peu invasifs pour les animaux, toutefois, ils sont toujours précédés par des démonstrations video. En ce qui concerne les prélèvements sur animaux morts porteurs de tumeurs, les étudiants sont d'abord entrainés sur d'autres cadavres sains.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans les procédures expérimentales associées à ce projet est réduit au maximum (à raison de 1 souris/5 étudiants) et permettra la réalisation des examens nécropsiques à acquérir ainsi que l’approche de différents modèles murins utilisés en cancérologie. Ceci conduira à une meilleure compétence, au profit de la fiabilité des études et donc à terme à la réduction des effectifs expérimentaux. Les souris utilisées seront de jeunes adultes âgées d’au moins 5 semaines, ce qui permet une pousse de tumeur répétable et standardisée.
Raffinement
Après réception, les animaux auront une période d’acclimatation d’une durée propre à l'espèce. Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et recevront un enrichissement du milieu adapté à l'espèce, régulièrement renouvelé. Des évaluations cliniques sont mises en place (observation quotidienne de l’état général, du comportement, observation du site d’administration, etc...). Tout au long des études les animaux sont manipulés/observés par un personnel formé et habilité à travailler chez cette espèce. Les voies et volumes d’administration suivront les recommandations des publications reconnues. Les souris vivantes incluses dans ce projet ne sont pas manipulées par les étudiants. Le modèle tumoral ne produisant pas de trouble clinique à ce stade, la gravité de la procédure reste légère et le bien-être animal est respecté.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de cancérogénèse du fait de l’existence de nombreux modèles bien caractérisés. Ainsi il est indispensable dans le cursus des étudiants en M1 cancérologie d’aborder ces modèles murins. Les souris utilisées seront de jeunes adultes âgées d’au moins 5 semaines, ce qui permet une pousse de tumeur répétable et standardisée.
Formations pratiques aux gestes techniques élémentaires utilisés dans les procédures expérimentales
- Formation professionnelle
Lapins : 4
40 souris et 4 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des prélèvements de sang et des injections par plusieurs voies, sous anesthésie, pour que des techniciens s'entraînent aux gestes de routine de l'animalerie. Le porteur signale un risque de lésions oculaires après un prélèvement derrière l'œil et fait de l'euthanasie elle-même un geste à acquérir. Il indique recourir surtout à des animaux commandés pour d'autres études mais restés inutilisés, et présente la mise en situation sur animal vivant comme "essentielle".
Objectifs
Les personnes travaillant avec des animaux de laboratoire doivent maitriser des gestes techniques plus ou moins complexes : administrations, prélèvements, … Leur formation initiale doit parfois être complétée par une formation spécifique, en fonction des études qu’ils seront amenés à réaliser et de l’évolution des connaissances et pratiques. Le but de ce projet est d’acquérir de nouvelles techniques, se perfectionner ou de maintenir la maitrise des gestes techniques faits en routine dans nos animaleries expérimentales par les techniciens. Ces formations doivent leur donner les moyens de raffiner les procédures expérimentales en évitant un stress et une souffrance animale supplémentaires liés à une non maitrise du geste technique et ainsi, réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nous ferons appel à une société extérieure pourvue de formateurs experts dans le domaine pour la réalisation des sessions de formation.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une maitrise des gestes techniques utilisés en routine par les techniciens de l’animalerie et un maintien accru des compétences permettant de limiter le nombre d’animaux de nos futurs projets.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins et des injections via différentes voies. Chaque animal aura au maximum 2 prélèvements et 2 injections de quelques secondes. Les gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié sauf si l’anesthésie est plus impactante que le geste réalisé.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues de l’ordre de quelques secondes pourront être : -un stress induit par une contention non maitrisée -une douleur lors des prélèvements ou des injections non maitrisées -un accident lié à une anesthésie mal maitrisée -lésions oculaires après un prélèvement au sinus rétro orbitaire
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des sessions de formation. L’euthanasie fait partie des gestes à acquérir dans le respect du bien-être animal.
Remplacement
Si les gestes techniques de base peuvent être enseignés et appris sur des systèmes inertes d’entrainement ou à l’aide de tutoriels vidéo, la mise en condition réelle sur le modèle animal reste essentielle pour l’apprentissage. La mise en condition sur modèle animal est donc d’une aide fondamentale dans l’apprentissage des conditions réelles d’expérimentation animale. Pour la formation pratique, il n’existe pas de méthode de substitution, qui pourraient restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux et/ou la manipulation des tissus vivants.
Réduction
Dans la très grande majorité des cas, il s’agira d’animaux commandés pour une étude mais n’ayant pas été utilisés et devant être euthanasiés ; le formateur est une personne experte, sa supervision étroite garantira une utilisation optimale des animaux en minimisant le risque d’erreur de geste technique qui pourrait entrainer le décès de l’animal. Pour ce projet, nous prévoyons d’utiliser au maximum 40 souris (4 techniciens à former par an et 2 animaux par techniciens) et 4 lapins sur une durée de 5 ans (au maximum 2 sessions de formation en 5 ans et 2 animaux par session).
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux de 8 animaux par cage et bénéficient d'un enrichissement de type bâtons à ronger, cachettes et cabanes. Ils seront euthanasiés après chaque formation. De plus, les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bon état général et tout geste potentiellement stressant sera réalisé sous anesthésie générale afin de préserver leur bien-être. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire, mais souhaitant acquérir une maitrise supplémentaire ou maintenir leur niveau de compétence. Enfin, la définition de points limites à ne pas atteindre permettra de réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Ces formations sont destinées aux techniciens de notre animalerie travaillant sur le modèle souris et le modèle lapin (bien que très rarement utilisé). Les espèces choisies le sont en conséquence afin de maintenir les compétences des personnels de notre animalerie. Nous prévoyons d’utiliser des animaux adultes, comme c’est le cas dans nos protocoles expérimentaux.
