Rongeurs

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. Le porteur reconnaît que l'infection peut causer des douleurs et qu'une tumeur à croissance rapide peut obstruer l'urètre. Il décrit ces travaux comme visant une "meilleure compréhension" des mécanismes immunitaires et affirme le recours à l'animal "absolument nécessaire", faute d'alternative.

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la patte leur inflige une douleur neuropathique chronique, suivie de tests du seuil mécanique aux filaments de von Frey, de préférence de place conditionnée et d'observation en IntelliCage, pour étudier l'anxiété et la dépression liées à la douleur chez les femelles. Le porteur précise qu'aucun anti-inflammatoire ni opiacé ne peut être administré, ces molécules interférant avec la douleur qu'il cherche à maintenir. Il affirme qu'il lui est "impossible" de remplacer ce modèle par une approche in vitro ou in silico.

Objectifs

La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur. En effet, environ 50% des patients présentent cette co-morbidité. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de cette co-morbidité restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Une modélasation chez la souris mâle des conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique existe. De plus, les données d’imagerie neuroanatomique et fonctionnelle chez l’homme, ainsi des résultats obtenus par des approches lésionnelle, ,d’optogénétique et imagerie, chez la souris montrent que la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures limbiques comme le cortex cingulaire antérieur (CCA), l’Habénula laterale (HBl), le noyau basolatéral de l’amygdale (BLA) et l’aire tegmentale ventrale (VTA). Le but de ce projet est de caractériser les comportements anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique chez les femelles et comparer les changements moléculaire et physiologique entre mâles et femelles.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est double : 1) caractériser pour la première fois chez la femelle l’établissement de la douleur chronique neuropathique et le développement progressif des comportements de type anxieux et dépressif et 2) en étudier les changements moléculaires au cours du développement de cette comorbidité dans 4 structures cérébrales d’intérêt, le cortex cingulaire antérieur (CCA), l’Habénula laterale (HBl), le noyau basolatéral de l’amygdale (BLA) et l’aire tegmentale ventrale (VTA). A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois l’apparition de cette comorbidité chez la femelle, en comparaison avec les données déjà connues chez le mâle, et pourront de plus décrire les adaptations moléculaires liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Chirugie patte droite de l'animal et pose de puce d’identification.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie "cuff" et / ou à la chirurgie stéréotaxique, toute perte de poids qui atteindrait 15 % sans récupération, ou une plaie ouverte seront considérées comme point limite. Tout animal montrant un de ces points limites et dont l'état ne s'améliore pas sur une période raisonnable (48 h pour une blessure et 5 jours pour la perte de poids) sera mis à mort par inhalation de dioxyde de carbone. Après chaque chirurgie, des croquettes ainsi que de l'eau gélifiée sont disposés dans les cages. Une fiche individuelle de suivi est utilisée afin de suivre le bon rétablissement de chaque animal. Cette fiche présente en annexe 3 est basée sur une évaluation numérique (scoring). Pour la chirurgie « cuff », chaque animal est scoré le lendemain de la chirurgie, puis deux fois par semaine jusqu'à la fin du protocole expérimental. Pour la chirurgie stéréotaxique, chaque animal est scoré quotidiennement pendant les 3 jours suivants la chirurgie puis deux fois par semaine jusqu'à la fin du protocole expérimental. » Points limites : - si le poids est inférieur à 80 % du poids initial (avant chirurgie) pendant 48 h - si, après anesthésie, l’animal présente des signes d'abdomen gonflé pendant 48 h - si l'animal présente une vocalisation spontanée ou une automutilation - si l’animal présente deux scores de 2 ou un score supérieur à 6 sur la grille de suivi-post-chirurgical (annexe 2). - Pour la procédure 1: problèmes moteurs, difficulté à se déplacer ou paraplégie - Pour les procédures 8 et 9 : rougeurs ou signes d’infection autour de l’implant crânien Remarque : l'utilisation d'antidouleur de type anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et opiacés n'est pas possible en post-chirurgie dans notre cas. Les AINS tout comme les opiacés bloqueraient (ou interfèreraient avec) les processus inflammatoires nécessaires au développement et au maintien de la douleur neuropathique.

Devenir

• P1 : Modèle de douleur neuropathique (TOUS les animaux sont gardés en vie pour les procédures suivantes soit 520 animaux) • P2 : Evaluation du seuil de sensibilité mécaniques filaments de von Frey (TOUS les animaux sont gardés en vie pour les procédures suivantes soit 520 animaux) • P3 : Evaluation de l’état anxieux/dépressif (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 160 animaux) P4: Evaluation de la douleur spontanée par le test de préférence de place conditionnée (CPP) (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 120 animaux) • P5 : Pose de puce pour analyse du comportement spontané dans une IntelliCage (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 80 animaux) • P6 : Evaluation de l'état anxieu/dépressif des animaux pour analyses moléculaires (TOUS les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale soit 160 animaux)

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur et de sa composante émotionnelle et affective nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Afin de réduire l’angoisse des animaux, les souris seront hébergées à 4-5 par cage. Chaque cage sera enrichie avec de la frisure et du coton pour favoriser les comportements de nidation et un barreau bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux explorant les comportements de type anxio-dépressif liés aux douleurs chroniques seront constitués d’au moins 20 souris. Les animaux étant consanguins, la variabilité phénotypique est considérablement diminuée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant en évidence un effet statistiquement significatif. Un calcul statistique « power analysis » a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique (multiple ANOVA).

