Rongeurs

54 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois formulations à doses croissantes, jusqu'à 100 mg/kg, en injection unique puis pendant cinq jours, avec des prélèvements de sang à la mâchoire sur animal éveillé puis un prélèvement terminal au cœur, pour fixer la dose maximale tolérée en vue d'un dossier d'autorisation de mise sur le marché. Le porteur indique qu'il est probable que les animaux présentent des effets indésirables et fixe des points limites tels que convulsions, détresse respiratoire ou automutilation. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'effet de l'"organisme entier" sur les molécules et qu'il est "indispensable de recourir à l'animal de laboratoire".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer la dose maximale tolérée de trois formulations différentes. Chaque formulation sera administrée à la dose de 10, 50 et 100 mg/kg.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer la dose maximale tolérée pour les trois formulations testées aprés une administration unique ou une administration répétée pendant 5 jours. La classe thérapeutique du principe actif est Neurologie, le but étant de déterminer les doses cibles pour les futures études de toxicologie demandées par les autorités pour un dépôt de dossier AMM.

Procédures

- Les animaux auront une simple administration en période 1 puis aprés une période de repos d'au moins 3 jours, ils auront une administration répétées pendant 5 jours (administrations Intra péritonéale en période 1 et 2). - Les prélèvements seront de 3 prélèvements par animal en période 1 juste aprés administration à 30min, 2h et 6h. Puis les animaux auront une période de repos d'au moins 3 jours. En période 2, les animaux auront également 3 prélèvements aux même temps aprés la cinquième et dernière administration. Volume maximal prélevé: 60 µl Les prélèvements se font sur animal vigile (microsampling à la veine mandibulaire) ou sous anesthésie (prélèvement terminal en intra-cardiaque).

Impact sur les animaux

Le but étant de déterminer une dose maximale, il est fort probable d'avoir des signes d'effets indésirables sur les animaux. Les animaux seront observés au minimum deux fois par jours pour un prise en charge rapide de l'animal si besoin. Les points limites ou points d'arrêt anticipés sont: - Immobilité prolongée de l'animal, décubitus - Suffocation, convulsion, détresse respiratoire - Apparence physique dégradée, absence de toilettage (ex : poil ébouriffé ou souillé) - Changements majeurs de comportements (ex : automutilation, agitation intense...)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur. Suite à cette procédure, des tissus (coeur, cerveau, poumons, reins, foie, rate, pancréas, muscle et tube digestif) seront collectés pour analyse

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer une dose maximale tolérée. La classe thérapeutique des formulations testées: neurologie. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire les effets de l'organisme entier sur les molécules, il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 54 animaux seront inclus (27 male et 27 femelle). Les animaux seront répartis en 9 groupes de 6 animaux. C'est le nombre d'animaux minimal requis pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (2 fois par jour à minima) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, comportement de l'animal....).

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques. La souche C57BL6 est particulièrement utilisée dans le domaine de la neurologie. Jeune adulte. Stade de developpement requis pour ce type d'étude

1340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose par instillation dans le nez sous anesthésie, pour identifier les gènes permettant au bacille de persister et de se transmettre. Le porteur indique que l'infection pulmonaire peut provoquer des signes cliniques aux stades avancés, des points limites précoces déclenchant l'élimination des animaux en souffrance. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne rend compte des phases tardives de la maladie et que le modèle souris est "incontournable".

