Rongeurs

61 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trente-huit reçoivent une greffe de tumeur mammaire, puis des injections de paclitaxel qui provoque une hypersensibilité au toucher et au froid, mesurée par des tests répétés pendant trois semaines, et toutes subissent une chirurgie cutanée avant la mise à mort. Le porteur affirme qu'en dehors des tests les souris ne montrent aucun signe de souffrance ni de perte de poids, tout en reconnaissant que la croissance de la tumeur peut endommager les tissus et provoquer des douleurs. Le projet vise à ajouter une tumeur aux modèles existants de neuropathie chimio-induite, un outil destiné à de futurs tests de molécules.

Objectifs

Les neuropathies périphériques associées de douleurs neuropathiques induites par les agents anticancéreux neurotoxiques représentent une des causes principales de l’altération de la qualité de vie des patients survivant à un cancer. Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie (NPIC) sont très fréquentes, plus de 60 % des patients sous chimiothérapie anticancéreuse, et impactent fortement la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie, pouvant conduire à une diminution des chances de survie des patients. A ce jour, il n’existe aucun traitement preventif contre les NPIC. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pharmacologiques spécifiques des NPIC représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge des patients traités par chimiothérapie anticancéreuse. Un modèle de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux communément utilisé dans la prise en charge du cancer du sein triple négatif, a déjà été développé et caractérisé, et a permis de mettre en évidence les propriétés neuroprotectrices de plusieurs molécules. In vitro, l’effet de l’interaction bénéfiques des molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique des chimiothérapies, ainsi que leur potentiel anticancéreux propre a été mis en évidence sur des lignées cancéreuses humaines. Fort de ces résultats, nous souhaiterions poursuivre dans un modèle animal plus intégratif impliquant les phénomènes de douleur et d’inflammation. Aucun modèle animal de neuropathie sensitive induite par le paclitaxel et associée à un cancer n’a encore été développé. Un tel modèle permettrait de mieux comprendre le lien entre le cancer et le développement des neuropathies associées à la chimiothérapie neurotoxique et d’évaluer l’effet de molécules candidates neuroprotectrices sur les douleurs induites par la chimiothérapie, ainsi que sur l’activité antitumorale de la chimiothérapie. L’objectif est de mettre en place et caractériser un modèle syngénique de cancer de sein sensible au paclitaxel, et dévellopant une neuropathie induite par le paclitaxel. Le modèle syngénique (greffe de même fond génétique que l'hôte), contrairement au modèle de cancer humain xénogreffé, permet de conserver une immunocompétence. L’intérêt est de pouvoir mettre en évidence l’implication du système immunitaire et de l’inflammation dans le développement des neuropathies chimio-induites en présence d’un cancer.

Bénéfices attendus

L’intérêt principal de ce modèle de neuropathie chimio-induite est la présence de la tumeur. Ce modèle fournira un outil pour la mise en place de nouvelles thérapeutiques neuroprotectrices dans un contexte de chimiothérapie néoadjuvante neurotoxique associé à une chirurgie. Les modèles murins actuels de neuropathie chimio-induite sont exempts de tumeur. Le modèle proposé permettra d’évaluer l’impact de la présence d'une tumeur sur l'évolution de la neuropathie chimio-induite. Ce modèle permettra également, dans des porjets futurs, de valider si nos molécules neuroprotectrices, interagissent avec l’activité anti-tumorale du paclitaxel dans un modèle intégré.