Travaux Pratiques pour une formation à la chirurgie : cathétérisme de l’artère carotide et cathétérisme chronique chez le rat.
- Formation professionnelle
105 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque rat sert de support à un binôme d'élèves pour poser un cathéter dans la carotide et prélever du sang, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels à la chirurgie expérimentale. Le porteur indique que l'apprentissage des sutures se fait au préalable sans animaux, mais juge le recours à l'animal vivant "indispensable" pour acquérir le geste. Il retient le rat parce que c'est "le modèle le plus utilisé" par les participants à la formation.
Objectifs
Fournir une formation réglementaire aux personnels engagés dans l'expérimentation animale et désireux de pratiquer des actes de chirurgie sur animaux de laboratoire. Permettre l'apprentissage des bonnes pratiques en chirurgie expérimentale.
Bénéfices attendus
Formation réglementaire des personnels. Raffinement des compétences en chirurgie. Réduction du nombre d'animaux requis pour les expérimentations à venir.
Procédures
La seule nuisance sera ici le stress de la contention et la douleur de l'entrée d'une aiguille par voie intrapéritonéale pour procéder à l'anesthésie puisque l'intégralité de la procédure se réalisera ensuite sous anesthésie générale. Une intervention par animal dure environ 1h30. Une pose d'un cathéter dans la carotide sur animal anesthésié. Un prélèvement unique de sang via le cathéter sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
La seule nuisance sera ici l'entrée d'une aiguille par voie intrapéritonéale pour procéder à l'anesthésie puisque l'intégralité de la procédure se réalisera ensuite sous anesthésie générale.
Devenir
Procédure sans réveil faisant suite à l'acquisition des compétences par le personnel.
Remplacement
Une partie de la formation théorique est destinée à faciliter l'execution des gestes de chirurgie. Un apprentissage des sutures aura été fait sans utilisation d'animaux vivants. Pour cette partie proprement dite, il s'agit d'acquérir un geste chirurgical donc l'utilisation d'animaux est indispensable.
Réduction
Chaque binôme travaillera sur un même animal.
Raffinement
L'intégralité de la procédure sera réalisée sous anesthésie de type chirurgicale qui comprend une analgésie tout au long de la procédure. Les élèves auront assisté à une démonstration réalisée par le formateur, ce qui leur permettra de pratiquer les gestes appropriés sur un animal anesthésié. Des points limites adaptés à ce projet sont également mis en place.
Choix des espèces
Il s'agit d'acquérir un geste chirurgical donc l'utilisation d'animaux est indispensable pour acquérir les bases en chirurgie expérimentale. Le modèle rongeur est utilisé ici car c'est le modèle le plus utilisé par les participants à cette formation. Des rats mâles ont une taille adéquate pour une meilleure démonstration du geste chirurgical. Les rats mâles adultes doivent faire un peu plus de 300g pour correspondre à la taille du cathéter utilisé.
Utilisateurs de cocaine sous influence : processus et mécanismes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
324 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie pour poser un cathéter dans une veine, parfois des fibres optiques dans le cerveau, et une restriction d'eau destinée à renforcer leur motivation, pour s'auto-administrer de la cocaïne et étudier le choix sous influence de la drogue. Le porteur écarte l'humain en invoquant l'"éthique spéciste actuelle" qui interdit ces approches invasives, et retient le rat comme un "compromis phylogénétique" jugé éthiquement moins sensible que le primate. Il annonce des retombées surtout théoriques, une redéfinition de l'addiction et des modèles pour la recherche future.
Objectifs
L’objectif majeur de notre projet de recherche est premièrement de mieux caractériser le comportement de choix sous influence (durée, persistance à long terme du phénomène, modulation de ce phénomène par certains paramètres altérant normalement le choix tels que le coût, le prix de la récompense ou la punition…). Ensuite, notre projet aura pour but d’étudier le rôle causal des interneurones du cortex orbitofrontal dans la consommation compulsive de cocaïne chez les individus sous influence de drogue. Notre hypothèse générale est que la perte de contrôle chez les individus ayant développé une addiction ne serait pas un trait constitutif ou inconditionnel des sujets mais plutôt une caractéristique comportementale dépendante de la drogue. Si tel est le cas, la perte de contrôle devrait exister mais principalement lorsque ces individus sont intoxiqués par la drogue et donc sous son influence. Ce projet est par essence mécanistique et nécessite une approche invasive qui n’est pas envisageable chez le sujet humain. Sa bonne réalisation repose donc sur le développement et l’utilisation d’un modèle animal - le rat de laboratoire – qui permet de reproduire de façon valide la distinction établie chez l’homme entre individus vulnérables et individus non-vulnérables face à l’addiction. Il s’agira de placer une population de rats face à un choix entre prendre de la cocaïne ou s’engager dans une activité alternative (boire une boisson édulcorée avec de la saccharine) et, ensuite, de tester l’influence d’une administration passive de cocaïne sur le choix des individus.
Bénéfices attendus
Ces recherches devraient permettre de résoudre un long débat théorique sur la nature de l’addiction en redéfinissant la perte de contrôle en tant qu’état induit par l’influence de la drogue et non en tant que trait constitutif. Sur le plan pratique, ce changement conceptuel devrait contribuer à réorienter les efforts de recherche vers des interventions permettant d’isoler et de protéger la prise de décision de cette influence de la drogue. Notre paradigme de recherche servira également de base aux recherches futures sur la neurobiologie et la neuropharmacologie de la prise compulsive de cocaïne. Enfin, les données générées par ce programme de recherche pourraient être utilisées pour affiner ou redéfinir les modèles théoriques ou computationnels actuels de l’addiction à la cocaïne.
Procédures
Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Certains animaux seront aussi soumis à une chrirugie intracérébrale (60 min en moyenne) pour la pose de fibres optiques. Ces chirurgies sont effectuées sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique ou gaseuze et sous analgésie. Certains rats seront soumis à une restriction hydrique avec un accès à l'eau de 5h30 par jour. Cette restriction hydrique aura pour effet d’augmenter le besoin physiologique et donc la motivation pour la récompense hydrique pendant le choix tout en couvrant le besoin quotidien en eau pour s’hydrater normalement. La restriction hydrique sera introduite graduellement.
