Rongeurs
Evaluation préclinique d’une immunothérapie innovante dans la Maladie d’Alzheimer et autres pathologies liées à la protéine Tau chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
2 286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles portent des modèles de la maladie d'Alzheimer ou un système immunitaire déficient, et subissent une biopsie sur souriceau vigile, jusqu'à 59 injections dans l'abdomen, des prélèvements sanguins répétés et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le projet vise à évaluer une immunothérapie ciblant les cellules immunitaires liées à la protéine Tau. Le porteur affirme que ces interactions ne peuvent être reproduites en culture cellulaire et juge le modèle animal "totalement indispensable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par la perte progressive de la mémoire et des fonctions cognitives. Elle est définie par deux types de lésions cérébrales : celles liées à la protéine A-Béta, et celles liées à la protéine Tau. Ces agrégats protéiques induisent une réaction immunitaire à plusieurs composantes. La première composante, consiste en une inflammation chronique cérébrale pouvant avoir des effets bénéfiques ou délétères. Des études récentes ont montré l’existence d’une seconde composante, par laquelle des cellules immunitaires infiltrent le cerveau et promeuvent la progression du déclin cognitif. Plusieurs analyses chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux suggèrent que ces cellules ont un rôle délétère dans la MA. Des études ont montré que la modulation de ces cellules immunitaires délétères permet de réduire la perte de mémoire et de modifier l’inflammation cérébrale dans un modèle murin de pathologie A-Béta. Ces cellules immunitaires régulatrices pourraient également contrôler les réactions immunitaires pathogènes liées à la protéine Tau pathologique. Sur la base d’études pré-cliniques dans un modèle murin de pathologie Tau, l’objectif de ce projet est d’évaluer une approche thérapeutique innovante ciblant les cellules immunitaires dans la MA et d’autres pathologies liées à la protéine Tau.
Bénéfices attendus
La Maladie d’Alzheimer (MA) touche environ 1 million de personnes en France, avec 225 000 nouveaux cas chaque année. Cette maladie, sans traitement, nécessite une prise en charge importante liée à la perte d’autonomie des patients. Des études précliniques antérieures dans un modèle murin de MA ont apporté la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique d’un traitement à faible dose d’une molécule. Cette preuve nous a permis d’initier un premier essai clinique pilote pour évaluer l’efficacité thérapeutique de ce traitement modulant les réponses immunitaires délétères dans la MA précoce. Ce projet vise à présent à évaluer et établir la preuve de concept pré-clinique de l’efficacité accrue d’une nouvelle approche ciblant les réponses immunitaires pathogènes associées aux agrégats de protéine Tau. Ces études devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux essais cliniques thérapeutiques dans la MA et dans d’autres maladies neurodégénératives, dans le but de proposer une prise en charge plus efficace aux nombreux patients touchés par ces maladies.
Procédures
Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rends plus sensible aux infections. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (inférieur à 1mm) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des injections répétées au niveau de l’abdomen (intra-péritonéale) à raison d’un maximum d’une injection quotidienne durant 3 semaines à l’âge de 3 mois puis de rappel toutes les 3 semaines durant 5 jours jusqu’à l’âge de 9 mois (environ 20 secondes par injection). Les injections seront réalisées sur animal vigile avec au minimum 1 injection et au maximum 59 injections intra-péritonéales sur la durée du traitement. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile toutes les semaines durant 3 semaines puis au maximum toutes les 2 semaines sur la durée du traitement (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés entre 1 et 9 fois sur la durée du traitement. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 mois. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés selon différentes méthodes réglementaires à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Un autre modèle animal utilisé dans le projet dispose d’un système immunitaire déficient réduisant leur capacité à lutter efficacement contre les microbes ce qui les rend plus sensible aux infections. La biopsie (
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’impact du traitement sur les différents marqueurs de progression de la pathologie.
Remplacement
L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre les interactions neuroimmunes au cours des maladies neurodégénératives. Il nécessite donc l’utilisation d’un système expérimental intégré, permettant de comprendre la physiologie du système nerveux central et ses interactions encore mal connues avec le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent être reproduites par des cultures cellulaires, qui ne permettent que l’étude du contact entre les cellules immunitaires et les cellules nerveuses. Or, ce type d’interaction ne constitue qu’une fraction minoritaire des échanges en jeu dans les maladies neurodégénératives. Des simulations informatiques ont également été effectuées et nous ont permis de valider que des réponses immunitaires spécifiques contre la protéine Tau étaient possibles. Cependant, l’effet de la modulation de ces réponses sur les maladies neurodégénératives ne peuvent être évaluées que dans un organisme vivant. Un modèle animal est donc de ce fait totalement indispensable.
Réduction
Le projet impliquera un total de 2286 souris. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
L’ensemble des procédures réalisées au cours de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.) quand cela est compatible avec les expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Il s’agit également d’une espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives et de lignée immunodéficiente nécessaire à la mise en œuvre de ce projet. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Dans le cadre des traitements, ils seront initiés à l’âge de 3 mois, correspondant au stade précoce de la pathologie. Les animaux seront ensuite analysés à 9-10 mois (âge normal d’apparition des troubles cognitifs). Justification du sexe : Concernant les modèles transgéniques utilisés, nos résultats préliminaires indique qu’il existe une différence de phénotype comportemental et neuroimmunitaire entre mâles et femelles. Ainsi, l’ensemble des expériences sera réalisé sur les deux sexes de manière indépendante.
Travaux pratiques de physiologie : Etude de la respiration chez la souris mâle ou femelle
- Enseignement supérieur
100 souris vont être utilisées, gardées en vie pour être réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chaque souris respire de l'air enrichi en dioxyde de carbone puis de l'azote, avant de recevoir une injection d'une molécule du système sympathique, pour un travail pratique d'étudiants sur la respiration. Le porteur décrit un objectif de formation aux métiers de l'expérimentation animale et affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet cet apprentissage. Il indique que la contention et l'injection provoquent stress et douleur.
Objectifs
Dans le cadre du programme pédagogique national de notre formation, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé". En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". C’est dans le cadre de ces enseignements que ces travaux pratiques (TP) ont lieu. Ainsi, cette séance de TP chez la souris est destinée à des étudiants, dont la formation peut conduire à des métiers en lien avec le domaine de l’expérimentation animale. Dans ce contexte, les étudiants doivent acquérir un savoir-faire pour participer aux essais chez l’animal vigile et être en mesure de réaliser entre autres les traitements et les observations cliniques des animaux afin de pouvoir candidater sur les postes proposés par les organismes publics ou privés de recherche et par les industriels. D’autre part, cet enseignement pratique participe à une meilleure orientation de nos étudiants par la découverte concrète des exigences et responsabilités liées à l’utilisation de l’animal. Les objectifs pédagogiques de ces TP sont de plusieurs ordres: 1) d'un point de vue physiologique: mettre en évidence les régulations principales de la fonction respiratoire (dioxyde de carbone, oxygène, système nerveux sympathique) et évaluer le mode d'action d'une molécule de référence du système nerveux sympathique; 2) d'un point de vue expérimental chez l'animal: préhension de la souris, mettre en application les points clefs de surveillance d'un animal anesthésié vus lors du précédant TP (Anesthésie chez le rat), réaliser une injection intrapéritonéale (IP) chez la souris anesthésiée, appliquer des éléments de raffinement lors des procédures (lampe chauffante, gel lubrifiant et hydratatnt oculaire), apprendre à observer les réactions de l'animal d'un point de vue respiratoire suite aux différents tests pour savoir identifier les points limites, savoir recueillir des données expérimentales de façon exhaustive afin de répondre à l’objectif de l’étude (sensibilisation à la nécessité de préparer une étude afin d’en tirer les résultats attendus sans avoir besoin de les reproduire).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’apprendre aux étudiants de notre formation à réaliser des expérimentations in vivo de physiologie et pharmacologie. En effet, ce diplôme est réglementé au niveau national et le contenu des enseignements est défini selon un programme pédagogique national. Dans le cadre de ce programme, les étudiants doivent acquérir différentes compétences, notamment celle de "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé". En première année, l’acquisition de cette compétence doit se faire notamment lors d’un ensemble d’enseignements destinés à apprendre aux étudiants comment "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". Ainsi ce TP s’inscrit parfaitement dans ce cadre et les bénéfices attendus pour les étudiants sont les suivants : 1) Apprentissage de la manipulation de la souris anesthésiée : préhension, injection IP, suivi d'anesthésie, mesure de la ventilation pulmonaire; 2) Apprentissage du déroulé d’une étude en physiologie in vivo : recueil de données et traçabilité, analyse et interprétation des résultats; 3) Mise en pratique des éléments vus en cours théoriques sur l’éthique en expérimentation animale (mise en évidence de la règle de bien-être animal au cours du TP) et des réflexes à surveiller pour une bonne anesthésie (vus dans le précédent TP anesthésie chez le rat). L’enseignant s’assure tout au long du TP du respect de l’éthique et interroge régulièrement les étudiants sur les éléments indispensables au respect du bien-être animal dans ce protocole; 4) Réflexion sur les points limites à appliquer pour stopper certaines étapes de la procédure au besoin pour chaque animal. Enfin, ce TP participe à la bonne formation de nos étudiants dans le domaine de l'expérimentation animale et favorise donc à mettre sur le marché du travail des personnes avec des compétences solides dans ce domaine.
Procédures
Chaque souris recevra une injection intrapéritonéale (IP) d'un mélange anesthésique / analgésique, puis elle recevra sous anesthésie, 1 à 3 IP pour prolonger l'anesthésie/ analgésie : le site d'injection IP sera alterné à chaque fois. La profondeur de l'anesthésie sera évaluée pendant toute la durée de celle-ci en vérifiant la fréquence respiratoire et les réflexes cutanés (pincement des pattes postérieures et de la queue). Sous anesthésie, chaque souris respirera pendant 1 min de l'air enrichi en dioxyde de carbone, suivi de 20 min de récupération, puis elle respirera de l'azote gazeux pendant 5-10s, suivi de 20 min de récupération et enfin elle recevra une IP pour injecter la molécule de référence du système nerveux sympathique.
Impact sur les animaux
La contention et la manipulation des souris entrainent du stress, l'injection en intrapéritonéal pour induire l'anesthésie et l'analgésie engendre une légère douleur au site d’injection. Aucune douleur pour les autres injections intrapéritonéales n'est prévue, car elles seront faites sous anesthésie/analgésie.
