Rongeurs
Développement d’applications thérapeutiques pour améliorer le transfert de thérapies au cerveau par ultrasons
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 136
368 souris et 136 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ultrasons focalisés destinés à ouvrir la barrière protégeant le cerveau, avec injection de microbulles et d'agent de contraste, certains subissant en plus une chirurgie et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que l'ouverture de la barrière peut provoquer une inflammation cérébrale transitoire et que les animaux présentant des effets visibles en imagerie sont tués sans réveil. Les retombées annoncées, un meilleur passage des médicaments contre les cancers du cerveau et une thérapie génique du syndrome de l'X fragile, sont renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La principale limite à l’efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison d'une barrière protégeant le cerveau qui limite le passage de la majorité des médicaments. Récemment, les ultrasons guidés par imagerie de résonance magnétique et associés à des microbulles ont attiré l’attention en tant que moyen non invasif pour permettre temporairement ce passage. Pour améliorer les traitements, il faudrait pouvoir faire passer ceux-ci plusieurs fois d'affilée au travers de cette barrière. Dans cette étude nous étudierons donc les effets de cette méthode au niveau des vaisseaux sanguins mais aussi l’intérêt de plusieurs ouvertures en faisant des analyses sur le tissu cérébral sain. Dans un second temps nous évaluerons le potentiel thérapeutique de cette méthode chez des rats et des souris présentant le syndrome de l'X fragile, une maladie neuro développementale due à la déficience d'un gène menant à des problèmes de développement du cerveau. Notre but sera donc de déterminer les meilleures conditions d’ouverture de la barrière dans le cerveau (temps d’ouverture, taux d’augmentation du passage des molécules) afin d’améliorer le passage de molécules thérapeutiques de manière non invasive. En plus des données que nous obtiendrons par imagerie par résonance magnétique et l'acquisition des signaux reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons le passage des molécules d’intérêt et étudierons les changements morphologiques des vaisseaux ayant reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer leur intégrité après traitement. La caractérisation de ces effets permettra d’optimiser les conditions pour déposer localement des médicaments dans un cadre thérapeutique. Pour la partie applicative, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de l'injection de thérapie génique chez des souris mimant le syndrome de l’X fragile.
Bénéfices attendus
Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales. Dans le cas des cancers cérébraux, la moyenne de survie chez l'homme est de 15 mois environ. Chez l'animal, plusieurs études ont montré que l'on pouvait guérir des cancers cérébraux, ce qu'aucun essai préclinique n'avait montré jusqu'ici. Les essais cliniques chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient être rapidement bénéfiques chez l'humain. Dans le cas du syndrome X fragile, une maladie génétique, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour réaliser de la thérapie génique. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies localisées dans le cerveau.
Procédures
Suivant les procédures, une partie des animaux subiront des chirurgies sous anesthésie et n'excedant pas 30 minutes. Tous les animaux seront exposés à des tests d'imagerie médicale pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Les animaux peuvent être amenés à participer à plusieurs séances d'imagerie (8 au maximum), dans ce cas celles-ci seront espacées d'au moins 24h. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection d'agent de contraste. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse d'une solution de microbulles. Les injections de produits à visée thérapeutiques sera aussi effectuée sur une partie des animaux.
Impact sur les animaux
L'utilisation des ultrasons focalisés guidés par imagerie de résonance magnétique peuvent provoquer une inflammation transitoire du cerveau qui se résorbe au bout de quelques jours. Cette inflammation est un effet normal dû à cette procédure qui ne provoque pas de dommages apparents pour l'animal. Si des effets néfastes sont visibles en imagerie, les animaux seront mis à mort sans réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), et plus particulièrement la frontière à l'interface entre le système vasculaire et le système nerveux central, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude de l'effet sur le cerveau du passage de particules virales à travers la barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses biologiques afin d'évaluer l’impact des ultrasons qui ne sauraient être remplacés par un modèle informatique ou cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer (données préliminaires obtenues dans d’autres expériences). Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront herbergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux fixés par le ministère, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée. Dans le cas où certains signes seraient observés, un traitement antalgique adapté sera mis en place.
Choix des espèces
L’ensemble des animaux sera utilisé à l'âge adulte (6 à 9 semaines pour la souris et 6 à 8 semaines pour le rat).
Rôle du récepteur nucléaire PPARy dans la fibrose médullaire et dans le soutien du tissu hématopoïétique.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
536 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une irradiation, une greffe de cellules hématopoïétiques sous anesthésie et jusqu'à six prélèvements de sang, pour étudier le rôle du récepteur PPARγ dans la fibrose de la moelle osseuse au cours de la myélofibrose, un cancer du sang. Le porteur indique que la maladie peut réduire la prise de poids et augmenter la taille de la rate, et que les souris sont tuées en fin d'expérience pour l'examen des fémurs, seuls les reproducteurs de la lignée étant gardés vivants. Sur le remplacement, il affirme qu'il reste impossible de reproduire in vitro la complexité du microenvironnement médullaire et conclut que la validation passe par le modèle murin.
Objectifs
La production des cellules sanguines (hématopoïèse) est réalisée au niveau de la moelle osseuse et résulte d’une interaction fine entre les cellules progénitrices (qui peuvent se diviser et donner les cellules du sang) et les cellules stromales qui sont une composante du microenvironnement de la moelle osseuse. La myélofibrose (MF) est un cancer du sang rare caractérisé par une fibrose de ces cellules stromales entrainant une altération de la production des cellules sanguines. C’est une pathologie grave, avec une médiane de survie de 5 à 6 ans. Il a été rapporté que l’activation du récepteur nucléaire (PPARγ) par des molécules pharmacologiques entraîne une réduction de la fibrose dans des modèles murins de MF. Ces résultats en font une une cible thérapeutique intéressante dans une pathologie où les traitements agissent principalement sur les symptômes de la maladie. Dans l’objectif d’utiliser des médicaments ciblant PPARy dans le traitement de la MF, il est impératif de caractériser le rôle physiologique de PPARy dans le stroma de la moelle osseuse. Pour répondre à cette question, un stroma médullaire murin qui, par l’utilisation d’une technique de génie génétique, n’exprime pas PPARy a été développé. Il récapitule des caractéristiques de la fibrose médullaire avec notamment une altération des capacités à soutenir l’hématopoïèse. Les premiers résultats obtenus in vitro ne permettent pas l’étude du rôle de PPARy dans toutes les composantes de l’hématopoïèse. Pour cela nous prévoyons de développer des systèmes d’étude plus complexes faisant appel au modèle murin. Nous mettrons en place une co-culture de cellules progénitrices hématopoiétiques murines et humaines sur stroma normal (WT) ou invalidé (KO) qui sera transplanté dans des modèles murins pour l’étude de leur hématopoïèse. La même approche sera utilisée avec des cellules progénitrices provenant d’hémopathies afin d’étudier l’effet sur une hématopoïèse pathologique En parallèle de cette étude un modèle murin d’invalidation (KO) de PPARy spécifiquement dans les cellules du stroma de la moelle osseuse sera développé. Il permettra après traitement par une molécule stimulant la MF de déterminer si la sensibilité à la fibrose est corrélée à l’expression de PPARy dans les cellules du stroma de la moelle osseuse. Enfin, on étudiera dans ce modèle la manière dont se développent différents cancers du sang afin de déterminer si la fibrose médullaire impacte l’histoire naturelle de ces maladies.
Bénéfices attendus
La myélofibrose (MF) est la plus grave des néoplasies myéloprolifératives (NMP) (famille de cancer du sang comprenant également la polyglobulie de Vaquez (PV) et thrombocytémie essentielle (TE) avec une médiane de survie de cinq à six ans. Les traitements actuellement disponibles ciblent principalement les symptômes et n’ont que peu d’influence sur l’histoire naturelle de la maladie. Seule la greffe de moelle osseuse est curative mais elle ne concerne qu’une faible minorité de patients qui sont éligibles au traitement. Récemment, il a été démontré que l’activation du récepteur nucléaire PPARy par ses ligands pharmacologiques permettait de réduire le développement anormal de la densité osseuse (ostéosclérose) et de la fibrose médullaire dans trois modèles précliniques murins de la MF. Au cours de ce projet, nous souhaitons caractériser la fonction physiologique de PPARy au sein des cellules du microenvironement de la moelle osseuse (stroma médullaire) qui supportent la production des cellules sanguines et sont les cibles de la fibrose. Nous souhaitons ainsi démontrer que PPARy est un acteur clé de la prévention du développement de la fibrose médullaire, de l’ostéosclérose et de la capacité des cellules mésenchymateuses à soutenir l’hématopoïèse. L’ensemble de ces travaux a pour objectif de mieux caractériser en quoi PPARy peut être une cible thérapeutique ouvrant de nouvelles stratégies de prise en charge (en monothérapies ou associées au traitement conventionnels) des NMP et particulièrement de la myélofibrose. Ces résultats pourront également être étendus à d’autres organes dont les pathologies impliquent le développement d’une fibrose. Dans un contexte plus général ce travail permettra également de mieux comprendre et appréhender la part relative au stroma médullaire dans le développement des hémopathies et le potentiel intérêt d’un ciblage thérapeutique du stroma en plus de celui des cellules hématopoïétiques. Des molécules pharmacologiques ciblant PPARy étant déjà sur le marché, ce travail permettra également d’envisager leur repositionnement thérapeutique dans la prise en charge de la MF.