Objectifs

Etudier les interactions entre l’hôte et les mycobactéries pathogènes est une étape clé dans l’optique d’identifier des cibles thérapeutiques et/ou des stratégies vaccinales nouvelles pour la lutte contre la tuberculose. Notre équipe s’attache, au travers de la manipulation de l’agent pathogène lui-même, à identifier les adaptations et facteurs permettant aux bacilles de la tuberculose de persister chez l’hôte et à se transmettre d’un hôte à l’autre et à comprendre le mécanisme moléculaire de fonctionnement de ces déterminants.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus doivent apporter des connaissances sur les mécanismes de la pathogénie mycobactérienne mais aussi sur l’importance de certains composés pour la survie de la bactérie chez l’hôte, et l’induction de la pathologie. Ces dernières informations sont essentielles pour valider certaines enzymes ou certaines voies de biosynthèse comme cibles thérapeutiques. Nos travaux se focalisent sur les adaptations et facteurs permettant aux bacilles de la tuberculose de persister chez l’hôte et à se transmettre d’un hôte à l’autre. Les informations sur ces étapes du cycle infectieux sont extrêmement limitées et il n’existe pas de modèle cellulaire pouvant se substituer au modèle animal.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions: 1) une injection d'anesthésique par voie intrapéritonéale qui conduira à une sédation de 15 min environ; 2) une instillation intranasale de la solution infectante réalisée sur les animaux anesthésiés.

Impact sur les animaux

Les protocoles consistent à inoculer un agent infectieux, une mycobactérie pathogène. Une infection principalement pulmonaire va donc en résulter. Dans les premières semaines de l’infection, les animaux ne présentent aucun signe de souffrance. Dans les stades avancés, les animaux infectés peuvent présenter des signes cliniques.

Devenir

Mise à mort. Les animaux seront infectés par des agents pathogènes, les bacilles de la tuberculose, et seront sacrifiés avant prélèvement d'organe.

Remplacement

Différents modèles cellulaires ou animaux sont utilisés par les équipes travaillant sur la tuberculose. Malheureusement les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de la tuberculose telles que la persistance ou la transmission. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’homme.

Réduction

Les différentes phases des projets (clairement identifiées dans les procédures détaillées) seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Toutes les expériences impliquant des animaux font l’objet d’un protocole expérimental écrit et validé par le responsable de l’animalerie. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité. Enfin, nous essayons d’analyser plusieurs paramètres sur un même lot d’animaux (par exemple : préparation d’ARN, cytométrie de flux et charges bactériennes).

Raffinement

Dans toutes les expériences, les souches de souris ont été choisies en fonction de l’objectif de l’expérimentation (détaillé dans le descriptif de la procédure expérimentale). L’état sanitaire et le bien-être des animaux sont évalués tout le long de l’expérience par des personnels formés et des points limites ont été définis. La souffrance et/ou le stress animal sont présents à deux niveaux dans nos expériences : i) lors de l’anesthésie et de l’infection des animaux,et ii) lors de l’inflammation pulmonaire chronique et des dommages tissulaires induits par l’infection mais où nous mettons en place des points limites précoces pour suivre les animaux et intervenir rapidement. Ces deux niveaux de douleurs font l’objet d’une prise en charge spécifique indiquée dans les procédures respectives et déjà appliquées dans nos projets antérieurs. Lors de l'infection des animaux, ceux-ci sont au préalable anesthésiés. Le second niveau de stress/douleur est lié à l'induction de la tuberculose expérimentale. Les expériences que nous réalisons sont limitées à une période de temps et à des doses infectieuses qui ne doivent pas générer de signes cliniques de la maladie. Cependant, nos expériences antérieures ont montré que parfois, et pour des raisons encore inconnues, les animaux peuvent développer des signes cliniques plus précocement qu’attendu. Ces évènements sont rares. Cependant, dès le premier jour d’infection et tout au long de l’expérience, la surveillance des douleurs chroniques est réalisée par observation directe et journalière des animaux par du personnel formé. Les signes de douleur ou de stress sont guettés et conduisent à l’élimination immédiate des animaux en souffrance. Une grille de scoring a été mise en place pour un suivi adapté.

Choix des espèces

Il existe plusieurs modèles animaux (souris, cobaye, lapin, porc, bovin, primate non humain) pour la tuberculose chacun présentant des avantages et des inconvénients. Pour notre projet visant à explorer les interactions hôte/pathogène par le biais de l'étude de souches bactériennes mutantes, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie, ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité protectrice chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (souris transgéniques, réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines.