Impact sur les animaux
Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne, hormis un possible risque d’infection lié à l’utilisation chronique de la voie d’administration intraveineuse.
Devenir
Les animaux seront mis à mort parce qu'ils auront complété les expériences programmées et pour prélever leurs cerveaux afin de procéder à des vérifications histologiques post-mortem.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Notre projet nécessite au total l'utilisation de 324 rats mâles sur une période de 5 ans. Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet scientifique proposé.
Raffinement
Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie (anti-inflammatoire non-stéroïdien), sous anesthésie chimique (mélange de kétamine et de xylazine) et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl) pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement (voir la grille des différents signes en annexe). Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique (anti-inflammatoire non-stéroïdien). L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl). Enfin, si cela ne suffit pas au bon rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées (e.g., C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la cocaïne mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés sont tous de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.
Interaction neuro-immune dans les ilots pancréatiques chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un régime gras pendant douze semaines, des injections, des périodes de jeûne, une chirurgie abdominale et une perfusion dans le cœur, pour étudier des cellules immunitaires des îlots du pancréas. Le porteur indique que 3 630 souris sont tuées d'emblée parce que leur génotype est inutilisable, avant toute procédure. Il affirme que les modèles animaux sont "nécessaires" et rattache l'étude au diabète, sans bénéfice thérapeutique précis annoncé.
Objectifs
Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation de la glycémie. Ces micro-organes ont pour fonction de produire les hormones permettant de réguler la glycémie. Les macrophages jouent une rôle important dans la fonction des ilots. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, leur rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. En particulier, l’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux n’a jamais été étudié. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes d’interaction entre les macrophages et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces interactions dans la fonction des ilots en condition normal, ainsi que dans trois contextes de stress glycémique: le jeun, l’altération des ilots et le diabète, une maladie caractérisée par une dérégulation de la glycémie. Ce projet se déroulera dans deux établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Il est aujourd'hui admis que les macrophages jouent un rôle primordial dans la régulation de la glycémie par le gras et le foie. Les macrophages résidant dans les ilots pancréatiques n'ont eux été décrits que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'ils restent encore largement ignorés. L'interaction entre les macrophages et le système nerveux a été montré comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant de part la difficulté d'étudier les macrophages des ilots pancréatiques, cette interaction n'est pas encore décrit dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les interaction macrophage/réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans le stress glycémique.
Procédures
Etablissement utilisateur 1: 1 biopsie de queue, 1 prélèvement de sang à la joue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 jeun (6h ou 16h) , 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésies gazeuses (10min), 1 perfusion intra-cardiaque. Etablissement utilisateur 2: 1 anesthésie gazeuse (2h), 1 chirurgie abdominale (2h).
Impact sur les animaux
-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. -Chirurgie abdominale : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Prélèvement de sang à la joue : douleur légère. -Biopsie de queue : douleur modérée.
Devenir
Procédure 1 : 3630 souris seront mises à mort car leur génotype ne sera pas utilisable. 2280 souris auront le génpotype requis et seront utlisées dans les procédures 2 à 5. Procédure 2 à 5 : Toutes les souris seront mises à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.
Remplacement
Cette étude a pour but d'étudier l'interaction des macrophages avec le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de stress glycémique, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ainsi que des études pilotes avec des petits nombres d’animaux ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement
Choix des espèces
La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.
Etude des mécanismes des récepteurs du glutamate sur la régulation de l’activité des neurones : EU 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau pour implanter des électrodes et injecter des virus, puis des enregistrements de leurs neurones pendant l'éveil et le sommeil, pour étudier un récepteur au glutamate. Le porteur indique que les souris implantées sont maintenues isolées, une autre souris pouvant endommager les électrodes, et signale une douleur post-opératoire de 48 heures et des risques liés à l'anesthésie. Il renvoie au long terme les retombées, des traitements des troubles anxieux liés au sommeil, et affirme qu'aucune alternative au rongeur ne préserve un réseau neuronal intact.
Objectifs
La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.
Procédures
Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress)
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Elle sera pratiquée au sein de l'établissement d'origine des animaux. Il s'agit d'un projet déjà autorisé, réalisé sur deux établissements et n'ajoutant aucun animal supplémentaire.
Remplacement
Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux : dont 1120 impliqués sur ce site.
Raffinement
Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.
Choix des espèces
Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Caractérisation mécanique et histologique du muscle squelettique immobilisé chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
28 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On immobilise une patte avant de vingt d'entre eux dans un gilet pendant sept à quatorze jours, avec des tests de motricité et des échographies sous anesthésie, pour mesurer comment le muscle se raidit après une immobilisation de type post-AVC. Le porteur indique que le gilet entrave le toilettage et gêne l'accès à la nourriture, et qu'une perte de plus de 20 % du poids entraîne la mise à mort. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico n'existe et conclut que les rats sont "essentiels".
Objectifs
L’immobilisation du muscle squelettique en position courte à la suite d’un AVC est la facteur qui entraine le plus de dommages et provoque l’atrophie du tissu contractile, l’épaississement du tissu conjonctif et une altération du comportement mécanique passif avec une augmentation de la raideur du muscle squelettique. C’est dans ce contexte que ce projet vise à mesurer l’évolution des propriétés mécaniques et structurelles du muscle squelettique, au fil du temps, à la suite d'une immobilisation chez le rat.
Bénéfices attendus
In fine, ce projet permettra d’apporter des informations sur l’évolution des propriétés du muscle squelettique après une immobilisation post-AVC aux personnels soignants et ainsi de donner une possibilité d’amélioration de la prise en charge des patients.