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit inversé (lumière allumée de 21h à 9h), pour éviter les manipulations durant le temps de sommeil des animaux et ainsi diminuer le stress. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Les signes de mal-être suivants seront recherchés : perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué. Un exemplaire du « mouse grimace scale » sera disponible (annexe 1) pour aider à la détection des signes de douleurs aiguës. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) seront réalisés après concertation avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut. Enfin, des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. De plus, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise aux questions scientifique posées. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).

4 770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de lipopolysaccharide bactérien pour induire un état de type dépressif, puis passent le test de la nage forcée avant un prélèvement de sang et de cerveau, afin d'évaluer des candidats médicaments. Le porteur indique que le produit provoque une hypoactivité et une perte de poids, et retire du bécher toute souris qui met la tête sous l'eau. Il affirme qu'il "n'existe pas de méthodes alternatives" pour modéliser la dépression et conclut au caractère "nécessaire" du recours à l'animal.

Objectifs

De plus en plus d’études démontrent que l’inflammation joue un rôle dans la physiopathologie du trouble dépressif majeur (MDD). En effet, il a été montré que les patients déprimés présentaient un taux plus élevé de cytokines pro-inflammatoires par rapport à des témoins sains. Des symptômes dépressifs ont également été détectés chez des patients traités par immunothérapie pour des cancers ou des maladies virales. L’administration périphérique de l'endotoxine bactérienne lipopolysaccharide (LPS) induit des symptômes de type dépressif chez les rongeurs dans le modèle de la nage forcée (ou forced swimming test, FST). L’objectif de ce projet sera dans un premier temps la mise en place de ce modèle puis l’étude, chez la souris ayant reçu du LPS, d’une potentielle efficacité de plusieurs candidats médicaments dans le test de la nage forcée.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour identifier le lien entre l’inflammation et l’état dépressif afin de tester de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

L’administration de LPS induit chez la souris une hypoactivité et une baisse de masse corporelle durant les heures qui suivent l’injection et l’administration de nouveaux candidats médicaments peut également entraîner des effets indésirables. Les animaux sont donc suivis après administration. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Des paramètres supplémentaires ont été rajoutés, il concerne les effets indésirables potentiels qu’un traitement pourrait provoquer. L’expérimentateur doit alors noter l’intensité de chacun de ces paramètres. Durant le test de nage forcée, si la souris met la tête sous l’eau, elle est immédiatement retirée du bécher et placée dans une cage contenant un linge pendant 10 minutes pour retourner ensuite dans sa cage d’origine.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la dépression. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour l’étude de la physiopathologie et l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre total d'animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d'animaux par groupe nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement interprétables. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées dans ce test, ce nombre a été fixé à 15 animaux par groupe. L'utilisation d'un nombre inférieur d'animaux a une probabilité importante d'entraîner la non-validité de l'étude, conduisant à la refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d'animaux plus élevé. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6 13 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de peau humaine ou bio-imprimée sous six à onze anesthésies, avec un suivi par pansements et imagerie, pour évaluer la cicatrisation. Le porteur liste parmi les effets attendus saignements, hématomes, infections et nécrose du greffon, et fixe la mise à mort à 15% de perte de poids. Il met en avant une innovation "made in France" et des publications à "haut facteur d'impact" autant que le bénéfice pour les grands brûlés.

Objectifs

L’objectif principal de cette étude vise à évaluer l’efficacité, chez un modèle murin immunodéprimé, d’une greffe de peau (dermo-epidermique) fabriquée à partir de cellules humaines par un procédé de culture cellulaire et d’impression 3D : apprécier la cicatrisation post greffe quantitativement (en surface et en épaisseur) et qualitativement (en terme d’intégrité cellulaire, d’inflammation et de vascularisation).

Bénéfices attendus

Les résultats feront l’objet de communications scientifiques et de publications dans des revues scientifiques internationales à haut facteur d’impact. Ce projet étant proposé par des chercheurs, industriels et des cliniciens, il a été élaboré de manière à ce qu’il soit transposable à l’Homme. La peau bio-imprimée préparée à partir d’un prélèvement peu invasif de cellules du patient permettrait de simplifier la procédure chirurgicale et d’éviter les larges prélèvements de peau, leur rançon cicatricielle et les procédures chirurgicales sous anesthésie générale qu’ils engendrent. Cette innovation thérapeutique « made in France » pourra être une avancée technique significative en termes de diminution de la morbidité pour la prise en charge des patients nécessitant une greffe de peau, comme les grands brulés, les exérèses de cancers cutanés et les victimes de traumatisme avec délabrement cutané.

Procédures

Toutes les interventions décrite ci-après sont faite sous anesthésie générale hallogéné : soit entre 6 et 11 anesthésie pour l'ensemble des animaux. (1) Procédure chirurgicale : Greffe de peau humaine ou de peau bio-imprimée 1 fois à J0 -- Nombre de souris =72 -- Durée= 20min/souris ; (2) Pansements et analyse photonumérique : 6 fois au total à J2, J5, J8, J12, J15, J21, pour tous les animaux vivants à date -- Durée=5min ; (3) Analyse macroscopique : étude de l’épaisseur de la greffe par pinch test de chaque animal -- maximum 3 fois, pour tous les animaux vivants à date -- Durée=5min ; (4) Laser Doppler : maximum 3 fois J2, J5, J12 -- Pour tous les animaux vivants à date -- Durée :10 minutes ; (5) Imagerie nucléaire : maximum 4 fois J5-8, J15-16 -- pour tous les animaux vivant à date -- Durée : 30 minutes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux communs aux greffes de peau chez l’Homme : - Saignements per et post opératoires - Hématome post-opératoire - Infection post-opératoire - Nécrose du greffon cutanée

Devenir

Une partie importante de notre projet se base sur l’étude microscopique des tissus à différents temps de la cicatrisation : J8, J15 et J21. Les prélèvements se feront en post-mortem, nous avons prévu d’effectuer ces prélèvements sur 4 souris pour chaque temps, soit un effectif de n=12 (4 souris x 3 temps) pour chaque lot.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de biothérapie nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant transposition à l'homme.