Procédures

Trente huit souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de cellules cancéreuses murines. Ving-trois souris recevront une injection sous-cutanée au niveau du flanc droit de 200 µL de sérum physiologique. Cette étape sera réalisée sous anesthésie légère à l'isoflurane pour l'ensemble des animaux. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisée à l'aide de la mesure au pied à coulisse de la tumeur 3 fois par semaine, sous anesthésie légère à l'isoflurane, seuls les animaux ayant reçu des cellules cancéreuses subiront cette intervention. Ving-neuf animaux recevront 4 injections intrapéritonéales de chimiothérapie (1 injection tous les deux jours pendant 7 jours), et les animaux contrôles recevront 4 injections intrapéritonéales de sérum physiologique selon le même shéma. L'ensemble des animaux (soit 61) subiront une chirurgie cutanée, avec résection de la tumeur sous-cutanée pour les animaux ayant une tumeur et ouverture des plans cutanés pour les animaux sans tumeur. Durant la procédure chirurgicale, les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane et recevront une injection sous cutanée de lidocaïne en pré-médication et une injection sous cutanée de buprénorphine en post-médication. L'ensemble des animaux sera soumis à deux test comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et l'autre la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 21 jours environ.

Impact sur les animaux

La neuropathie périphérique induite par le paclitaxel, un agent anticancéreux, se manifeste chez l'Homme par des troubles de la sensibilité, des douleurs neuropathiques ou des faiblesses. Notre équipe a développé et caractérisé chez la souris un modèle de neuropathie induite par le paclitaxel dans lequel nous observons l'apparition d'une hypersensibilité tactile et d’une hypersensibilité au froid en réponse à un stimulus. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluées). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ont un comportement similaire aux animaux contrôles et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. La croissance de la tumeur peut générer des nuisances telles que des dommages aux tissus environnants, induissant des douleurs et de l’inconfort, le développement potentiel de métastases. Les souris peuvent souffrir de faiblesse et de déficience physique en raison de la croissance tumorale et de la propagation de la maladie. Les points limites permettront de limiter au maximum ces nuisances.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées au paclitaxel et au développement de la tumeur seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle qui suit le protocole d'injection des agents anticancéreux le plus proche de celui utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet des molécules neuroprotectrices sur les neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par le paclitaxel (utilisé en chimiothérapie) ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse. De même, l’effet de nos molécules neuroprotectrices sur l’activité cytotoxique du paclitaxel a été évalué in vitro sur des lignées cancéreuses humaines.

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un test statistique spécifique qui estime un nombre total de 32 animaux (avec 9 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes (en estimant une prise de tumeur de 100 %). L'analyse statistique sera réalisée à l'aide d'un logiciel dédié. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus seront effectués sur chaque animal mort. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote (n = 3) pourront être utilisés pour l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre d’augmenter le nombre d'animaux de l'étude principale.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seuls des test d'évitements seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la molécule de chimiothérapie doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôles pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal. Les animaux seront anesthésiés légèrement pendant l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses et à chaque contrôle de la croissance tumorale au pied à coulisse. Pendant la chirurgie, les animaux seront profondément endormis par anesthésie gazeuse. Une anesthésie local sera réalisée au niveau du site de la tumeur avant résection. Un onguent ophtalmique sera appliqué durant l’anesthésie afin d’éviter un dessèchement oculaire. Une injection sous-cutanée d'analgésique sera réalisée avant le réveil, afin de diminuer les douleurs post-opératoires et faciliter la récupération. La température corporelle sera maintenue tout au long de la chirurgie à l’aide d’un tapis chauffant, puis à l’aide d’une lampe chauffante durant la phase de réveil.

Choix des espèces

Ces modèles murins de neuropathie induites ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Le choix de la lignée de cellule cancéreuse murine et de la souche de souris a été déterminé pour limiter les risques de réaction immunitaire et de rejet. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.

Pour comprendre le rôle de l'exportine 7, associée à la schizophrénie, dans la maturation des cellules du cerveau, 1 911 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements. Des femelles gestantes sont opérées pendant 45 minutes sous anesthésie générale pour une électroporation in utero, puis les souris transgéniques ou issues des embryons électroporés passent 6 h 40 de tests de comportement répartis sur un mois. L'anesthésie peut entraîner dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire, et la chirurgie un risque d'infection. Le porteur attend des effets sur la mémoire de travail, l'anxiété et la mémoire sociale, sans nommer les tests qui doivent les mesurer.