Procédures
La première étape du protocole consiste à mesurer le niveau d’asymétrie des deux pattes avant à travers un test de motricité indolore. La seconde étape consiste à mesurer la rigidité du muscle squelettique à l’aide d’un échographe, sous anesthésie gazeuse, pendant 20 minutes. Toujours sous anesthésie, les pattes avant gauche des rats des groupes « immobilisation pendant 7 et 14 jours » (20 au total) sont ensuite immobilisées à l’aide d’un gilet confectionné à partir des bandes auto-adhésives et de bandes velcro. Les animaux seront sous surveillance lors de leur réveil et la tenue du gilet d’immobilisation ainsi que leur état de santé seront surveillés tous les jours (prise/perte de poids, état général). Les tests de motricité (d'une durée de 2 minutes) et les mesures par imagerie échographique seront effectuées à Jour 0, Jour 7 et Jour 14.
Impact sur les animaux
L'immobilisation de la patte avant entrave le toilettage normal de l'animal. Ceux-ci seront brossés et nettoyés deux fois par jours avec une lingette humide. De plus, des difficultés à se déplacer et à se nourrir pourraient intervenir. Par conséquent, une gamelle de granulés humidifiés ou des gels nutritifs pourront être déposés quotidiennement au sol de sorte que les animaux puissent se nourrir plus facilement, si ils n'arrivent pas à atteindre les granulés des mangeoires.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort afin de prélever les muscles des pattes avant. Ces muscles seront soumis à des tests mécaniques in vitro permettant de déterminer l'évolution de leurs propriétés mécaniques après 7 et 14 jours d'immobilisation. Des coupes histologiques seront par la suite réalisées pour évaluer la quantité de tissu conjonctif, la taille des fibres musculaires et, entre autres, le type de fibre.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l’évolution des propriétés mécaniques et structurelles du muscle squelettique immobilisé. Les modèles animaux sont donc essentiels et ne peuvent donc être remplacés.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin de garantir une quantité suffisante de matériel biologique pour les analyses post-mortem, tout en tenant compte de la variabilité individuelle observées dans d’autres études. De plus, le protocole d’immobilisation a été adapté pour assurer son efficacité sur le plus grand nombre d’animaux possible.
Raffinement
Il existe un moyen d'immobilisation plus rapide à mettre en place et moins encombrant pour l'animal. En effet, les bandes auto-cohésives couplées à des bandes de velcro permettront d'immobiliser la patte de l'animal tout en étant plus souple et plus léger que le plâtre. L'ajout de velcro permettra de protéger temporairement les bandes cohésives du grignotage par les congénères. Les bandes de velcro pourront être remplacées si besoin. Ce dispositif permettra aussi de maintenir les animaux par groupe et non plus individuellement comme c'est le cas pour le plâtre. Un surplus d'enrichissement à ronger sera ajouter dans chaque cage et la nourriture sera humidifiée et déposée dans une gamelle afin d'aider les animaux à se nourrir plus facilement. L'immobilisation et les échographies seront effectuées sous anesthésie gazeuse et les animaux seront positionnés sur un plateau chauffant à 37±0.5°C afin d'éviter une hypothermie. Si les animaux présentent des signes de douleurs, celles-ci seront prises en charge par des analgésiques. Si les animaux perdent moins de 20% de leur masse initiale, des aliments appétents seront distribués. En revanche, si la perte de masse est supérieure à 20%, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle de rat est approprié à notre étude pour plusieurs raisons: - Il partage de nombreuses similitudes anatomiques, physiologiques et génétiques avec les êtres humains, notamment sur l'aspect des propriétés biomécaniques du muscle squelettique. - Sa petite taille permet de mesurer facilement les paramètres physiologiques (notamment moteurs) et dans le cas de notre étude d'immobiliser facilement un membre. - Il y a une bonne homogénéité entre les différentes souches de rats et donc la possibilité de comparer les résultats collectés à ceux d'autres études - Les dimensions limites pour réaliser les tests de traction-relaxation font que le modèle de rat permet de tester mécaniquement plus de muscle que le modèle de souris. - Il est souvent utilisé dans des études sur les effets de l'immobilisation du muscle squelettique. Des jeune adultes de 10 semaines sont choisis pour ce projet. Leur prise massique est réduite de l’ordre de 15% de prise de masse en 14 jours, ce qui permet de réaliser le protocole d’immobilisation sans avoir à modifier les gilets d’immobilisation à plusieurs reprises.
Etude de l’origine et de la fonction des fibroblastes associés aux tumeurs du poumon et de la vessie dans deux modèles murins de carcinogénèse chimio-induite
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
632 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 256 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit des cancers du poumon ou de la vessie par un carcinogène chimique présenté comme identique à celui du tabac, administré par injections ou dans l'eau de boisson pendant plusieurs semaines, pour étudier des fibroblastes qui entourent les tumeurs. Le porteur indique que les tumeurs de vessie peuvent provoquer une occlusion, une rétention d'urine et des douleurs, contenues par une palpation régulière et des points limites. Il reconnaît que des cultures d'organoïdes sont à l'essai mais les juge insuffisantes, et renvoie à une perspective les retombées pour l'immunothérapie.