Réduction

L’objectif principal de cette étude vise à évaluer la greffe de peau fabriquée par impression 3D chez un modèle murin. Nous avons déterminé à partir d’études préalablement réalisées que 24 souris immunodéficientes par série - pour 3 séries étalées sur 3 ans - seront nécessaires et suffisantes pour mener à bien ce projet. L’utilisation de l’imagerie isotopique permettra de faire un suivi longitudinal, multiparamétrique et quantitatif non invasif du processus de cicatrisation et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Le nombre de souris prévues est minimum mais suffisant pour chaque étape pour obtenir des résultats significatifs. Nous avons retenu le nombre de 12 animaux maximum par groupe analysés et par temps ; ce nombre a été choisi à partir d’études précédentes s’approchant de notre protocole.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 5 en portoirs ventilés durant la période d’acclimatation pour diminuer leur stress et permettre les interactions sociales. Chaque cage sera agrémentée de tunnel rouge afin d'amener un enrichissement aux souris et de les stimuler. Elles auront à disposition de la nourriture et de l’eau à volonté, le cycle jour/nuit (12h/12h) sera respecté et la température et l’hygrométrie ambiante seront contrôlées. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé afin d’optimiser le bien-être des souris et l’obtention de résultats positifs. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec une analgésie pré et post-opératoire. Après la chirurgie, les souris seront hébergées dans des cages individuelles pour éviter que les pansements soient arrachés par les congénères. Pour limité aux maximum le stress de l'animal toutes les gestes de suivi post-opératoire (pansements, imageries, ...) seront réalisés sous anesthésie. Et les différents gestes seront regroupés au maximum pour limiter le nombre d'anesthésie par animal. De plus, la douleur et le bien-être des souris seront évalués quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin d’adapter leur prise en charge en fonction. Si l’atteinte du point limite défini par une souffrance sévère irréversible (En cas de perte de poids supérieure à 15 % ; troubles du comportement : arrêt du toilettage, faciès douloureux, signe d’apathie, difficulté à se déplacer et à se nourrir ; invalidité ou de signe d'infection cutanée) était objectivée, une mise à mort de l’animal sera réalisée sans délai.

Choix des espèces

La souris présente un modèle de cicatrisation cutanée proche de l'homme et le plus documenté actuellement. Ce modèle de plaie reproductible et comparable est validé pour l'étude objective des biothérapies dans la cicatrisation. Il s’agira de souris nude femelles compatibles avec l’utilisation d’un greffon de peau (bioimprimée ou non) humaine. Utilisation des souris à 8 semaines de vie, au moment où leur potentiel de cicatrisation est le plus important.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie stéréotaxique une greffe intracérébrale de cellules de gliome pédiatrique du tronc cérébral, tumeur incurable, pour tester l'effet de l'inhibition du gène VRK3 sur sa progression. Le porteur indique que les animaux développeront des troubles neurologiques et une ataxie liés à la tumeur. Il décrit ces modèles, suivis par bioluminescence, comme un "outil indispensable" faute de pouvoir reproduire l'infiltration tumorale hors de l'animal.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes malins infiltrants du tronc cérébral (ou DIPG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Nous avons initié un programme de recherche pour caractériser ces tumeurs et montrer qu’elles sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs corticales de l’enfant. Des mutations originales de l’histone H3, quasi-constantes dans les DIPG et jamais décrites dans aucun autre type de cancer, ont été découvertes. Il s’agit donc d’un mécanisme oncogénique complètement inédit et intimement lié au développement de cette partie du cerveau. Par ailleurs, les DIPG ne forment jamais de masse tumorale, mais infiltrent les structures cérébrales normales puis se disséminent dans la totalité du cerveau. Nous avons récemment réussi à développer des modèles expérimentaux de tumeurs cérébrales issus de tumeurs de patients atteints de DIPG. Ces modèles que l'on peut suivre par bioluminescence, développent des signes cliniques neurologiques entre deux et quatre mois post-greffe, et histologiquement la tumeur se développe en infiltrant le tronc cérébral. Ces modèles sont encore très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. Afin d’identifier les gènes nécessaires à la survie cellulaire du DIPG, une étude de screening par shARN ciblant l’ensemble des kinases humaines a été réalisé sur quatre lignées in vitro. Plusieurs gènes ont été identifiés dont VRK3. Les résultats de ce crible ont été confirmés in vitro par shARN et Crispr/Cas9 sur un plus grand nombre de lignée cellulaire de DIPG. Pour les études vivo, des constructions spécifiques de shRNA et Crispr/Cas9, dirigées vers le gène VRK3, inductibles par la doxycyline ont été réalisés afin d’éteindre le gène dans les cellules tumorales après la greffe.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la réduction ou le ralentissement du volume ou de la croissance tumorale dans le cerveau de souris, comme modèle de la maladie humaine, après inhibition du gène VRK3 par induction de 845mg/kg de doxycycline dans l'alimentation. En effet, in vitro, nous avons pu voir que l'inhibition du gène VRK3 était létal sur les cellules. Nous nous attendons à cette létalité sur les cellules tumorales in vitro ou bien un ralentissement de leur croissance.

Procédures

Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Injection de luciférase en IP 10ml/kg sous anesthésie locale à raison d'une injection tous les 15 jours pour observer la bioluminescence (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

L’inhibition de VRK3 sera spécifique aux cellules tumorales, car les constructions seront intégrées uniquement dans ces dernières en amont de la greffe, nous ne nous attendons donc pas à observer des signes de toxicité systémique chez la souris. Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liés aux symptômes tumoraux (trouble neurologiques perceptibles; ataxie).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements des cerveaux et analyses ex-vivo.