Procédures
Les animaux seront soumis au maximum à : - Une irradiation : procédure indolore, réalisée en maintenant les groupes sociaux définis, et durant une dizaine de minutes. - Une unique injection pour chaque animal (animal sous anesthésie générale et analgésie) de cellules hématopoïétiques normales ou pathologiques. Cette intervention ne dure que quelques minutes et se déroule sous un contrôle permanent pour veiller à la bonne anesthésie, l’absence de douleur et gérer le réveil. - Des prélèvements de sang : pour le suivi de l’hématopoïèse, réalisés sur animaux vigiles sur une durée ≤ à une minute, avec un délai minimum de 3 semaines entre chaque prélèvement et un nombre maximum de 6 prélèvements - un traitement par injection impliquant un geste d’une durée inférieur ou égale à une minute sur une période maximale de 3 semaines.
Impact sur les animaux
L’irradiation, l’anesthésie, la transplantation de cellules hématopoïétiques, les injections sous-cutanées et les prélèvements de sang au niveau de la veine faciale peuvent engendrer du stress chez la souris. Le développement d’une hématopoïèse pathologique peut également engendrer des modifications des constantes hématologiques avec notamment une augmentation de plaquettes et/ou de l’hématocrite, qui peuvent à terme générer de la fibrose et une diminution de production des cellules sanguines, ainsi qu’une augmentation de la taille de la rate. Durant le développement des hémopathies PV, TE, MF la prise de poids des animaux est réduite.
Devenir
Les analyses de la fibrose de la moelle osseuse ce font par examen histopathologiques des fémurs ce qui nécessite l’euthanasie des animaux à la fin de chaque expérimentation. Seuls les animaux reproducteurs seront maintenus en vie. En effet, si le modèle murin d’invalidation de PPARy dans les cellules stromales médullaires apporte les résultats escomptés, il pourra être utilisé pour d’autres hémopathies ou pour des questions plus fondamentales d’étude de la communication entre le microenvironnement et les cellules hématopoïétiques. Il constituera donc un intérêt pour la communauté scientifique et pourra être pérennisé.
Remplacement
Au cours de ce projet, une grande partie des expériences seront menées in vitro, cependant en raison de la complexité et du nombre d’intervenants cellulaires et matriciels composant le micro-environnement médullaire et régulant l’hématopoïèse, il est actuellement impossible de mimer la physiologie médullaire par des modèles exclusivement in vitro. Nos modèles in vitro seront donc utilisés autant que faire se peut afin de mettre au point les protocoles et de générer les résultats préliminaires, mais ils nécessitent néanmoins d’être validés dans des modèles in vivo murins dans un second temps. D’autre part, ce projet a pour objectif de caractériser la pertinence du ciblage thérapeutique de PPARy dans la myélofibrose. Il est donc important de valider sa fonction dans des modèles murins précliniques, validés et reconnus, de cette pathologie.
Réduction
Dans l’ensemble des expérimentations associées à cette demande les animaux sont hébergés en groupe (n=5 individus par cage). Nos expériences précédentes nous ont montré que pour une condition expérimentale en analyse non-paramétrique un minimum de deux boites (dix individus) était nécessaire. Le nombre d’expérimentations indépendantes pour chaque condition est réduite à 2 (pour vérifier la reproductibilité entre expérience). Lorsque cela était possible, nous avons choisi de réaliser des greffes compétitives. Cette stratégie présente deux avantages, 1) elle augmente la sensibilité en permettant de comparer les conditions au sein d’un même individu ce qui réduit dans les analyses de groupe la variation inter-individu et permet de réduire les effectifs, 2) chaque individu étant son propre contrôle cela permet de supprimer le groupe contrôle et de limiter encore le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les souris seront hébergées en groupe, avec des éléments d’enrichissement. Elles seront surveillées régulièrement pour limiter tout mal-être éventuel en accord avec les critères d’évaluation de l’état général des animaux. Certains critères biologiques spécifiques comme le taux l’hémoglobine seront également monitorés et pris en compte comme point limite. Les interventions de transplantation seront pratiquées sous anesthésie générale et analgésie en limitant la durée de l’anesthésie et en assurant un maintien de la température corporelle grâce à un tapis chauffant et de l’hydratation des yeux grâce à un gel oculaire. Les animaux sont traités par antibiotiques durant les 3 semaines post-transplantation pour limiter le risque d’infection. Les prélèvements de sang seront faits par voie sub-mandibulaire afin d’être le moins douloureux possible et seront espacés d’au moins 3 semaines.
Choix des espèces
Le modèle rongeur nous semble le plus adapté car c’est historiquement un modèle de prédilection pour l’étude de l’hématopoïèse. C’est un modèle bien établi, validé par la communauté scientifique, et qui fait l’objet de nombreuses publications scientifiques. Les modèles précliniques des différentes hémopathies étudiées, la leucémie myéloïde chronique (LMC), la thrombocytémie essentielle (TE), la polyglobulie de Vaquez (PV) et la myélofibrose (MF) sont établis dans le modèle rongeur. Travailler sur la même souche murine apporte une pertinence à la comparaison entre nos données. Que cela soit pour obtenir une meilleure prise de greffe, ou pour avoir la possibilité de suivre le développement de la pathologie au cours du temps, nous devons utiliser des animaux jeunes (8 semaines).
Évaluation de nanoparticules de polymère magnétiques dans un modèle de souris immunodéprimées portant des xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales mammaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
374 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un implant hormonal sous chirurgie, une greffe de cellules de cancer du sein dans la glande mammaire, des injections répétées de nanoparticules magnétiques, l'application d'un champ magnétique et des séances d'imagerie, avant d'être tuées pour prélèvement des tumeurs et des organes. Le porteur indique un risque d'infection, de nécrose tumorale, de perte de poids et de lésions liées aux injections. Les nanoparticules sont présentées comme une alternative "moins coûteuse" aux anticorps conjugués contre les cancers triple négatifs.
Objectifs
Malgré les avancées notables dans la prévention, le dépistage et la prise en charge du cancer du sein, celui-ci reste un problème de santé publique majeur en raison de ses taux alarmants d’incidence et de mortalité prématurée dans le monde. Le cancer du sein est une maladie très hétérogène. Les cancers mammaires les plus agressifs et les plus résistants aux traitements conventionnels sont appelés triples négatifs. C’est pourquoi développer des nouvelles thérapies capables de cibler spécifiquement ce type de cancer est plus que nécessaire. A ce titre, des anticorps conjugués à des médicaments (ADC) ont été récemment développés et mis sur le marché. Cependant, la production d'ADC est très complexe, longue et surtout coûteuse. Il est donc nécessaire de développer une alternative aux ADCs offrant une nouvelle voie pour le traitement du cancer. Notre projet s’inscrit dans cette logique. Notre objectif est de proposer un nouveau concept de ciblage des tumeurs mammaires en utilisant des nanoparticules magnétiques de polymères emprisonnant des médicaments. La délivrance de ces derniers se fera grâce aux propriétés d’échauffement local des nanoparticules magnétiques sous champ magnétique alternatif (AMF), permettant un contrôle spatio-temporel du relargage du médicament ainsi encapsulés dans le polymère.
Bénéfices attendus
Le projet présente plusieurs bénéfices pour la santé humaine. En effet, ces nanomatériaux, rapides et moins coûteux à synthétiser, présentent de nombreux avantages par rapport aux anticorps conjugués à des médicaments développés récemment. Ils sont faciles et rapides à synthétiser, très peu couteux, présentent une bonne biocompatibilité, sont capables de traverser la membrane cellulaire en absence de toutes réponse immunogène. Cette approche permet de délivrer de façon spatio-temporelle des médicaments anti-cancéreux grâce à ses propriétés de ciblage et de délivrance contrôlée. Ainsi, notre approche transforme potentiellement des agents thérapeutiques non spécifiques avec des effets secondaires prononcés en un système thérapeutique ciblé utile pour la médecine de précision.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers mammaires et à leurs traitements. Les différents gestes réalisés sur les souris incluront au maximum les étapes suivantes en fonction des questions scientifiques : i) Pose chirurgicale d’un pellet contenant des hormones en sous-cutanée sous anesthésie et analgésie (1x/animal, 5-10 minutes) ii) Injections unique orthotopiques dans la glande mammaire de cellules tumorales sur animal vigile (15 seconde/animal) iii) Suivi du poids et de la croissance tumorale mesure de la taille de la tumeur 3 fois par semaine (2 minutes/animal) iv) Injection intraveineuse ou intra-tumorale des nanoparticules sur animal vigile (1x/semaine, 2min/animal pendant 28 jours soit 4 injections/animal) v) Imagerie sur animal anesthésié (1x/vie, 30 min) vi) Application d’un champ magnétique alternatif sur animal vigile (4x/vie, 30min-1heure) vii) Euthanasie selon une méthode réglementaire à la fin de la procédure et prélèvements des tumeurs et des organes pour analyse.
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus dans ce projet sont : i) le risque infectieux et la sensation de douleur, conséquence potentiel de la pose d’implants d’œstrogènes nécessaire au développement préalable des glandes mammaires avant de pouvoir greffer les cellules cancéreuses. ii) le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience sur le modèle), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. iii) le stress et le risque de lésion au niveau de la queue ou de la tumeur suite aux injections des nanomatériaux par voie intraveineuse ou intra-tumorale. iv) les risques liés aux anesthésies (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.) v) le stress potentiel pour les animaux lors du transport des animaux sur un autre site en vue de l’imagerie.
Devenir
A la fin des différents actes et de la période de maintien prévu, l’ensemble des animaux (n=374) sont euthanasiés par une méthode réglementaire en vue de réaliser les différents prélèvements. Les tumeurs et les organes seront récupérés et analysés.