Objectifs
Les recherches actuelles sur les cancers solides ne se focalisent plus uniquement sur les cellules cancéreuses mais ciblent aussi le microenvironnement tumoral. En effet, ce dernier composé de différents types cellulaires joue un rôle déterminant dans l’initiation et la progression tumorale. Le ciblage des cellules immunitaires (immunothérapie réactivant les lymphocytes T notamment) a conduit à des résultats spectaculaires de rémissions durables dans des tumeurs solides notamment dans le mélanome, le cancer du poumon et plus récemment le cancer de la vessie. Toutefois, cette stratégie thérapeutique fonctionne chez un nombre limité de patients (20 à 30%), incitant à étudier et comprendre les éléments contrôlant cette résistance. Des études récentes dans le cancer du poumon ont montré que certaines cellules (fibroblastes) associées aux tumeurs (CAF) forment une barrière autour des ilots tumoraux et empêchent les lymphocytes T de rentrer en contact directe avec les cellules tumorales empêchant leur destruction. Cette exclusion peut expliquer certains de ces échecs thérapeutiques. Deux types de tumeurs solides répondant partiellement à l’immunothérapie seront étudiées dans ce projet : - Le cancer du poumon :principale cause de décès par cancer dans le monde. Les traitements des stades précoces par chirurgie et radiothérapie conduisent à des rémissions durables mais les stades métastatiques ont une faible survie et restent un enjeu majeur de santé publique. - Le cancer de la vessie qui reste un enjeu majeur de santé publique en cas d’envahissement du muscle ou des ganglions lymphatiques voisins. Ces tumeurs peuvent potentiellement être guéries par l'ablation chirurgicale de la vessie et des ganglions lymphatiques. Cependant, chez plus de la moitié des patients qui subissent ce type d'intervention chirurgicale, des cellules cancéreuses ont déjà métastasé et le pronostic vital reste sombre. L’objectif de ce projet est d’identifier l’origine des fibroblastes capables de générer une barrière autour des ilots tumoraux et d’étudier leur fonctionnalité sur l’initiation et la progression tumorale. Cette recherche fondamentale sur l’origine et la fonction des CAF pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les fibroblastes afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies
Bénéfices attendus
Les retombées à venir et les bénéfices attendus de ce projet sont importants car une meilleure caractérisation des cellules composant le microenvironnement tumoral a un impact majeur sur l’efficacité des nouvelles approches thérapeutiques antitumorales. Ainsi, l’identification de cibles pour manipuler les CAF et permettre aux lymphocytes T d’atteindre les cellules tumorales permettrait de guérir un nombre plus important de patients par immunothérapie, notamment dans un contexte de cancer du poumon ou de la vessie.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront soumis à une biopsie auriculaire, en vue de déterminer leur génotype, avant d’intégrer les différentes procédures. Dans une première expérience, les animaux recevront une injection d’un produit non douloureux directement dans l’abdomen (intrapéritonéale) à raison d’une fois par jour pendant 5 jours. Deux jours après la dernière injection, les animaux recevront un traitement chimique en vue de favoriser le développement de tumeurs pulmonaires. Ce traitement (non douloureux) sera administré directement dans l’abdomen des animaux, à raison d’une fois par semaine pendant 10 semaines. Dans une seconde expérience, les animaux recevront un traitement chimique en eau de boisson pour induire le développement de tumeurs vésicale. Les animaux seront exposés à ce traitement pendant 4 à14 semaines.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée est attendue lors des biopsies auriculaires nécessaire au génotypage des animaux. Les produits administrés aux animaux ne sont pas irritants. Ils sont administrés dans l’eau de boisson ou par injection intrapéritonéale (douleur légère et de courte durée). Les dommages causés par le développement des tumeurs pulmonaires sont à long terme une perte de poids importante et dans les cas extrêmes non étudiés ici une difficulté respiratoire. Dans cette étude, une définition de points limites prédictifs et suffisamment précoces et un suivi régulier des animaux permet de ne pas atteindre ces stades avancés et de limiter la survenue de douleur. Suite au développement des tumeurs de vessie, les animaux pourront présenter une occlusion vésicale potentielle engendrée par une tumeur trop volumineuse (>7mm de diamètre). Cette occlusion peut provoquer une rétention d’urine et des douleurs associées. Une palpation régulière des animaux permet d’éviter ce stade terminal et de limiter la survenue de douleur. Aucune métastase n’a été observée dans ce modèle.
Devenir
Mise à mort des animaux d’élevages de génotypes non pertinents Mise à mort des souris pour analyse des tumeurs post mortem
Remplacement
Le rationnel de ce projet a été établi sur des prélèvements de tumeurs humaines étudiés par immunohistochimie. Des essais de culture sous forme d’organoïdes en 3 dimensions sont en cours mais ne nous permettent pas pour l’instant de reproduire les observations réalisées ex vivo chez l’homme. Seuls des modèles de souris transgéniques possédant un marquage des populations de fibroblastes d’intérêt et porteurs de tumeurs pulmonaires et de vessie peuvent nous permettre d’initier cette recherche fondamentale. L’identification des fibroblastes impliqués dans l’initiation et la progression tumorale pourrait déboucher sur des thérapies innovantes ciblant les CAF afin d’augmenter l’efficacité des immunothérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les données de la littérature décrivant les 2 modèles chimioinduits et nécessite au minimum 10 souris/temps d’analyse afin d’obtenir suffisamment de matériel tumoral. Les souris mâles et femelles transgéniques seront inclus afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits en élevage. Aucune différence liée au sexe n’est attendue ici . Les souris non pertinentes d’une même portée seront utilisées en contrôles. Aucun test statistique ne sera envisagé dans cette étude car il s’agit d’une étude qualitative de suivi des fibroblastes par un marqueur sur des coupes d’histologie de tumeurs pulmonaires et de tri de la population tracée. En revanche le faible nombre de tumeurs par souris nous impose d’utiliser un nombre suffisant d‘animaux afin d’avoir le matériel pour conclure.
Raffinement
Les animaux transgéniques utilisés dans cette étude possèdent des fibroblastes marqués par une molécule fluorescente et présentent un état physiologique normal L’exposition au carcinogène chimique n’induit pas de douleur par lui-même, ni de perte de de l’appétit ou de poids. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux et l’absence de douleur due au développement des tumeurs. Un suivi régulier des animaux et une définition de points limites précoces permettent de limiter au maximum la souffrance engendrée par le développement des tumeurs. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte d’un point-limite
Choix des espèces
Le choix d’un modèle tumoral préclinique chez la souris est justifié du fait de l’existence de modèles de souris génétiquement modifiées permettant de visualiser une population de fibroblastes d’intérêt similaires à ceux trouvés chez l’Homme. L’induction de tumeurs (poumon ou vessie) par un carcinogène chimique dans de telles souris transgéniques permet de tracer in vivo le devenir de ces fibroblastes lors de la tumorigenèse et leur implication potentielle dans l’initiation et la progression tumorale. Les carcinogènes utilisés sont identiques à ceux présents dans le tabac et reproduisent des cancers de même type que ceux induits chez l’homme par l’exposition au tabac. De plus, les modèles murins permettent d’utiliser de nombreux outils disponibles (anticorps, cytokines) qui permettent d’étudier précisément la réponse immunitaire antitumorale dans cette espèce. Les souris seront génotypées à 3 ou 4 semaines (prélèvement auriculaire) Des souris adultes agées de 8 à 32 semaines seront utilisées en procédures. Cet âge adulte permet d’avoir un système immunitaire fonctionnel.
