Rongeurs

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ovariectomie puis une greffe de cellules tumorales dans l'utérus, suivie de plusieurs semaines d'imagerie sous anesthésie, pour tester un anticorps anti-Netrin-1 contre le cancer de l'endomètre. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer des douleurs abdominales et que les métastases pulmonaires peuvent entraîner des difficultés respiratoires, les animaux étant alors mis à mort. Le bénéfice annoncé, "améliorer la prise en charge" des patientes, reste général, et il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le cancer de l'endomètre est le cancer gynécologique le plus diagnostiqué dans les pays développés, et son incidence ne cesse d'augmenter. L'objectif de ce projet est de créer un modèle de greffe de cellules tumorales dans l’endomètre des souris pour mimer au mieux les conditions micro-environnementales dans le but de caractériser l’action de l’anticorps anti-Netrin-1 sur la croissance tumorale. il permettra également par la suite d’utiliser ce modèle pour tester l’efficacité de l’anticorps anti-Netrin-1 en le combinant avec des traitements anti-cancéreux connus.

Bénéfices attendus

Améliorer la prise en charge et le traitement du cancer de l’endomètre chez les patientes atteintes de tumeurs avancées et/ou métastatiques.

Procédures

Ovariectomie et xénogreffes de cellules tumorales en orthotopique (1à à 15 minutes, une fois). Imagerie par ultrason (10 à 20 minutes, 1 à 2 fois par semaine pendant 7-8 semaines). Imagerie de la luminescence (10 à 15 minutes, 1 à 2 fois par semaine pendant 7-8 semaines).

Impact sur les animaux

Bien que la publication dans laquelle cette procédure est décrite ne fasse pas état d’effets indésirables particuliers, la croissance tumorale des tumeurs de l’endomètre peut générer des douleurs abdominales qui seront atténuées par traitement analgésique si l’animal montre des signes de souffrance. Si les signes de douleurs se poursuivent et sont accompagnés d’une baisse d’appétit et une perte de poids > 20%, l’animal sera mis à mort. Suivant la taille des tumeurs, il est possible que la mobilité des animaux soit réduite du fait de la localisation des tumeurs. La présence de métastases pulmonaires peut générer des difficultés respiratoires chez l’animal. Le comportement et la respiration de l’animal seront monitorés régulièrement et l’animal sera mis à mort si l’atteinte respiratoire devient trop grave.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, ou si un point limite est atteint en cours de procédure, par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane. Cela est nécessaire afin d'une part de limiter la souffrance de l'animal en cas d'atteinte de point limite et d'autre part de valoriser l'expérience par des analyses immuno-histochimiques et biochimiques sur différents tissus (sains et tumoraux) récoltés après la mise à mort de l'animal et d'ainsi identifer les mécanismes moléculaires impliqués.

Remplacement

Une attention particulière sera accordée à la règle des 3R afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour valider l’observation clinique et analyser les effets de la thérapie ciblée. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, l’abrasion puis l’injection de cellules tumorales seront réalisées au niveau des cornes utérines droite et gauche de l’animal, afin de générer 2 tumeurs par animal et ainsi réduire le nombre total d’animaux par deux. De plus, les procédures se feront de façon séquentielle et donc en fonction des premiers résultats, les expérimentateurs pourront réduire le nombre d'animaux nécessaires au total.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. L’ovariectomie et l’injection de cellules tumorales seront réalisées par un expérimentateur habitué et formé aux techniques de chirurgie expérimentale et l’animal sera anesthésié à l’isoflurane. Il est important de noter qu'en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront euthanasiés dans le respect de la réglementation en fonction des signes de souffrance. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé, de manière non-invasive, soit par échographie soit par imagerie de fluorescence non-invasive, sous anesthésie, une fois par semaine tant que la taille de la tumeur est inférieure à 2 mm, puis tous les 3 jours jusqu'à ce que la tumeur atteigne le point limite de 50mm3. Ces techniques d'imagerie non-invasive permettent de réduire les manipulation et le stress de l'animal. Pour le traitement de la douleur, de la buprenorphine sera administrée avant le début de la procédure chirurgicale afin de prévenir toute douleur opératoire. Pour le traitement des douleurs post-opératoires, l'eau de boisson sera additionnée de paracétamol.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. De plus, la souris immunocompétente permettra d’analyser la contribution du système immunitaire dans les effets observés après xénogreffes de lignées tumorales murines. Par ailleurs, les schémas d’administration des chimiothérapies (voie, doses, posologies) sont bien standardisés chez la souris, contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de l'oreille interne puis une bio-impression assistée par laser via la fenêtre ronde de la cochlée, sous deux anesthésies générales, pour mettre au point une technique d'injection intra-cochléaire. Le porteur décrit la bio-impression et les mesures auditives comme ne générant "aucune douleur ou traumatisme", alors que la chirurgie reste classée en gravité modérée. Sur le remplacement, il affirme que ces mesures ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères, au système auditif jugé "trop éloigné" de celui de l'homme.

Objectifs

L'oreille interne représente l'un des organes cibles les plus difficiles pour l'administration de médicaments. Les voies conventionnelles, telles que l'administration orale et les injections, ont une efficacité limitée, principalement en raison de la barrière hémato-cochléaire qui bloque la plupart des molécules provenant de la circulation sanguine. L’une des voies d’accès la plus étudiée et la plus prometteuse comme « porte d’entrée » de l’oreille interne repose sur la fenêtre ronde à la base de la cochlée (1.5 mm de diamètre environ). Elle constitue une membrane souple, relativement perméable, de 40 à 60 µm d'épaisseur et est composée de 3 couches cellulaires. Son rôle est de vibrer de manière opposée aux vibrations acoustiques qui entrent dans l’oreille interne, jouant ainsi le rôle de soupape de pression et permettant aux ondes sonores de se propager dans la cochlée. Cette membrane permet d’avoir un accès privilégié aux fluides internes de la cochlée. L’objectif du projet est donc de développer un nouveau dispositif permettant de délivrer un agent thérapeutique en intra-cochléaire, via la fenêtre ronde, de manière atraumatique et contrôlée. Pour cela, l’équipe s’est orientée vers la bio-impression assistée par laser, déjà utilisée au laboratoire dans des protocoles de régénération osseuse in situ chez l’animal, qui ne produit pas de souffrance apparente des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer une technique pour réaliser des injections de substances thérapeutiques dans l’oreille interne, avec une grande précision et sans risque de lésions des structures sensorielles cochléo-vestibulaires contrairement aux stratégies développées à ce jour.