Objectifs

Des études récentes montrent que les mutations de certains gènes augmentent considérablement le risque de schizophrénie, une pathologie invalidante qui touche environ un pour cent de la population adulte et se caractérise notamment par des idées délirantes, un retrait social, des difficultés de concentration et de planification. L’ensemble de ces symptômes de la schizophrénie sont mal traités par les médicaments actuellement disponibles, et les effets secondaires de ces traitements sont importants. L’impératif de trouver des traitements efficaces implique de mieux comprendre les fondements neurobiologiques de la schizophrénie. Bien que rares, les mutations génétiques qui confèrent un risque fortement accru de développer la schizophrénie permettent d’identifier des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la pathologie.

Bénéfices attendus

La schizophrénie est une pathologie courante (500 000 à 600 000 patients en France) et très invalidante. Les traitements pharmacologiques de la schizophrénie traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Les grandes classes d’antipsychotiques et leurs modes d’action ont très peu évolué au cours des 50 dernières années. Le manque de progrès dans le développement thérapeutique est en grande partie une conséquence de notre compréhension limitée des troubles moléculaires sous-jacents. Très récemment, des mutations rares mais pénétrantes (qui augmentent très fortement le disque de la pathologie) dans certains gènes spécifiques ont été identifiées. Ces mutations sont très informatives car 1) elles ciblent un gène donné et 2) elles peuvent être modélisées chez l’animal. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en modifiant l’expression d’un gène impliqué dans la schizophrénie dans les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont pertinents pour comprendre les mécanismes de la schizophrénie, et possiblement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

1) Femelles gestantes : chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur). Injection d’un composé par voie intrapéritonéale (5 minutes) 2) Souris transgéniques ou issues d’embryons électroporés : Tests de comportement (6h40 en tout, répartis sur un mois). Une euthanasie sera réalisée selon une méthode réglementaire, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.

Impact sur les animaux

La perte d’expression du gène étudié par électroporation in utero sera localisée uniquement dans le cerveau au niveau du cortex frontal. De ce fait, les phénotypes comportementaux liés à la perte d’expression devraient affecter sélectivement des comportements dépendants du cortex frontal (mémoire de travail, anxiété, mémoire sociale). Dans le cadre de la chirurgie, des nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. La chirurgie peut induire un risque infectieux et de douleur associée à l’infection. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire. L’injection intrapéritonéale implique une contention et donc un stress momentané. Un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test des différents tests de comportements est attendu.

Devenir

Pour chaque procédure, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie psychiatrique, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, notre étude de l'impact de la diminution d’expression d’un gène associé à la schizophrénie sur le fonctionnement du cortex nécessite d'utiliser des animaux pour pouvoir tirer des conclusions comportementales. Pour ces raisons, seule l’utilisation d’animaux permet d’aborder les mécanismes de régulation des fonctions corticales dans le cadre de cette étude. Cependant, notre laboratoire, dans le cadre de projets portant sur le même thème (bases neurobiologiques de la schizophrénie) utilise aussi des modèles de cellules pour des caractérisations d’effets génétiques.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans une pathologie humaine. Ce choix est aussi dicté par la possibilité d’effectuer chez la souris des manipulations qui permettent de cibler une population neuronale générée à un point précis du développement prénatal. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal prénatal sont des embryons à un stade de développement embryonnaire qui permet d’étudier à la fois les conséquences de la modification d’expression du gène étudié sur la prolifération et sur la migration des neurones immatures. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal posnatal sont des souris juvéniles (15 à 25 jours) ou jeunes adultes (60 à 100 jours).