Devenir
Toutes les souris seront gardées en vie à la fin du TP, car la procédure globale a été conçue de façon à ce que les animaux aient récupéré leur respiration basale après leur réveil. Elles pourront alors être réutilisées dans le cadre de procédures hors champ au sein de notre établissement. Cette réutilisation dépendra de l'état clinique des animaux au moment de la réutilisation et donc de l'avis du vétérinaire référent.
Remplacement
Dans le cadre de la formation de nos étudiants, le programme pédagogique national prévoit dans la compétence "mener des études à l’échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé", que les étudiants apprennent à "Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques chez l'animal", tout "en respectant la réglementation et les règles d'éthique sur l'utilisation du vivant". C’est dans le cadre de ces enseignements que ce TP aura lieu. Ce TP doit permettre d’une part d’évaluer in vivo les effets de variations de la composition en gaz de l'air inspiré et d'une molécule de référence du sytème adrénergique sur la respiration et d’autre part l’apprentissage par nos étudiants de la surveillance d'un animal anesthésié et de l'administration par voie intrapéritonéale (IP) chez un animal anesthésié. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de remplacement permettant une formation appropriée de nos étudiants tant sur le plan technique (manipulation de l’animal anesthésié, administration de substance chez l’animal anesthésié…) que sur le plan physiologique/pharmacologique (observation des effets induits par l'air modifié ou par la substance étudiée, pratique des méthodes d'évaluation des effets). Enfin pour favoriser l'apprentissage des étudiants et éviter d'intégrer des animaux d'entraînement, des vidéos présentant la réalisation des gestes techniques (préhension, placement du capteur de pression, pose des masques, injection IP) leur seront présentées avant le début du TP. L'enseignant mimera les gestes à faire avant chaque étape de la procédure sur une des 4 souris de chaque TP. De plus, les étudiants pourront au cours du TP s'entraîner à réaliser les injections IP en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge).
Réduction
Les étudiants, répartis en trinôme ou quadrinôme, travailleront avec une souris par trinôme ou quadrinôme. Cette répartition permettra aux étudiants de surveiller l'animal aisément tout en réalisant les enregistrements et les analyses des tracés de la respiration et l'injection de la molécule. Ce fonctionnement lors de ce TP permettra d'utiliser un nombre réduit d’animaux tout en garantissant un apprentissage de qualité des étudiants. Chaque année, 4 groupes de 14 étudiants au maximum réaliseront ce TP. A chaque séance de TP un enseignant encadrera 1 groupe d’étudiants. Comme les gestes à réaliser sont relativement simples, leurs démonstrations seront réalisées au début du TP grâce à des vidéos et seront mimées lors du TP sur les animaux des étudiants, évitant ainsi l'utilisation d'un animal de démonstration. De même au cours du TP, les étudiants pourront s'entraîner à réaliser les injections IP en manipulant des seringues/aiguilles dédiées sur un support inerte (éponge). Ainsi, pour chaque groupe de 14 étudiants maximum, 4 souris seront donc nécessaires. Soit un total de 4x4 = 16 souris par an et 4 souris supplémentaires seront prévues par an afin de remplacer éventuellement une souris ne pouvant pas entrer dans le protocole pour cause de santé, soit 100 souris sur 5 ans pour 280 étudiants au maximum. Chaque année, ce nombre sera bien entendu revu à la baisse si le nombre d'étudiants par groupe est inférieur à 14 étudiants.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe socialement harmonieux en présence de deux éléments d’enrichissement (papier absorbant et une petite maison ou tunnel soit en polycarbonate soit en carton). Les souris seront anesthésiées et analgésiées tout au long du TP. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée avant de commencer le protocole, mais également tout au long du TP, par les étudiants et l'enseignant. Tout signe de réflexe de l’animal induira l’administration immédiate d’une demi-dose supplémentaire d’anesthésique/analgésique (un quart de dose à la dernière étape de la procédure). Pendant la durée du TP, les animaux seront placés sous une lampe afin d’éviter toute hypothermie et un gel lubrifiant et hydratant oculaire sera déposé afin d'éviter la dessication de leurs yeux. L'enregistrement des paramètres de respiration se fera grâce à un capteur de pression situé à la surface de la cage thoracique et maintenu en place grâce à une ceinture velcro. Ce dispositif est donc non invasif. Les points limites spécifiques du projet seront appliqués : tout animal présentant des signes de stress ou de maladie (tels que poil hérissé, stéréotypie, comportement agressif ou absence de prise de poids telle qu'attendue à l'âge de ces animaux) ne sera pas inclus dans le TP et sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire référent; les procédures de variations de la qualité de l'air inspiré en dioxyde de carbone ou en oxygène ou l'injection d'adrénaline par voie intrapéritonéale se feront sous le strict contrôle de l'enseignant et les temps d'application choisis courts permettront la récupération d'une respiration basale en 1 à moins de 10 min pour l'animal. Par ailleurs préalablement au TP, les animaux auront été manipulés régulièrement, afin de diminuer leur stress lors de l’injection intrapéritonéale destinée à l'anesthésie/analgésie et une récompense (de type vers séchés, mélange de fruits légumes et graines, mini-gouttes de yaourt, billes de céréales, pop corn, gâteau sec…) leur sera donnée afin d'augmenter leur familiarité. De plus, toujours pour diminuer le stress des souris, leur répartition dans leur cage d’hébergement sera conservée à l’issue du TP et une nouvelle récompense leur sera donnée après leur réveil. Enfin, le fait que les étudiants aient déjà vu les procédures en image ou en démonstration améliore leur travail sur les animaux et garantit une meilleure réussite des différentes procédures et donc de l'ensemble de ce TP.
Choix des espèces
La souris est bien connue des points de vue physiologique et pharmacologique et c'est aussi l'une des espèces les plus utilisées en recherche et pharmacologie. De plus, sa taille permet une surveillance aisée de l’animal entier anesthésié et un enregistrement facilité des paramètres basiques de la respiration/ventilation pour des étudiants. Les souris devront peser entre 30 et 45g. Ce poids est adapté à la taille des capteurs et des ceintures que nous avons à disposition et qui permettent d’enregistrer les paramètres de respiration.
Développement des nouvelles techniques d’imagerie et photostimulation multi-photonique pour l’étude des circuits neuronaux dans les rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une injection de vecteur viral sous anesthésie, 900 subissent une craniotomie avec pose d'une barre de tête et d'une fenêtre crânienne, et une partie est observée éveillée sous contention, pour mettre au point de nouveaux microscopes d'étude des circuits visuels. Le porteur indique que les implants peuvent causer douleur, stress et perte de poids pendant un à trois jours. Il affirme que ces circuits ne sont pas observables in vitro et juge l'usage de l'animal "scientifiquement indispensable".
Objectifs
Ce projet vise à mettre au point des nouvelles technologies d’optique permettant de contrôler avec plus de précision les neurones impliqués dans la vision. L’objectif est de comprendre comment les circuits neuronaux de la vision sont organisés et comment ils traitent les signaux sensoriels pour produire le comportement. Nous concevons et construisons de nouveaux microscopes utilisant des techniques d’optique pour mise en forme de la lumière. Jusqu’à présent, les études n’ont pu être réalisées qu’en surface dans les tissus, ou dans des échantillons transparents. Ces nouveaux microscopes constituent des outils sans précédent pour l’étude en profondeur des circuits visuels. En effet, les nouvelles méthodes d’optique développées permettront d’activer des neurones spécifiques avec la lumière et de décrire l’architecture des connexions neuronales dans une même région du cerveau ou entre deux régions différentes afin de comprendre les dynamiques de la perception sensorielle. Ce travail sera mené essentiellement dans des circuits du cortex cérébral.
Bénéfices attendus
Le projet permettra : 1. Le développement de nouvelles technologies d’optique pour la manipulation et l’enregistrement de l’activité neuronale dans le cerveau. Les nouvelles techniques optiques permettront l’étude des circuits neuronaux avec la lumière de façon plus précise par rapport aux méthodes utilisées jusqu’à présent. 2. Les nouvelles techniques optiques permettront de contrôler l’activité des neurones dans des régions du cerveau en profondeur. 3. Cette étude nous permettra de comprendre les mécanismes de perception sensorielle et la structure des circuits neuronaux impliqués, afin de cibler au mieux les thérapies géniques pour la restauration sensorielle en cas de pathologie (par exemple visuelle).
Procédures
1-L’injection d’un vecteur viral sous anesthésie profonde (durée de la chirurgie : 45 min) sera réalisée sur tous les animaux (1320 souris) et sous conditions stériles. 2-Une craniotomie sera réalisée sur une partie des animaux (900 souris) sous anesthésie profonde ; une barre de tête et une fenêtre seront posées. Durée : 1h. 3-Une partie des animaux observés en microscopie multi-photonique sera sous anesthésie profonde (600 souris) (durée : 1-6h). 4-Une partie des animaux observés en microscopie multi-photonique sera vigile (300 souris) (durée : 1-2h). Les expériences avec animaux vigiles seront précédées d’une habituation de l’animal à l’environnement afin de minimiser le stress de l’animal (durée : quotidiennement de quelques minutes à 1 heure, habituation progressive de plusieurs jours). 5- Un prélèvement caudal sera réalisé sur tous les animaux (1320 souris maximum) pour déterminer le profil génétique (durée : 5 minutes). L’analgésie est toujours utilisée avec l’anesthésie lors des chirurgies. Une euthanasie par une méthode réglementaire est nécessaire en fin de procédure pour les prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à ce que certaines chirurgies, comme les implants chroniques, puissent causer de la douleur, du stress ou une perte de poids temporaire. Des effets indésirables (stress ou douleur) peuvent durer pour un temps variable d’une journée à 3 jours après l’opération. Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur. L’adaptation de l’animal à l’environnement expérimental et au microscope d’enregistrement est accompagnée au début d’une détresse de l’animal, qui va diminuer avec l’habituation en quelques jours. Un risque de stress cardio-respiratoire est aussi présent lors de l’anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet pour prélever le cerveau et vérifier les données obtenues en microscopie multi- photonique.
Remplacement
Une partie des expériences avec les nouvelles protéines sensibles à la lumière et les indicateurs d’activité neuronale seront faites d’abord dans des modèles cellulaires in vitro, pour identifier les plus efficaces avec les systèmes optiques développés. Des simulations par ordinateur, préalables aux expériences, sont utilisées pour obtenir les paramètres optimaux d’illumination des tissus (température, modèles pour l’activation des protéines sensibles à la lumière…). À l’heure actuelle, ce modèle ne peut pas être entièrement remplacé par une approche alternative in vitro car les circuits neuronaux activés par la stimulation sensorielle ne sont pas observables in vitro. L’utilisation de l’animal est donc scientifiquement indispensable à notre étude.