Remplacement

Une singularité des gliomes du tronc cérébral résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures normales, l’absence de masse tumorale et l’importante capacité d’invasion du tronc cérébral dans un premier temps, puis plus largement du cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur stroma qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite.

Réduction

Nos xénogreffes intracérébrales de DIPG que nous pouvons suivre par bioluminescence, développent des tumeurs avec un temps de survie des animaux de façon reproductible. Le nombre minimal nécessaire et suffisant a été calculé au plus juste par calcul de puissance (GPower). Les contrôles ont tous été vérifiés et validés ou supprimés.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale (injections). Les animaux seront pesés deux fois par semaine et examinés trois fois par semaine au début de la maladie, puis quotidiennement avec des tumeurs au stade avancé. Ils seront hébergés au minimum par 2 avec un enrichissement de la cage type sizzlenest et recevront des anti-douleurs dès l’arrivée des premiers symptômes neurologiques ou de douleur. L'eau et la nourriture seront donnés ad libitum. La nourriture sera adaptée en cas de symptômes (DietGel).

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées (Swiss/Nude) permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas de différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (3 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 2 mois et 1 an selon les modèles), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.

358 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue dont 144 perfusés à cœur battant sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après implantation d'un capteur de température, ils sont exposés aux radiofréquences 5G pendant six semaines puis soumis à dix tests comportementaux évaluant mémoire, anxiété, dépression et seuil douloureux, une lignée sélectionnée pour son phénotype dépressif étant comparée à une lignée saine. Le porteur cherche à comprendre l'électrohypersensibilité, qu'il qualifie lui-même de "syndrome médicalement inexpliqué", et rappelle que les études antérieures n'ont pas montré que l'humain perçoit consciemment les radiofréquences. Le bénéfice annoncé, mieux reconnaître ces patients, reste une hypothèse à explorer.

Objectifs

L’objet de ce projet est la recherche fondamentale pris au sens du 1er article R. 214-105 du Code rural et de la pêche maritime. Le contexte général est celui de l’augmentation exponentielle de l’utilisation de la téléphonie mobile et des techniques de communication et du déploiement de la 5G. Il pose la question de l’augmentation de notre exposition environnementale et de ses conséquences possibles sur notre santé physique et mentale. De plus, certaines personnes souffrent d’hypersensibilité électromagnétique (EHS) et à ce jour, aucune évidence biologique ou clinique n’explique ces symptômes, et les causes de l’EHS restent inconnues. L’implication d’un niveau d’inquiétude élevé, d’un mal-être et /ou d’états anxieux ou dépressifs est suggéré mais pas établie. L’objectif du projet est de tenter de répondre aux questions suivantes : le sujet dépressif perçoit-il les radiofréquences différemment d’un sujet sain? la dépression est-elle la cause ou la conséquence de l’EHS ? Quelles différences hommes-femmes, considérant que l’EHS concerne plutôt les femmes, comme c’est le cas pour la dépression ou l’anxiété (ratio : 2 femmes/1 homme)? Le projet propose d’étudier les effets d’une exposition chronique aux radiofréquences de la 5G (2 gammes de fréquences, 900 MHz et 26 GHz) sur le comportement et la plasticité cérébrale de rats adultes mâles et femelles, sains ou dépressifs (souche Flinders Sensitive Line ou FSL) en ciblant la sphère cognitive (mémoire à court et à long terme, flexibilité) et la sphère affective (anxiété, dépression, sensibilité à la douleur).

Bénéfices attendus

Ce projet qui vise à mieux comprendre les déterminants de l'électrohypersensibilité, doit faire progresser les connaissances sur ce syndrome encore médicalement inexpliqué dans le but notamment d'améliorer la reconnaissance et la prise en charge de ces patients.

Procédures

Les rats seront soumis à : i) une intervention chirugicale courte (10-15 min, anesthésie gazeuse, implant d'un logger température intra-abdominal), 2) une exposition aux radiofréquences de la 5G en chambre réverbérante dans une cage d'élevage pendant 6 semaines (5j/semaines, 4h/j) et 3) 10 tests comportementaux répartis sur une période de 2 mois pour évaluer la mémoire (2 tests), l'activité (2 tests), l'anxiété (3 tests), la dépression (1 test) et le seuil douloureux (2 tests), chaque session durant de 1 min à 10 min maximum avec 1 session/jour et chaque test d'une durée de 1 à 7 jours (voir détails Procédure expérimentale 1, figure 3 annexe).

Impact sur les animaux

Il n'est pas attendu de nuisances ou effets indésirables importants ou durables pouvant altérer leur bien-être, l'essentiel des interventions proposées nous sont très familières. De plus, les rats dédiés aux expériences préliminaires permettront d'affiner les protocoles pour certains tests et d'en ajuster si besoin les paramètres, il en est de même pour le protocole chirurgical (pose des 'capteurs' de température) et la période post-opératoire. Pour ce qui est de leur environnement au quotidien et la prise en charge de leur bien-être tout au long des expériences, nous avons une grande expérience de ce type de projet, une cellule SBEA présente et disponible ainsi qu'une vétérinaire pour le suivi médical. De plus, le projet scientifique a pour thème la dépression et l'anxiété et l'impact d'un facteur environnemental: nous serons donc particulièrement vigilants et réactifs sur leur bien-être car tous les résultats des tests comportementaux en dépendent.