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie deux greffes sous-cutanées de cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas, foie ou poumon, dont la croissance est suivie trois fois par semaine avant la mise à mort et le prélèvement des tumeurs. Le porteur indique que la croissance des tumeurs sous la peau peut provoquer une douleur modérée. Le projet vise à constituer un panel de tumeurs de patients pour de futures greffes, un modèle dont il affirme qu'il ne peut être remplacé par des cellules en culture faute de reproduire la complexité de l'"organisme entier".

Objectifs

La compréhension de la biologie des tumeurs est au cœur de la recherche actuelle. Issue de cette explosion de données et de connaissances, une multitude de thérapies ciblées a pu voir le jour. Ces dernières ont pour la plupart été préalablement testées sur des modèles animaux et reposent sur leur efficacité contre le cancer dans des expériences de greffe chez la souris qui consiste à injecter dans des souris des cellules cancéreuses. La sélection de nouvelles molécules repose notamment sur leur efficacité anticancéreuse dans des modèles animaux greffés. Dans ces derniers, des cellules cancéreuses issues de patients sont injectées dans des souris afin d’y faire se développer une tumeur et d’évaluer l’activité de ces molécules. Cependant, l’efficacité anticancéreux de ces molécules sur de telles greffes et sur les tumeurs issues de patients est souvent faiblement corrélée. L’amélioration du pouvoir de prédiction de ces modèles animaux peut être obtenue grâce à des modèles de greffe dérivée de la tumeur du patient dans lesquels un fragment du cancer du patient est greffé dans les plus brefs délais chez des souris. De plus, lorsque la tumeur est implantée, ces tumeurs issues de patients permettent parfois de mimer l’apparition de métastases. Pour ces raisons, un effort est actuellement en cours afin de générer un panel représentatif de tumeurs de patients pour chaque sous-type de cancer et plus particulièrement en ce qui nous concerne, les cancers (côlon, pancréas, foie et poumon). Le but de cette étude est d’établir un panel de différentes tumeurs de patients issus des 4 organes déjà cités, tumeurs qui pourront ainsi être des modèles cellulaires cancéreux qui seront greffés dans les modèles animaux dans nos futures études.

Bénéfices attendus

Communément, lorsque l’on parle de greffes, on fait référence au modèle qui consiste à injecter dans des souris des cellules cancéreuses. Pour la plupart des types tumoraux, des cellules ont pu être établies et sont fréquemment utilisées pour greffer des souris. Les cellules cancéreuses sont couramment utilisées car elles sont faciles à amplifier. Elles sont souvent bien caractérisées et relativement stables au cours du temps. Cependant, elles présentent quelques désavantages : i) une erreur de sélection lors de leur établissement et de leur propagation en culture, ii) une perte de l’aspect tridimensionnel de la tumeur puisque la plupart de ces cellules cancéreuses croissent en deux dimensions formant un tapis cellulaire ; iii) une perte de communication entre les cellules de l’environnement de la tumeur (cellules sanguines et immunitaires) et les cellules de la tumeur. Afin de palier la majorité de ces inconvénients, un modèle amélioré de greffe est de plus en plus utilisé : il s’agit de la greffe dérivée de la tumeur du patient. Ce modèle résulte d’une implantation après dissociation d’un fragment tumoral du patient fraîchement prélevé, chez des souris. La greffe dérivée de la tumeur du patient va alors se stabiliser et conserver dans la plupart des cas les caractéristiques pathologiques de la tumeur humaine initiale. Néanmoins, au vu de leurs avantages, les greffes dérivées de tumeurs de patients ont vu leur développement s’accélérer depuis quelques années et offrent aujourd’hui une approche pertinente pour mieux comprendre le développement des cancers afin d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de côlon, pancréas, foie ou poumon sous anesthésie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie par mesure régulière à l'aide d'un pied à coulisse électronique. L’ensemble des souris sera alors évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs, mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, au cours du temps.