Remplacement
Les études in vitro déjà menées ont permis de sélectionner/affiner au mieux les conditions expérimentales du projet afin de réduire au maximum le nombre d’animaux impliqués dans cette étude. En effet, cette étude doit être conduite in vivo car celle-ci prend en considération la tumeur, son environnement ainsi que l’ensemble des interactions mises en jeu. Ainsi, il n’y a pas de modèles alternatifs au modèle animal permettant de recréer l’ensemble des acteurs impliqués dans le développement tumoral et l’action des traitements proposés. Nous avons besoin d’un modèle qui mime ce qui se passe en clinique chez les patients traités. Travailler sur des cellules en culture cellulaire ne permet pas de répondre à ce que sera l’efficacité d’un médicament sur une tumeur en trois dimensions et avec son microenvironnement. C’est pourquoi, le modèle de xénogreffe chez la souris permet de créer un modèle d’étude qui se rapproche de celui observé chez les patients.
Réduction
Le projet impliquera un total de 374 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Notre procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris. Une étude pilote sur 20 animaux permettra d’optimiser les conditions expérimentales en validant le modèle murin ayant le meilleur taux de prise de greffe permettant par la suite de réduire la taille des groupes (moins de variabilité). L’étude de biodistribution sera réalisée sur des groupes de 3 souris maximum. Enfin, chaque groupe de traitement comportera 10 souris au total. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée avec les tests adaptés. Pour ce faire, nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est un mammifère comme l’Homme, la souris Nude est l’un des rares modèles permettant de créer des xénogreffes de tumeurs humaines sans qu’il n’y ait de rejet du non-soi (modèle immunodéficient). Enfin, la réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant toute administration chez l’humain. La souris est le modèle le plus utilisé en première ligne et il permet d’acquérir un grand nombre d’information dans un temps relativement court. Description du ou des modèle(s) : Nous utiliserons des souris Nude qui présentent une mutation de leur système immunitaire. Les souris peuvent ainsi recevoir des cellules d’une autre espèce (l’homme dans le cas présent), et il n’y aura pas de réaction du non-soi, les cellules injectées pourront alors pousser sans être rejetées. Le choix de la souche de souris Nude sera effectué à la suite d’une étude pilote nécessaires pour optimiser les conditions de prise des xénogreffes et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaire au projet. Justification du stade de développement : Livraison des animaux âgés de 4 semaines. Début de l’expérimentation après deux semaines d’acclimatation soit à 6 semaines ; ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées.
Mise en place d’expériences de perception de signaux acoustiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, réutilisées à l'issue pour d'autres mises au point, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un marquage par perçage des oreilles au sevrage, puis des isolements de deux à vingt-quatre heures et jusqu'à trois tests de réaction à des cris ultrasonores de congénères. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu et que les animaux n'auront pas subi de "stress significatif". Le protocole prépare des études ultérieures sur des souris modèles de déficiences intellectuelles et d'autisme.
Objectifs
Les souris communiquent entre elles en utilisant principalement l’odorat, mais aussi le toucher, la vue et l’ouïe. En effet, les souriceaux isolés de la mère et du nid ainsi que les juvéniles ou adultes au cours des interactions sociales émettent des cris dans le domaine de l’ultrason, non perceptibles par l’Homme. Des études ont montré que ces cris de petits non sevrés déclenchaient de manière robuste le comportement de recherche de la mère et que les cris ultrasonores du juvénile ou de l’adulte pouvaient refléter la motivation pour l’interaction sociale. Les fonctions plus précises de ces signaux sont cependant encore peu détaillées. Dans ce projet, nous mettrons en place un protocole expérimental qui nous permettra d’évaluer les réactions comportementales des souris à la perception de cris ultrasonores de leurs congénères. Nous établirons donc un protocole permettant de tester la réaction de la mère lorsqu’elle perçoit les cris de ses souriceaux et un protocole permettant de tester la réaction des juvéniles et des adultes lorsqu’ils sont soumis à des enregistrements de cris ultrasonores de congénères.
Bénéfices attendus
La mise en place de ce protocole nous permettra de tester ultérieurement la perception des cris ultrasonores ainsi que d’identifier les régions du cerveau impliquées dans le traitement de ces signaux chez des souris modèles de déficiences intellectuelles et de troubles du spectre autistique.
Procédures
Les animaux subissent une identification par perçage des oreilles au moment du sevrage. Ce geste ponctuel réalisé en contention légère sur animal vigile ne dure que quelques secondes. Les souris juvéniles et adultes seront soumises à un isolement de 2h ou de 24h, respectivement. Ces durées sont maintenues au minimum pour augmenter leur motivation pour faire le test. Ces isolements ne seront pas répétés plus de trois fois chez chaque animal car ils s'habituent très rapidement aux manipulations de playback. Les animaux subissent aussi ensuite un test comportementa de playback (réaction à l'écoute de vocalisations ultrasonores) au maximum trois fois par animal; ce test dure au maximum 10 min.
Impact sur les animaux
Les souris juvéniles et adultes seront soumises à un isolement de 2h ou de 24h, respectivement. Ces durées sont maintenues au minimum pour augmenter leur motivation pour faire le test. Aucun effet indésirable lors du test n’est attendu. Aucun phénotype dommageable n’a été rapporté chez les lignées utilisées. Uniquement une partie des souris subira une légère douleur très ponctuelle lors du marquage à l’oreille au moment du sevrage. Les animaux seront soumis à un stress léger lors des tests comportementaux (isolement ponctuel et exploration d’un nouvel environnement).
Devenir
Les animaux utilisés seront donc conservés pour une réutilisation dans les mises au point de tests comportementaux non invasifs. Ils n’auront pas subi de stress significatif.
Remplacement
Pour évaluer la perception de signaux de communication, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire, et en particulier de la souris dans ce cas. En effet, cette espèce sera ensuite étudiée dans le cadre de modèle de maladies neuropsychiatriques d’origine génétique. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser ces pathologies humaines.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Les échantillons proposés permettront de vérifier si le test de mise au point donne les résultats attendus.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Les temps d’isolement seront limités au minimum. Dans la procédure impliquant les mères allaitantes, le contact avec les petits sera maximisé, les séparations mère-souriceaux minimisées. Les animaux sont manipulés au moyen d'un tube pour réduire tout stress au minimum. Dans la procédure impliquant des juvéniles, les animaux rejoignent leur groupes sociaux dès la fin du test. Les animaux seront inspectés visuellement pour vérifier leur bon état corporel et leur vivacité; l'animal sera sorti de la procédure si besoin.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. Comme le laboratoire utilise ces modèles, nous mettons au point les tests comportementaux pour les explorer. Les souris seront testées une fois au stade juvénile (22-35 jours) et au stade jeune adulte (8-12 semaines). Nous avons choisi ces âges car ils correspondent à des périodes critiques pour le test réalisé, suivant les publications existantes.
Mise au point de souris humanisées par du microbiote- EU2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée s'étale du "sans réveil" au sévère, alors que le porteur qualifie l'ensemble des actes de "sévérité légère". Des reproductrices axéniques reçoivent un gavage de microbiote de patients obèses, puis les animaux passent une imagerie sous anesthésie sans réveil, un isolement de vingt-quatre heures sans enrichissement et des injections irritantes. Les reproducteurs devenus trop vieux et les descendants au mauvais microbiote sont tués par dislocation cervicale, les autres après imagerie ou tests comportementaux pour analyse du cerveau. Le modèle est présenté comme "unique" pour relier microbiote et déclin cognitif.
Objectifs
Créer des colonnies de souris "humanisées" avec du microbiote issus de patients obèses avec des fonctions cognitives faibles ou fortes afin de démontrer la causalité et d'identifier pour isoler les bactéries d'intérêt. Etudier le rôle du microbiote sur les performances cognitives et émotionnelles des souris et ainsi développer des nouvelles stratégies thérapeutiques visant à ralentir le déclin neurocognitif associé à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir un modèle unique et original de souris humanisées et stables, colonisées avec le microbiote de patients présentant un score faible ou élevé de fonction cognitive, qui peut être étudié sur plusieurs générations (F1, F2, F3) sans transplantation fécale sur les descendants. Ce modèle de souris axénique humanisé peut être utilisé pour identifier le rôle du microbiote dans la variation des fonctions physiologiques et physiopathologiques, et nous permettront l'étude de l'apparition des composantes cognitives similaires à l'être humain.
Procédures
Pour la procédure expérimentales 1, les souris reproductrices de deux lignées de souris axéniques, C57Bl/6J et Tg2576, recevront un gavage unique d'une solution de 200 ul. Pour la procédure 2, les souris seront, par une unique séance, mises dans l’imagerie non invasive qui est faite sous anesthésie pendant 2 heures. Pour la procédure 3, les souris doivent être isolées, sans aucun enrichissement pendant 24 heures. Dans la procédure 4, marquage des cellules progénitrices par injection intrapéritonéale peut être irritante.
Impact sur les animaux
Notre projet comporte des actes expérimentaux de sévérité légère. En effet la procédure1 consiste en 1/ un gavage unique avec du microbiote de patients obèses qui va coloniser le tube digestif des animaux, qui seront vigiles durant cet acte. Le geste est rapide, sans douleur, générant un stress léger du à la contention, 2/la collecte de fèces pour vérifier la colonisation de leur tubes digestifs, elle est sans douleur. La colonisation du tube digestif par un microbiote humain n’a pas à priori d’impact sur la santé des animaux dans la durée. Pour la procédure 2, des mesures de tissus adipeux seront fait par une technique d’imagerie non invasive (l’IRM) pour lesquels les animaux seront anesthésiés pour les immobiliser, ils ne seront pas réveillés avant leur mise à mort, évitant ainsi toute souffrance/stress. Pour la procédure 3, l'isolement durant 24h pour le phénotypage métabolique en temps réel. Le manque d'un enrichissement au quel les souris sont habituées (sopalin, donc elles ne peuvent pas faire un nid) et il n' y a pas de litière au fond des cages non plus, ce qui peut stresser la souris. Dans la procédure 4, marquage des cellules progénitrices par injection intrapéritonéale peut être irritante.