Devenir

Procédure 1: 214 rats seront mis à mort et le cerveau récupéré pour 144 d'entre aux pour les études de la plasticité cérebrale (coloration de Golgi) et 144 rats seront gardés en vie et entreront dans la Procédure 2. Procédure 2 (sans réveil) : 144 rats perfusés en intracardiaque pour récupération du cerveau et études immunohistochimiques nécessitant une préservation uniforme et rapide de tissu cérébral.

Remplacement

L’approche chez l’animal, en particulier le Rat, est la seule permettant d’aborder la question de de l’impact des radiofréquences sur la sphère cognitive et affective/émotionnelle et les mécanismes cérébraux sous-jacent afin de comprendre un syndrome inexpliqué, l’électrohypersensibilité ou EHS. Ce projet est une première tentative de modélisation chez le rat pour tester une hypothèse originale : l’impact de troubles de l’humeur (dépression) à l’origine de l’EHS? Ce projet devrait permettre aussi de répondre à la question du rôle des radiofréquences sur l'apparition de ce syndrome: les études précédentes n’ayant pu montrer que l’humain est capable de percevoir consciemment les radiofréquences et un effet nocebo a été proposé pour expliquer l’EHS. Enfin, l'arrivée des nouveaux signaux de la téléphonie mobile 5G nécessite des études chez l'animal pour en comprendre les effets biologiques, physiologiques voire pathologiques.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé au plus juste en fonction des prérequis statistiques à l'aide tests paramétriques. Nous avons une grande expériences de ce type de projets et de nombreuses publications scientifiques.

Raffinement

Dès leur arrivée au laboratoire, les rats sont hébergés dans de grandes cages à 3 individus et 3 bâtons à ronger pour enrissement dans une animalerie agrée avec températire, humidité et cycle jour/nuit adaptés. L'évaluation de leur bien-être se fera au quotidien à l'aide de la grille de l'Afstal, une attention particulière sera portée à la chirurgie et la période juste après. De plus avant toute procédure, les rats seront habitués à l'expérimentateur, la salle de test et le test lui-même. L'objectif est de les amener à coopérer en réduisant le stress et l'anxiété. De plus, le thème du projet vise justement à évaluer l'impact de l'environnement (les radiofréquences) sur divers paramètres incluant l'anxiété, la dépression,et la cognition. Nous serons donc particulièrement vigilant dans le raffinement de nos procédures, essentiel pour le bien-être mais aussi la qualité de nos données scientifiques. Pour plus de détails voir Procédure 1

Choix des espèces

Le choix du Rat s’impose par l’existence de très nombreuses données anatomiques, électrophysiologiques et comportementales solides sur la cognition, mémoire, mais aussi l’anxiété, la dépression ainsi que sur les effets des radiofréquences. En effet, les bases neurobiologiques de la mémoire, de l’anxiété ou de la dépression étudiées chez le rongeur, et notamment chez le Rat, ont permis de grandes avancées dans la compréhension de ces phénomènes physiologiques et pathologiques chez l’homme. Le rat possède des capacités cognitives élaborée et un répertoire comportemental complexe. Il s’adapte bien à la vie au laboratoire et coopère facilement dans les tâches comportementales. De plus, le rat est un modèle pré-clinique validé pour la dépression ou les troubles anxieux et plusieurs souches ont été développées : le rat FSL utilisé dans ce projet en est un bon modèle depuis plus de 30 ans (241 publications 1986-2020). Ce projet propose d'étudier les effets des radiofréquences sur la sphère cognitive et affective dans 2 souches de rats, dont l’une présente un trouble de l’humeur (dépression). Ceci dans le but de montrer si ce phénotype dépressif est capable d’induire des effets biologiques et comportementaux spécifiques des radiofréquences qui ne seraient pas observés chez des sujets sains. En effet, les sujets EHS présentent tout un panel de symptômes (troubles de la mémoire, de l’attention, du sommeil, anxiété, douleurs…) qu’ils attribuent aux ondes électromagnétiques et notamment aux radiofréquences. Ce syndrome, à ce jour inexpliqué à la fois au plan scientifique et médical, est rapporté dans la très grande majorité des cas chez les adultes, très rarement chez l’enfant ou le sujet très âgé. Ceci justifie le choix du rat jeune adulte âgés de 2 à 5 mois au moment des expériences.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des plaies cutanées par découpe à l'emporte-pièce ou par compression à l'aimant, pour étudier le rôle d'une "protéine X" dans la cicatrisation et la fonction vasculaire. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ne sera administré pendant la cicatrisation "car cela pourrait modifier les résultats", une douleur modérée pouvant persister plusieurs jours. Il décrit le passage par l'animal comme "indispensable" pour observer ces mécanismes dans un "organisme entier".

Objectifs

Des candidats médicaments sont en cours de développement pour traiter certains défauts de cicatrisation tels que les plaies des grands brûlés, les opacités cornéennes ou les conséquences déletères d'un infarctus au niveau cardiaque ou d'une infection au niveau hépatique ou pulmonaire. Toutes ces pathologies peuvent s'avérer mortelles ou très invalidantes et représentent un coût sociétal très important. Pour le moment, les candidats médicaments se fixent principalement sur la Protéine Y bien caractérisée mais aussi sur une protéine très semblable, appelée Protéine X, dont les fonctions sont mal connues. Pour mieux anticiper les effets secondaires des candidats médicaments et déterminer s'il faut les améliorer pour qu'ils ne reconnaissent que la Protéine X ou la Protéine Y, il est crucial de mieux comprendre les rôles précis de la Protéine X chez les mammifères. La peau et les vaisseaux sanguins seront investigués en analysant particulièrement le rôle de la Protéine X dans la cicatrisation de la peau ainsi que dans la capacité des vaisseaux sanguins à répondre aux agents qui régulent la pression artérielle ou à laisser passer des molécules dans les tissus.