Procédures

Les 4 groupes d’animaux (soit 100 souris) seront soumis à une procédure chirurgicale et aux mesures de PEAs. La bio-impression assistée par laser ne concernera que les groupes 2 à 4 (soit 90 souris sur les 100 prévues). Ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale (mélange Kétamine-Xylazine) accompagnée d’une analgésie dans le cas de la chirurgie (Carprofène). Les procédures de mesure de PEAs pré-opératoire, de chirurgie et de bio-impression seront réalisées en continuité directe lors de la première anesthésie (10 min pour les mesures de PEAs, 15 min pour la chirurgie et 10 min pour la bio-impression, soit 35 min de procédure sur souris anesthésiées). Une seconde anesthésie sera réalisée, 48h à 7 jours après l’intervention (post-opératoire), pour mesurer les PEAs. A la fin de la seconde mesure de PEAs post-opératoire, les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue. Ainsi, sur les 100 souris qui subiront la procédure chirurgicale et les mesures de PEAs (pré- et post-opératoire), 90 souris subiront également la bio-impression assistée par laser. Les 4 groupes d’animaux seront donc soumis à 2 anesthésies générales au total, pour une durée maximale de 35-40 min par anesthésie (cf. frise chronologique en annexe). Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies.

Impact sur les animaux

La durée des procédures n’excède pas 40 minutes maximum permettant de limiter la durée de l’anesthésie. Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies. Les procédures de bio-impression et de mesure des PEAs ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et seront réalisées sous anesthésie générale car elles nécessitent une immobilisation complète de l’animal. Lors de la chirurgie (niveau de sévérité modéré), un analgésique sera également utilisé pour limiter le niveau de douleur de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie après les différentes procédures excepté après la seconde mesure de PEAs (post-op) où les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue. Les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour analyse.

Remplacement

L'application de substances thérapeutiques sur la fenêtre ronde s'insère dans un projet d'application clinique future. Il faut dans un premier temps démontrer son efficacité et son innocuité sur un modèle animal. Par ailleurs, ces mesures ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Toutes les manipulations préalables de calibration par exemple seront effectuées dès que possible sur matériel inerte (gélose).

Réduction

Chaque souris sera utilisée pour toute la série de procédures (chirurgie, bio-impression assistée par laser et mesures de PEAs) afin d'en limiter leur nombre. Les souris seront donc soumises à 2 anesthésies au total : une première anesthésie pour la mesure pré-opératoire des PEAs, la chirurgie et la bio-impression puis une seconde anesthésie pour la mesure post-opératoire des PEAs (cf. frise chronologique en annexe). Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par conditions de bio-impression, conformément aux limites biostatistiques nous permettant une fiabilité des résultats. Pour les tests statistiques, nous utiliserons essentiellement des tests non paramétriques (type Wilcoxon-Mann-Whitney) puisque les échantillons seront petits et que les pré-requis des tests paramétriques (distributions normales, variances égales) ne seront pas satisfaits. Le nombre total de 100 souris utilisées sur l’ensemble du projet permet un traitement statistique significatif des données obtenues en se laissant une marge de manœuvre en cas d’échecs. Une phase de mise au point de bio-impression in vivo sera nécessaire, nécessitant des animaux surnuméraires (pris en compte dans nos lots). Un nombre minimum de 15 souris/groupe de bio-impression sera nécessaire pour assurer la fiabilité des tests statistiques. Ainsi, en fonction des résultats obtenus, un nombre plus faible d'animaux pourrait permettre d’avoir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Une analgésie adaptée sera appliquée en pré- et post-opératoire ainsi que des conditions de stabulation appropriées. Pour soulager l’inconfort et le stress des souris, nous hébergerons les souris dans une cage à milieu enrichi (tunnel carton, aspen bois, fibres de papier et abri) dans un local à ventilation, température et éclairage contrôlés. Pendant les différentes procédures, l’animal sera profondément anesthésié avec une surveillance des points vitaux (fréquence cardiaque et respiration, couleur des muqueuses, température corporelle). Des points limites seront définis afin de respecter le bien-être animal et pourront entraîner l’arrêt immédiat des manipulations. Trois expérimentateurs impliqués dans le projet possèdent l’expérimentation animale niveau concepteur (un expérimentateur supplémentaire fera la formation en mars 2022). Concernant les 2 expérimentateurs principaux (possédant l’EA concepteur), l’un a également suivi la formation chirurgie (octobre 2021) et l’autre suivra la prochaine formation chirurgie prévue en mars 2022. Concernant la formation continue, ces 2 expérimentateurs ont accumulé respectivement 26h sur 6 ans et 18h sur 4 ans (notamment sur le bien-être animal, la règle des 3R, les points limites, la gestion de la douleur…).

Choix des espèces

Les mesures de PEA ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. L’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 semaines, c’est-à-dire à un stade de développement postnatal où l’appareil auditif a atteint sa maturité.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation chirurgicale de la quasi-totalité des reins en deux opérations pour induire une maladie rénale chronique, puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, pour évaluer un probiotique. Le porteur indique une mortalité chirurgicale de moins de 5% et prévoit la mise à mort en cas de glycémie hors seuil. Les retombées cliniques, un éventuel "essai thérapeutique chez l'homme", restent conditionnées à des résultats positifs.