Devenir
Les reproducteurs devenus trop vieux (à l'âge de 6-8 mois), ainsi que les animaux de la descendance ne présentant pas le microbiote approprié seront mis à mort par dislocation cervicale. Il en va de même pour tout animal qui présenterait le moindre signe de souffrance. Les souris utilisées, pour la procédure 2, seront également euthanasiées à la fin de la séance d’IRM afin de prélever des tissus adipeux qui seront utilisés pour des analyses ex vivo (résonance magnétique nucléaire et lipidomique). Après tous les tests de comportement, les souris seront euthanasiées afin d'étudier l'anatomie du cerveau. Les associations entre les résultats anatomie des tissus et les fonctions cognitives ainsi que les états émotionnels seront évaluées pour comprendre comment l'anatomie du cerveau détermine leur fonction.
Remplacement
Notre étude vise à évaluer les effets de la transplantation de microbiote fécal humain sur les performances cognitives et émotionnelles de souris. Cela ne peut être fait que sur un modèle animal. Comme les animaux présentent un microbiote local, notre étude nécessite un modèle animal dans lequel ce microbiote résident est supprimé (c’est-à-dire, des souris axéniques). Celles-ci offrent la garantie de pouvoir étudier spécifiquement l’impact comportemental du microbiote transplanté. De tels modèles axéniques sont actuellement disponibles dans les espèces de souris. Nous proposons une approche unique et originale pour transplanter le microbiote fécal de patients obèses dans ce modèle de souris axéniques. Dans les études que nous réaliserons au laboratoire, nous serons amenés à tester ces souris axéniques transplantées et leur descendance pour lequel il a été montré une stabilisation du microbiote.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit pour atteindre une valeur minimale sans nuire à la qualité statistique des données. En outre, les souris seront réutilisées pour plusieurs expériences. Par exemple, après l'isolement dans les cages métaboliques, les souris seront mis à mort et prélever les tissus adipeux et le foie pour le profilage du microbiote tissulaire, afin d'obtenir un maximum de données en utilisant un nombre minimum d'animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans une structure et des conditions parfaitement adaptées (élevage en isolateur, litière changée régulièrement, eau et nourriture à volonté, température et hygrométrie régulée,...) avec une surveillance quotidienne, week-end et jours fériés inclus. Les animaux bénéficient également d’un enrichissement de leur milieux (type feuille de cellulose, permettant une diminution du stress potentiel et la réalisation de petits nids par les animaux). Enfin, la souffrance éventuelle des animaux sera minimisée autant que possible et nous interviendrons immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance.tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, pelage terne et hirsute, traces de blessures infligées par les autres animaux sera isolé. Il fera l'objet d'une attention accrue et benéficiera de soins appropriés (désinfection des plaies ou accès facilté à la nourriture si nécessaire).Si aucune amélioration de son état n'est constaté, il sera mis à mort le plus rapidement possible pour eviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Afin d'étudier l'effet du microbiote, un modèle axénique sera nécessaire pour éviter les effets de la flore locale de l'animal hôte. Les espèces de souris axéniques sont actuellement disponibles. En plus, les modèles de souris sont des modèles bien adaptés à la recherche en neurosciences comportementales, car ils présentent une variété de comportements pertinents pour les maladies humaines. - Pour les souris de production, afin de générer la ligne de la souris, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (2-8 mois) car il faut qu'ils aient atteints la maturité sexuelle pour permettre la reproduction. - Pour les souris en experimentation des souris adultes (6-18 mois) seront utilisées pour caractériser les phénotypes des souris dans ce projet et étudier leur évolution au cours du vieillissement.
ETUDE HISTOLOGIQUE SUR L’ORGANISATION TISSULAIRE D’UN HYDROGEL DE REVITALISATION PULPAIRE INJECTE DANS DES RACINES DES DENTS HUMAINES
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
102 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau du dos des racines de dents humaines remplies d'un hydrogel ou de sang, pour quatre à douze semaines, avant de les tuer et de prélever les échantillons pour analyse. Le porteur décrit une douleur post-chirurgicale, un stress lié aux points de suture et une anxiété qu'il présente comme "attendue dans toute expérimentation animale". L'objectif est de valider un gel de revitalisation des dents nécrosées comme alternative à la dévitalisation chez de jeunes patients.
Objectifs
L’acte de dévitaliser les dents sur de jeunes patients peut-être éviter en préférant une thérapie régénérative (Traitement Endodontique Régénératif (TER) ou revitalisation pulpaire). Ce traitement se base sur l’obtention d’un tissu vascularisé à partir d’un caillot sanguin formé à l’intérieur de la racine de la dent nécrosée. Pour favoriser le développement d’un tissu de type pulpe dentaire à partir d’un caillot sanguin, au sein de notre laboratoire , a été développé un gel injectable dans la racine de la dent. Les études in vitro ont démontré la capacité de ces matrices sous forme de gel à former un tissu similaire à la pulpe dentaire, vascularisé et organisé. L’étape suivante vise à évaluer et à étudier le tissu formé dans des conditions in vivo chez le rat. Le modèle in vivo consiste en l’implantation sous-cutanée dans le dos du rat, de racines des dents humaines remplies avec les matériaux de revitalisation pulpaire. Pour notre étude, 10 racines remplies avec du gel (groupe test) et 10 racines remplies avec du sang (groupe contrôle) seront implantés sur 10 animaux par groupe. Chaque animal sera implanté avec 2 échantillons selon un modèle en split mouth : un échantillon « contrôle » et un échantillon « test ». Après la fin de la période d’implantation une étude histologique des tissus néoformés dans les racines sera réalisée. L’ensemble de ces résultats seront comparés avec les résultats des études in vitro.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité de l’étude des effets des biomatériaux pour la revitalisation pulpaire. Les bénéfices attendus de ce projet sont l’obtention d’un tissu en condition proche de la clinique dont les caractéristiques en termes de cellules, de fibres et de formation de vaisseaux sanguins et nerveux seraient proches de celles de la pulpe dentaire. L’étude de la formation du tissu par l’hydrogel en condition in vivo nous permettrait de valider la capacité de l’hydrogel à recréer un tissu proche de la pulpe qui pourrait ensuite être appliqué en condition réelle à l’intérieur de la dent d’un patient, afin de remplacer le processus de dévitalisation.
Procédures
Implantation sous cutanée des échanitillons dans la loge dorsale de l'animal pour une période de 4 et 12 semaines. Dans chaque animal nous allons implanter 2 échantillons - un échantillon "test" et un échantillon "contrôle". Après les deux périodes d'implantation les animaux seront autanasiés et les échantillons prélévés pour une étude histologique et immunohistochimique.
Impact sur les animaux
- Douleur post chirurgicale au niveau du site opératoire (gonflement, inflammation) due à la cicatrisation - Stress physique provoqué par les points de suture au niveau des incisions (excitation, comportement anormal des animaux qui peuvent essayer de se retirer les points) - L’anxiété est un effet indésirable attendu comme dans toute expérimentation animale.-
Devenir
A la fin des deux périodes d'implantation, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération et analyse des échantillons
Remplacement
Ce projet de recherche s’inscrit dans la suite d’études expérimentales in vitro concluantes qui peuvent donner lieu à l’application chez l’homme des biomatériaux proposés. C’est pourquoi, des études sur le petit animal doivent être entreprises pour confirmer le bénéfice in vivo et informer d’éventuels biais non révélés in vitro. Il n’existe pas d’alternatives non animales pour réaliser ce test in vivo. L’implantation de l’hydrogel à base de fibrinogène et du sang dans la racine dentaire humaine permettra de réaliser le test in vivo directement sur l’environnement du produit dans lequel il sera appliqué. En effet, cliniquement, l’hydrogel sera en contact avec le sang de l’hôte pour permettre la formation d’un tissu similaire à la pulpe dentaire humaine. L’implantation de nos échantillons dans le dos du rat offre un environnement avec des conditions de vascularisation similaire à la réalité clinique, ce qui augmente la significativité des résultats.
Réduction
La taille d’échantillon utilisé (racine dentaire humaine 10mm) nous permet d’implanter maximum 2 échantillons dans la loge sous-cutanée thoracique dorsale de deux côtés de la colonne vertébrale par animal. Ansi dans un animal nous allons implanter un échantillon "test" et un échantillon "controle". Cela va diviser par deux le nombre d' animaux necessaires pour tous les tests. Le résultat du nombre de sujets nécessaires est de 10 par groupe (soit 20 échantillons implantés) et par la période d’implantation pour l’étude principale et de deux animaux pour l’étude préliminaire au total 102 animaux. Cela détermine un nombre d' animaux implantés pour l’étude principale égal à 100. Les résultats seront groupés dans des fiches individuelles pour chaque animal.
Raffinement
les animaux seront isolés en post-opératoire afin d'éviter tout risque de blessure.Les rats disposeront dans leurs cages individuelles de modules de cœur de bois de peuplier qui permettent de développer l’activité d’exploration de l’animal et de participer à son bien être. L'environnement du rongeur est également enrichi avec frisottis de papier qui stimule les instincts de nidification et d'exploration de jeu. Le rythme circadien des rongeurs sera respecté. Les procédures ne débuteront que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement.Visites quotidiennes par le personnel qualifié de l’animalerie. Utilisation d'un anesthésique local en début de toute chirurgie .Mise en place d’un protocole antalgique adapté . En cas de signes clinique d'infection du site opératoire, nous lui administrerons un antibiotique.Mise en place d’une grille de score ,utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance .
Choix des espèces
Le rat est un animal dont la taille et les proportions permettent la mise en place d’un protocole chirurgical pour l’implantation des racines dentaires humaines avec ces dimensions déterminées dans le dos du rat. L’implantation des biomateriaux pour la revitalisation de la pulpe dentaire et du sang dans la racine dentaire humaine permettra de réaliser le test in vivo directement sur l’environnement du produit dans lequel il sera appliqué. De plus le rat est un animal connu pour la rapidité de cicatrisation, sa résistance à la douleur et aux infections ainsi que sa bonne tolérance à l’anesthésie. Le rat dispose d'une qualité tissulaire proche de celle de l’homme ce qui nous permettra d’obtenir des conditions expérimentales proches des situations cliniques, augmentant ainsi la significativité des résultats. Animaux adultes : la taille suffisante pour l’implantation de deux échantillons par animal.
Rôle de K1K1 dans la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) et la résistance à l’insuline.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques, elles reçoivent des injections répétées d'une protéine, la pose d'une pompe osmotique et d'un cathéter sous chirurgie, et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la maladie du foie induite peut provoquer douleur, inconfort, inflammation et troubles du comportement. Le composé testé est présenté comme "prometteur" pour traiter le diabète et les maladies du foie, sur la base de données "préliminaires".
Objectifs
Ce projet vise à mettre en évidence que l'administration de K1K1 ralentit la progression de la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) en réduisant la stéatose et la fibrose hépatique dans deux modèles nutritionnels de souris atteintes. De plus, nous postulons que l'effet antifibrotique de K1K1 dans le foie sera associé à la prévention de certains types de cancers du foie. In vivo, des données préliminaires montrent que l'administration intrapéritonéale de K1K1 pendant 3 semaines améliore fortement la production, la sécrétion et la sensibilité à l'insuline, conduisant à une réduction significative de l'hyperglycémie dans un modèle de souris obèses et diabétiques. Sur la base de données préliminaires fortes et uniques fournissant la preuve du développement d'un mimétique fonctionnel du facteur de croissance hépatique pour une administration in vivo, nous postulons que le mimétique K1K1 est un composé prometteur pour améliorer la transplantation de cellules des îlots, traiter le diabète et les maladies du foie. Nous proposons donc dans cette étude collaborative de valider l'efficacité et la sécurité de K1K1 d'une part dans le traitement de la stéatose et de la fibrose hépatiques, et d'autre part vis à vis de l'Elafibranor, tout cela à l'aide de modèles in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait donc permettre de valider le rôle régénérateur de K1K1 dans la fibrose hépatique
Procédures
Pour la procédure 1 : injection de la protéine d'intérêt ou son solvant 3f/semaine pendant 3 semaines. Pendant la semaine 3 : tests de tolérance à l'nsuline, injection d'insuline et prélèvements de gouttes de sang à la queue pour mesurer la glycémie (durée 120 minutes). 3 jours plus tard : tests de tolérance au glucose, gavage de glucose puis prélèvements de sang pour dosage d'insuline à t0, t15 et t90 (durée 120 min). Procédure 2 : injection de la protéine d'intérêt ou son solvant 3f/semaine pendant 3 semaines. chirurgie pour pose de cathéter une semaine avant le clamp. Procédure 3 : insertion de la pompe osmotique en sous-cutané et tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Procédure 4 : insertion de la pompe osmotique en sous-cutané et chirurgie pour pose de cathéter une semaine avant le clamp.
Impact sur les animaux
La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est une maladie du foie caractérisée par l'accumulation excessive de graisse dans les cellules du foie. Il peut donc survenir plusieurs effets indésirables au cours de l’étude : L'induction de la NAFLD peut perturber le métabolisme des souris, entraînant une augmentation de la glycémie et une résistance à l'insuline. Elle peut également entraîner une inflammation dans le foie et d'autres tissus, ce qui peut causer de la douleur, de l'inconfort et des troubles du comportement chez les souris. De plus, si celle-ci n'est pas traitée, elle peut évoluer en fibrose hépatique, ce qui peut entraîner une dégénérescence du foie et une insuffisance hépatique. L'accumulation de graisse dans le foie peut également entraîner une production accrue de radicaux libres, qui peuvent endommager les cellules hépatiques et provoquer une réponse de stress oxydatif.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'organes et/ou étude de la radioactivité
Remplacement
Le remplacement par des études in vitro (avec l'études de cellules d'hépatocytes en culture par exemple) ne semble pas possible au vue de cette étude: nous souhaitons étudier principalement l'effet du peptide K1K1 sur la stéatose hépatique mais avant tout les bénéfices de celui-ci sur un organisme complexe, avec des effets sur des voies métaboliques intégrées telle que la sensibilité à l'insuline. De plus, l'utilisation de souris est nécessaire, avant les tests chez l'Homme, pour suivre des effets actuellement inconnus (nous souhaitons par exemple vérifier en parallèle si ce traitement permet d'éviter un développement tumoral induit par la NASH, phénomène que l'on peut observer exclusivement dans un organisme vivant complexe, regit par bons nombres de cascades de signalisation inter organes, hormonales, neurales,etc...). Des approches in silico et in vitro ont déjà été mises en oeuvre afin de s'assurer que le peptide K1K1 lie bien le récepteur Met et active la voie de signalisation, ainsi l'utilisation d'animaux est l'étape suivante pour s'assurer d'un effet biologique in vivo. Selon les résultats de l'étude, d'autres approches in vitro pourraient être utilisées afin de disséquer sur des modèles de cellules les mécanismes d'action (on pourrait envisager l'utilisation d'organ-on-chip afin de faire cohabiter les différents types de cellules hépatiques).
Réduction
Plusieurs études au sein de notre laboratoire ont précédemment montré que des groupes de 10 souris étaient necessaire au minimum pour obtenir des résultats optimaux. Afin de réduire le nombre d'animaux contrôles, nous utiliserons des souris contrôles sous régime normal pour comparer aux souris génétiquement diabétiques ou ayant une résistance à l'insuline induite par un régime hyper-lipidique.
Raffinement
Enrichissement environnemental, consistant à fournir un environnement plus stimulant pour les souris, en ajoutant des objets tels que des tunnels, des matériaux de nidification, etc. Cela permet de réduire le stress et l'ennui chez les souris en captivité, tout en favorisant leur comportement naturel. Anesthésie et analgésie : il est important d'utiliser des protocoles d'anesthésie et d'analgésie efficaces pour minimiser la douleur et la détresse chez les souris lors de procédures chirurgicales ou invasives. Suivi régulier de l'état de santé des souris : il est important de surveiller régulièrement l'état de santé des souris pour détecter rapidement tout signe de maladie ou de détresse et agir en conséquence.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle d'étude de l'homéostasie glucidique (physiologie et pathophysiologie très similaires à l'Homme).
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments sur des troubles neuromusculaires dans des modèles de neuropathies d’origine auto-immune et diabétique chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 365
2 043 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Une partie subit une chirurgie d'induction de neuropathie, une électrophysiologie du nerf sciatique sous anesthésie et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, avec trois tests comportementaux répétés, pour évaluer des candidats médicaments contre des neuropathies auto-immunes et diabétiques. Le porteur décrit des douleurs neuropathiques, une baisse sévère de la mobilité au pic de la maladie et les effets du diabète induit, obésité, hyperglycémie et retard de cicatrisation. Parmi les bénéfices avancés figurent une banque de tissus, des publications et une mise sur le marché "prévue d'ici 2035".
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) est composé des nerfs qui commandent les mouvements et renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps. Par exemple, le nerf sciatique étudié dans ce projet est situé au niveau des pattes arrière permettant à la fois leur motricité mais aussi de ressentir des sensations perçues à leur niveau (toucher, douleur, température…). Les nerfs sont composés de fibres (les axones) et des cellules de Schwann formant une enveloppe autour des axones, la gaine de myéline, qui est isolante, protectrice et nutritive. La plupart des maladies du SNP ont pour origine la perte progressive de la gaine de myéline (démyélinisation) ou celle des axones engendrant des troubles moteurs et sensoriels handicapants. Contrairement à la perte axonale, la démyélinisation est un phénomène réversible. Ces maladies sont soit innées, c’est-à-dire d’origine génétique (héréditaire) ou bien acquises, comme la neuropathie (maladie des nerfs) diabétique (causée par le diabète) et la neuropathie d’origine auto-immune lors de laquelle le système immunitaire s’attaque à la myéline. Dans ce projet nous nous intéresserons aux neuropathies périphériques acquises qui touchent 4% de la population mondiale et pour lesquelles les traitements actuels ne ciblent pas spécifiquement la démyélinisation pathologique dans ces maladies. Cependant, des études réalisées sur des cultures cellulaires et chez les animaux ont mis en évidence des cibles sur lesquelles agir pour arrêter le processus de démyélinisation engagé dans ces maladies. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de plusieurs traitements agissant directement sur la démyélinisation pathologique dans les modèles rongeurs transgéniques de ces maladies. Ils seront donc complémentaires de ceux déjà employés en clinique. Les résultats seront publiés auprès de la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Avantages à court-terme : - Démontrer l’efficacité de notre stratégie thérapeutique. - Sélectionner les produits efficaces pour un futur passage en clinique. - Créer une banque de tissus. - Publier des résultats. Avantages à long terme : -Thérapies complémentaires de celles sur le marché pour les patients. -Une autorisation de mise sur le marché prévue d’ici 2035.