1000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des trypanosomes, prélevés chaque jour d'une goutte de sang à la queue puis exsanguinés sous anesthésie, une partie des souris étant exposée aux piqûres de mouches tsé-tsé pour étudier la transmission. Le porteur indique que l'infection peut rendre les animaux moribonds ou prostrés, le poil hérissé, et décrit des points limites déclenchant une euthanasie précoce. Il affirme que ces souches parasitaires ne peuvent pas être maintenues in vitro et que l'hôte vivant reste nécessaire pour tester molécules et vaccins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est donc d’amplifier des souches sanguicoles de trypanosomes (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma evansi, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax) conservées en azote liquide, par passage sur souris et rats afin de a) produire des souches en quantité massive pour production d’antigènes parasitaires nécessaires aux tests de dépistage type ELISA et pour des études de caractérisation du protéome, du transcriptome et du secrétome des trypanosomes dans l’objectif de développer de nouvelles molécules afin de proposer des tests diagnostiques plus sensibles et spécifiques, b) réaliser des stabilats cryoconservés de trypanosomes pour entretien de notre cryothèque, c) réaliser des repas sanguins infectants de glossines (sur souris balb/c et génétiquement modifiées) pour étudier les modalités de la transmission vectorielle des trypanosomoses africaines humaine et animale, d) tester des molécules candidates afin de mettre au point un traitement contre les trypanosomes humaine et animale et d’étudier l’efficacité de certaines d’entre elles pour développer un vaccin anti-maladie. e) évaluer l’importance de la localisation des parasites dans le derme au cours de l’infection en fonction de l’espèce de trypanosome et valider sa valeur diagnostique.

Bénéfices attendus

Notre unité de recherche développe des approches multidisciplinaires visant à améliorer la compréhension des mécanismes infectieux dans les maladies induites par des protozoaires parasites de la famille des trypanosomatidae (les trypanosomes). Ces maladies transmises par des vecteurs (glossines essentiellement) sévissent dans des zones rurales pauvres des pays africains et constituent un obstacle majeur à l’installation humaine et au développement de l’élevage et de l’agriculture avec un fort impact socio-économique pour des populations déjà fortement appauvries. Des moyens de lutte existent, basés sur la lutte anti-vectorielle et l’utilisation d’outils diagnostiques et de traitements curatifs, mais bien qu’utilisés de façon raisonnée et intégrée, ils montrent de plus en plus leurs limites (chimiorésistances développées par les populations d’insectes et les parasites par exemple). Nos travaux s’inscrivent dans un souci d’amélioration des outils diagnostiques existants (amélioration et développement de tests de dépistages), d’identification de molécules ayant une action curative ou préventive, de mise au point d’un vaccin efficace pour protéger les populations humaines et animales et enfin, d’amélioration des outils de la lutte anti-vectorielle.

Procédures

Injections et prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. 40 rats et 300 souris seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes (dans certains cas une immunosuppression sera, au préalable, réalisée par injection), un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 210 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum, une anesthésie par injection d’un mélange anesthésique sera ensuite réalisée suivi d’un repas de glossines de 10 minutes. 240 souris seront immunisées trois fois à deux semaines d’intervalle, puis seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 mois maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 30 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, 90 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes et une fois avec la molécule à tester et 30 souris seront inoculées une fois avec la molécule à tester. Sur ces 150 souris un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement pendant 10 jours. 60 rats seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé avant l’inoculation et quotidiennement pendant 10 jours, un prélèvement de peau à 2 endroits différents sera réalisé deux fois à J4 et J10 après l’inoculation.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés voient une parasitémie se développer dans leur sang, les nuisances vont de l'asymptomatisme à un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond ou un état de prostration. Les inoculations peuvent provoquer du stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des souris et rats seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récolter les parasites ou le sérum des animaux.