Objectifs

La maladie rénale chronique est un enjeu de santé publique majeur compte tenu de sa fréquence en constante augmentation et de ses conséquences en termes de décès. Elle est caractérisée par une diminution du fonctionnement des reins responsable de l’accumulation de déchets que le rein ne peut plus éliminer. Ces déchets sont appelés toxines urémiques et sont responsable d’une perturbation de la glycémie et de la progression de la maladie rénale. Le microbiote intestinal (bactéries de l’intestin) est responsable de la production de ces toxines urémiques issues de la dégradation des protéines de l’alimentation. Ainsi, la modulation du microbiote intestinal semble être une nouvelle stratégie thérapeutique pour réduire la production des toxines urémiques en plus des régimes pauvre en protéines proposés aux patients ayant une maladie rénale. Cependant réduire les protéines peut exposer les patients à un risque de dénutrition sévère et à des retards de croissance chez l’enfant. Les probiotiques qui sont des bactéries vivantes peuvent avoir un intérêt dans la maladie rénale en améliorant la composition du microbiote. Certains probiotiques semblent particulièrement intéressant. Par exemple, le probiotique Lactobacillus plantarum peut stimuler la croissance de souris juvéniles en condition de dénutrition. L’objectif de cette étude est d’étudier l’effet du probiotique Lactoplantibacille plantarum chez des souris ayant une maladie rénale chronique induite par chirurgie (ablation des 5/6èmes de reins, provoquant une maladie rénale chronique modérée) sous une alimentation pauvre en protéines chez des souris en croissance (souris jeunes) et chez des souris âgées. Nous cherchons à étudier l’impact de ce probiotique en particulier sur la croissance, la régulation de la glycémie, la fonction rénale et l’accumulation des toxines urémiques.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de mieux comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la progression de la maladie rénale chronique, la production des déchets urémiques et leurs conséquences néfastes. Cela nous permettra de mieux définir si l’ajout d’un probiotique qui stimule la croissance et l’hormone de croissance, pourrait en plus de la modulation du microbiote lutter contre les effets délétères des régimes pauvre en protéines chez l’enfant et l’adulte. Si les résultats sont positifs, ce projet pourra faire l’objet d’un essai thérapeutique chez l’homme ayant une maladie rénale chronique.

Procédures

Le modèle de maladie rénale chronique sera induit par ablation chirurgicale des 2/3 du rein droit puis de la totalité du rein gauche 1 semaine plus tard. Chacune de ces opérations sera réalisée sous anesthésie générale et antalgie efficace. Le traitement antalgique sera poursuivi de façon systématique pendant 48 heures. Les chirurgies seront réalisées en conditions stérile et les souris seront installés sur des tapis chauffant afin d’éviter un refroidissement. Les souris contrôles auront une chirurgie factice au cours de laquelle le rein sera exposé selon la même procédure chirurgicale mais sans réaliser d’intervention au niveau du rein. Au cours de la chirurgie, l’opérateur vérifiera l’absence de saignement anormal. Les probiotiques seront administrés à la pipette dans la bouche des souris. Au cours de la procédure les animaux auront plusieurs prélèvements. Les prélèvements réalisés en condition vigile se feront par le biais d’une micro-incision à l’extrémité de la queue préalablement anesthésiée par crème anesthésiante locale. Un premier prélèvement sera réalisé avant la 1ère chirurgie et réitéré 3 semaines après la 2ème chirurgie. A 4 semaines, nous réaliserons un test de tolérance au glucose après 6 heures de jeûne. Le glucose sera injecté en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. A 5 semaines nous réaliserons un test de tolérance à l’insuline après 6 heures de jeûne. L’insuline sera injectée en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. La survenue d’une glycémie trop haute ou trop basse (malgré une injection intra-péritonéal de glucose) constitue un point limite et les animaux seront mis à mort selon la procédure (injection d’un anesthésiant à forte dose et dislocation cervicale). A 6 semaines, les souris seront placées 2 par 2, pendant 24 h en cage avec un fond contenant de trous millimétrique afin de récolter l’urine. A la fin de la procédure les souris seront mises à mort. Le dernier prélèvement sera réalisé à cœur battant, sous anesthésie générale afin de permettre le prélèvement d’un volume le plus grand possible pour permettre le dosage des toxines urémiques. La mise à mise sera réalisée sans réveil par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Dans de précédentes études, la mortalité chirurgicale était de moins de 5%. La mortalité est généralement liée à l'induction d'une maladie rénale chronique trop sévère et arrive généralement dans les 24-48h après la 2° chirurgie. De plus, il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant une souffrance ou une anxiété des animaux. Il n'a pas été noté de perte d'appétit en condition de régime pauvre en protéine dans nos précédentes études. L’appétence pour les probiotiques est bonne. L’utilisation de régimes pauvre en protéines peut cependant induire une agressivité chez les animaux. Au cours de cette étude l’administration du probiotique se fera en intrabuccale grâce à l’utilisation d’une simple pipette et d’un cône. Par ailleurs les souris seront amenées à subir des test métaboliques nécessitant un prélèvement d'un micro-goutte de sang par incision de la portion terminale de la queue. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale selon le protocole soit animaux.

Remplacement

La production des déchets urémiques résulte à la fois de la diminution du fonctionnement du rein et de la composition modifiée du microbiote. Ces éléments ne sont pas modélisables sur un modèle cellulaire. De plus nous voulons étudier en autre les modifications de la structure l’intestin et de la régulation de la glycémie qui nécessite des examens trop invasifs pour être réalisé chez l’homme. Enfin l’étude de l’impact du probiotique sur la croissance dans une population d’enfant ayant une maladie rénale n’est pas possible à ce stade de développement du fait du risque potentiel infectieux de ce traitement. Ainsi toute expérimentation dans des modèles cellulaire ou chez l’homme est impossible à ce stade.