Réduction
L’utilisation d’animaux avec implants permanents nous permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à chaque expérience. Cela nous permettra de travailler sur un plus petit nombre d’échantillons sur lesquels nous répéterons les stimulations avec la lumière. Grâce à des schèmes et formules mathématiques développés dans notre laboratoire, capables de définir préalablement des profils de stimulations avec la lumière (nombre de cellules et séquences de stimulation), nous pouvons réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention des données requises pour notre étude. Les schèmes de stimulation nous permettent aussi de réduire la durée des expérimentations. Pour chacune des mesures à réaliser, nous utiliserons des tests statistiques pour l’interprétation des résultats. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Au total, et sur 5 ans, nous utiliserons 1320 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes de 5 congénères dans des cages ventilées. Ils seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation (cages de stabulation avec enrichissement, nourriture et boisson à volonté). Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours minimum avant expérimentation. Une signalétique particulière sera utilisée pour les animaux en expérimentation. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis pour chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque type d’expérimentation. L’utilisation d’une grille d’évaluation permettra de définir les points limites pour chaque acte expérimental, afin d’éviter toute souffrance de l'animal et permettre l’euthanasie lorsque celle-ci ne peut être prise en charge. Les animaux observés éveillés seront soumis à un entrainement avant les observations au microscope, pour les habituer à leur environnement et réduire le stress.
Choix des espèces
Notre modèle animal est la souris adulte car ce modèle, très utilisé par les laboratoires de recherche, permet d’étudier le fonctionnement de circuits neuronaux complexes dans des conditions physiologiques proches de l’Homme. La taille du cerveau de souris est aussi idéale pour les études sous microscope avec haute précision. Le modèle souris permet aussi de disposer d’animaux ayant des particularités génétiques pertinentes pour notre étude. Nous utiliserons des souris âgées entre 28 jours et 1 an avec circuits neuronaux matures.
Étude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique durant la gestation chez le rat Wistar.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
964 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles reçoivent un régime gras et sucré pendant plusieurs semaines, une injection sous-cutanée quotidienne et des gavages de glucose répétés pendant la gestation, avant d'être tuées un jour avant la mise bas pour prélever leurs organes et ceux des fœtus. Le projet cherche à comprendre le rôle d'une modification protéique dans l'hypertrophie cardiaque liée au diabète gestationnel. Le porteur affirme que reproduire le développement cardiaque in vitro n'est "pas envisageable" et juge l'usage d'animaux "indispensable".
Objectifs
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. L’O-GlcNAcylation est une modification protéique qui est augmentée lors d’hyperglycémie et qui a été démontrée comme étant impliquée dans l’hypertrophie cardiomyocytaire. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation associée à l’hyperglycémie, pourrait être un facteur pathogénique de l’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de l’O-GlcNAcylation dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique au cours de la grossesse (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans les atteintes du développement cardiaque induites par l’hyper O-GlcNAcylation.
Bénéfices attendus
Les défauts cardiaques et l’hypertrophie myocardique sont 3 fois plus fréquents chez des enfants de mères diabétiques. L’hypertrophie cardiaque néonatale associée au diabète gestationnel a longtemps été considérée comme une conséquence de l’hyperinsulinémie fœtale. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire conduisant à l’hypertrophie cardiaque dans un contexte de diabète gestationnel n’a été validé. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent 1 unique procédure qui correspond à une alimentation standard ou riche en sucre et lipides sur une période de 9 à 17 semaines. 1 jour avant l’accouplement et jusqu’au sacrifice ou la mise bas les mères recevront une fois par jour, une injection sous cutanée de NButGT afin d’augmenter les niveaux de O-GlcNAcylation indépendamment de la diète. Entre la 12ème semaine d’âge et jusqu’à la mise bas, 1 fois par semaine, des tests de tolérance au glucose oral ainsi que des mesures de glycémie seront réalisées afin de valider l’intolérance au glucose. Le test de tolérance au glucose orale consiste en un gavage oral de glucose et au suivi de la glycémie sur les 2 heures suivantes. Les mesures de glycémie sont réalisées grâce à un glucomètre avec prélèvement d’une goutte de sang à la queue des animaux. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel du diabète +/- O-GlcNAcylation sera réalisée via une échocardiographie et un électrocardiogramme sur les animaux à 60 jours post naissance. A la fin de cette période, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang).
Impact sur les animaux
L’alimentation riche en sucre et gras utilisée dans ce projet est une alimentation très bien décrite dans la littérature. A ce jour, aucune étude n’a démontré une modification délétère du phénotype des animaux nourris avec cette diète. L'injection sous cutanée peut entrainer une inflammation localisée qui sera surveillé quotidiennement.
Devenir
A la fin de la procédure (procédure sans réveil), l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.
Remplacement
Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches in vitro n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’hypertrophie cardiaque, le diabète gestationnel et l’O-GlcNAcylation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 964 animaux. Lors de la phase d’analyse, des tests statistiques type ANOVA 1 voie seront réalisés.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors de l'euthanasie des animaux, et lorsque cela est possible (euthanasie des mères, des animaux à 60 jours), une couverture anesthésique sera mise en place. L'euthanasie des animaux à 12 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien entre une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, et l’hypertrophie cardiaque pédiatrique dans un contexte de diabète gestationnel. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux au stade embryonnaire E15,5 ; E20,5, à la naissance (J0), à 12 et 60 jours post naissance (J12 et J60), permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque embryonnaire et post-natal.
Rôle de l’habenula latérale dans l’intégration des signaux olfactifs sociaux chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
775 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, et la déclaration en compte 20 sans réveil, 100 en souffrance légère et 655 en souffrance modérée. Selon les groupes, elles subissent une chirurgie du cerveau de 30 minutes pour y injecter des virus, des analogues ou des antagonistes, des frottis vaginaux répétés pour les femelles, des recueils d'urine en leur massant le ventre, sept jours d'isolement avant des tests olfactifs d'évitement et de préférence sexuelle, et pour certaines huit injections dans l'abdomen, ou une injection d'endotoxine qui mime une infection pour que leur urine porte l'odeur d'un congénère malade. Les bénéfices annoncés, à moyen terme, relèvent de la connaissance : montrer qu'une région du cerveau, l'habenula latérale, relaie les odeurs sociales, et que deux hormones de la reproduction agissent dès la transmission de ces odeurs. Le porteur juge "impératif d'utiliser un animal entier", tout en écrivant que s'appuyer sur des "données fortes de la littérature" lui permettra de limiter le nombre de tests.
Objectifs
Chez la plupart des animaux, les signaux chimiques olfactifs sont cruciaux pour communiquer des informations sur leur identité, leur organisation sociale, leur maturité sexuelle et leur territoire. Ces odeurs sociales sont intégrées via les neurones sensoriels du système olfactif et sont ensuite codées par des voies cérébrales spécifiques, afin de déclencher des comportements sociaux appropriés. Récemment, l'habenula latérale (LHb), une région cérébrale épithalamique qui participe à l'apprentissage à partir d'expériences aversives, a été impliquée dans la régulation des comportements sociaux et reproducteurs chez les mammifères. Les lésions habénulaires chez les rongeurs entraînent une altération de la sensibilité aux stimuli olfactifs, provoquent une diminution de la réactivité sexuelle (lordose) et un évitement des contacts sexuels. En outre, l'Hb reçoit les projections neuronales exprimant des hormones contrôlant la reproduction : la gonadolibérine (GnRH) et la kisspeptine (KP)). Il a été montré que l’LHb exprime les récepteurs de ces deux hormones. Cependant, le rôle de LHb comme centre de traitement olfactif régulant les comportements sociaux ainsi que la modulation de la fonction de l'Hb par les hormones GnRH et KP restent peu compris à ce jour. Nos résultats préliminaires montrent que LHb est activée par des stimuli olfactifs contenus dans l’urine de congénères malades. Ces mêmes stimuli olfactifs provoquent aussi l’évitement du congénère malade par la souris saine. Par conséquent, ce projet a pour objectif de : (i) caractériser le rôle de la LHb dans le traitement des odeurs sociales lié à l'évitement des congénères malades et à l'attirance sexuelle ; (ii) déterminer le rôle de la GnRH et de la KP dans la modulation du traitement des odeurs d'attraction sexuelle par LHb.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus avec ce projet seront de deux ordres à moyen terme : (i) la mise en évidence que l’LHb relaie des informations externes, telles que les odeurs sociales, permettant une régulation fine des comportements sociaux adaptatifs ; (ii) que les hormones KP et GnRH ne sont pas seulement des régulateurs clés de l'axe de reproduction hypothalamo-hypophyso-ovarien mais qu’ils peuvent aussi agir en amont dès la transmission des stimuli olfactifs.
Procédures
Les neurochirurgies seront d'une durée moyenne de 30 minutes par animal. Une seule neurochirugie sera effectué par animal. Pour déterminer le stade du cycle sexuel, les femelles auront 4 à 8 frottis vaginaux, prélévement de quelques secondes. Ces femelles seront vigiles et maintenues pendant le prélèvement. Selon les résultats des tests comportementaux, l'urine sera prelevé entre 4 à 8 fois pour chaque animal, en maintenant la souris et en massant délicatement son ventre afin de favoriser la miction dans le tube et ainsi récolter l'urine. Quelques secondes suffisent pour récolter l'urine. Pour les urines de souris mimiquant un état infectieux aigüe, une seule injection de l'endotoxine en intrapéritonéale (IP) sera effectuée et l'urine sera prélevée qu'une seule fois par animal. Chaque souris injectée avec l'inhibiteur de l'excitation neuronale, recevra au total 4 injections de l'activateur de l'inhibition en IP (1 fois/semaine) et 4 injections du tampon contrôle en IP (1 fois/semaine) juste avant le test olfactif. Chaque test olfactif durera 10 minutes. Toutes les injections IP ne dureront que quelques secondes.
Impact sur les animaux
La chirurgie nécessaire à l'injection des virus, analogues et antagonistes peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Elle peut induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours essentiellement localisée au niveau du site d’incision du crâne. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines est possible. Il s’agira d’un stress aigu de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux injectés avec l'endotoxine pourront développer des effets secondaires transitoires tels que fatigue, réduction de l'appétit et diminution de l'intérêt social. Ces effets, qui peuvent être observées 2 à 3 h après l'injection de l'endotoxine, disparaissent rapidement et n’entraînent pas d’effet à long terme. Les animaux injectés avec l'activateur d'inhibition pourront développer des effets secondaires transitoires tels qu'une diminution de la locomotion et de l'anxiété. L'injection intrapérotonéale peut parfois générer une douleurs et hématome au point d'injection. Les animaux expérimentaux isolés 7 jours avant les tests olfactifs pourront présenter du stress lié à leur hébergement solitaire.