Impact sur les animaux

(1) Un stress physique serait une nuisance induite par l’anesthésie lors de la xénogreffe et (2) une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses, dissociation et mise en culture.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant de travailler à l'échelle d'un organisme vivant entier. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Dans le but de répondre à la règle des 3R, nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir un nombre de cellules tumorales pour en evisager leur culture in vitro après la mort de l'animal et la dissociation des tumeurs. Dans le but de réduire le nombre d'animaux par groupe, celui-ci sera de 2 souris chacune implantée de 2 tumeurs issues de patients sur chaque flanc (droit et gauche), c'est à dire 4 tumeurs implantées par prélèvement issu de patient, ceci dans le but d’obtenir suffisamment des cellules tumorales issues de patients à mettre en culture in vitro en fin d’expérience. Ce nombre de 2 souris par tumeur issues de patient est le nombre suffisant pour obtenir une quantité utile de cellules (2 à 5 millions) pour envisager leur culture in vitro. Ce résultat est le fruit de l'expérience de ce type de procédure qui a déjà été proposé dans de multiples demandes d'autorisation à expérimention animale précédentes.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi clinique (3 fois par semaine) seront réalisés dans le calme pour limiter au maximum le stress des animaux. L’administration d’analgésique sera réalisée si nécessaire (en cas de douleur). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie des cancers du côlon, du pancréas, du foie et du poumon induits dans cette espèce animale est proche de celle chez l’Homme. De plus, ce modèle apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade de développement tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles hébergés dans une même cage.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit de la vincristine, un anticancéreux qui provoque une hypersensibilité douloureuse au toucher, mesurée par l'application de filaments sous la patte à plusieurs reprises, avant que les animaux soient tués pour l'analyse des nerfs. Le porteur affirme que les souris ne présentent en dehors des tests aucun signe de souffrance ni de perte de poids, et teste un composé censé prévenir cette neuropathie. Les bénéfices avancés, un futur essai clinique chez des patients sous chimiothérapie, sont renvoyés au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hépatotoxicité. Dans le domaine de l’onco-hématologie, la vincristine, un agent anticancéreux commumément utilisée pour la prise en charge des lymphomes, constitue une des chimiothérapies les plus neurotoxiques et est responsable de la neuropathie induite par la vincristine, caractérisée notamment par l'apparition d'une hypersensibilité tactile douloureuse. Cette complication impacte autant la qualité de vie des patients que la bonne mise en œuvre des protocoles de chimiothérapie. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de telles stratégies neuroprotectrices constitue un enjeu de santé publique. Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Il a déjà été démontré que la modulation pharmacologique des récepteurs à l’angiotensine II, permettait d’exercer un effet neuroprotecteur dans plusieurs modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le système rénine-angiotensine, bien connu dans la régulation de la pression artérielle, est également exprimé au niveau du système nerveux périphérique. Certains éléments du système rénine angiotensine, peu étudiés, pourraient jouer un rôle important dans les phénomènes de neuroprotection/neurorégénération du nerf périphérique. L’activation d'un récepteur du systéme rénine-angiotensine présenterait des propriétés analgésique et neurorégénérative au niveau du système nerveux périphérique. Nous supposons que l'activation de ce récepteur par un traitement préventif pourrait également avoir des effets neuroprotecteurs en l’administrant avant la chimiothérapie. A court terme, nous nous attendons à ce que ce traitement préventif améliore la sensibilité tactile chez des animaux ayant reçu de la vincristine et présentant une hypersentibilité tactile, et restaure/prévienne également les altérations morphologiques des tissus du système nerveux sensitif induites par la chimiothérapie. A plus long terme, nous espérons réaliser la même étude sur nos modèles de neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine, deux autres agents anticancéreux neurotoxiques, avec un effet bénéfique attendu du traitement préventif sur les troubles sensitifs et les atteintes nerveuses induites par les chimiothérapies. La mise en évidence d’un effet neuroprotecteur du traitement préventif dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur le développement des neuropathies induites par la chimiothérapie.