Réduction

Nous avons pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure expérimentale. En effet, à notre connaissance, la question scientifique que nous posons ici n’a encore jamais été adressée. Il s’agit donc d’un projet totalement original et nous avons veillé, lors de l’élaboration de notre procédure, à éviter toute redondance dans les expérimentations. Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Le nombre de souris du groupe contrôle a été réduit au minimum car des données obtenues d’expérience précédente seront réutilisées. Nous utiliserons au maximum 260 souris.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. Des antidouleurs seront délivrés systématiquement au moment de la chirurgie et 48 après. Les interventions seront réalisées sur tapis chauffant. Une surveillance 2 fois par jour sera effectuée pendant les 48 premières heures après les chirurgies. Dans les suites, les souris seront surveillées 1 fois par jour 5 jours par semaine afin de repérer toutes situation d’inconfort, de stress, douleurs ou agressivité. Pour limiter l’anxiété, les animaux seront placés 5 par cage. L’agressivité sera en particulier évaluée chez les animaux sous régimes pauvre en protéines. Tout au long de notre expérimentation nous resterons également vigilants à la survenue des points limites. Si une atteinte des points limites définis est constatée, les animaux seront sortis du protocole et mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale. Les prélèvements réalisés sur souris vigiles seront réalisés par incision de l’extrémité de la queue préalablement anesthésiée par crème anesthésiante locale. Au cours des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, en cas de glycémie trop haute ou trop basse à la fin du test, cela constitue un point limite et les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale L’administration des probiotiques sera réalisée directement dans la bouche par le même opérateur durant toute la procédure pour éviter tout traumatisme des animaux. Nous évitons ainsi le gavage directement dans l’estomac qui pourrait causer des lésions internes.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des souris, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme (accumulation de toxines urémiques, hyperglycémie, modification du microbiote intestinale). Des souris âgées de 4 semaines ont été choisi car les souris sont dans une phase de croissance et d’étudier plus spécifiquement l’intérêt de ce probiotique sur la croissance. Des souris âgées de 12 mois seront utilisées afin d’évaluer l’impact du probiotique sur la dénutrition en particulier, reproduisant une situation retrouvée chez l’homme adulte.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la mutation de la mucoviscidose, elles reçoivent dans la trachée des fragments de la bactérie Pseudomonas aeruginosa pour déclencher une inflammation pulmonaire, plus une injection d'un candidat anti-inflammatoire, avant une ponction cardiaque, un lavage des poumons et la mise à mort. Le porteur indique que l'exposition peut provoquer une gêne respiratoire sur une durée courte de 24 heures. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ou informatique ne reproduit cette réponse inflammatoire complexe entre le poumon et la rate.

Objectifs

La mucoviscidose est une maladie génétique incurable qui touche 1 enfant sur 4500 naissances en France. Elle atteint le système digestif et l’appareil respiratoire mais l’atteinte pulmonaire est responsable du décès dans 90% des cas. La faible espérance de vie de ces enfants résulte majoritairement de leurs prédispositions génétiques et des infections chroniques pulmonaires contractées qui aggrave leur pathologie pulmonaire. Afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces infection chroniques, nous avons établi un modèle murin permettant de mimer l’inflammation présente chez les patients. Pour mener notre étude, nous allons valider notre modèle d’inflammation. La mutation génétique la plus fréquemment rencontrée chez les patients atteints de mucoviscidose est la mutation F508del du gène CFTR. Nous avons donc utilisé le modèle murin portant la même mutation F508del. Les poumons de ces souris seront exposés à des extraits de bactéries mortes Pseudomonas aeruginosa. Cette bactérie est celle qui contamine majoritairement les patients atteints de mucoviscidose. Nous travaillons sur le composé CIGB-552, un peptide synthétique qui a montré son efficacité contre l’inflammation liée au cancer et aux infections généralisées. Notre objectif est de mesurer les paramètres de l’inflammation par des méthodes scientifiques robustes, afin de montrer l’effet anti-inflammatoire du CIGB-552 sur les infections pulmonaires dans le contexte de la mucoviscidose. Cela permettra de proposer un nouveau médicament pour les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : 1) D’obtenir un modèle murin de la mucoviscidose qui se rapproche des patients. La mesure des différents paramètres de l’inflammation pulmonaire permettra de mieux identifier les phénomènes inflammatoires sur lesquels agis le CIGB-552. 2) Que ce modèle murin d’inflammation soit suffisamment caractérisé, validé et reproductible. Cela permettra d’utiliser ce modèle pour mieux caractériser les futures molécules anti-inflammatoires développées par notre équipe ou par la communauté scientifique. 3) D’évaluer l’efficacité anti-inflammatoire du CIGB-552 sur plusieurs paramètres de l’inflammation qui sont observable seulement à l’échelle d’un individu.