Remplacement

Les souches parasitaires que nous utilisons ne peuvent pas être maintenues in vitro, elles sont extracellulaires et se développent dans le sang de leur hôte, voire dans le derme. Ils entretiennent avec l’organisme hôte des relations étroites de nature cellulaires et chimiques nécessaires à leur développement et il nous est impossible de les reconstituer en utilisant des milieux artificiels même complémentés. De même, les mécanismes de transmission à la glossine nécessitent également l’utilisation du modèle animal. Les « tests de molécules à visées thérapeutiques et vaccinales », bien que nous mettions en place des tests in vitro et ex vivo visant à étudier leurs effets sur les cellules de l’hôte, nécessitent l’hôte pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes complexes mis en jeu lors d’une infection. La mise en évidence de parasites dans le derme ne peut se vérifier que par le mode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés sont reduits au strict minimum.

Raffinement

L'espériencce des utilisateurs a permis la définition de points limites qui permettent grâce au suivi quotidien des animaux et de leur parasitémie, de procéder à l'euthanasie précoce d'un animal qui commence à présenter des signes de malêtre.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces classiquement utilisées pour la multiplication des souches de trypanosomes africains. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Le cas échéant, des souris génétiquement modifiées pourront être utilisées pour l’étude des interactions hôtes/pathogènes/vecteur. Les rats sont utilisés lorsque la quantité de parasites à produire est plus importante (cas de la production d’antigènes parasitaires). Des souris et des rats adultes seront utilisés afin d’optimiser la quantité de parasites à produire ou de sérum à récolter.

600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier des syndromes d'hypercroissance liés au gène PIK3CA. Une partie est gavée pendant deux mois avec un inhibiteur, d'autres reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules mutées, plusieurs lignées génétiquement modifiées étant entretenues en parallèle. Le porteur indique que les souris de maintien de lignée restent en vie, celles des procédures étant tuées pour exploration anatomique et histologique. Il affirme que ces syndromes ne peuvent pas s'étudier in vitro, hors de leur environnement, et que la souris est le seul animal chez qui la protéine PIK3CA a été mutée.

Objectifs

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Nous souhaitons maintenant : 1-Étudier l’effet de la mutation PIK3CA dans chaque tissu de l’organisme (graisse, muscle, os, vaisseaux lymphatiques, vaisseaux artériels, vaisseaux veineux et les nerfs) en utilisant des modèles génétiques appropriés. 2- Tester l’efficacité d'un inhibiteur dans chacune des conditions. 3- Comprendre la physiopathologie de ces syndromes.

Bénéfices attendus

Meilleur compréhension de la physiopathologie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieux. Identification des tissus sensibles à une inhibition pharmacologique.

Procédures

Au cours de la procédure 2, un gavage sera effectué par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souples et non traumatisante pour l’animal. Au cours de la procédure 3, des cellules de différents types de tissus portant une mutation PI3KCA seront injectées en sous cutanée chez des souris immunodéficientes. Cette injection sera réalisée par un technicien expérimenté, chez des souris anesthesiées et un injectant le plus petit volume possible.

Impact sur les animaux

1-Le gavage quotidien qui débutera à la semaine 6 de vie et sera effectué pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par l'inhibiteur de PIK3CA. 2- Injection sous cutanée de cellules mutées PIK3CA chez des souris immunodéficientes (une injection unique).Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage ou à l'injection sous cutanée.

Devenir

Procédure 1: maintien de lignée, donc souris maintenues en vie Prodédures 2 et 3: animaux sacrifiés pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur lces syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus avec des modèles murins peuvent tout au mieux être complétés par des expériences in vitro.

Réduction

La taille des groupes utilisés (n-25), minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Ce protocole est peu invasif puisque le gavage sera réalisé sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul). Le gavage débutera à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront gavés soit par le véhicule soit par du BYL719. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori l'inhibiteur de PIK3CA devrait améliorer le phénotype des souris. Nous injecterons également 1 million de cellules en sous cutanée chez des souris. Ces injections seront réalisées chez des souris anesthésiées (injection intrapéritonéale de Kétamine (128 mg/kg)/Xylazine (6,4 mg/kg)), par un technicien expérimenté et le plus petit volume possible sera administré aux souris (50ul).