Caractérisation des conséquences des mutations de l’enzyme adenylate cyclase et de parkin sur les circuits de récompense et le mécanisme métabolique ainsi que les anomalies moléculaires dans le cerveau chez des souris mutées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
13 366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 108 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations liées à la dystonie et à la maladie de Parkinson, elles reçoivent jusqu'à trente injections dans le péritoine, des chirurgies du cerveau, neuf prélèvements sanguins et des tests de récompense qui imposent isolement et restriction alimentaire pendant plusieurs semaines. Le porteur indique qu'un tiers des souris d'une lignée cessent de grandir et sont alors tuées. Il affirme que ce réseau neuronal ne peut pas être reproduit in vitro et renvoie au long terme les retombées pour des maladies rares.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de déterminer les conséquences de mutations de gènes impliqués dans des dystonies et dans la maladie de Parkinson sur les circuits moteurs, les circuits de la récompense, l’addiction et de la dépression, ainsi que les anomalies moléculaires dans une zone spécifique du cerveau chez des souris mutantes, modèles de troubles du tonus musculaires (contractions musculaires involontaires par exemple). Puisque les protéines perturbées peuvent être exprimées dans d’autres organes que le cerveau, les altérations métaboliques due à ces mutations seront aussi étudiées. Nous étudierons également les anomalies moléculaires des souris mutées.
Bénéfices attendus
Bénéfices tant scientifiques que thérapeutiques. Mise en évidence des anomalies potentiellement similaires à celles observées chez les patients et essai d'un traitement potentiel de ces anomalies. Ces découvertes bénéficieront à la caractérisation et compréhension des anomalies moléculaires expliquant les symptômes observés chez les patients et permettront de découvrir de nouveaux traitements et d'améliorer la prise en charge des patients qui souffrent d'une maladie rare et orpheline donc nécessitant un effort de recherche pour les soutenir.
Procédures
Prélèvement d'extrémité de queue pour génotypage (durée de quelques secondes). Les animaux ayant un phénotype dommageable (1/3 des animaux au sein d'une seule des lignées participantes) arrêtant leur croissance seront euthanasiés avec appui du personnel en charge du Bien Etre Animal pour la décision. Les injections intrapéritonéales (max30 au total par animal réparties sur une plusieurs semaines - quelques seconde/injection) ainsi que le nouvel environnement dans les appareils expérimentaux pourraient potentiellement introduire un stress chez certains animaux et une fatigue liée aux tâches d'apprentissage sans jamais atteindre l’épuisement mais qui entraînerait un arrêt de la participation à la tâche par l'animal. Les souris qui participeront à un test de récompense seront isolées pour la restriction alimentaire pendant une semaine avant de commencer le protocole de réponse aux récompenses pendant 3 semaines, effectué dans une cage équipée de distributeurs de récompense. Les souris participant au test de préférence à l’eau sucrée seront isolées pendant 4 à 6 semaines, placées dans des cages de plus grande taille avec 2 biberons. Les souris chez qui les paramètres métaboliques seront mesurés auront 9 prélèvements sanguins, sous anesthésies locale, répartis sur 3 jours différents espacés d’une semaine, sur des periodes de 2h lors des jours de prélèvement. Une unique procédure chirurgicale est prévue pour certains des animaux : l’opération chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, durera 30 min environ pour une micro-injection dans une structure cérébrale. En fin de période de maintien, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable observé chez certaines souris (1/3 des animaux au sein d'une seule des lignées participantes) provoquera une perte de poids et un arrêt de croissance. Les animaux seront euthanasiés dès l’observation d’absence de croissance. L'identification génétique (génotypage) des animaux réalisée par prélèvement de quelques millimètres d'extrémité de la queue est susceptible de générer une douleur et un stress de courte durée. Les injections intrapéritonéales, les prélèvements sanguins répétés et l'injection du traitement et le test comportemental répété à plusieurs reprises peuvent également générer du stress et une douleur légère et de courte durée. L’isolement et la restriction alimentaire nécessaires pour certaines tâches comportementales pourrait introduire un stress et une perte de poids limitée. Les injections neurochirurgicales pourraient potentiellement introduire un stress ainsi que de la douleur chez certains animaux dans les heures ou les jours suivants après la chirurgie.