Procédures

Pesée des souris : les souris vigiles seront pesées sur une balance conçue pour les petits animaux. Sera réalisée sur les 112 animaux, 4 fois par animal, pendant la durée de l’expérimentation (25h). Injection intra-péritonéale de CIGB-552/véhicule : les souris vigiles seront maintenues par contention par l’expérimentateur dans un environnement conçu pour l’expérimentation animale. Il sera injecté un volume de 100µl à une dose de 1,4 mg/kg avec une seringue. Sera réalisée sur les 112 animaux, 1 fois par animal au début de la procédure. Instillation oro-pharyngée de LPS de p.a. : les souris sont anesthésiées (Buprénorphine (0.05mg/Kg), Zoletil (40mg/Kg) et Xylazine (4.2mg/Kg) (150 μL par voie IP)). Injection dans la trachée à l’aide d’un cathéter, d’un volume de 20µl de LPS de pseudomonas aeruginosa 4mg/kg et 2mg/kg (ou du véhicule). Après ce geste, l’instillation d’un petit volume d’air via le cathéter permet de dégager les voies respiratoire en favorisant le dépôt du LPS (ou du vehicule) sur les paroies des voies aériennes. Sera réalisée sur les 112 animaux, 2 fois par animal à 1h et 22h après le démarrage de la procédure. Le geste technique par animal ne dure que quelques minutes et est réalisée dans un environnement conçu pour l’expérimentation animale.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir une gène respiratoire causée par l’exposition de leurs poumons aux bactéries mortes de Pseudomonas aeruginosa (P.a). Les morceaux de bactérie vont induir la réponse immunitaire des souris, et développer l’inflammatoire pulmonaire comparable à l’observation chez les patients atteints de mucoviscidose. Notre maitrise des gestes techniques montre que la méthode d’exposition des poumons des souris (instillation oro-pharyngée) n’est pas un geste invasif, ce qui garranti que le déclencheur de l’inflammation sont les morceaux de bactérie P.a. Dans l’état de nos connaissances, nous ne pouvons prédire l’effet de l’inflammation sur la perte de poids des souris. Du moins, nous n’anticipons pas de perte de poids sur une exposition aussi courte à la bactérie P.a (24h). Nous peserons les animaux au cours de la procédure. Si une nuisance de l’animal est observée, elle sera déclenchée seulement après l’exposition au LPS jusqu’à la fin de la procédure, soit un temps maximal de 24h.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l’issu de notre seule procédure par injection d’Euthasol 40 (140mg/kg). Nous récupèrerons le sang par ponction intra-cardiaque, le lavage broncho-alvéolaire et les lobes des poumons pour étudier la signature moléculaire et cellulaire liée à l’inflammation. Ces paramètres seront évalués par la méthode d’ELISA, d’histochimie, de RT-qPCR et de cytométrie de flux.

Remplacement

Notre étude porte sur l’évaluation de l’inflammation pulmonaire. Ce phénomène se prépare à l’échelle d’un individu par des échanges de messagers chimiques et cellulaire entre le poumon et la rate. Les modèles disponibles en laboratoire (cellule et prédiction bio-informatique) ne permettent pas à ce jour d’étudier cette réponse complexe de l’inflammation. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de comprendre et la réponse anti-inflammatoire, et d’évaluer la part bénéfique du CIGB-552 dans la modulation et la résolution de la réponse inflammatoire locale pulmonaire. En revanche nous limiterons cette étude préliminaire à un seul modèle de souris qui est le modèle F508del, le plus pertinent de la communauté scientifique pour étudier le processus complexe de l’inflammation.

Réduction

Précédemment au laboratoire nous avons optimisé les procédures afin d’observer sur un même animal, les paramètres clés de la mesure de l’inflammation. Les deux expositions aux morceaux de bactérie P.a. à deux temps différents de la procédure sur un même animal, permettent d’étudier deux moments de la réponse inflammatoire dans un même individu : les messagers chimiques ainsi que les messagers cellulaires qui permettent de répondre à l’infection. De ce fait, nous divisons par deux le nombre d’animaux nécessaires pour observer l’effet du CIGB-552 sur ces deux phénomènes de l’inflammation distincts dans le temps. D’après les expérimentations animales antérieures de l’équipe, nous estimons que 14 souris (7 mâles et 7 femelles) par groupe sont nécessaires pour révéler statistiquement l’effet bénéfique du CIGB-552.

Raffinement

Les souris seront élevées dans des cages ventillées de 5 animaux maximum, pour favoriser leur vie sociale. Un enrichissement de l’habitat sous forme de maisonnettes, de briquettes de bois et de morceaux de cotons permettra de réduire le stress des animaux et de favoriser leur bien-être. Les souris F508del possèdent une alimentation en croquettes Teklade plus riches en protéines pour éviter la perte de poids liée à la mucoviscidose. Les souris sont abreuvées avec une eau contenant de faibles doses de laxatifs (movicol) pour favoriser l’évacuation des selles. Les zootechniciens ainsi que les expérimentateurs sont tous formés et familiers aux soins particuliers à donner à notre modèle d’étude. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront réalisées en limitant au maximum le caractère invasif. L’ensemble des geste technique est maitrisé au sein de notre équipe. Les souris seront placées dans un caisson de réveil à 25°C après anesthésie, et nous contrôlerons particulièrement les paramètres température, respiration et battement cardiaques pour mener au réveil et à la reprise d’activité normale des animaux. Les souris d’une même cage appartiendront au même groupe expérimental, afin d’homogénéiser le comportement social des animaux lié aux injections et instillations. Par ailleurs, les souris recevant les morceaux de bactéries P.a. seront dans la même cage afin d’éviter la contamination croisée lors du toilettage des souris. Nous raffinons cette partie de l’expérimentation pour atteindre efficacement nos objectifs. Notre étude se concentre sur un phénomène inflammatoire court, ce qui limite la durée d’exposition et la douleur liée à des phénomènes d’exposition répétée et long. Nous pourrons modéliser l’effet de l’inflammation par des méthodes de prédiction mathématique lorsque nous aurons les conclusions de notre étude. L’évaluation permanente de la souffrance des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort à l’atteinte d’un point limite. Enfin, nous raffinons notre étude en observant deux phénomènes inflammatoire distincts dans le temps, sur un même individu sans en affecter la qualité des résultats. Nous étudions les effets du CIGB-552 sur la réponse inflammatoire en évaluant plusieurs paramètres sur un même individu, ce qui nous permet de comprendre les phénomènes inflammatoires et leurs liens.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. 1) Le modèle murin F508del est le plus utilisé dans la recherche sur la mucoviscidose et est très bien caractérisé. Ces souris sont fournies et recommandées aux chercheurs français par l’association de patients Vaincre la Mucoviscidose. 2) Les modèles murins peuvent facilement être exposées aux morceaux de bactéries de Pseudomonas aeruginosa. Cela permet le développement d’un modèle plus affiné pour répondre à notre objectif qui est d’évaluer les propriétés anti-inflammatoire du CIGB-552 dans un contexte d’inflammation pulmonaire proche de celui des patients mucoviscidose. Il est donc pertinent d’utiliser ce modèle. 3) La génétique de la souris compte parmi les meilleures connaissances de la communauté scientifique. Les souris utilisées pour notre procédure seront âgées d’au moins 8 semaines (adultes). Nous choisissons cet âge pour deux raisons expérimentales : 1) La trachée des souris adultes est plus grande. 2) les souris F508del ont une anomalie de la trachée. Le choix de l’âge adulte facilite la procédure d’exposition des poumons aux morceaux de bactéries (instillation oro-pharyngée).