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul animal pour lequel la protéine PIK3CA a été mutée Jeunes souris de 6 semaines car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.

172 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur de gliome humain est greffée dans leur cerveau, suivie par imagerie de bioluminescence, puis un composé est injecté dans le cerveau et un anticancéreux administré par gavage, pour tenter de lever la résistance des glioblastomes au témozolomide. Le porteur invoque le secret d'un brevet pour ne pas décrire le composé et rapporte une sensibilisation de 45 % obtenue in vitro. Les souris sont tuées par perfusion de formol dans le cœur pour l'analyse histologique du cerveau.

Objectifs

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale, à croissance rapide et dont le pronostic vital est mauvais puisque seulement 2% des patients survivent au-delà de 2 ans après le diagnostic. Les tumeurs sont constituées de multiples types cellulaires plus ou moins différenciés, parmi lesquels les rares cellules souches sont responsables de la résistance aux traitements anticancéreux et de la récurrence tumorale. La première phase du traitement consiste en une exérèse chirurgicale suivie de cycles répétés de radiothérapie et de chimiothérapie par prise orale de témozolomide (TMZ) permettant de ralentir la repousse tumorale. Le TMZ est l’anticancéreux le plus efficace à ce jour cependant les cellules cancéreuses deviennent résistantes au TMZ au fur et à mesure du traitement. Il n’existe pas d’alternative efficace au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients. Nous proposons d’utiliser un composé qui cible une molécule endogène des tumeurs cérébrales. Nous avons montré in vitro que ce composé et la stratégie utilisée permettaient de sensibiliser jusqu’à 45 % les cellules de gliomes à l’anticancéreux TMZ. Notre stratégie faisant l’objet d’un dépôt de brevet, nous ne pouvons pas donner plus de détail à l’heure actuelle car la plus stricte confidentialité est de rigueur. Nos données obtenues in vitro sur les lignées cellulaires de gliomes U251, U87 et T98G sont très encourageantes et nous proposons maintenant d’évaluer in vivo la capacité de notre traitement à sensibiliser les tumeurs au TMZ. Pour cela, le développement de tumeurs orthotopiques de gliomes, générées par injection de cellules tumorales humaines dans le cerveau de souris immunodéficientes est nécessaire (procédure expérimentale 1). Le développement tumoral sera suivi par imagerie de bioluminescence (procédure expérimentale 2) et le composé administré en intracérébroventriculaire (ICV) dès détection de la tumeur (procédure expérimentale 3). Les souris seront ensuite traitées par gavage avec le TMZ (procédure expérimentale 4) et suivies chaque semaine en bioluminescence pour mesurer le développement tumoral (procédure expérimentale 2). Lorsque les points limites seront atteints, les souris seront sacrifiées par perfusion intracardiaque de formol à 10 % (procédure expérimentale 5) et les cerveaux récoltés pour analyse histologique.

Bénéfices attendus

Le témozolomide (TMZ) est l’anticancéreux le plus efficace à ce jour pour traiter le glioblastome multiforme (GBM), cependant les cellules cancéreuses deviennent résistantes au TMZ au fur et à mesure du traitement. Il n’existe pas d’alternative efficace au TMZ. Toute avancée permettant d’identifier des cibles moléculaires et cellulaires visant à réduire la capacité des cellules tumorales à résister au TMZ sera donc bénéfique pour les patients. Nous proposons d’utiliser un composé qui cible une molécule endogène des tumeurs cérébrales. Nous avons montré in vitro que ce composé et la stratégie utilisée permettaient de sensibiliser jusqu’à 45 % les cellules de gliomes à l’anticancéreux TMZ.