Procédures

Chaque animal (soit 100 animaux) recevra une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 7 jours. Sur les 100, 35 animaux subiront une injection i.p. le matin du traitement préventif puis une injection i.p de vincristine l'après-midi. Sur ces 35 animaux, 10 recevront en plus une injection sous-cutanée d'un bloqueur une heure avant l'i.p. du traitement préventif. L'ensemble des animaux sera également soumis au test des filaments qui permet d'évaluer le dégré de sensibilité tactile, une fois avant le début des traitements puis à J1, J3 et J7. L'injection intrapéritonéale a été privilégiée par rapport à l'injection intra-veineuse. Les injections seront répétées tous les jours pendant 7 jours, ainsi la répétition des injections sera plus aisée en intrapéritonéal qu'en intraveineux. La pose d'un cathéter a été exclu afin de garantir une liberté de mouvement totale à l'animal nécessaire pour le test comportemental. L'injection du bloqueur, qui n'est pas un produit irritant, se fera en sous-cutanée, afin de ne pas dépasser le nombre de deux injections i.p. par jour.

Impact sur les animaux

Nous avons déjà dévellopé et caractérisé le modèle de neuropathie induite par la vincristine. Dans ce modèle, nous observons l’apparition d’une allodynie mécanique suite à l’administration de vincristine. Cette allodynie se traduit par une hypersensibilité en réponse à un stimulus focalisé qui est l’application d’un filament sur la voute plantaire. Les animaux ne présentent aucun trouble moteur (la coordination motrice et la force musculaire ont été évaluée). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine présentent un comportement tout à fait similaire aux animaux témoins. Ils ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids. Ainsi, nous nous attendons à ce que les animaux recevant de la vincristine et le traitement préventif présentent une amélioration de leur symptômes, à savoir un retour à la normale de la sensibilité tactile.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations morphologiques associées à la vincristine et aux traitements seront mises en évidence par l’analyse histologique et immunohistologique des tissus du système nerveux sensitif. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêts seront prélèvés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l'expérimentation animale disponible qui reproduit l'ensemble des mécanismes mis en jeu à la génération d'une douleur induite par des cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi un modèle dont la séquence d'injection des agents anti-cancéreux est la plus conforme aux protocoles de chimiothérapies neurotoxiques utilisés chez l'Homme. En parallèle de cette étude chez la souris, une étude in vitro évaluant l'effet de la vincristine et de sa combinaison avec le traitement préventif sur des neurones sensitifs humains dérivés est en cours. Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, ...) mis en jeu au niveau du neurone sensitif humain, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation inhérents aux neuropathies induites par la chimiothérapie, ainsi que toute la complexité des phénomènes aboutissant à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 10 animaux par groupe a été calculé à partir de résultats (moyenne et écart-type) obtenus au cours d'une étude sur le modèle de neuropathie induite par la vincristine. L'analyse statistique sera réalisée à l'aide de deux logiciels. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, le test de comportement puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur de cadavres.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement préventif sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide d'un test d'évaluation de la sensibilité tactile. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors cette étude pilote sera renouvelée avec des doses deux fois inférieures. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de cette étude pilote, et que le traitement préventif ne présente pas d’effet positif sur la neuropathie, alors la même étude sera réalisée sur deux nouveaux groupes de 5 souris. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement préventif présente un effet positif sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale, à la dose efficace. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul un test d'évitement sera utilisé pour l'évaluation de la sensibilité, et une valeur limite est établie pour chaque test à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés à la vincristine et/ou au traitement préventif doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôle pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses au test comportemental seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique. Ces conditions sont les mieux réunies avec des adultes jeunes (7-8 semaines, poids 25-30g).