14 562 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des candidats médicaments, le plus souvent par gavage, puis passent des tests comportementaux avant un prélèvement de sang et de cerveau, dans des modèles d'autisme obtenus par lignées mutantes ou par activation immunitaire des mères. Le porteur indique que les effets attendus se limitent à des crampes abdominales ou une sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de modéliser ces troubles et que le recours à la souris est "nécessaire".

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA) sont des troubles neurodéveloppementaux caractérisés par des déficits dans trois domaines: 1) des troubles dans les interactions sociales ; 2) des déficits du langage et de la communication et 3) des comportements limités ou répétitifs. Il devient de plus en plus évident que les causes des troubles du spectre autistique (TSA) sont dues à la fois à des facteurs génétiques et environnementaux. Les études animales fournissent des modèles translationnels importants pour élucider des facteurs génétiques ou environnementaux spécifiques qui contribuent aux déficits comportementaux liés aux TSA. Par exemple, de nombreux modèles murins d'activation immunitaire maternelle ont démontré que l'infection virale et bactérienne maternelle modifie le comportement de la progéniture, entraînant des phénotypes de type TSA. D’autre part, des souris mutantes transgéniques (BTBR T+ Itpr3 tf /J) et des souches consanguines (BALB/cByJ) ont été utilisées pour étudier les contributions génétiques possibles aux comportements de type TSA. Ces comportements comprennent des niveaux réduits d'interactions sociales réciproques, un manque de sociabilité typique de l'espèce et des niveaux significativement plus élevés d'auto entretien répétitif. L’objectif de ce projet consiste : 1) d'étudier l'effet de nouveaux candidats médicaments dans un modèle murin d'autisme (soit BTBR soit BALB/cByJ) et 2) la mise en place d’un modèle d’autisme par activation du système immunitaire innée (injection de Poly I:C) chez la souris et étude de l’effet de nouveaux candidats médicaments dans ce modèle.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux pour les TSA. Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ces modèles animaux peuvent être utiles pour identifier d’une part les contributions génétiques possibles aux comportements de type TSA et d’autre part le lien entre l’inflammation et l’autisme afin de tester de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes régulières dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués sous anesthésie générale, à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les administrations (molécule de référence, candidats médicaments...) sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Devenir

A la suite des administrations des produits (molécule de référence, candidats médicaments et véhicule), l’ensemble des animaux passent en tests. Ensuite, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang et de cerveau (sous anesthésie générale), juste avant la mise à mort. Ces prélèvements permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour modéliser les TSA. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour l’étude de la physiopathologie et l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : C57Bl/6 J, BALB/cByJ, BTBR T+ Itpr3 tf /J (BTBR) 1- Effet de nouveaux candidats médicaments dans le modèle murin d’autisme chez les souris BTBR et BALB/cByJ 4-10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes. 2- Mise en place d’un modèle d’autisme par activation du système immunitaire innée (injection de Poly I:C) chez la souris et étude de l’effet de nouveaux candidats médicaments dans ce modèle 6-12 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq jours d'injections pour désactiver la signalisation thyroïdienne dans leur tissu adipeux brun, la moitié étant ensuite exposée à 4 °C pendant 72 heures avant un prélèvement de sang sous anesthésie et la mise à mort, pour distinguer l'action centrale et périphérique des hormones thyroïdiennes. Le porteur indique n'attendre aucun effet délétère des injections et que le froid abaisse la température corporelle durant les premières heures. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est adapté et qu'une alternative cellulaire exigerait 128 animaux contre 32 ici.

Objectifs

Le tissu adipeux brun (TAB) est capable d’utiliser les lipides et le glucose pour les transformer en chaleur (thermogenèse). Ce processus est dépendant des hormones thyroïdiennes (HT). Il était jusque-là établi que les hormones produites par la thyroïde passaient dans le sang pour jouer leur rôle directement dans le TAB, (action périphérique). Mais des études montrent que l’administration d’HT dans le cerveau des souris active directement le TAB (action centrale). Cela suggère que le cerveau est la cible principale des HT, ce qui bouscule ce qui était précédemment établi. Ces résultats restent encore controversés. A court terme, l’objectif de ce projet est donc d’arriver à distinguer la part de l’action centrale et périphérique des HT pour ses fonctions métaboliques dans le TAB afin de tirer au clair les données contradictoires jusqu’alors publiées. Pour cela, nous utilisons une lignée mutante murine qui ne dispose plus de signalisation thyroïdienne spécifiquement dans le TAB. L’utilisation de cette lignée a mis en évidence de nombreux indices suggérant que le froid déclencherait la multiplication des cellules du TAB (afin d’augmenter la quantité de chaleur produite par le tissu) ainsi que la production de lipides (mécanisme appelé lipogenèse, nécessaire pour alimenter la thermogenèse du TAB), mais pas chez les souris mutantes. Cela suggère que ces mécanismes seraient contrôlés par les HT directement dans le TAB, et pas dans le cerveau. Ainsi, cette étude pose la question suivante : l’altération de signalisation thyroïdienne dans le TAB empêche t-elle une lipogenèse et prolifération efficaces, du TAB ? Actuellement, notre modèle murin est le seul à permettre la distinction entre l’effet central et périphérique des hormones, grâce à la spécificité tissulaire des mutations induites.