Procédures

- implantation de tumeurs en intracérébrale (15 minutes par souris, 1 seule fois) ; - imagerie bioluminescente (10 minutes par souris,1 fois par semaine durant toute la pousse tumorale) ; - injection intracérébrale (10 minutes par souris, 1 seule fois lorsque la tumeur est bien établie) ; - gavage des souris (1 minute par souris, 1 fois par jour un semaine sur 2)

Impact sur les animaux

- Changement de l'état corporel (poids, pelage, écoulement oculaire/nasal) ; - Changement de comportement (posture, mobilité, automutilation) ; Comme décrit dans les points limites des procédures, ces effets indésirables sont cotés et l'animal est mis à mort s'il montre des signes de soufrances.

Devenir

Les animaux de chaques tâches sont gardés en vie à la fin des procédures 1, 2, 3 et 4 afin de pouvoir participer à la procédure suivante. Les animaux sont mis à mot à la fin de la procédure 5 car des analyses histologiques sont effectuées sur les cerveaux de chaque animal par la suite.

Remplacement

Nous avons montré in vitro sur des cellules de gliomes humains que le composé et notre stratégie sont efficaces. Nous continuons actuellement in vitro sur ces cellules toutes les études nécessaires à la caractérisation fine des mécanismes à l’origine de cette sensibilisation. Afin de déterminer si le traitement pourrait être utilisé chez l’Homme, il est nécessaire de le tester dans un organisme vivant. La souris NUDE est une souris mutante athymique qui présente une défaillance des lymphocytes T. La souris NUDE développe des tumeurs après greffe orthotopique de 200 000 cellules de U251. La souris NOD/SCID présente une défaillance des lymphocytes T et B et développe plus facilement des tumeurs à partir de petites quantités (1000) de cellules souches issues d’un gliome humain. Ces deux modèles murins sont immunodéficients ce qui limite le rejet des greffons de cellules de gliomes humains.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides.

Raffinement

Le composé et la stratégie ont été testés in vitro sur des cultures cellulaires. Ces expériences nous ont permis de déterminer des doses efficaces qui seront injectées in vivo. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63) . Les souris utilisées seront des souris mutantes NMRI NUDE et NOD SCID. L’immunodéficience de ces souris permet le développement sans rejet des xénogreffes de cellules de gliomes humains. Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Dans ce but, des points limites spécifiques à chaque expérimentation seront clairement établis afin de prendre les mesures nécessaires au soulagement ou à l'arrêt de de la souffrance de l'animal. De plus toutes les procédures possiblement traumatisantes sont effecturées sous anesthésie gazeuse, avec une gestion de la douleur adaptée à chaque situation (utilisation d'analgésique).

Choix des espèces

Les souris utilisées seront des souris mutantes NUDE et NOD/SCID. La souris Nude est athymique et présente une défaillance des lymphocytes T. La souris NOD/SCID présente une défaillance des lymphocytes T et B. Ces propriétés rendent les souris immunodéficientes ce qui limite le rejet des greffons de cellules de gliomes humains. Les animaux seront utilisés "à l'âge adulte" c'est à dire à partir de l'âge de 2 mois, les glioblastomes étant des tumeurs survenant à l'âge adulte.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une instillation dans la trachée ou une exposition d'une heure en chambre d'aérosolisation pour reproduire une pneumonie à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple. Le porteur indique que tout animal saignant ou respirant anormalement après l'instillation sera tué, et prévoit un analgésique en cas de signes de douleur. Les souris sont tuées pour prélever les organes et mesurer l'atteinte pulmonaire.