Procédures
- La chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent chez 504 souris au maximum. Elle durera 30 minutes. - L’électrophysiologie du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 30 minutes. - Les trois tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois tous les quinze jours sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum. - Le modèle de rat Guillain Barré sera induit par une réaction immunitaire. -Les prélèvements de sang via le sinus rétro-orbital et celui du liquide dans lequel baigne le cerveau (liquide céphalo-rachidien) seront effectués au maximum sur 914 animaux, une fois par animal et sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances -Chirurgies en suivant les recommandations des bonnes pratiques vétérinaires. -Douleurs post-opératoires (4 jours) -Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité (durée 5 semaines) entre-coupée d’une diminution sévère de la mobilité lors du pic de la pathologie (durée de 5 jours entre le 15ème et 19ème jour) puis réversibilité progressive des symptômes. -Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) -Nuisances associées au diabète : obésité, hyperglycémie, myocardie et retard de cicatrisation (6 à 10 semaines et une évolution progressive).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures car des prélèvements terminaux sont nécessaires à l'étude des effets des traitements.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude qui repose principalement sur une profonde collaboration entre les cellules de Schwann et les axones qu'elles couvrent rend difficile la modélisation in silico et la reproduction in vitro du système. Des méthodes existent pour étudier la myélinisation in vitro mais la myéline obtenue par ces méthodes reste très fine et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il est clair que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénérescence et régénérescence du nerf périphérique ne sont pas reproduits in vitro. L'expérimentation animale reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
Un calcul de taille d’échantillon a été réalisé, basé sur la variabilité attendue, la différence biologiquement significative à mettre en évidence avec une puissance suffisante et un risque alpha déterminé. Ces calculs ont été réalisés sur les données d’électrophysiologie et de comportement moteur afin de connaitre le nombre minimum d’animaux à avoir par lot pour chaque test. Dans tous les modèles sauf ceux des souris développant une démyélinisation d’origine auto-immune, les deux sexes seront utilisés car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Pour les modèles de souris de neuropathies d’origine auto-immune uniquement les femelles seront utilisées car 100% présenteront la pathologie, contre 16 à 30% des mâles. Une autre manière de réduire le nombre d’animaux nécessaire sera de les commander chez les fournisseurs ou de les générer par FIV (fécondation in vitro).
Raffinement
- Les rongeurs auront une période d’acclimatation d’une semaine à l’animalerie lors de laquelle une habituation aux expérimentateurs sera effectuée ; - Pour éviter les douleurs neuropathiques, nous utiliserons de la litière de cellulose. Cette litière présente également l’avantage d’avoir une bonne capacité d’absorption et sera donc particulièrement adaptée à la polyurie des souris diabétiques. De plus, le personnel formé et compétent augmentera la fréquence du change des cages et des biberons en fonction de l’évolution du diabète. - Des fiches individuelles de suivi pré- et post-opératoire seront utilisées ; - Deux fois par semaine, l’évaluation de l’état clinique des animaux sera faite, avec des scores corrélés à l’intensité de la souffrance, à l’aide de plusieurs fiches dont chacune est adaptée aux besoins spécifiques des lignées et au suivi post-opératoire. Selon la souffrance évaluée, il y aura une discussion avec le vétérinaire pour décider des soins à apporter ou de la nécessité d’une euthanasie. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, par exemple, en cas de déshydratation, apport d’eau gélifiée ou injections sous-cutanées d’une solution isotonique d’électrolytes. En cas de perte de poids ou d’état affaibli, mise à disposition de nourriture humide et d’eau gélifiée sur le sol de la cage. -Nous sédaterons les rats avant leur euthanasie par dislocation cervicale ; -Une fois par semaine (modèles de souris de neuropathie auto-immune) ou une fois par jour (rat SGB) nous évaluerons l’évolution de la paralysie par une fiche de scoring. -Pour éviter la perte d’identification des animaux et le stress de contention : les animaux seront marqués de manière permanente soit par des poinçons d’oreille, soit par des micro-puces sous-cutanées, soit à la queue par un stylo marqueur non toxique.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez des souris C57Bl6 sauvages ou db/db et sur des rats, ceci nécessitant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Rat/souris : juvéniles et adultes Les animaux seront reçus entre 3 et 6 semaines d’âge. Une partie d’entre eux commenceront à être traités entre 4 et 8 semaines d’âge (procédure 1, 2, 3, 4 et 5). L’autre partie des animaux sera traitée à partir de 20 à 30 semaines d’âge (une partie de la procédure 4). Il s’agit de souris modèles de neuropathie périphérique d’origine auto-immune chez qui les symptômes moteurs s’expriment tardivement. Ces femelles seront générées par FIV, aucun mâle ne sera commandé pour ces modèles.
Etude de la micro-architecture osseuse dans un modèle murin d’hémiplégie vasculaire: HemiPLOS
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une occlusion de l'artère cérébrale moyenne, un modèle d'AVC provoquant un déficit moteur, une perte de poids et une anorexie possible, l'autre moitié une opération témoin, toutes recevant des injections et des prélèvements sanguins avant d'être tuées à quatre semaines pour prélèvement des fémurs. Le porteur décrit une douleur peropératoire et une mobilité réduite, et justifie le modèle par la "nécessité" d'un contexte pathologique homogène. L'étude vise à décrire la fragilité osseuse après un AVC et l'effet de bisphosphonates, des retombées thérapeutiques renvoyées "à terme".
Objectifs
L’ostéoporose représente l’une des maladies métaboliques osseuses les plus fréquentes ayant comme principale conséquence la fracture, dont les paralysies ou parésies (paralysie partielle) constituent elles aussi un facteur de risque. La fracture est un facteur d’altération de la fonction et de la survie chez les patients ayant eu un AVC. La densité minérale et la micro-architecture osseuse sont deux déterminants clefs de la solidité osseuse. Les modifications concernant la micro-architecture de l'os chez les patients paralysés ou parétiques sont elles peu décrites. Les bisphosphonates (traitement ayant pour but de prévenir la perte osseuse) sont un des traitements les plus utilisés dans l’ostéoporose. Mais il n’existe à ce jour aucune stratégie thérapeutique chez les patients post-AVC afin de prévenir de l’ostéoporose et de leurs conséquences pouvant être dramatiques (les fractures). L’objectif principal de notre travail est l’étude de la densité minérale osseuse et de la micro-architecture osseuse au cours des paralysies ou des parésies. Ce travail permettra d’explorer les mécanismes de la fragilisation osseuse induite par ces conditions. Il sera mené chez l’animal dans un modèle de souris hémiplégiques. Ce choix est motivé par la nécessité d'un contexte pathologique homogène, la fréquence des hémiplégies vasculaires chez l’homme et de leurs complications osseuses ainsi que par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physiopathologiques. L’objectif secondaire de notre travail est l’étude de l’effet des bisphosphonates sur la micro-architecture osseuse dans ce même modèle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la caractérisation de la micro-architecture osseuse, de son lien avec la différenciation des ostéoclastes (cellules qui résorbent l'os) et de l’effet des bisphosphonates après un accident vascualire cérébral. La connaissance de ces modifications micro-architecturales osseuses survenant après une hémiplégie et la connaissance des effets des bisphosphonates sur ces modifications sont essentielles pour l'établissement d'une stratégie de prévention des fractures par fragilisation dans ce contexte. Notre travail pourrait ainsi contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de la fragilisation osseuse conduisant à la fracture chez les patients paralysés. Il pourrait à terme conduire à l'ouverture de perspectives thérapeutiques visant à prévenir les modifications micro-architecturales osseuses et à réduire le risque de fractures ainsi que leurs complications trop souvent dramatiques, chez des patients fragiles et particulièrement exposés.
Procédures
La moitié des souris subira une intervention chirurgicale d'occlusion artérielle de l’artère cérébrale moyenne transitoire (2 heures en tout, modèle d'AVC) puis l'autre moitié subira une procédure sham (procédure controle, sans occlusion de l'artère). Toutes les souris auront une injection sous cutanée de biphosphonates ou vecteur le jour de la chirurgie. Puis auront lieu pour toutes les souris des injections intra péritonéale de molécules fluorescentes visibles en imagerie et anesthésiants. Ainsi que des prélèvements sanguins avant intervention, à 1 semaine et 4 semaine.
Impact sur les animaux
Les nuisances concernent principalement les souris qui subiront l'intervention "occlusion intraluminale de l'artère cérébrale moyenne (OACM)", avec pour conséquence un déficit moteur diminuant la mobilité, la perte de poids et l'anorexie possible. Ce modèle induit également une douleur peropératoire. Les injections péritonéales sont également une nuisance pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront tous mise à mort 4 semaines après la chirurgie afin de pouvoir prélever les fémurs pour l’étude de la microarchitecture osseuse et la moelle osseuse des tibias sera extraite en culture pour l’étude de la différentiation ostéoclastique chez toutes les souris afin de pouvoir répondre aux objectifs de l'étude.
Remplacement
Ce choix du modèle murin type souris est motivé par la nécessité d'un contexte pathologique homogène, la fréquence des hémiplégies vasculaires chez l’homme et de leurs complications osseuses aggravant le pronostic fonctionnel et vital chez ses patients, ainsi que par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physio-pathologiques. Il est en effet impossible de reproduire in vitro les conditions de motricité/marche de cellules isolées nécessaires pour cette expérimentation.