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour permettre les analyses scientifiques biologiques par prélèvements de tissus
Remplacement
Notre projet propose de disséquer les mécanismes et les conséquences du rôle de mutations dans des gènes impliqués dans des maladies comme la dystonie et le Parkinson, dans l'apparition de troubles de l’apprentissage par récompense et de troubles du métabolisme, mettant en jeu différents réseaux neuronaux et métaboliques, ainsi que les voies de signalisation moléculaires chez les souris porteuses de ces mutations. Le fonctionnement de ce réseau ne peut, à ce jour, pas être reproduit ni modélisé par des modèles in vitro ou computationnels. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et ne peut se faire qu'à l'aide d'études comportementales au niveau de l'animal. Une fois les acteurs moléculaires déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures lorsque cela est possible pour limiter le nombre d'animaux utilisés. D'une façon générale, nous nous efforçons continuellement d'évaluer nos approches et adapter nos expériences pour des modèles in vitro ou computationnels autant que possible
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués est de maximum 13366 pour l'ensemble des procédures. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
Concernant le raffinement, pour toute cette étude, les conditions d'hébergement et les protocoles expérimentaux utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de douleur et d'inconfort possible. Pendant les procédures, les animaux seront observés et manipulés quotidiennement et une pesée sera effectuée régulièreement. Lorsque cela est possible, les animaux seront hébergés en groupe de 2 à 5 animaux, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne nocturne de 12h. L'eau, la nourriture seront fournies ad libitum sauf en cas de procédure avec restriction alimentaire, un carré de coton pour nidifier ainsi qu’un bâtonnet à ronger sont placés dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux un enrichissement. Si besoin, lors d’un petit effectif ou de tension dans le groupe un complet d’enrichissement peut être apporté par des maisonnettes ou des lanières de kraft. Ils feront l'objet d'un contrôle quotidien. L'évaluation de la douleur et de la détresse est réalisée en observant l'aspect des souris et leur comportement. Des points limites sont définis spécifiquement aux procédures et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Le cas échéant, des méthodes seront mises en place pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux (injection d'antalgiques) si trouble mineur ou passager, ou bien euthanasie règlementaire. Les mutations dans les lignées transgéniques envisagées ne sont pas dommageables pour l’état de santé de l'animal. Lors des chirurgies : mise en place de diverses mesures préventives des complications.
Choix des espèces
Dans nos études, les souris sont utilisées afin de tirer profit des techniques de transgénèse (souris transgéniques). La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies du mouvement proche de celle de l'homme. Il existe de nombreux tests comportementaux nécessaires pour cette étude qui sont développés chez la souris. La souris est un modèle reconnu d'étude du mouvement, notamment car elles ont des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et sont déjà utilisées dans des modèles de mouvements anormaux hyperkinétiques, particulièrement pertinents dans l'étude de la pathologie étudiée ici. La souris est aussi très utilisée dans les études de récompense, l’addiction, et l’anxiété. Les protocoles concernant ces aspects sont bien définis et les mécanismes sont également clarifiés. Concernant l’étude de métabolisme, la souris partage beaucoup de similarités physiologiques avec l’humain qui fait que la souris est un très bon modèle pour effectuer des études in vivo et ex vivo concernant la mesure d’insuline, concentration de glucose etc. la zone du cerveau de la souris qui nous intéresse (le striatum) murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et des humains, en faisant ainsi un modèle particulièrement utile à l'étude d'une maladie de cette zone , telle que les mouvements anormaux étudiés ici. Expériences chez des animaux adultes. Cette partie du projet s'intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des mouvements anormaux liés aux dystonie et à la maladie de parkinson, exprimés dans un organisme mature, à l'âge adulte, en prenant en compte la variabilité individuelle et le sexe. Afin de ne pas interagir avec les phénomènes développementaux, nous utiliserons donc uniquement des animaux adultes.
Décontamination de lignées transgéniques pour le maintien du statut sanitaire de la plateforme animalerie rongeurs.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée pour prélèvement, les autres redirigées vers d'autres projets ou l'élevage. Les mâles subissent une vasectomie, les femelles une superovulation par injections d'hormones puis une chirurgie de réimplantation d'embryons, pour débarrasser des lignées transgéniques de pathogènes et fournir aux équipes des souris au statut sanitaire conforme. Le porteur signale des pertes de sang, des douleurs post-opératoires et un risque d'arrêt cardio-respiratoire lié à l'anesthésie. Ce projet ne produit aucune connaissance en propre, il entretient et assainit un élevage destiné à d'autres expériences.
Objectifs
L'objectif du projet sera de garantir le statut sanitaire de la plateforme animalerie rongeurs. Ceci signifie que nous devons rendre les lignées dépourvues de pathogènes spécifiques car cela pourrait altérer la fiabilité et la reproductibilité des expériences des equipes de recherche.
Bénéfices attendus
Nous pourrons maintenir un elevage de la lignée avec un statut sanitaire conforme à notre plateforme. Les equipes de recherche de notre Institut doivent travailler sur des modèles exempt de pathogènes spécifiques afin que cela n'altère pas leurs projets. Cela evite aux equipes de recherche d'effectuer cette intervention chez un prestataire extèrieurs ce qui induirait un cout supplémentaire et un transport en plus pour les animaux.
Procédures
Une vasectomie sous anesthésie et analgésie (procédure chirurgicale de 10 minutes). Deux injections intra-péritonéales d’hormones sur animal vigile (procédure de 20 secondes à 46h d’intervalle). Cet acte pouvant être renouvelé 3 fois espacé de 15 jours au maximum. Une chirurgie de réimplantation d’embryon sous anesthésie et analgésie (procédure chirurgicale de 20 minutes). . Les animaux seront euthanasiés à la fin de la période de maintien par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
D'une manière générale, la vasectomie et la réimplantation d'embryons sont des chirurgies sans complication. Il peut cependant avoir quelques effets indésirables: perte de sang importante, cicatrisation difficile, douleur post opératoire. Les animaux sont anesthésiés, il y a donc certains risques difficultés d'endormissement, hypoxie, pouvant aller jusqu’à un arrêt cardio-respiratoire). Concernant la superovulation, il y a le stress lié à la contention et la douleur de courte durée liée aux injections d'hormones.
Devenir
Concerant la Vasectomie les animaux seront euthanasiés lorsque nous observerons une baisse de la fertilité (environ 1 an). Concernant la procédure sur les injections hormonales, une partie des animaux sera euthanasié car un prélévement est nécessaire, l'autre partie pourra être réutilisé pour d'autres projets. Concerant la procédure sur la réimplantation d'embryons, aprés le sevrage des animaux, les femelles seront euthanasiées.