Bénéfices attendus

Les expériences ne nécessitant pas de recours aux animaux ont déjà été réalisées. Ceci a permis d'identifier des mécanismes d'action possibles pour la Protéine X. L'étape suivante consiste à vérifier ce qui se passe dans un organisme entier et à confirmer les données préliminaires déjà obtenues concernant l’effet de l’absence de la Protéine X sur l’organisation de la peau normale et cicatricielle ainsi que sur la fonction des vaisseaux sanguins. Ces éléments seront étudiés indépendamment puis conjointement dans un modèle de plaie où l’apport en oxygène et nutriments est déficient (type escarre). A plus long terme, les informations collectées lors de ces expériences serviront à mieux comprendre les fonctions de la Protéine X dans la peau et à évaluer s’il est plutôt bénéfique ou délétère que les candidats médicaments reconnaissent à la fois la Protéine X et la Protéine Y. Par exemple, s'il s'avère que la Protéine X est nécessaire à la fonction vasculaire, il faudra développer des candidats médicaments qui n'affectent que la Protéine Y. Les résultats obtenus seront ainsi très importants pour optimiser leurs propriétés.

Procédures

Il n'est pas prévu de prélèvements sur animaux vigiles. Cependant, une injection de colorant (Bleu EVANS) est programmée sur certains animaux pour identifier des "fuites" éventuelles au niveau des vaisseaux sanguins. Une série d'animaux sera également soumise à des plaies réalisées soit à l'aide de "punchs" et ciseaux fins (6 mm de diamètre; 1 seule induction de plaies) soit par application de 2 aimants de 8 mm de diamètre pendant 3 fois 3h à 24h d'intervalle (plaies de compression). Les autres interventions auxquelles seront soumis les animaux sont non invasives et indolores.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en Protéine X sont viables, fertiles et ne semblent pas présenter de phénotype dommageable, en conditions normales, susceptible d’induire de la souffrance ou d’affecter leur comportement. La procédure visant à évaluer la fonctionnalité vasculaire utilise des techniques non invasives et indolores (laser doppler) réalisées sous anesthésie générale pour diminuer le stress des animaux. L’injection de bleu EVANS dans la veine caudale en fin de procédure peut cependant induire un stress momentané. L’induction des plaies d’excision et de compression peut aussi causer douleur et stress chez l’animal. Elles sont réalisées sous isoflurane pour diminuer ces effets et un produit analgésique sera administré avant l'induction des plaies d'excision. Une douleur modérée peut persister après l'induction de la plaie pendant quelques jours. Il n’est pas prévu d’administrer de produit anti-inflammatoire pendant l’induction des plaies ou pendant la cicatrisation car cela pourrait modifier les résultats de notre étude. L’apparition d’autres effets indésirables (perte de poids, mobilité réduite, comportement anormal etc) sera surveillée tous les 2 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures car des prélèvements seront réalisés pour étudier la peau et ses différents composants cellulaires.

Remplacement

Les modèles in vitro (protéines recombinantes) et cellulaires ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées qui nécessitent des systèmes intégrés multi-cellulaires et multi-organes. Il n’existe par exemple pas de modèle de peau reconstruite intégrant toutes les composantes cellulaires nécessaires aux études de physiologie vasculaire ou de cicatrisation. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures de fonctionnalité vasculaire, il est possible de tester deux agents vaso-dilatateurs différents sur les mêmes animaux à 7 jours d’intervalle minimum. Les mêmes animaux peuvent donc être utilisés pour ces deux mesures qui sont également couplées à chaque fois à au moins une autre mesure non invasive (réponse à la pression ou perfusion cutanée). Avant la mise à mort des animaux en fin de procédure, il est également prévu de faire une injection de bleu EVANS qui permettra de mettre en évidence une augmentation éventuelle de perméabilité vasculaire au niveau de la peau. Dans les études de cicatrisation, deux plaies sont réalisées sur le même animal pour diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Les 5 temps de mise à mort ont été soigneusement sélectionnés en fonction de la connaissance actuelle des modèles pour couvrir toutes les phases de la cicatrisation et évaluer précisément le rôle de la Protéine X dans chacune de ces phases.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). Des points limites (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal atteint par la souris, état de prostration de l’animal, plaies infectées) ont été définis qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal. Les animaux utilisés pour l’étude de fonctionnalité vasculaire ne subiront pas plus de deux anesthésies générales chacun. Le nombre de souris par cage sera compris entre 3 et 5, suivant la taille de la cage et en accord avec la réglementation en vigueur. Après induction des plaies ou en cas de comportement agressif d’un animal, les animaux seront isolés dans des cages individuelles pour éviter le risque de sur-blessure. Ces cages possèdent des séparations transparentes pour permettre aux animaux de continuer à communiquer et diminuer le stress lié à l’isolement. Les cages seront également enrichies avec des boules d’ouate, des bâtonnets de bois, du carton etc. Les plaies seront protégées par des pansements pour éviter les risques d'infection. Tous les changements de pansements (et les photographies permettant de suivre la fermeture des plaies) seront réalisés sous anesthésie gazeuse sur table chauffante.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du tissu d'intérêt (peau) très semblable au tissu humain et les étapes clés du processus de cicatrisation sont conservées (phase inflammatoire et vasculaire, phase de réparation, phase de remodelage). Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 8-16 semaines pour rester cohérent avec les expériences préliminaires qui ont été réalisées.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées comme donneuses de moelle osseuse et 720 transférées vers un autre protocole de tests comportementaux. Rendues obèses par un régime gras pendant 18 semaines, elles reçoivent du busulfan induisant une myélodysplasie, une greffe de moelle et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle de la protéine DNase1L3 dans le syndrome métabolique et la dépression liés à l'obésité. Le porteur décrit la perte de poids et l'anémie post-busulfan comme "transitoires". Les 720 survivantes prolongeront l'expérimentation dans une animalerie dédiée aux tests d'anxiété et de dépression, sous une autre autorisation.