Bénéfices attendus

Ce projet présente deux bénéfices principaux. Premièrement, il viendra confronter les données publiées dans la littérature qui suggèrent que la cible des HT est le cerveau (qui médie ensuite les effets aux autres tissus) et non pas les tissus périphériques comme il était jusque-là pensé. La démonstration ou la réfutation de ces découvertes sont primordiales afin de comprendre comment les HT régulent le métabolisme et la dépense énergétique. Egalement, il est d’intérêt sociétal de trouver des innovations aux moyens de prévention/traitement de l’obésité et le TAB a dès sa découverte suscité un engouement particulier pour sa capacité à utiliser lipides et glucides et ainsi consommer des calories . Les HT participent au contrôle de la thermogenèse du TAB, puisque des souris hyperthyroïdiennes ont une forte activité du TAB, résultant en une plus grande dépense énergétique et une plus faible susceptibilité à l’obésité et aux désordres métaboliques qui lui sont associés. Toutefois, l’injection d’HT ne peut pas être considérée comme une option viable à ces problématiques puisqu’elle va également avoir des effets métaboliques sur le cœur ou les os, déclenchant des effets secondaires tels que la tachycardie ou l’ostéoporose, par exemple. Il est ainsi crucial de comprendre comment les HT régulent spécifiquement la thermogenèse du TAB, et notamment le métabolisme des lipides, afin de, à plus long terme et avec les progrès de la pharmacologie, concevoir de nouvelles molécules ne stimulant que les activités métaboliques des HT sur le TAB tout en s’affranchissant des effets secondaires néfastes.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés en intrapéritonéal quotidiennement pendant 5 jours avec un produit permettant d’induire la mutation de la signalisation thyroïdienne dans le TAB) via une contention manuelle. Pour réduire le stress généré par cette technique, les animaux seront préalablement contentionés manuellement sans injection, tous les jours pendant une semaine afin de les accoutumer à l’expérimentateur et à la contention. La moitié des effectifs seront ensuite exposés à 4°C pendant 72h, une température à laquelle les animaux arrivent à maintenir leur température corporelle (données publiées et données du laboratoire). Durant cette exposition, les groupes sociaux et un enrichissement de la cage seront maintenus pour faciliter le maintien de la température corporelle. Au bout de 48h au froid, une injection intrapéritonéale unique sera réalisée sur tous les animaux (avec un marqueur de prolifération des cellules), un geste auquel ils auront été accoutumés précédemment. Pour finir, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie profonde puis les animaux seront mis à mort pour prélèvement des tissus d’intérêts.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétère à l’injection du produit utilisé pour induire les mutations dans le TAB n’a jusque-là été observé aux doses utilisées ici . Ce protocole et ces doses ont été déterminées sur les recommandations de la bibliographie, en réduisant les doses préconisées aux doses minimales mises au point dans notre laboratoire permettant l’induction des mutations dans notre modèle murin. De la même manière, aucun effet délétère n’a été observé par une injection unique du produit utilisé pour marquer les cellules prolifératives) aux doses utilisées fréquemment dans notre laboratoire. Cette dose a été choisie sur la base des données bibliographiques ayant définies cette dose comme étant la dose la plus faible permettant le marquage de toutes les cellules prolifératives. Nous savons que l’exposition au froid fasse diminuer la température corporelle des souris les 4 premières heures avant de revenir proche de la normale au bout de 8h . De plus, les souris mutantes défendent leur température corporelle de la même manière que les animaux non-mutants à 4°C pendant 72h en présence de nourriture dans la cage. Les animaux mutants tendent à consommer légèrement plus de nourriture que les animaux contrôles pour défendre de manière similaire leur température corporelle . La présence de nourriture permet aux souris de palier à la baisse de température, c’est pourquoi des méthodes de facilitation d’accès à la nourriture seront mises en place. De la même manière, tout le matériel nécessaire à la réalisation d’un nid sera maintenu.

Devenir

Cette étude vise à comprendre le rôle des HT dans la prolifération et la lipogenèse du TAB en réponse au froid. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés. En effet, l’entièreté du TAB doit être analysé pour mesurer les paramètres questionnés. Egalement, une quantité importe de sang doit être prélevée afin de contrôler le taux d’hormones thyroïdiennes circulant, une étape incontournable pour contrôler la pertinence de notre modèle transgénique.