390 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie une greffe sous-cutanée de tumeur pulmonaire humaine, puis des injections deux fois par semaine et un gavage quotidien pendant quatre semaines, avant d'être tuées à l'atteinte d'un point limite ou au bout de quatre-vingt-dix jours. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer une gêne et une perte de poids, et qualifie de "non toxiques" les composés administrés. Il décrit une étude exploratoire sans test statistique, dont les retombées pour les patients atteints de ce cancer rare restent renvoyées à l'avenir.

Objectifs

Nous travaillons sur les cancers du poumon avec une fusion NRG1. Cette fusion est un évènement très rare (moins de 1% des cancers du poumon non à petites cellules) et les patients ne répondent pas aux traitements ou sur une durée très limitée. Les modèles d’étude sont rares. Ce projet a deux objectifs : 1/ d’établir des modèles d'étude de cette pathologie dans la souris, à partir d'échantillons de patients. Ces modèles sont des modèles de choix pour évaluer l’efficacité d’une thérapie et ses effets néfastes à l’échelle de l’organisme ; 2/ d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique dans ces modèles. Ce projet pourrait permettre de proposer à l'avenir une meilleure prise en charge aux patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. En effet, il n’y a pas aujourd’hui de stratégies thérapeutiques pour les patients atteints de cancer du poumon avec une fusion NRG1. L’établissement de modèles dérivés de patients permettra de valider l’efficacité d'un nouveau traitement, seul ou en association avec un inhibiteur déjà utilisé en clinique, dans ce contexte dans des modèles robustes.

Procédures

Implantation de tumeurs en sous-cutané, chirurgie, degré de gravité modéré, durée du geste : 10 minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Injection intrapéritonéale (2 fois par semaine pendant 4 semaines), durée du geste : quelques secondes et gavage (une fois par jour, 5j/7, pendant 4 semaines), durée du geste : quelques secondes de composés thérapeutiques non toxiques - Pesée et mesure de tumeur : contention et geste de quelques minutes

Impact sur les animaux

Chirurgie pour implantation de tumeur en sous-cutané (degré de gravité modéré) - Développement tumoral : gêne si le volume tumoral atteint le point limite - Perte de poids possible - Pesées et suivi tumoral : stress lors de la contention et du geste (quelques minutes) - Gavage : irritation

Devenir

Tous les animaux ayant atteint un point limite, ou 90 jours après la greffe si aucun point limite n'est atteint, seront mis à mort. Les tumeurs seront collectées et analysées.

Remplacement

Les échantillons de patients sont précieux et la mise en culture in vitro difficile. La génération de modèles de cancers du poumon humain dans les souris permettra d'intégrer les cellules tumorales dans l'environnement d'un organisme entier et des interactions qui en découlent. De plus la sensisbilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Pour ces différentes raisons, nous devons effectuer cette étude sur la souris. Avant le passage dans les souris, l’efficacité du nouveau traitement a été validée in vitro.

Réduction

Cette étude est exploratoire et descriptive. Nous avons choisi des effectifs permettant une analyse 'pilote' pertinente et une reproductibilité des résultats tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux. Aucun test statistique ne sera effectué.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés et sensibilisés aux manipulateurs pendant 7 jours afin de limiter le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement, pesées chaque semaine et nous serons attentifs à leur état général (prostration de l’animal, poil hérissé, difficultés locomotrices) à chaque visite afin de détecter rapidement une souffrance ou l'atteinte d'un point limite. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux. Les conditions d'hébergement des animaux permettent d'éviter l'apparition de phénotype dommageable. Les animaux sont hébergés en groupe de 6 souris par cage pour répondre au besoin de socialisation et chaque cage présentera des enrichissements. La chirurgie sera réalisée après anesthésie des animaux.

Choix des espèces

Nous proposons d’établir des modèles dérivés de patients atteints de cancer du poumon et d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement. Une souche murine fortement immunodéprimée est nécessaire pour éviter le rejet des tissus implantés et favoriser la prise de greffe d'origine humaine. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux, il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. L'efficacité du traitement a été évalué in vitro. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.