Objectifs

Nous avons observé que la déficience en DNase1L3 rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité. Un de nos objectif courant est de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la DNase1L3 dans le contexte de l’obésité. De plus, l’obésité induit des troubles neuropsychiatriques comme la dépression. Un deuxième objectif de notre travail est d’évaluer l’impact de la déficience en DNase1L3 sur la survenue des syndromes neuropsychiatrique induits pas l’obésité. Tous les concepts, incluant l’état de l’art, le rationnel de notre étude ainsi que sa méthodologie sont décrits dans la section suivante.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence le rôle de la DNase1L3 dans la régulation de l’inflammation chronique induite par l’obésité ainsi que ces mécanismes d’actions. De plus, il nous permettra de déterminer si une dérégulation de la DNase1L3 peut contribuer aux troubles neuropsychiatriques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité qui est à l’origine du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Les souris sont soumises à un régime riche normal et riche en graisse durant 18 semaines. Une myélodysplasie est induite par le Busulfan durant 4 jours. Une reconstitution des souris myélodysplasique est faite par transfer de cellules de moelle osseuses . La reconstitution se fait par une seule injection et a lieu en 1 mois. Des prises de sang retroorbitaires sont effectué toutes les six semaines. Un test de tolérance au glucose par injection i.p de glucose et prise de sang a la base de la queue est effectué toutes les 6 semaines aussi.

Impact sur les animaux

1. Placer les animaux sur un régime riche dans le temps imparti pour l’expérimentation augmente leur poids d’une manière considérable sans causer une altération significative de l’état général de l’animal. 2. La génération de souris chimérique nécessite l’induction d’une myélodysplasie par un traitement aux Busulfan. Ce traitement induit une perte de poids

Devenir

Procédure 1 : 288 animaux sont inclus dans cette procédure. 48 animaux sont utilisés en tant que donneur de moelle osseuse et sont euthanasiés par dislocation cervicale a l’issue de cette procédure. Le prélèvement de la moelle osseuse ne peut être effectue que sur des animaux morts. Le reste des animaux (240), constituent les animaux chimériques receveur de moelle osseuse qui seront gardés en vie et donc inclus dans les procédures qui suivent. Procédure 2. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un régime normal (360) et un régime riche en graisse (360). Tous les animaux de cette procédure sont gardés en vie en passent dans la procédure 3. Procédure 3. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à des prises de sang. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie en passent dans la procédure 4. Procédure 4. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un test de tolérance au glucose. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie et transférés dans l’animalerie NutriNeuro ou ils seront soumis à des tests comportementaux. Une autre DAP a été soumise pour cela.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologiques observés chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de la DNase1L3 dans le développements d’un syndrome métabolique et dans la régulation des troubles neuropsychiatriques qui découlent de l’inflammation induite par l’obésité. De plus les études comportementales afin d’évaluer le développent de l’anxiété et des états dépressifs ne peuvent être réalisé que sur des animaux vivants. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité de la régulation des états mentaux par les processus inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons également optimisé leur utilisation. En effet sur les mêmes animaux nous allons à la fois évaluer la survenue du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques. Cela nous permet de réduire l’utilisation des animaux d’un facteur deux.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang retro-orbitaires sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort de cette procédure. De plus, les prises de sang réalisées à l’extrémité de la queue incluent une anesthésie locale pour réduire la douleur qui peut être induite par cette procédure.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris déficientes pour la DNase1L3, DNase1, TLR9 et IFNAR sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont très sensibles aux régimes alimentaires pour l'induction de l’obésité (Surwit et al., Diabetes, 1988). Comme l’Homme, elles développent une obésité, un diabète de type II, une stéatose hépatique et des troubles neuropsychiatriques (dépression et anxiété) un fois exposées à un régime riche en graisse, alors qu’avec une alimentation standard, elles restent minces et ne développent pas de problèmes métaboliques ni de troubles neuropsychiatriques. En plus des souris congénique B6/SJL (pep boy, CD45.1) seront utilisées pour réaliser des chimères de moelle osseuse. Leur utilisation est necessaire afin d'évaluer l'efficacité de nos greffes qui est rendu possible par l'analyse de l'expression du variant de la molécule CD45. Les souris seront nourries dès l’âge de 12 semaines par HFD. L’exposition des souris C57BL/6 de cet age à un régime HFD ad libidum conduit à une obésité et au développent du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques assez proche de ceux se développant chez l’homme. Les premières manifestations apparaissent environ 6 semaines après l’introduction du régime HFD mais l’hyperglycémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique ainsi que les troubles neuropsychiatriques sont observées vers 18 semaines post régime HFD (Surwit et al. ; Diabetes, 1988).