Devenir
Tous les animaux seront tous euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux utilisés pour les prélévements d'urine qui seront euthanasiés par le personnel animalier.
Remplacement
A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) ne peut être utilisée pour ce projet qui est dépendant de l'interconnectivité́ de neurones de résidants dans plusieurs structures qui sont à la fois olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de transmission et de régulations interconnectant l’olfaction et les fonctions comportementales des mammifères. Néanmoins nos expériences s’appuient sur des données fortes de la littérature ce qui nous permettra de limiter le nombre de tests et d’acquérir des résultats pertinents.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. La taille de nos échantillons a été calculée grâce à un logiciel spécialisé. Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaire, nous réutiliseront les mêmes animaux pour l’étude comportementale d’évitement et de préférence sexuelle. La significavité des résultats sera évaluée grace à des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe sociaux en présence d’enrichissements (abri cartonné complémenté de matériel de nidification)] avec un accès à la nourriture et boisson ad libitum. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies avec une première sédation analgésique suivie d’une anesthésie gazeuse. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflamatoire non stéroidien permettant une couverture analgésique de 24h. L’administration sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoire si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant la neurochirurgie pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra une dose de molécule contrant les effets de l'analgésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation en se conformanat aux points limites post-opératoires connus chez cette espèce.
Choix des espèces
Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par l’olfaction chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés et bien décrits majoritairement régulés par les signaux olfactifs. En outre, cette espèce permet des approches génétiques fonctionnelles (génération d'animaux mutants par exemple) qui ne sont pas ou peu possibles sur d'autres espèces. Les animaux mâles ou femelles seront des adultes qui seront âgés de 8 semaines au début des expériences.
Révéler la neuroanatomie des fibres de la matière blanche chez la souris.
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
107 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une intervention neurochirurgicale sous anesthésie de 30 à 45 minutes, avec un risque de douleur, d'infection et de perte de poids, pour cartographier l'organisation des fibres de matière blanche du cerveau. Les retombées annoncées pour l'humain, une meilleure compréhension du cerveau normal et pathologique, sont renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que seuls les modèles mammifères conviennent et conclut que le recours à la souris est "nécessaire".
Objectifs
L'objectif global de notre projet est de faire progresser nos connaissances anatomiques sur la manière dont le cerveau est connecté. Pour ce faire, nous étudierons l'organisation de la matière blanche (qui contient les voies qui relient les différentes régions du cerveau) dans le cerveau de la souris. Les techniques non invasives actuellement disponibles pour étudier ces voies sont incapables de révéler de manière fiable l'organisation des structures complexes telles que les faisceaux de fibres et manquent de la précision par rapport à la neuroanatomie de référence. Par conséquent, nous visons à améliorer la précision avec laquelle nous pouvons étudier l'anatomie de ces voies en utilisant une approche multimodale avancée. En fin de compte, les connaissances et la méthodologie développées dans ce projet serviront de d'étape clé pour une approche similaire appliquée à d'autres espèces, y compris le cerveau humain, et contribueront à une meilleure compréhension de l'organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau humain, qu'elle soit normale ou pathologique. A termes, notre étude conduira également au développement des modèles informatiques et algorithmes prédictifs qui permet d'éventuellement remplacer certaines études impliquant les animaux.
Bénéfices attendus
La matière blanche du cerveau est impliquée dans un certain nombre de maladies humaines. Une meilleure compréhension de son organisation structurelle et fonctionnelle dans des conditions normales est nécessaire pour identifier et comprendre les différences qui peuvent survenir dans des conditions "anormales" ou pathologiques. En améliorant la précision de nos connaissances sur la neuroanatomie de la matière blanche du cerveau, notre projet permettra de mieux comprendre l'organisation structurelle et fonctionnelle du cerveau. En outre, les méthodes et approches techniques que nous innoverons dans notre projet d'étude du cerveau de la souris contribueront au développement d'une nouvelle approche qui permettra une étude fiable de la neuroanatomie de la matière blanche dans le cerveau humain.
Procédures
Les animaux subiront une seule intervention neurochirurgicale sous anesthésie d'une durée de 30 à 45 minutes, qui n'aura lieu qu'une seule fois dans la vie de la souris.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent une brève intervention chirurgicale sous anesthésie. Cet acte comporte un faible risque de douleur, d'infection, d'inconfort et de perte de poids.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Nous utiliserons la souris parce qu'elle possède les structures cérébrales que nous étudions et qui existent également chez l'homme. Comme nos recherches visent à fournir un aperçu et des bases pour des études plus approfondies sur les cerveaux humains, un modèle mammifère est préférable en raison de la plus grande similitude de l'organisation des structures neuronales. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possible. A notre connaissance, seuls les modèles mammifères, et plus particulièrement la souris (grâce à sa petite taille permettant la visualisation de son cerveau entier lors des approches de microscopie à lumière), répondent à l'ensemble de ces critères. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre projet car des procédures invasives sur le tissu vivant soient nécessaires pour effectuer le marquage par vecteurs viraux. Cela empêche l'utilisation des tissus port mortem humains. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Le projet vise à contribuer à la validation et au développement d'outils de prédiction et de modèles cérébraux in silico. Il contribuera au développement d'une ressource réutilisable à la disposition de la communauté scientifique qui pourra à terme réduire et même remplacer les études sur les animaux. De par sa nature même, il contribuera directement aux objectifs de réduction prévus par les principes des 3Rs et la législation européenne. Le succès de notre projet repose sur des aspects techniques : la capacité de cibler des zones cérébrales de faible volume et nécessitant une grande précision, la capacité de réaliser un marquage intense des neurones nécessitant une optimisation de notre approche expérimentale. Plusieurs facteurs sont susceptibles d'influencer les résultats obtenus. Pour ces raisons, il est très difficile d'estimer a priori le nombre d'animaux nécessaires. Cependant, nous sommes et resterons très attentifs à l'objectif de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. C'est pourquoi nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale qui nous permettra d'analyser nos données au fur et à mesure (c'est-à-dire des expériences réalisées sur de petits lots de 2 à 5 animaux). Cela nous permettra de modifier notre stratégie expérimentale et d'arrêter les expériences dès que le résultat obtenu sera satisfaisant. Comme notre stratégie expérimentale dépend de ces facteurs techniques, nous ne sommes pas en mesure de proposer des tests statistiques pour estimer la taille de l'échantillon nécessaire.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal pendant la période précédent l'intervention chirurgicale conformément aux critères généraux. iii) Intervention immédiate et appropriée (si nécessaire) - les mesures conservatrices doivent être privilégiées. iv) Perfectionnement des procédures chirurgicales afin de réduire le risque de douleur ou de souffrance v) Lors de la chirurgie : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation des produits anti-douleurs adaptés. Respect des principes d’hygiène et d'asepsie. Surveillance continue, application d'une procédure de "nursing" si nécessaire. vi) Formation appropriée et actualisée des expérimentateurs aux techniques chirurgicales pertinentes. vi) Adaptation des conditions d'hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris parce qu'elle possède les structures cérébrales que nous étudions et qui existent également chez l'homme. Etant donné que nos recherches visent à fournir un aperçu et des bases pour des études plus approfondies sur le cerveau humain, un modèle mammifère est préférable puisque l'organisation des structures neuronales est grandement similaire. Bien que nos recherches initiales utilisent des animaux sains, nous avons l'intention d'effectuer des recherches semblables sur des modèles de pathologie humaine. À ce jour, la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible de modifier le génome de manière routinière et constitue donc le modèle idéal pour nos recherches. La petite taille du cerveau de la souris permet de l'adapter à la fois à l'appareil d'IRM et au microscope optique, qui sont tous deux des dispositifs essentiels à notre étude. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (âgés de 4 à 6 semaines), premièrement car les circuits neuronaux concernés sont stables à cet âge par rapport à des souris plus jeunes, mais aussi car il sera plus facile de nettoyer le cerveau pour l'imagerie. En effet, ce processus d'élimination des lipides du cerveau de la souris devient techniquement plus difficile chez les adultes plus âgés. Il s'agit d'une étape cruciale pour préparer le cerveau à la visualisation de structures spécifiques et, par conséquent, un jeune adulte est l'âge optimal pour faciliter une procédure réussie. Le choix de la souris est également motivé par nos données antérieures et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà développés, qui garantissent le succès de notre étude.
Evaluation du profil pharmacocinétique de candidats médicaments chez le cobaye
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
720 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart tués à l'issue, environ 5 % pouvant être réutilisés. Ils subissent une chirurgie de pose de cathéters ou de minipompe, un isolement d'une semaine, des prélèvements de sang répétés et un prélèvement terminal de liquide céphalo-rachidien, pour mesurer le devenir de candidats médicaments dans l'organisme. Le porteur reconnaît que les effets indésirables des produits ne sont pas prévisibles au départ du projet. Il présente le recours à un modèle en "corps entier" comme "indispensable", aucune méthode in vitro ne reproduisant selon lui la pharmacocinétique.