Réduction
A des fins de puissance, le protocole comportera 10 souris sur 4 groupes soit un total de 40 souris. Il était impossible de réutiliser un groupe afin de valider scientifiquement notre étude, ni même d’utiliser le côté non hémiplégique d'une souris car dans la littérature le côté non hémiplégique présente également une perte osseuse et représenterait donc un mauvais témoin. Nous avons décidé d'avoir 10 souris par groupe, en sachant qu’avec cette procédure nous avons 20% d'échecs, cela reviendra à 8 souris par groupe, ce nombre sera nécessaire pour une puissance statistique suffisante.
Raffinement
L'environnement sera adapté et une limitation des contraintes et des douleurs sera mise en place. Les souris à la réception dans l'animalerie, seront réparties de façon aléatoire dans un environnement enrichi (jeux, abris, substrats, cachette, blocs de bois). Une période d'acclimatation de 7 jours sera respectée avant toute intervention sur l'animal. Les animaux seront élevés dans un environnement calme et surveillé de façon quotidienne. Si l'animal montre des signes de souffrance (stéréotypies, repli, perte de poids, vocalisations), il sera isolé dans un environnement riche et recevra un traitement analgésique. La chirurgie sera effectué sous anesthésie et les procédures de mesure de la densitométrie seront réalisées après une anesthésie également. Au vu de la procédure, l’analgésie est assurée avant le début de la chirurgie, en per-opératoire et dans les 72 heures post-opératoire (matin et soir). Les souris seront placées dans une couveuseaprès l'intervention et jusqu'au réveil de l'animal. Après avoir vérifié que l'animal retrouve sa mobilité, la souris sera remise dans sa cage et laissée sous le coussin chauffant pendant 12 heures. Parce que la perte de poids post-chirurgicale est généralement observée, la nourriture en purée sera placée dans une boîte de Pétri pour encourager à manger. Les 48 1ères heures, les animaux sont surveillés deux fois par jour, puis après cette période de manière quotidienne par l’animalier.
Choix des espèces
Ce choix est motivé par l’existence d’un modèle d’hémiplégie vasculaire propice aux explorations physiopathologiques, au vu de la capacité de mobilité de cet animal semblable à l'homme et permettant les explorations adaptés pour répondre aux objectifs de l'étude. Les expérimentations in vitro ne permettent pas d'appréhendrer l'objectif de l'étude. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. Les animaux auront entre 8 et 10 semaines, un age ou les animaux sont dit matures que ce soit pour le modèle hémiplégique et osseux. De plus les animaux sont pris à cet âge-là dans la littérature.
Rôle de deux enzymes dans l’épileptogenèse chez la souris atteinte de la sclérose tubéreuse de Bourneville sur le cerveau. 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une chirurgie crânienne sous anesthésie pour des injections, toutes reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours, et 600 sont opérées pour la pose de transmetteurs enregistrant les crises. Le porteur indique que ces souris, modèles de la sclérose tubéreuse de Bourneville, développent des crises d'épilepsie pouvant être létales pour 10 % d'entre elles. Les bénéfices avancés, de nouveaux biomarqueurs et pistes thérapeutiques, restent formulés au conditionnel.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels dans le cerveau. Ces modèles nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.
Bénéfices attendus
L'établissement de modèles murins pertinents de la sclérose tubéreuse de Bourneville avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement de malformations corticales et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
1200 souris seront utilisées dont 600 souris qui auront de la chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie de 3 minutes) pour subir des injections. Les 1200 souris seront soumises à des traitements pharmacologiques par injections quotidienne pendant 15 jours d'une durée de 1min. 600 souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale de 20 min afin d’enregistrer les crises épileptiques et les paramètres physiologiques en continue sans stress des animaux sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La cinétique des signes cliniques des animaux épileptiques est bien connue et démontrent un phénotype précoce et sévère. Nous anticipons que le phénotype des animaux que nous avons générés, sera potentiellement moins sévère que celui des animaux épileptiques. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces animaux développent un phénotype équivalent et nous nous attendons à observer chez ces animaux la survenue des crises épileptiques même si plus tardives et moins fréquentes mais qui pourraient être léthales pour 10% des souris. Les traitements pharmacologiques par injection n'entrainent pas d'effet néfaste. Les injections répétées sont susceptibles d’entraîner des irritations, si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. La pose des transmetteurs pour permettre la télémétrie se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après les chirurgies. Il n'est pas connu de risque de rejet du transmetteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Le développement corticale et l’épilepsie est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations endocrines. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes d'intérèt sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. les traitements pharmacologiques ne présentent pas de toxicité et ont déjà été testées in vitro ainsi que in vivo aux mêmes doses. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. Dans ce modèle, un groupe de 25 animaux est suffisant donc des groupes de 25 animaux seront utilisés. L'estimation du nombre d'animaux a été réalisé en comptant une perte de 10% de nos animaux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton, de bâtonnets de bois et de tunnel. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites 2 fois par semaine. Le traitement pharmacologique choisi sera administré quotidiennement et sera effectué par un technicien expérimenté à l'aide de seringues très fine qui donnent une injection quasi indolore. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Les traitements pharmacologiques par injection ne provoquent pas d'effet néfaste. Les injections auront lieu alternativement à gauche ou droite. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. La pose de transmetteur sera faite sous anesthésie générale avec une analgésie. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après la chirurgie. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérèt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.
Identifier les déterminants physiologiques de maladie (obésité, diabète…) par l’analyse non-invasive des paramètres métaboliques chez le petit animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 48
252 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré du "sans réveil" au léger, une partie réutilisée pour d'autres études et le reste tué pour prélèvement d'organes. Les animaux passent par une plateforme de mesure métabolique non invasive, avec un isolement individuel d'environ deux semaines présenté comme la seule contrainte. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et estime qu'un quart environ des animaux est tué dans son établissement. Le dispositif sert des collaborations extérieures, le devenir de chaque animal dépendant de l'équipe qui le récupère.
Objectifs
Le but est d'étudier au niveau préclinique le métabolisme énergétique des souris ou rats par un outil non-invasif et complètement automatisé. Pour cela, la plateforme d’Exploration Physiologique Fonctionnelle (EPF) est composée de 12 cages et permet la mesure en temps réel et pour chaque souris ou rats : - la prise alimentaire et hydrique - la mesure de la consommation d’oxygène - la production de dioxyde de carbone - la mesure du quotient respiratoire (indicatif de la nature du métabolisme glycolytique ou oxydatif) - la dépense énergétique globale de l’animal - l’activité spontanée et la mesure fine des déplacements dans les 3 dimensions spatiales (X, Y, Z). La plateforme EPF permet aussi l’analyse non-invasive de la composition corporelle des souris et rats par un scanner à résonance magnétique. Ce système ne requiert pas d’anesthésie et permet de déterminer la masse maigre, la masse grasse, les fluides corporels et la composition totale en eau sur des souris et rats.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre de collaborations qui auront été préalablement validées par des comités éthique locaux aux équipes voulant collaborer avec nous pour connaitre les comportements métaboliques et cela sans douleur et en limitant le stress des animaux.
Procédures
Aucune intervention n'est effectuée, il s'agit d'une procédure non invasive de mesure de calorimétrie indirecte.
Impact sur les animaux
Cette lecture métabolique est non-invasive et nécessite un isolement de 2 semaines au total avant d'être regroupé. Nous n'attendons aucun effet indésirable sur les animaux, ceux-ci ont de la nourriture et de l'eau à disposition comme dans une cage d'hébergement classique, la seule contrainte étant l'isolement de l'animal obligatoire pour les prises de mesure. Chaques études collaboratives (21 par an) sont réalisées sur 12 souris ou rats.
Devenir
En fonction des collaborations, les animaux seront récupérés dans le cadre des collaborations et mis directement à mort pour prélèvements d'organes. Nous pouvons estimer que 25% des animaux sont mis à mort dans notre EU.
Remplacement
Dans le cadre des projets de collaborations nous devrons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour nos études nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux (activité, prise alimentaire et hydrique) et de métabolique . De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs / le stress dans la procédure. Cette procédure est non invasive et ne provoquent normalement aucun effet indésirable sur les animaux.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur. Les animaux doivent être âgées au minimum de 10 semaines lorsque toutes les structures cérébrales et le métabolisme soient stabilisés.
Mécanismes biologiques du codage prédictif dans le néocortex de la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent jusqu'à trois chirurgies crâniennes d'une heure sous anesthésie, la pose d'une plaque de tête et l'implantation d'électrodes, puis une contention de la tête et un entraînement en réalité virtuelle, parfois sous restriction d'eau pour les motiver. Le porteur affirme que l'enregistrement cérébral est "indolore" car le cerveau ne possède pas de récepteurs de la douleur, tout en reconnaissant douleur post-opératoire, risque d'infection et perte de poids. La recherche est présentée comme fondamentale, ses retombées médicales étant renvoyées au "long terme".