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à huit prélèvements sanguins sur une journée, aux veines mandibulaire, saphène et fémorale, pour mettre au point une technique de micro-prélèvement. Le porteur admet que des sites de prélèvement seront "abîmés" puisqu'il s'agit d'une mise au point, et fixe la validation à 90% d'animaux aux sites corrects. Il justifie le projet par la réduction du nombre d'animaux dans de futures études, tout en qualifiant le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Ce projet consiste à effectuer huit prélèvements sanguins par animal en vigile via la technique du micosampling. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile par microsampling c'est à dire prélèvement à la veine mandibulaire, à la veine saphène et/ou à la veine fémorale (2 prélèvements maximum par site de 40 μl maximum). Nombre maximal de prélèvement par animal: 8

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de développer une nouvelle technique de prélèvement, via le microsampling, qui permettra de faire 8 prélèvements de 40 µL maximum et donc de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés pour les prochaines études

Procédures

La veille des prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse: Isoflurane) pour pouvoir raser les pattes arrières des animaux. Avant de commencer les prélèvements, les cages hébergeant les animaux seront placées sous lampes chauffantes pendant environ 15 minutes pour faciliter les prélèvements et dilater les veines. Cette opération peut être renouvellée autant que nécessaire si besoin. Les sites de prélèvement sanguin ( veine mandibulaire, saphène ou fémorale droite ou gauche) seront alternés au maximum. 4 prélèvements seront fait au niveau des mandibules droites et gauche et 4 autres prélèvements seront réalisés au niveau des saphènes droite et gauche et fémorales droite et gauche (1 prélèvement par site) Les temps de prélèvement seront: T5min, T15min, T30 min, T1h, T2h, T4h, T6h, T8h. Volume de sang prélevé: 40 µL par temps de prélèvement

Impact sur les animaux

Il est probable d'avoir des sites de prélèvement abimés car c'est une mise au point de technique... Un suivi quotidien (voire plusieurs fois par jour, à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin. Cette technique sera validée si 90 % des animaux présentent des sites de prélèvements convenables, non abîmés avec un bon aspect général des animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure , les animaux seront anesthésiés et euthanasiés par dislocation cervicale (possibilité d'exsanguination précédant la dislocation).

Remplacement

Le but de ce projet est de mettre en place une nouvelle technique de prélèvement sanguins ( le microsampling) chez la souris. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de valider cette technique sur un autre support , il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 40 animaux seront inclus pour une durée de 1 an. C'est le nombre d'animaux nécessaire et minimal requis pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Les animaux seront divisés en 2 groupes de 6, et les essais seront fait sur trois souches de souris différentes (souris SWISS, C57Bl6 et les souris SCID). Douze animaux seront utilisés pour chaque souche.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 maximum dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin.

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Les souches SWISS, C57BL6 seront particulièrement utilisées . La souche SCID, pourra aussi être utilisée. Majoritairement adultes. Souris d'environ 20-40g

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traumatisme crânien est provoqué chez des souriceaux de 17 jours, suivi pendant six mois d'une batterie de tests comportementaux (open field, poutre, échelle, test de Von Frey, labyrinthe en croix surélevé, labyrinthe de Barnes) et d'IRM sous anesthésie, pour étudier le rôle du facteur HIF1. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme que l'animal "ne montre aucun signe de douleur" une fois réveillé, alors que la procédure est classée en gravité modérée. Le bénéfice annoncé, cerner les conditions de séquelles après un traumatisme crânien pédiatrique, reste une perspective de recherche.

Objectifs

Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien (TC) le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Après un TC, les atteintes des vaisseaux ont pour conséquence de diminuer l’apport en oxygène aux cellules du cerveau. Cette baisse en oxygène (hypoxie) peut aller jusqu’à provoquer la mort de certaines cellules du cerveau. La réponse de l’organisme face à l’hypoxie est régulée par le facteur HIF1 (Hypoxia Inducible Factor). Nous voulons tester si ce facteur joue un rôle délétère dans les évènements cellulaires après un TC. Si tel est le cas, ce facteur représenterait une cible potentielle de traitement innovante et à fort intérêt thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine HIF1 représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

Les 640 animaux subiront tous les procédures non-terminales suivantes : 1. traumatisme crânien léger unique sous anesthésie générale courte (5 minutes) pour moitié des animaux et anesthésie générale courte seule pour l’autre moitié (animaux contrôles dits « sham ») à 17 jours après la naissance. 2. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 et 7 jours après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field) et un test de coordination motrice sur échelle (Foot Fault) réalisés la même journée. 3. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 mois, 3 mois et 6 mois après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field), 2 tests de coordination motrice sur poutre et échelle (Beam walk et Foot Fault) d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile (Von Frey test) d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux (Elevated Plus Maze et White/Black box) de 5 minutes et un test d’apprentissage spatial (Barnes Maze) qui nécessite des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale comprendra 11 tests quotidiens d’environ 5 minutes répartis sur 2 semaines. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure répétée à 1, 3 et 6 mois après le trauma, un jour après le dernier test comportemental.

Impact sur les animaux

Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Le traumatisme est réalisé chez l’animal anesthésié, et une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur, il reprend immédiatement un comportement normal. Comme il s’agit d’un traumatisme léger, les conséquences à long terme ne sont pas anxiogènes ou douloureuses pour l’animal. Ces conséquences sont principalement des retards/défauts d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de la mobilité de l’animal. De plus, le modèle murin utilisé n’engendre pas de phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, soit 640 animaux.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données (PubMed, Web of science, …) permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 640 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes : analyses multi-ANOVA avec répétition / analyses de régression entre les différents paramètres mesurés pour des tests comportementaux / IRM (voir annexes pour le plan expérimental).

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Les protocoles expérimentaux s'appuient notamment sur l'utilisation d'un agoniste opioïde, la Buprénorphine, afin de prévenir ou traiter la manifestation de douleurs.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Notre projet s'appuie sur l'utilisation d’une de ces souches : des souris pour lesquelles le gène codant pour le facteur HIF1-alpha a été inactivé dans les astrocytes. Cette invalidation de gène n'induit pas d'effet sur le développement, la survie, la croissance et les fonctions neuromusculaires. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à long-terme.