Remplacement

Ce projet nécessite de manière incontournable l’utilisation d’animaux puisqu’elle vise à comprendre le rôle des HT spécifiquement dans le TAB . Aucun modèle in vitro n’est adapté pour répondre aux questions posées. Notamment, une lignée cellulaire provenant du TAB ne répond que très peu aux HT et cette réponse est très différente comparée au tissu in vivo. Une autre alternative in vitro a mis en évidence une limitation puisque dans nos conditions, un très grand nombre d’animaux serait nécessaire pour cette étude (nombre d’animaux estimé à 128, contre 32 en utilisant les animaux entiers). Par ailleurs, la lipogenèse (production de lipides, que nous étudierons dans cette expérience) est un processus impliquant directement plusieurs organes, notamment le foie, dont le métabolisme est lui-même contrôlé par le cerveau. Enfin , l’observation de la lipogenèse et de la prolifération est étudiée en réponse au stimuli principal en conditions physiologiques, à savoir une exposition au froid. Le froid est détecté par les récepteurs sensoriels présents à la surface de la peau. Aucun modèle non-animal n’est capable de récapituler cette complexité multi-organes ni de répondre directement au froid. L’étude de processus métaboliques impliquant nécessairement plusieurs organes en réponse à un stimuli environnemental implique l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les études préliminaires réalisées dans le cadre de ce projet nous permettent d’affirmer que 6 animaux par groupe sont suffisants pour détecter une différence de lipogenèse et de prolifération . Néanmoins, la quantité de TAB étant limitée (30mg) l’utilisation de ce tissu peut être délicate. Egalement, un des points limites peut être atteint lors de l’exposition au froid. En ce sens, le groupe d’animaux par groupe est augmenté à 8, toutefois, l’expérience sera d’abord réalisée avec 6 animaux : si aucun point limite n’est atteint et que les extractions aboutissent et répondent aux questions posées, les 2 animaux restants par groupe ne seront pas utilisés. Si un problème technique est rencontré, les animaux supplémentaires pourront être utilisés. Ainsi, nous utilisons le nombre minimal d’animaux en prévoyant une marge pour s’adapter aux limitations techniques que nous pouvons rencontrer. De cette manière, nous ne préovoyons pas de répétition d’expérience. Par ailleurs, la procédure a été optimisée afin d’en tirer le plus d’information possible, à savoir la lipogenèse et la prolifération en réponse au froid, afin de ne pas avoir à dupliquer cette exposition et ne pas utiliser plus d’animaux. Enfin, plusieurs tissus seront prélevés, puisqu’ils pourront être utilisés à posteriori afin de regarder les effets d’une exposition au froid sur ceux-ci, sans avoir à exposer d’autres animaux.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe de 3-4 animaux par cage en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, feuille de papier, bois à ronger), et ce même pendant l’exposition au froid. Nos expériences précédentes montrent une température des animaux plus faible les 8 premières. Ainsi, pendant cette première phase, les animaux seront surveillés toutes les heures afin de détecter le plus rapidement possible des comportements anormaux. Ensuite, les animaux seront surveillés la journée toutes les 4h, soit quatre points de surveillance quotidiens. En dehors de l’exposition au froid, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours. La souffrance des animaux est évaluée au comportement, comportant entre autres la prostration, le pelage et la posture. Egalement, les animaux seront aussi pesés lors des visites (tous les jours) et pendant l’exposition au froid (deux fois fois par jour) afin de contrôler l’absence de perte de poids significative, définissant un point limite de l’expérience. Une attention particulière sera également portée à l’aggressivité entre les animaux. Si de l’aggressivité ou des blessures résultantes sont détectées, les animaux blessés/responsables seront écartés et les blessures soignées à la Vétédine. Les animaux blessés ne seront pas exposés au froid, ou retirés du froid afin de permettre une cicatrisation optimale de leur blessure.

Choix des espèces

Les récepteurs des hormones thyroïdiennes de la souris sont très similaires à ceux de l’homme et chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique. Comprendre comment les hormones thyroïdiennes stimulent ce processus chez la souris apportera donc de précises indications sur les mécanismes présents chez l’Homme et pourront, à terme, être utilisés pour développer de nouveaux composés pharmacologiques afin d’augmenter la dépense énergétique et ainsi lutter contre l’obésité et les désordres métaboliques qui lui sont associés. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats avec ceux publiés dans la littérature, et d’autre part de les comparer avec les résultats obtenus précédemment dans notre groupe. Nous nous intéressons à la régulation de la physiologie du TAB chez l’adulte, les souris utilisées auront donc entre 2 et 4 mois. Les animaux ne sont pas utilisés au-delà car le tissu adipeux brun tend à décroître avec l'âge.

18 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent un test de mémoire en labyrinthe en Y après administration de candidats médicaments ou de molécules mimant la maladie d'Alzheimer (scopolamine) ou la schizophrénie (MK-801), avant un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur indique que les effets attendus se limitent à l'inconfort des injections et à une possible sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer les fonctions cognitives et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le test d’alternance spontanée en labyrinthe en Y est utilisé pour évaluer l'état des fonctions cognitives des rats et des souris dans des modèles expérimentaux. Le comportement normal d’un animal se caractérise par des alternances de visites des bras. Une alternance est définie comme une visite consécutive des 3 branches. Un animal avec une mémoire de travail intacte (donc des fonctions corticales préfrontales intactes), se souviendra du bras précédemment visité et montrera une tendance à entrer dans un bras moins récemment visité. Un déficit mnésique se caractérisera par un pourcentage d’alternance proche de 50% (visites au hasard). Le projet présenté ici a pour objectif la mise en place d’un test de mémoire « le test d’alternance spontanée en labyrinthe Y » chez le rongeur (rat/souris) pour : 1) étudier les effets potentiels induits par un médicament candidat sur les fonctions cognitives ; 2) tester l’efficacité de médicament candidat sur les déficits cognitifs induits soit par une molécule amnésiante tel que la scopolamine (l’administration de scopolamine induit des changements de connectivité cérébrale observés dans la maladie d’Alzheimer, elle est donc utilisée comme modèle pharmacologique de la maladie d’Alzheimer chez le rongeur) soit par un antagoniste non compétitif du récepteur du N-méthyl-D-aspartate tel que le MK-801 (le dysfonctionnement des récepteurs NMDA est maintenant bien connu dans la schizophrénie, le MK-801 est donc utilisé comme modèle pharmacologique de la schizophrénie chez le rongeur).

Bénéfices attendus

La compréhension des déficiences fonctionnelles et des processus pathologiques est d'une importance vitale afin de développer des thérapies efficaces. En utilisant le comportement exploratoire naturel des rongeurs, le labyrinthe d’alternance spontanée en labyrinthe Y permet d’évaluer la mémoire de travail spatiale à court terme. Le protocole de test du labyrinthe en Y est simple et nécessite des ressources minimales. Il peut également être appliqué pour étudier la mémoire à court terme dans des modèles de rongeurs âgés.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple)

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d’évaluer les fonctions cognitives. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J ou SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2, BTBR.....) Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar et Sprague-Dawley. D'autres lignées de rats peuvent également être utilisées (SHR) 5 -52 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes et personnes âgées.