Objectifs
Le projet consiste à évaluer le profil pharmacocinétique de candidats médicaments chez le cobaye (vigile ou anesthésié), grâce à des prélèvements répétés dans le temps d'échantillons sanguins après administration des produits à tester ainsi qu'un prélèvement terminal de LCR (Liquide Cephalo-Rachidien). Le but est d’évaluer la concentration d'un produit ou de marqueurs biologiques dans le sang ou dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Certaines voies d'administration et de prélèvements nécessiteront une chirurgie préalable afin d'implanter le dispositif nécessaire à l'injection des produits à tester ou nécessaire à des prélèvements sanguins (cathéters ou minipompes).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (cobaye) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Chirurgie d'implantation de cathéters et/ou minipompe (pour prélèvements et/ou administration). Cette chirurgie durera environ 20-45min. Isolement des animaux pour récupération post-chirurgicale (durée maximale de 1 semaine post-chirurgie). Manipulation des animaux pour administration anesthésiques, analgésiques et du produit à tester (durée inférieure à 3 minutes). Prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié ou conscient (durée entre 1 et 4 minutes). Prélèvement sanguin terminal et prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie (durée entre 4 et 6 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échanges avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. La manipulation des animaux vigiles pour induire l'anesthésie, l'analgésie et administrer le produit peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. La chirurgie d'implantation peut induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins postopératoire (sauf cas d'intéraction avérée entre les analgésiques et le produits à tester). Post-chirurgie, les animaux pourront être isolés : 1 semaine maximum post-chirurgie. Cet isolement engendra un stress de durée moyenne et d'intensité modérée. Les cobayes de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture et à l'isolement en cage de mise à jeun. Ils pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille ou une contrainte légère liée à l'administration per os lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Tous les animaux implantés avec des cathéters ou avec une mini-pompe seront mis à mort. Ce sera également le cas pour les animaux avec prélèvements terminaux (liquide cephalo-rachidien et prélèvements sanguins). Les animaux non-implantés (cathéters et/ou mini-pompe) ou les animaux n'ayant pas subi de prélèvements terminaux pourront être réutilisés (environ 5% des études). Leur réutilisation sera possible si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le cobaye afin d'étudier la pharmacocinétique d’un candidat médicament. La pharmacocinétique consiste à suivre le devenir d'un produit dans un organisme (le plus souvent, concentration du produit dans le sang). Le candidat-médicaments dans un organisme (de son entrée à sa sortie) est soumis à différentes voies d'absorption puis dégradation pour enfin être éliminé (dégradation hépatique, rénale, etc...). Ainsi, le recours à l'animal est à l'heure actuelle indispensable car il est nécessaire d'utiliser un modèle en "corps entier". En effet, aucune modélisation in silico ou analyse in vitro ne peut reproduire la complexité de la pharmacocinétique d'un composé chez le mammifère (absorption, dégradation, élimination).
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe, 8 animaux, est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses pharmacocinétiques.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période postopératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Les cobayes font parties des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour les modèles animaux de la recherche biomédicale dont les études de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir d'un candidat-médicament au cours de son développement préclinique. Les cobayes sont également pertinents lors des études de médecine comparative. D'une part, ce sont des animaux de petite taille, facile d'entretien, avec un cycle de vie court et pour lesquels il existe une abondance de leurs ressources génétiques. D'autre part, le cobaye est particulièrement utilisé pour évaluer les effets d'un produit sur le système cardiovasculaire. En effet, le cobaye possède un profil proche de celui de l'Homme (notamment au niveau de ses cellules cardiaques). Ainsi, cette espèce est pertinente pour évaluer le profil pharmacocinétique de substances, en complément d’études cardio-vasculaires. Dans ce projet seulement des animaux adultes seront utilisés. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Etude de l’effet de peptides dérivés de l’endogline sur l’hémostase et sur l’angiogenèse chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines portent une maladie du saignement, avec hémorragies et malformations des vaisseaux, et subissent une coupure de la queue pour mesurer le temps de saignement, une ponction cardiaque ou la pose puis le retrait chirurgical d'implants aux flancs, pour tester des peptides contre une maladie génétique rare. Le porteur indique que des tests sur plaquettes humaines et une optimisation par ordinateur ont précédé ces expériences. Il présente la mise au point d'un traitement local comme "essentielle", les patients n'ayant aujourd'hui aucune solution sans risque.
Objectifs
Ce projet porte sur l’étude de peptides (séquence d’acides aminés), dérivés d’une protéine des vaisseaux sanguins. L’absence de cette protéine entraîne chez l’homme une maladie génétique rare, responsable de malformations des vaisseaux sanguins et de saignements de nez spontanés et récurrents. Au cours des 15 dernières années, plusieurs traitements ont été proposés mais aucun n’a été totalement efficace, entraînant soit des risques de formation de caillots dans le sang, soit une résistance ou une rechute de la maladie. Développer une nouvelle solution thérapeutique visant l’hémostase (le mécanisme permettant d’arrêter un saignement), et notamment les plaquettes serait essentiel pour traiter la maladie. Dans ce contexte, nous avons récemment démontré qu’un peptide dérivé de cette protéine est capable d’agir sur les plaquettes sanguines et de les agréger, permettant l’arrêt du saignement. Lors d’une étude préliminaire, nous avons montré que ce peptide est également efficace sur un modèle de souris mimant cette maladie, faisant de ce peptide une potentielle cible thérapeutique. Nous cherchons à optimiser ce peptide et avons identifié trois variants de sa séquence semblant améliorer son efficacité. Le but de ce projet est donc de tester sur différents modèles de souris l’efficacité des variants sur le temps de saignement, l’effet sur l’agrégation plaquettaire et l’effet sur la formation des vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
Cette étude pourrait permettre de proposer une nouvelle solution thérapeutique au traitement d’une maladie génétique rare. En effet, à terme, le but est de développer un traitement local, qui non seulement arrêterait le saignement mais apporterait également un effet préventif. Les patients n’ayant à l’heure actuelle pas de traitement sans risque de complication, de résistance ou de rechute, le développement de nouvelles thérapeutiques améliorerait leur prise en charge.
Procédures
Une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), une injection intra-péritonéale d’anesthésique (15 secondes /souris) puis une coupure de l’extrémité de la queue, sous anesthésie (10 min). Après un mois de repos, de nouveau une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), une injection intra-péritonéale d’anesthésique (15 secondes /souris) puis un prélèvement sanguin au niveau du cœur, sous anesthésie générale (30 secondes /souris). Ou : Une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris) puis, sous anesthésie gazeuse, une injection d’implant gélifié au niveau des flancs (2 fois 15 secondes /souris). Une à deux semaines plus tard, une injection sous-cutanée d’analgésique (15 secondes /souris), puis sous anesthésie gazeuse, une incision de la peau au niveau des flancs pour récupération des implants (2 fois 1min/souris).
Impact sur les animaux
Les souris modèles de pathologies du saignement peuvent présenter des nuisances dues à leur phénotype : hémorragies en cas de blessures, saignements de nez, malformation des vaisseaux sanguins. Les manipulations peuvent entraîner un stress à l’animal après réveil, avec un risque de reprise de saignement dans les jours suivants. Elles peuvent également entraîner un stress et une légère douleur au moment de l’anesthésie et de la prémédication (contention, piqure). Les implants gélifiés peuvent entraîner une légère gêne.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort sous anesthésie générale afin d’effectuer des prélèvements et réaliser des études ex vivo.
Remplacement
Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des plaquettes humaines de volontaires sains afin de démontrer l’efficacité du peptide sur la coagulation du sang. L’optimisation de la structure des variants a été réalisée par ordinateur, 3 variants sur les nombreux identifiés ont été sélectionnés pour être testés dans nos différents modèles murins. Ces expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet de notre peptide dans l’optique du développement d’une nouvelle thérapie.
Réduction
Les modèles de souris que nous allons utiliser existent déjà, ces souris nous sont rendues disponibles via des collaborations du responsable du projet. Seul le nombre de souris nécessaire aux procédures nous seront envoyées, permettant d’éviter la création d’un nouveau noyau d’élevage. Les mêmes souris seront utilisées pour le test de temps de saignement et les tests ex vivo d’étude des fonctions plaquettaires, réduisant ainsi le nombre de souris totales utilisées dans l’étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées par cage de 2 à 5 afin d’éviter l’isolement et la surpopulation, en présence d’enrichissement (matériel de nidification, igloos). Elles recevront une alimentation standard et de l’eau à volonté. Les souris issues de modèles de pathologie de saignement feront l’objet d’une surveillance accrue afin de prévenir tout signe de souffrance. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, qui sera contrôlée régulièrement au cours de la procédure. D’autre part, des souris immunodéficientes seront utilisées pour l’injection d’implant gélifié, afin d’éviter le phénomène de rejet.
Choix des espèces
La souris est le seul modèle permettant de réaliser à la fois des tests d’hémostase in vivo et d’obtenir suffisamment de sang nécessaire aux études ex vivo. Par ailleurs, le modèle souris nous permet d’utiliser des modèles transgéniques mimant les pathologies de saignement faisant l’objet de notre étude. Le stade de développement des souris, de 8 à 12 semaines, a été choisi par analogie avec la littérature pour l’étude des pathologies de saignement.
Etude de la contribution neuroinflammatoire à la spasticité post-traumatique et de sa modulation par Stimulation Transcutanée dans un modèle murin de lésion de moelle épinière
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On implante à chacune une fenêtre vitrée, et 450 subissent une section de la moelle épinière qui paralyse leurs pattes arrière, avant une rééducation et une stimulation électrique dont le porteur veut optimiser les réglages. Il signale une paralysie postérieure, des difficultés à vider la vessie qui imposent des massages abdominaux deux fois par jour, et une douleur résiduelle malgré les antalgiques. Les retombées annoncées pour les patients paralysés sont formulées comme un espoir, appuyé sur l'actualité d'une équipe suisse.
Objectifs
Ce projet mettra en place un modèle murin de traumatisme médullaire permettant de clarifier les mécanismes neuroinflammatoires régulés par ce traitement et d'optimiser les paramètres de stimulation en vue d'accélérer et maximiser la récupération fonctionnelle. Compte tenu de la diversité des paramètres électriques ajustables (fréquence de stimulation, durée et intensité des impulsions, nombre de répétitions quotidienne/hebdomadaire, positionnement des électrodes relativement à la lésion...), une approche rationnelle doit être mise en oeuvre sur modèle murin. Il s'agit donc non seulement d'un enjeu de recherche fondamentale mais aussi de recherche cliniquement applicable.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de mettre en place et valider le premier modèle souris permettant de tester l’effet de la stimulation électrique transcutanée sur la récupération fonctionnelle après traumatisme de moelle épinière. Il permettra également d’évaluer l’effet anti-spastique de cette stimulation en vue d’application à d’autres pathologies comme la sclérose en plaques, les AVC, les hémorragies, la sclérose amyotrophique… Il permettra notamment de mieux comprendre les effets thérapeutiques en fonction de la fréquence de stimulation utilisée notamment en évaluant le potentiel immunomodulateur de ces différents protocoles et leur impact neurotrophique. Il est ainsi attendu qu’une optimisation rationnelle des traitements proposés aux patients puisse être mise en place sur la base de biomarqueurs circulants choisis pour caractériser à la fois la gravité du traumatisme et sa réponse aux traitements électriques. En clarifiant les actions directes et indirectes des impulsions électriques sur le système nerveux central, ce projet permettra également de clarifier les conditions dans lesquelles l’implantation d’électrodes est requis pour obtenir l’effet thérapeutique souhaité. La prise en charge des patients humains pourrait devenir à la fois moins invasive et plus efficace.