Objectifs

Tropheryma whipplei est l’agent de la maladie de Whipple, une maladie chronique systémique caractérisée par un syndrome de malabsoprtion, de la fièvre et des douleurs abdominales. Un certain nombre de données suggèrent que chez l’homme, l’infection résulte d’une transmission oro-fecale ou oro-orale. Les avancées en épidémiologique et techniques diagnostiques ont montré que T. whipplei étaient en fait responsable d’un large spectre d’infections et qu’à côté des infections chroniques, systémiques ou localisées, il existait des infections aigues et même un portage asymptomatique. Ainsi, il a été rapporté que chez l’homme, T. whipplei était un agent de gastroentérite, probablement au cours de la primo-infection. Des travaux de notre équipe avait alors montré qu’en infectant des souris par voie orale, on retrouvait T. whipplei dans les selles de manière transitoire et qu’elle induit une diarrhee passagere. Par ailleurs, nous avions également pu montrer qu’une lesion intestinale epitheliale prolongeait le portage de T. whipplei, aggravait de manière non significative la gastroenterite et permettait la colonisation de la muqueuse intestinale et une séro-conversion.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place et la physiopathologie des pneumonies à T. whipplei. Il permettra également de développer des outils diagnostiques et éventuellement pronostiques de telles infections.

Procédures

Dans la procédure 1, les animaux seront soumis à une instillation intra-trachéale. Le tube flexible relié à une seringue à insuline sera inséré à 0.5-1 cm dans la trachée et la solution sera injectée (volume inférieur à 50 microlitres). Afin d'éviter que l'instillat ne s'échappe de la trachée, le tube sera maintenu en place 5 sec. Il sera retiré et la souris sera maintenue en position pendant au moins 30 secondes. Pour la procédure 2, les animaux seront exposés dans la chambre d'aérolisation pendant une heure.

Impact sur les animaux

En cas de signes de douleur, de souffrance ou d’angoisse suite à l’instillation intra-trachéale, un analgésique (buprénorphine) sera injecté en sous-cutané, à raison de 0.2 mg/kg de poids corporel en sous cutané. Les effets indésirables directs de la procédure 1 seraient une mauvaise instillation intratrachéale. Ainsi, tout animal qui saigne, qui présente une respiration anormale après récupération de l'anesthésie sera euthanasié.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. En effet, les organes seront prélevés pour être analysés et évaluer l'impact de la pneumonie.

Remplacement

Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle de souris afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de la pneumonie induite par T. whipplei et de comprendre les mécanismes sous-jacents dans le but de fournir des pistes diagnostiques et thérapeutiques dans la prise en charge des patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, de par notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminer le nombre de souris nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes (p < 0.05) avec une puissance au moins supérieure à 80%.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint un point limite, la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse. Les animaux seront hébergés en groupe de cinq maximum, dans des cages équipées afin d’offrir un environnement enrichi et approprié.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.

4200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une administration unique d'un candidat médicament, le plus souvent par gavage, avant un test d'activité locomotrice, puis un prélèvement de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît des effets indésirables possibles comme des crampes abdominales ou une sédation, et justifie l'effectif par ce qui est "classiquement utilisé en expérimentation animale". Il décrit le recours à l'animal comme "nécessaire", faute de méthode alternative pour ces mesures sur le système nerveux.

Objectifs

Lors du développement d’un candidat médicament, il peut être pertinent d’évaluer si celui-ci peut induire des effets sur le niveau d’activité générale, l’activité locomotrice globale ainsi que les habitudes d’exploration chez la souris. La modification de l’activité locomotrice peut entraîner des biais pour l’évaluation correcte du candidat médicament dans certaines thématiques. Pour exemple, une diminution de l’activité locomotrice peut entraîner un comportement de type anxiolytique (une diminution de nombre de billes enfouies dans le test d’enfouissement de billes). Il est donc important de vérifier avant toute caractérisation des effets d’un candidat médicament dans ce type de modèle. L’objectif de ce projet sera d’étudier, chez la souris, l’effet d’un candidat médicament dans le test de mesure de l’activité locomotrice spontanée.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour identifier les potentiels effets indésirables de nouveaux candidats médicaments sur l’activité locomotrice afin d’éviter de biaiser son développement.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Les administrations sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant, par exemple si le produit administré est destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou si sa biodisponibilité nécessite un autre mode d’administration, les voies intrapéritonéale, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier les effets potentiels induits (fonction motrice, l'exploration, l'anxiété, l'hyperactivité ou la sédation) par des médicaments candidats sur le SNC. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d'erreur standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6J De 5 à 10 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.