Remplacement
Cette technique offre les meilleurs résultats en nombre d'animaux obtenus ainsi que dans la prise de risque sanitaire. Il s’agit de pouvoir mettre à disposition de la communauté scientifique de notre Institut des animaux conformes aux standards de recherche. Les projets qui en découlent seront eux même justifiés dans le cadre d’un projet. Le projet sera réalisé uniquement si aucune lignée avec statut sanitaire conforme n'est disponible, dans ce cas là aucun remplacement n'est possible.
Réduction
La redérivation se fait principalement avec les mâles d'interêt avec lesquels nous accouplons des femelles. Si les femelles ne présentent pas de bouchon vaginal elles seront reutilisées, les mâles sont reutilisés jusqu'au succés de la manipulation, puis redirigés vers d'autres projets. Le nombre totale d'animaux sur la totalité du projet dépendra des demandes d'importation des équipes de recherche. Pour chaque redérivation, nous demandons 3 mâles de la lignée, nous super-ovulons 6 femelles pour les accouplements (selon les projets précédents le minimum requis pour avoir un nombre de femelles avec bouchons vaginaux suffisant) et 15 femelles pour accouplements avec des mâles vasectomisés pour obtention des femelles pseudo-gestantes, sachant que les femelles sans bouchons vaginaux sont utilisées pour d'autre projet de redérivation ou pour des accouplements d'elevage. Le nombre totale d'animaux impliqués est de 1140.
Raffinement
Les animaux ont une pèriode d'acclimation d'une semaine et leur milieux de vie est contrôlé. Lors de la chirurgie, les femelles et les mâles recoivent une anesthésie et une analgésie adéquates pour eviter la douleur. La température sera contrôlée tout au long de la chirurgie. Toutes les cages sont enrichies avec du Kraft et un dôme est mis dans les cages des femelles et des mâles aprés chirurgie, de l'alimentet gelée sont disposées dans la cage. Les animaux sont manipulés par du personnel compétent pour diminuer le stress. Il seront attentifs par une surveillance journalière aux points limites: perte de sang, poils hérissés, animal prostré.
Choix des espèces
La souris est actuellement le modèle génétique de choix pour les expérimentations de notre Institut. La pertinence de ce modèle est justifié par chaque projet en fonction de leur domaine d'expertise. Chaque lignée transgénique que nous aurons décontaminé fera parti d'un projet scientifique d'une équipe de recherche. Les femelles donneuses auront entre 6 et 16 semaines, de manière à garantir une reponse hormonale optimale. Les femelles receveuses auront entre 8 et 26 semaines. Nous avons besoin de femelles matures pour la reimplantation, mais au dela de 6 mois les femelles commencent à avoir une matière grasse importante, ce qui rend la chirurgie plus complexe. Les mâles vasectomisés auront entre 3 et 18 mois, nous avons besoin d'animaux sexuellement mature, aprés 18 mois le taux de bouchon vaginal positif diminue.
Utilisation de miARN dans la prévention du cancer colorectal associé aux Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin
- Recherche appliquée
- Cancers
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une inflammation chronique de l'intestin évoluant vers le cancer, avec une injection dans le péritoine et sept prélèvements sanguins rétro-orbitaux sous anesthésie sur trente-neuf jours, provoquant diarrhées et pertes de sang. Le porteur indique que la vérification in vivo est "exigible réglementairement" avant tout développement clinique, et qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la "complexité" de la cancérisation. Le bénéfice annoncé, prévenir le cancer colorectal par des microARN, reste hypothétique.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) qui regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH) se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif. Les MICI peuvent survenir à tout âge mais sont le plus souvent diagnostiquées chez des sujets jeunes et 15 % des cas concernent des enfants. Chez environ 20 % des patients, les crises sont sévères nécessitant l'hospitalisation, l'arrêt de l'alimentation et un traitement parentéral pendant quelques jours. En outre, l’évolution de la maladie peut entraîner des complications aiguës chirurgicales et chroniques comme le cancer du côlon. Même si la pathogenèse des MICI n’est pas encore bien élucidée, des facteurs génétiques et environnementaux ainsi que des facteurs associés aux altérations du microbiote intestinal sont suspectés. La physiopathologie des lésions épithéliales intestinales notamment durant les phases aigues des poussées implique un processus inflammatoire résultant de la réponse immunitaire dite innée. Parmi les mécanismes de régulation de l’activité de cette réponse immunitaire, les microARN (ou miARN), qui sont des séquences d’ARN de petite taille, jouent un rôle en inhibant différentes voies de signalisation pro-inflammatoires. Le rôle de ces miARN dans la régulation du processus inflammatoire permet de les considérer comme de nouveaux outils thérapeutiques. L’objectif de ce projet est de tester, dans un modèle murin connu de MICI chronique/cancer, certains miARN précédemment identifiés comme jouant un rôle anti-inflammatoire afin d’évaluer leur potentiel effet inhibiteur du développement du cancer colorectal.
Bénéfices attendus
La stratégie de lutte contre l'inflammation induite lors des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin avec un miARN permettrait de prévenir le développement du cancer colorectal.
Procédures
Les animaux seront sousmis à une injection péritonéale pour une durée d'1 minute et sept injections sanguines sous anesthésie étalées sur 39 jours et pour une durée de 5 minutes par injection.
Impact sur les animaux
Le modèle d'inflammation chronique de l'intestin nécessite deux actes expérimentaux, à savoir des injections rétro-orbitales et des injections par voie péritonéales pouvant créer un léger stress pour l'animal. De plus le modèle induit des diarrhées et des pertes de sang légères et parfois une perte de poids.
Devenir
Le prélevement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro sur un modèle de cellules de l’intestin permettent de sélectionner les miARN présentant une activité anti inflammatoire intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique de notre candidat anti-inflammatoire lors d'un processus de cancérisation et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 32, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Les groupes contrôles des animaux ont été mutualisés aussi souvent que possible.
Raffinement
Les animaux seront hebergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées quotidiennement et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée enutilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Souris (Mus musculus) [A1
Choix des espèces
La souris est l'animal utilisé dans le modèle du cancer colorectal induit par une inflammation chronique du colon. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle du cancer colorectal.