Procédures
Sur cinq ans, 750 animaux seront implantés avec fenêtre vitrée. 450 de ces souris seront soumises à une transection de moelle épinière thoracique . La paralysie transitoire des membres postérieurs sera prise en charge dans le cadre d’un protocole de rééducation et d’électrothérapie dont nous souhaitons optimiser les paramètres. Tous les animaux recevront des anti-inflammatoires en post-trauma comme en clinique humaine. 87% de ces animaux traumatisés recevront un traitement complémentaire : soit une rééducation fonctionnelle, soit une stimulation électrique transcutanée, soit la combinaison des deux traitements. La durée des expériences sera limitée à 62 jours post-trauma, sauf pour les animaux a forte récupération dont la stabilité sera évaluée sur 360 jours. La réponse au traitement de ces animaux sera comparée à celle de 300 animaux non lésés. Les animaux seront soumis à des sessions d’imagerie intravitale ni douloureuses, ni destructives. Sur tous les animaux, la réponse musculaire réflexe sera évaluée sous anesthésie volatile légère grâce à des enregistrements électromyographiques de la contraction induite par stimulation du nerf tibial. Sous anesthésie gazeuse également, des prélèvements sanguins seront réalisés 1 fois par semaine à raison de 50µl par prélèvement (sans dépasser un volume maximum de 7,5% de la volémie de l'animal de façon hébdomadaire). 20% des animaux seront soumis à une antibiothérapie préalable au traumatisme pour étudier l'impact du microbiote sur les phénomènes étudiés. La majorité des animaux sortiront du projet dans les 62 jours suivant le traumatisme initial et soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. Les animaux ayant le mieux récupérer seront éventuellement gardé pendant 360 jours pour évaluation trimestrielle de la stabilité de leurs performances.
Impact sur les animaux
Les différentes techniques d'exploration utilisées dans ce projet sont suceptibles d'engendrer les nuisances suivantes : diahrée post-prise antibiotiques, gêne locomotrice avec paralysie temporaire unilaterale postérieure pouvant occasionner une difficulté à la prise alimentaire, risque éventuel de difficulté de la vidange de la vessie peut-être observé dans les premiers jours, stress et/ou douleur résiduelle modérée malgré la prise d’antalgique et anti-inflammatoires.
Devenir
Tous les animaux (750) seront sacrifiés soumis à une procédure terminale sous anesthésie profonde permettant de collecter les tissus et prélèvements sanguins/LCR nécessaires aux études et caractérisations post-mortem. La majorité d'entre eux sera sacrifiée avant le jour 62. Les meilleurs récupérateurs seront conservés pendant un an pour évaluer de façon trimestrielle la stabilité de leurs facultés sensorimotrices.
Remplacement
Les pathologies neurodégénératives et traumatismes médullaires sont des processus complexes impliquant l’interaction entre de très nombreux organes et systèmes physiologiques (nerveux, immunitaire, endocrinien, cardiovaculaire… ) qu’il est nécessaire d’analyser et de comprendre. Aucun modèle cellulaire ou aucun modèle in silico ne sont aujourd’hui en mesure de rendre compte de cette complexité. Le modèle d’hémisection est nécessaire pour permettre de tirer des conclusions sur les mécanismes de récupération fonctionnelle. A ce jour il n’existe pas de méthodes de remplacement, mais l’actualité récente de la recherche en Suisse démontre l’intérêt de la recherche animale pour aider les patients tétraplégiques à retrouver une certaine utilisation de leurs membres. Notre modèle murin permettra de clarifier les mécanismes d’action du traitement par SET en réduisant au maximum les facteurs de variabilité (conditions traumatiques, gravité des lésions, diversité des genres, âges et conditions de vie des patients). Il permettra également de réaliser une optimisation rationnelle du traitement clinique à partir d’indicateurs difficiles d’accès chez le patient (évolution dynamique du phénotype de cellules inflammatoires).Un des critères principaux de l'effet du traitement est l'évolution des capacités motrices, avec et sans traitement, au cours du temps. Cette étude ne pourrait donc pas etre réalisée autre que in-vivo
Réduction
Sur la base de nos travaux passés, les lots d’animaux sont dimensionnés au minimum pour s’assurer de la significativité statistique des quantifications in vivo et sur tranches en utilisant le test de Mann Whitney dédié aux petits échantillons. Ainsi il est nécessaire de réaliser la quantification in vivo pour 8 animaux par groupe à J62. Compte tenu d’une probabilité d’environ 70% d’obtenir une fenêtre claire sur deux mois post-traumatiques suivant l’expertise des expérimentateurs chirurgiens, il est prévu d’utiliser 12 animaux par groupe pour les expériences intravitales. Les expériences d’imagerie sur coupes histologiques sont moins bruitées et permettent de moyenner l’analyse sur un plus grand volume de tissus pour obtenir des résultats moins variables. Le nombre d’animaux nécessaires à chaque temps est donc de 3 au lieu de 8 in vivo. Afin de couvrir les 6 temps d’intérêts, 18 animaux seront nécessaires par groupe pour réaliser les expériences d’immunohistochimie. Le nombre de 750 animaux a donc été établi afin d'avoir un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe permettant d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences avec significativité statistique. Le modèle souris est choisi en raison de sa très bonne récupération spontanée suite à un traumatisme de moelle, récupération que nous souhaitons accélérer par une prise en charge thérapeutique de type clinique tout en étudiant dans le même temps l’implication du système immunitaire. Les mêmes animaux et les mêmes données servent ainsi à la recherche fondamentale ET à la recherche applicative.
Raffinement
Reception et adaptation de 7 jours. Après anesthésie gazeuse légére et injection d'antidouleurs, l'anesthésie est approfondie par injection intrapéritonéale d'anesthésique avant d'être positionnés sur un tapis chauffant. Les yeux sont oints de gel hydratant , et de l'anesthésique local appliqué avant toute incision. Après l'opération, une injection sous-cutanée d'une solution d'anti-inflammatoires est réalisée le jour de la chirurgie puis tous les deux jours pendant 10 jours. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles respectant la surface minimale requise, avec objet d’enrichissement de l’environnement (dômes en carton ou en plexiglas ou encore coton) et un accès non limité à la nourriture et l’eau. Le cycle jour/nuit, la température et l'humidité sont contrôlés. Les animaux sont visités tous les jours par des personnes compétentes dans le domaine de l’expérimentation et du bien-être animal comme attesté par les autorités référentes. Pour s'assurer de la bonne vidange de la vessie le bas du ventre de chaque animal est palpé 2 fois par jours. Dans le cas éventuel où la vessie ne se viderait pas, nous appliquons des massages jusqu'a vidange de celle ci. Du gel sucré énergétique est mis à disposition au fond de la cage pendant la procédure afin de s’assurer que l’animal a les apports énergétiques dont il a besoin. Le recours à l’anesthésie a lieu aussi souvent que nécessaire pour limiter le stress ou la douleur inhérentes aux manipulations requises pour les prélèvements ou les sessions d’imagerie. Les animaux sont pesés quotidiennement les 5 premiers jours avec pour poids de référence le poids avant la procédure chirurgicale. Une variation de plus de 20% pendant plus de 3 jours, malgré la supplémentation sous-cutanée en solution sucrée, sera considérée comme un point limite. Les procédures seront accompagnées d'un suivi rigoureux des signes cliniques (score de douleur: Grimace scal Langford et al). La mise a mort de l'animal sera effectuée s'il atteint son point d'arrêt.
Choix des espèces
Nous utilisons la microscopie de fluorescence intravitale. Il est donc nécessaire d’étudier des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents. Nous disposons d’une lignée dans laquelle les populations cellulaires d’intérêt sont génétiquement marquées de différentes couleurs et dont le phénotype est aujourd’hui très bien caractérisé par nos travaux précédents. Ceci évite de perdre des animaux en mise au point de protocole. Dans le cadre du traumatisme de moelle, la souris démontre une très bonne récupération spontanée tout en impliquant des processus physiologiques fortement similaires à ceux rencontrés chez l’humain : neurodégénération et repousse de colatérales d’axones, angiogénèse et recrutement de cellules inflammatoires, gliose réactionnelle… Les observations sont donc facilement transférables au contexte clinique. Les vastes connaissances actuelles sur l’organisation de la moelle épinière chez la souris et de son comportement en font un modèle pré clinique de choix dans lequel les signes de douleur ou souffrance sont aisément détectables et interprétables. Tous les animaux seront des animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaires. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux. Tous les animaux seront de animaux adultes de plus de 10 semaines sans limitation d’age pour rendre compte de la diversité des âges observées chez les patients traumatisés médullaire. Seront néanmoins exclus les animaux de moins de 10 semaines pour s’affranchir des phénomènes inhérents au développement tant pour des raisons méthodologiques de pose de fenêtre vitrée que pour des raisons physiologiques liée à la plasticité des jeunes animaux.
Rôle de la connexine 43 gliale dans le contrôle de la balance énergétique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau, puis un hébergement individuel, des séjours en cage à métabolisme, un jeûne de 24 heures et un régime gras et sucré, pour étudier une protéine des cellules gliales dans l'obésité. Le porteur indique que la chirurgie échoue chez 55 % des souris, dont la région visée n'est pas atteinte, et que l'isolement et le jeûne causent inconfort et anxiété. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet cette étude "sur un animal in toto" et renvoie au long terme les pistes contre l'obésité.
Objectifs
L’obésité et les troubles métaboliques associés constituent un enjeu de santé publique majeur et une préoccupation planétaire. L’obésité est une maladie chronique de la nutrition qui trouve son origine, en partie, dans des dysfonctionnements de plusieurs structures nerveuses. Ces structures cérébrales intègrent les informations liées à nos réserves adipeuses et à l’alimentation. Elles participent au contrôle de l’appétit pour maintenir un poids corporel stable. Malgré une recherche intense dans le domaine, les mécanismes régulant notre appétit restent mal compris et les stratégies pour lutter efficacement et durablement contre l’obésité sont limitées. Ce projet vise à mieux comprendre comment une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régule la prise alimentaire et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Il étudie le rôle dans la régulation de l’appétit et du poids corporel de cellules non-neuronales appelées cellules gliales. Plus spécifiquement, il étudie un acteur cellulaire, la connexine 43 qui contribue à la communication des . La moitié des animaux auront l’expression de la connexine 43 réduite dans la région cérébrale d’intérêt, permettant de tester sa contribution : 1) dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel sous un régime alimentaire standard ; 2) dans le maintien du métabolisme énergétique, le contrôle de la prise alimentaire et hydrique, ainsi que la régulation des dépenses énergétiques ; 3) dans les réponses comportementales, hormonales, et cellulaires à une réalimentation après mise à jeun. Par ailleurs, une partie de ce projet testera la contribution de la connexine 43 dans un contexte de régime enrichi en graisses et en sucres. Nous testerons alors la propension des animaux à prendre du poids et développer un diabète de type 2 lorsqu’ils sont nourris avec ce régime hypercalorique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales d’une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régulent la prise alimentaire, le métabolisme et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la communication des cellules gliales dans la propension des animaux à développer une obésité et un pré-diabète lors d’un régime enrichi en graisses et en sucre. Nous étudierons les contrôles fins de la prise alimentaire, évaluerons la prise hydrique, les dépenses énergétiques, la réponse au jeûne ou encore de l’activité locomotrice des animaux. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités, en particulier le diabète de type 2.