Objectifs
Nous étudions les mécanismes neuronaux qui sous-tendent le comportement animal. Notre hypothèse est que les processus mentaux génèrent constamment des prédictions sur le monde extérieur. Cette hypothèse considère le cerveau comme une machine prédictive capable de bien plus qu'une simple analyse des informations sensorielles arrivant par les yeux, les oreilles, etc. Au contraire, l'expérience antérieure est utilisée pour construire des modèles internes du monde qui sont ensuite utilisés pour prédire les événements extérieurs. Si vous êtes assis dans votre jardin, si vous voyez le chat du voisin sauter la clôture, vous vous y attendez et l'activité cérébrale produite par cette scène est faible. En revanche, si un kangourou saute la clôture, cet événement n'est pas prévu par votre modèle interne de votre jardin, et l'activité cérébrale sera élevée pour traiter cette situation inattendue et potentiellement dangereuse. À l'inverse, si vous déménagez en Australie et que vous vivez dans l'arrière-pays, votre modèle interne sera rapidement mis à jour par les expériences que vous avez vécues en voyant un kangourou sauter la clôture et vous ne serez pas surpris la prochaine fois que cela se produira. Nous étudions les fondements biologiques de ce calcul, comment les modèles internes sont formés et comment ils régissent la perception et le comportement. Nous utilisons des souris pour nos recherches, car elles possèdent un riche répertoire comportemental et une architecture cérébrale similaire à celle des humains. En outre, nous disposons d'outils de recherche inégalés pour enregistrer et modifier l'activité cérébrale des souris. Nous étudions comment les cellules du cerveau se connectent les unes aux autres et comment elles communiquent afin de permettre un traitement prédictif. En outre, nous étudions les souris au cours d'un comportement naturaliste dans un environnement de réalité virtuelle, où nous pouvons contrôler ce qu'elles voient, de sorte que nous pouvons introduire des événements inattendus (comme le kangourou). En enregistrant et en modifiant l'activité cérébrale au cours de ces comportements, nous pouvons mieux comprendre quels calculs le cerveau des mammifères effectue et comment. Ce travail est essentiel pour comprendre les processus mentaux. Il est important de noter que la compréhension du fonctionnement d'un esprit sain nous permettra de mieux comprendre ce qui ne va pas dans les maladies psychiatriques, comme la dépression ou la psychose.
Bénéfices attendus
Bénéfices principaux: Ce programme de recherche vise à combiner des techniques expérimentales de pointe avec des approches nouvellement développées afin d'ajouter de nouvelles connaissances fondamentales à notre compréhension de la fonction cérébrale et des structures qui la soutiennent. Nous publierons ces données dans des revues de premier plan et diffuserons les résultats lors de conférences nationales et internationales. Nous nous engageons aussi activement à rendre nos données, notre code et nos développements techniques open source. Bénéfices secondaires: La nature invasive de nos approches expérimentales permet d'obtenir une quantité inégalée d'informations sur la structure et la fonction du cerveau, mais elle est limitée à l'étude d'organismes modèles. Cependant, la compréhension du cerveau des rongeurs conduira inévitablement à une meilleure compréhension du cerveau humain. Cette recherche de découverte fondamentale ne peut être réalisée sans l'utilisation d'animaux. La connaissance du cerveau sain est nécessaire à la réparation causale des dysfonctionnements dans les pathologies. Nos travaux apporteront de nouvelles connaissances sur les calculs cérébraux fondamentaux qui sont déréglés dans les maladies psychiatriques et, à long terme, de nouvelles pistes pour améliorer la santé humaine. Selon l'OMS, la santé mentale et les maladies neurologiques représentaient 13 % de la charge totale de morbidité dans le monde en 2004. Le coût de la maladie en 2010 était estimé à 2,5 billions de dollars US pour les maladies mentales (contre 0,3 billions de dollars US pour le cancer), et atteindra 6 billions de dollars US d'ici 2030 (The Global Economic Burden of Noncommunicable Diseases. Genève : Forum économique mondial 2011).
Procédures
Les animaux subiront au maximum trois interventions chirurgicales d'une heure sous anesthésie gazeuse. Ces interventions comprennent des injections dans le cerveau et la mise en place d'une plaque de tête pour faciliter l'immobilisation des animaux pendant l'enregistrement. En outre, des électrodes d'enregistrement peuvent être implantées. Pendant et après l'opération, les souris recevront une injection d'anesthésique local dans le crâne, un analgésique et un anti-inflammatoire. Pour la procédure 1, quelques semaines après l'opération, des études ex vivo seront menées en utilisant des méthodes d'enregistrement et d'optogénétique de pointe. Pour les procédures 2 et 3, les animaux seront entraînés à la réalité virtuelle et des enregistrements électriques du cerveau seront effectués pour étudier le codage neuronal. Les souris peuvent ressentir une gêne légère et transitoire pendant quelques jours, le temps qu'elles s'habituent à la fixation de la tête. Les séances d'entraînement et d'enregistrement dureront de 1 à 3 heures et seront répétées de manière ponctuelle pendant 2 à 7 jours. L'enregistrement cérébral est indolore, car le cerveau ne possède pas de récepteurs de la douleur. Les stimuli (visuels et vestibulaires) sont indolores.
Impact sur les animaux
En général, toutes les procédures sont bien tolérées par l'animal et n'affectent pas le phénotype général de la souris. En ce qui concerne la chirurgie implantaire, les désagréments comprennent la douleur postopératoire, le risque potentiel d'infection et la perte de l'implant. Les souris auront besoin de quelques jours pour se remettre de la chirurgie. Le cerveau n’étant pas sensible, la douleur liée à la chirurgie sera due uniquement à des aspects périphériques. En ce qui concerne les expériences comportementales, les nuisances peuvent inclure le stress lié à l'isolement et le stress lié à la manipulation. Dans certains cas, la restriction d'eau sera utilisée pour motiver le comportement des animaux, ce qui peut entraîner une baisse de poids modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sans cruauté à la fin des procédures. Les cerveaux seront prélevés pour des analyses anatomiques et physiologiques ultérieures afin d'obtenir le maximum de données sur chaque animal.
Remplacement
Malgré un siècle de recherche sur le cerveau, la science est encore loin de comprendre les détails biologiques de la fonction cérébrale. L'étude des processus cognitifs chez les animaux et les tissus cérébraux vivants est essentielle pour la recherche biologique fondamentale. À mesure que nous en apprendrons davantage sur les neurones et les synapses à l'étude, nous pourrons utiliser davantage la modélisation mathématique et informatique. Cependant, pour que les approches de modélisation soient utiles, elles devront être étroitement limitées par des mesures biologiques. L'utilisation d'animaux est inévitable pour les questions scientifiques importantes que nous souhaitons aborder. Cependant, nous utiliserons également la modélisation informatique aux niveaux synaptique, cellulaire et réseau pour tester des scénarios possibles afin de générer des hypothèses testables.
Réduction
Les objectifs nécessitent l'utilisation de lignées de souris transgéniques. Le nombre d'animaux requis reflète les schémas de reproduction connus, la taille des portées et la demande. Dans la mesure du possible, les lignées seront maintenues à l'état homozygote, afin de limiter le nombre de descendants présentant des génotypes inappropriés. Pour la plupart des expériences quantitatives, le plan sera basé sur les directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org/) et nous utiliserons le nombre minimum d'animaux pour fournir une description adéquate basée sur l'expérience précédente (la nôtre et celle de la littérature) . Nous avons une expertise statistique à l'Institut pour déterminer adéquatement la taille de l'échantillon en fonction de l'analyse de puissance. Nous utiliserons les méthodes de recherche les plus modernes qui maximisent la quantité de données recueillies sur chaque animal. De plus, en effectuant des enregistrements répétés sur les mêmes animaux, nous pouvons obtenir des données plus précieuses sur la dynamique des processus neuronaux des individus, réduisant à nouveau le nombre d'animaux nécessaires, par rapport aux expériences ponctuelles uniques. Enfin, dans la mesure du possible, le tissu cérébral d'un animal sera partagé et/ou déplacé pour d'autres analyses expérimentales, par exemple, l'histochimie dans un tissu fixé après des enregistrements in vivo.
Raffinement
Toutes les mesures visant à atténuer ou à minimiser la douleur, la souffrance, la détresse ou les dommages durables à l'animal seront prises. Des protocoles expérimentaux ont été affinés en utilisant les pratiques vétérinaires les plus modernes et en prévoyant des périodes de récupération pour réduire le stress et la souffrance des animaux. La douleur et/ou la détresse des animaux sont réduites par sédation, analgésie, anesthésie ou tout autre moyen approprié pour réduire la douleur ou la détresse, suivant une pratique vétérinaire reconnue. Les injections cérébrales stéréotaxiques et les chirurgies d'implantation seront réalisées dans des conditions aseptiques pour prévenir les infections post-chirurgicales. La récupération de l'animal après l'opération est directement surveillée dans une salle de réveil jusqu'à ce que l'animal soit ramené dans sa cage d'accueil. Une fois que les animaux sont retournés dans leur cage d'accueil, ils sont observés au moins deux fois par jour. De plus, les souris sont généralement hébergées en groupes et bénéficient d'un enrichissement environnemental, ce qui réduit considérablement les niveaux de stress par rapport au logement isolé. Enfin, nous surveillons en permanence les meilleures pratiques et les nouvelles informations disponibles dans la littérature internationale (par exemple https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources). Cette action respectera les principes de la déclaration de Bâle (www.basel-declaration.org), qui défend l'idée que les expérimentations animales en recherche fondamentale et appliquée doivent être planifiées et réalisées avec le plus grand soin et qui contribue à apporter à la société informations ouvertes et transparentes sur les expérimentations animales.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J sont choisies car leur système nerveux est largement similaire à celui de l'homme et qu'elles disposent d'une riche boîte à outils génétique pour les expériences. En outre, elles ont une bonne acuité visuelle, sont suffisamment petites pour être fixées sur la tête et constituent l'espèce de mammifère la plus simple pour réaliser ces expériences. Les objectifs de cette recherche sont de découvrir les mécanismes de la fonction cérébrale bien développée chez les animaux adultes. Pour certaines expériences (par exemple celles nécessitant un long temps d'expression des vecteurs viraux), nous utiliserons des animaux juvéniles (P18+). Pour la plupart des expériences, des animaux âgés de P35+ seront utilisés.