Procédures
Pour les procédures impliquant des animaux nourris avec un régime standard, la durée totale du projet est de 5 ou 11 semaines . Pour les procédures impliquant des animaux alimentés avec un régime enrichi en graisses et sucres, la durée totale du projet est de 14 semaines. Toutes les souris ont une intervention chirurgicale de 45 minutes pour l’injection intracérébrale d’un composé qui cible la connexine 43. Les animaux sont ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, soit 4 semaines pour 24 animaux et 10 semaines pour les autres animaux. Après récupération chirurgicale, le poids et prise alimentaire des animaux sont mesurés 2 fois par semaine pendant 10se. Entre la 6 et 7e semaine qui suivent la chirurgie, les souris sont utilisées dans différents test(s) métabolique(s) : - Certains animaux sont hébergés pendant 3 jours dans des cages métaboliques qui mesurent la prise alimentaire en continu et les dépenses énergétiques. Le premier jour permet à l’animal de s’habituer à son environnement. Les enregistrements sont réalisés au cours des 48h suivantes. Ces animaux sont également utilisés dans un protocole de 25h qui mesure la réalimentation consécutive à un jeûne. La moitié des souris est mise à jeun pendant 24h et les autres pendant 21h puis réalimentées pendant 3h. - Pour d’autres animaux, un test de tolérance au glucose (4h), classiquement utilisé pour diagnostiquer un diabète, est utilisé. Une solution de glucose est administrée par voie orale, puis des prélèvements sanguins sont réalisés pour suivre l’évolution de la glycémie (7 prélèvements au cours des 4h). Après le test et selon les résultats obtenus, les animaux seront soumis à un test qui vérifie l’absence d’anxiété, ainsi qu’à un test de préférence alimentaire (plusieurs régimes pour rongeurs proposés pendant 8j). - Certains animaux sont utilisés dans un test de tolérance à l’insuline. Une injection d’insuline est réalisée, puis des prélèvements sanguins sont réalisés de la même façon que pour le test de glucose (7 prélèvements, 4h). -Enfin, des animaux seront utilisés dans deux tests de privation en glucose (par l’administration d’un composé pharmacologique ; durée 4h). Au cours de ce test, des suivis de mesures de la glycémie (7 prélèvements en 4h) seront réalisés, ou des mesures de la prise alimentaire (pendant 4h).
Impact sur les animaux
Ce projet nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. Le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale implique une période de récupération post-opératoire qui est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Après cette chirurgie, les animaux sont hébergés individuellement. Un inconfort et de l'anxiété peuvent résulter de cet isolement. L’hébergement de 3 jours dans les cages métaboliques est une source d’inconfort, dû à l’environnement hermétique qui limite les contacts olfactifs avec les congénères. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal qui entraîne une perte de poids corporel importante chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. Le suivi du statut glycémique et le diagnostic d’un diabète requièrent des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue. Par ailleurs, la modification du statut glycémique cause un inconfort dû à la contention de l’animal et aux administrations des composés modifiant le statut glycémique. Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent d’être mis à mort pour des analyses post-mortem.
Devenir
Les animaux éventuellement sortis de l’étude prématurément en raison d’une souffrance non-traitable seront mis à mort. Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent d’être mis à mort pour des analyses post-mortem. Ces analyses comprennent des étude in situ, des analyses biochimiques de marqueurs métaboliques. Elles permettent également de vérifier l’efficacité de la chirurgie dans la région d’intérêt et de caractériser les réponses cellulaires neuronales et gliales. Les animaux sortis des procédure pour une prise de poids insuffisante sous régiùe obésogène seront sacrifiés et les tissus prélevés afin d’abonder un tissuthèque interne à l’équipe permettant de réaliser des analyses biochimiques tests et/ou des essais immunohistochimiques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe pas de méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la balance énergétique. En effet il s’agit ici d’étudier le rôle d’une sous population de cellules gliales présente dans une région spécifique du cerveau et de comprendre leur interactions avec les neurones régulant la balance énergétique. Il est capital que ces cellules soient dans l’environnement complexe qui est le leur in vivo et que ne peut pas être reproduit in vitro. De plus l’objectif est ici de voir si la perturbation de la communication gliale modifie le comportement alimentaire, la prise de poids, la régulation glycémique, les dépenses énergétiques… Ces paramètres ne peuvent être abordés que sur un animal in toto et pas in vitro.
Réduction
Le nombre maximal de souris nécessaire à ce projet est de 348. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Le nombre de lots nécessaires dépend du nombre de variables testées, avec dans chaque procédure des animaux contrôle. 1) La moitié des animaux reçoit un composé inerte vis-à-vis de la connexine 43 et les autres animaux reçoivent un composé qui réduit la connexine 43 dans notre région cérébrale d’intérêt. Cela constitue la variable « condition d’expression de la connexine 43 ». Pour 2 procédures, la condition d’expression de la connexine 43 est la seule variable et nécessite 2 lots d’animaux. 2) Une partie des animaux est soumise à une modification du métabolisme (jeûne ou régime enrichi en graisses et en sucres). Le statut nutritionnel constitue une seconde variable et les procédures concernées nécessitent 4 lots d’animaux (avec la condition d’expression de la connexine 43). Pour l’ensemble des procédures, 20 lots sont nécessaires. L’effectif nécessaire par lot dépend des paramètres étudiés. Il prend en compte : 1) La variabilité individuelle des paramètres étudiés permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ce nombre a été déterminé à l’aide d’études bibliographiques ou au cours de précédents projets. Une procédure nécessite 6 animaux inclus dans les analyses finales, et les autres procédures 8 animaux par lot. 2) L’inclusion ou non des animaux dans les groupes statistiques finales. Dans ce présent projet, deux critères d’exclusion sont relevés : a) l’échec des chirurgies. L’intégralité de la région d’intérêt doit être touchée, cela représente 55% des animaux et b) l’échec, pour induire une obésité chez la souris qui peut aller jusqu’à 30 %. Ainsi, pour l’étude de paramètres nécessitant 8 animaux, nous devons utiliser au maximum 8 souris inclues dans les analyses statistiques et prévoir 8 souris exclues des analyses (et 6 souris résistantes au régime enrichi en graisses), soit au maximum 22 animaux par lot de souris soumises à un régime enrichi. Pour les animaux exposés à un régime standard, 16 animaux par lot maximum sont nécessaires. En prenant en compte les critères d’inclusion et d’exclusion, nous nous assurons que les animaux utilisés seront suffisants pour obtenir des résultats scientifiquement valables qui pourront être utilisés par la communauté scientifique.
Raffinement
Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entrainé. L'état clinique des animaux est suivi quotidiennement et un état anormal fait l’objet d’une quantification par une grille de score, permettant une prise en charge adaptée . Les actes pouvant générer de la douleur sont réalisés sous analgésie et/ou anesthésie. La chirurgie est réalisée sous analgésie pré-opératoire et post-opératoire, anesthésie locale et anesthésie générale. Après la chirurgie, un suivi renforcé est mis en place. Durant les 3 jours qui suivent la chirurgie, les animaux sont placés dans une salle de l'animalerie dédiée pour une surveillance accrue. Pendant cette période, une alimentation adaptée limitant la déshydratation et la perte de poids est disposée en fond de cage et une analgésie est systématiquement administrée. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de glycémie sont réalisés après application d'une crème anesthésiante. La mise à mort est réalisée sous anesthésie générale profonde et sous analgésie quand elle est susceptible de générer de la douleur. Pour étudier le métabolisme des animaux nous avons recours à un système de calorimétrie indirecte s’inscrit dans une démarche de raffinement puisqu’il permet, en une seule étude et par des méthodes non-invasives, la mesure de plusieurs paramètres métaboliques. Les mesures sont effectuées simultanement sur un même animal pour faciliter les études de corrélation entre les différents paramètres mesurés. Avant les tests nécessitant une mise à jeun, les animaux seront habitués au retrait de la mangeoire pour réduire l'angoisse causée par l'absence de nourriture. Les animaux sont habitués à la manipulation et à la contention avant les différents tests métaboliques pour réduire l'angoisse animale et éviter des fluctuations de la glycémie dues au stress de la manipulation et de la contention. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire depuis la chirurgie jusqu'à la fin des procédures. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes sont disposées afin de permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères. Par ailleurs, un enrichissemen plus varié est mis en place. Deux enrichissements au choix (en plus des nids composés de lanière de papier) seront placés dans la cage et modifiés toutes les deux semaines.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Pour les procédures n’incluant pas l’étude des effets du régime enrichi en graisses, des souris adultes à partir de 8 semaines seront utilisées. L’anatomie des différentes régions du cerveau est bien connue à cet âge et ce qui nous permet plus aisément de cibler la structure cérébrale. Pour les procédures étudiant l’effet d’un régime enrichi en graisses et en sucre, des souris à partir de 5 semaines seront utilisées. Il est important de débuter les régimes enrichis en graisses et en sucres peu après le sevrage pour en maximiser les effets sur la croissance pondérale.
Plasticité Microgliale et Obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 224 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit un régime gras, subit un jeûne de 24 heures et des prélèvements de sang répétés à la queue, avant un prélèvement terminal dans le cœur, pour étudier des cellules du cerveau, la microglie, dans l'obésité. Le porteur indique que le jeûne provoque une perte de poids et une sensation de faim, et que les prélèvements causent stress et douleur. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit ces populations et renvoie au long terme les pistes contre l'obésité et le diabète.
Objectifs
Le cerveau joue un rôle essentiel dans la régulation de la prise alimentaire via le contrôle de la sensation de faim et du contrôle de la glycémie. Des régions spécialisées du cerveau contribuent à cette régulation en intégrant les informations liées à l’état nutritionnel provenant des organes périphériques (intestin, foie, pancréas, tissu adipeux). Les cellules microgliales, représentant 5 à 20 % de la population totale de cellules gliales, cellules du cerveau qui ne sont pas des neurones. Elles détectent les signaux extracellulaires et jouant un rôle important dans le maintien de l’intégrité du cerveau. Au repos, ces cellules possèdent de longs prolongements cellulaires mobiles leur permettant de détecter les perturbations du milieu interne. Quand les cellules microgliales détectent une modification, elles entrent dans un état actif et prennent une forme plus arrondie appelée amiboïde. Cette plasticité est considérée comme une première étape importante dans la détection des changements locaux et le déclenchement de réponses spécifiques. Il existe de plus en plus d'indices suggérant que les cellules microgliales contribuent à la régulation de la balance énergétique. Ces cellules sont idéalement positionnées pour détecter et réagir aux signaux circulants car elles expriment des récepteurs pour un large éventail de nutriments, de signaux hormonaux ou immunologiques. L’objectif du projet est de déterminer si les cellules microgliales du tronc cérébral réagissent à une modification du régime alimentaire (obésité, jeûne) et de définir la cinétique de ces éventuelles modifications
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules microgliales réagissent à une modification du régime alimentaire. Nous souhaitons également déterminer si ces modifications sont précoces et si elles précédent l’installation du surpoids et du diabète. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités, en particulier le diabète de type II.
Procédures
Le projet a pour objectif de tester la contribution des cellules microgliales dans la régulation de l’homéostasie énergétique. L’accomplissement de cet objectif nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source de stress physique. Le suivi du statut glycémique requiert des prélèvements d’une goutte de sang dans la veine de la queue. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal accompagnée d'une sensation de faim, entrainant une perte de poids corporel chez les animaux ainsi que des modifications du statut métabolique. Une partie des animaux sera alimenté par une alimentation riche en graisse succeptible d'induire un prise de poids . Un prélèvement sanguin terminal intracardiaque sera effectué juste avant la mise à mort. Un prélèvement d'une goutte de sang sera réalisé chaque semaine au niveau de la veine de la queue sur certains animaux. La glycémie sera alors mesurée à l’aide d’un glucomètre et de bandelettes.
Impact sur les animaux
Les pesées régulières et la manipulation des animaux pourront constituer une source de stress physique. Les prélèvements répétés d’une goutte de sang dans la veine latérale de la queue pourront induire un stress physique et de la douleur. La mise à jeun de 24h est une source de stress pour l’animal induisant une sensation de faim.
Devenir
Les analyses histologiques et biochimiques post-mortem permettront de déterminer l'impact de la consommation d'un régime alimentaire gras sur l'histologie et la physiologie des cellules microgliales du tronc cérébral.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe pas de méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules microgliales dans le contrôle de la balance énergétique. En effet il s’agit d’étudier ici la réactivité de sous-populations microgliales, aux signaux métaboliques et hormonaux complexes associés à l’obésité et au jeûne. La culture de cellules microgliales ne permettrait pas d’étudier les différentes populations de façon spécifique comme nous souhaitons le faire dans cette étude in situ. De plus, la localisation spécifique de certaines de ces populations microgliales qui conditionne sans doute leur fonctionnement ne pourrait être conservée in vitro. Enfin, les modifications métaboliques et hormonales se mettant en place au cours de l’obésité ou du jeûne ne peuvent être parfaitement mimées in vitro.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 232. POUR LE NOMBRE DE LOTS (23 lots) : Le nombre de lots nécessaires dépend du nombre de variables testées. Dans cette étude, les différentes variables sont : 1/ le type d’animaux (souris non obèse vs souris génétiquement obèse), 2/ le statut nutritionnel ou le régime alimentaire des animaux (régime standard vs régime obésogène), 3/ le temps d’exposition au régime alimentaire spécifique et 4/ la nature des analyses post-mortem réalisées. POUR L’EFFECTIF PAR LOT : L’analyse de la morphologie des cellules microgliales et les analyses biochimiques imposent un effectif minimum de 8 animaux par lot. Dans ce projet, le critère principal d’exclusion pour les comparaisons statistiques finales repose sur l’échec de la mise en place du régime obésogène qui est compris entre 30 et 35 % ce qui implique d’ajouter 4 animaux dans les lots soumis au régime alimentaire riche en gras.
Raffinement
L’état clinique des animaux est suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fait l’objet d’une quantification par une grille de score, permettant une prise en charge adaptée. Les animaux sont habitués à la manipulation et à la contention. Les actes pouvant générer de la douleur sont réalisés sous analgésie et/ou anesthésie : La mise à mort est réalisée sous analgésie préopératoire et anesthésie générale. L’hébergement se fait en cage collective. Deux enrichissements au choix (en plus des nids composés de lanière de papier) seront placés dans la cage et modifiés toutes les deux semaines parmi : dôme, tunnel, bûchette, coton.
Choix des espèces
La souris deumeure le meilleur modèle pour les études en rélation avec la régulation de la balance énergétique et l'obésité. Ce modèle dévellope une obésité sous régime gras et est le plus documenté dans la littérature. Pour la mise en place de l'obésité grâce à un régime enrichi en graisses, des souris de 5 semaines seront utilisées. Il est important de débuter le régime obésogène peu après le sevrage pour en maximiser les effets sur la croissance pondérale. Pour les expérimentations n’incluant pas l’étude des effets du régime obésogène, des souris adultes de 8 semaines seront utilisées.
Souris humanisées : génération de souris humanisées à l’aide de cellules hématopoïétiques humaines transduites avec un gène d’intérêt thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes, elles reçoivent un agent toxique puis une greffe de cellules humaines, avec des poses d'implants par chirurgie, pour mettre au point un modèle de souris "humanisée" servant à tester des thérapies géniques. Le porteur indique que la greffe peut déclencher une maladie du greffon contre l'hôte, avec anémie progressive et perte de poils au bout de plusieurs mois. Il affirme qu'aucune coculture de cellules ne prédit ces effets à l'échelle de l'organisme et conclut au recours "requis" à la souris.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est de mettre en place un modèle de souris permettant d’ évaluer des thérapies géniques à base de cellules immunitaires génétiquement modifiées, pour traiter des maladies humaines.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra de mettre en place un modèle de souris humanisées à l’aide de cellules hématopoïétiques humaines transduites avec un lentivirus, afin par la suite de pouvoir tester dans ce modèle l’efficacité de l’injection de cellules hématopoïétiques génétiquement modifiées sur des maladies inflammatoires et/ou cancéreuses.
Procédures
Des souris immunodéficientes seront réceptionnées puis acclimatées au moins 5 jours. Elles recevront au maximum 4 administrations intrapéritonéales afin de faciliter la prise de la greffe dans les deux premiers jours suivant l’acclimatation (injection sur animal vigile, moins de 5min). Ensuite, 24-48h après la dernière des ces injections elles recevront une greffe de cellules humaines par voie intraveineuse à la veine de la queue (animal vigile : moins de 5 minutes / Animal anesthésié : maximum 30 minutes). Afin d’évaluer l’efficacité de potentiels traitements sur la prise de la greffe, des composés chimiques ou biologiques pourront être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’au maximum une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie ou en moins de 5 min sur animal vigile; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’au maximum une heure sinon); ou par minipompe ou implant (intraveineux, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Les études dureront au maximum 1 an mais en moyenne 3-6 mois.
Impact sur les animaux
Les administrations de Busulfan pourront générer une toxicité modérée manifestée par une perte de poids transitoire. Les animaux récupèreront leur poids initial en 3 semaines environ. A très long terme (plusieurs mois), une anémie est susceptible d’apparaître. Bien que de la douleur suite à l’injection ne soit pas attendue, son absence sera contrôlée lors des premières administrations. La greffe est susceptible (risque très faible compte tenu du tri des cellules) de générer une maladie du greffon contre l’hôte d’intensité modérée, se manifestant par une anémie progressive et des dépilations. Ces manifestations sont susceptibles d’apparaître après plusieurs mois. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.
Devenir
Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les effets d’une greffe de cellules immunitaires génétiquement modifiées se matérialisent à l’échelle de l’organisme dans son ensemble, et bien qu’il existe des systèmes de coculture de cellules, il n’est à ce jour pas possible d’en prévoir les effets sur un organisme dans sa globalité. Il en est de même pour la prédiction de l’efficacité de molécules visant à influencer la prise de la greffe. C’est pour cette raison que l’utilisation de ce modèle murin est requise.
Réduction
Sur la base de la littérature, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure est de 10 animaux par groupe. Cependant, les premières études visant à établir les conditions de la greffe permettront de modifier au besoin ce nombre, s’il est insuffisant, ou au contraire s’il peut être réduit. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps.
Raffinement
Les cellules injectées auront été au préalable triées afin de minimiser le nombre de lymphocytes T qui seraient susceptibles de générer une maladie du greffon conte l’hôte. Lors des premières administrations de Busulfan, les animaux seront observés au moins deux fois lors des 6 premières heures afin d’évaluer les effets indésirables. Si de la douleur est constatée sur les premiers animaux, une analgésie à la buprénorphine sera délivrée a posteriori, et mise en place préventivement (30 minutes avant minimum) pour les animaux suivants. Les animaux seront pesés au minimum deux fois par semaine et leur état clinique sera contrôlé, avec une attention particulière pour l’anémie (couleur des muqueuses, température et niveau d’activité des animaux), et pour l’apparition de lésions dermatologiques (alopécie, irritation des yeux) du fait du risque de développement d’une maladie du greffon contre l’hôte. Le risque principal étant la mise en place d’anémie après plusieurs mois, lors des études de mise en place du modèle, des numération formule sanguine permettant d’évaluer l’anémie seront réalisées (environ toutes les 2 semaines) afin de suivre ce paramètre. L’évolution de l’hématocrite suite à la greffe sera un critère de choix de la souche finale de souris. Les points limites concernant l’état général de l’animal sont listés en détail dans la procédure. De la nourriture sera placée au fond de toutes les cages ainsi que de la nourriture gélifiée lorsque que certains animaux présenteront au moins 10% de perte de poids. En cas de déshydratation constatée sur certains animaux, les animaux concernés seront réhydratés une (déshydratation légère) ou deux fois (déshydratation modérée ou sévère) par jour par voie sous cutanée. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie (implants), une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait d’implant maximum par animal.
Choix des espèces
La greffe de cellules hématopoïétiques humaines chez la souris immunodéficiente est bien décrite dans la littérature. Par la suite, la mise en place de ce modèle chez la souris nous permettra dans le cadre d’autres projets de l’utiliser en combinaison avec d’autres modèles établis chez la souris de maladie pour lesquelles la greffe de cellules hématopoïétiques génétiquement modifiées pourrait présenter un intérêt thérapeutique. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.