Rongeurs

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero sous anesthésie, une chirurgie de trente minutes, pour introduire deux mutations d'un gène du développement cérébral reproduisant des traits proches de l'autisme. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter stress, douleur post-opératoire, bagarres entre mâles et retards de croissance, et précise que les organismes génétiquement modifiés ne peuvent être ni replacés ni relâchés. Les reproducteurs âgés comme les souriceaux sont tués pour prélèvement de tissus, les bénéfices restant une meilleure compréhension du neurodéveloppement "à terme".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.

Remplacement

Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.

123 cobayes vont être utilisés, avec au programme une anesthésie générale par semaine pendant onze semaines pour examiner leur tympan, en plus de celles de la perforation du tympan, faite par une chirurgie sans incision, des trois mesures de l'audition, des prélèvements du microbiote de l'oreille et de l'administration des traitements. Tous sont mis à mort à l'issue pour des analyses histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La perforation peut causer une douleur faible à modérée traitée par antalgiques, une perte auditive légère et, dans des cas exceptionnels, une infection avec écoulement purulent, et l'équipe cherche à obtenir une perforation qui dure plus de huit semaines, un état que le porteur dit "difficile à obtenir". Pour les enfants atteints d'otite moyenne chronique, le bénéfice reste à venir : le porteur écrit qu'en cas de succès, le projet "serait poursuivi par des études cliniques".

Objectifs

L'otite moyenne chronique est la maladie infantile la plus fréquente dans le monde. Elle se caractérise par des écoulements auriculaires dus à une perforation persistante du tympan. Cette membrane sépare l'oreille moyenne de l'oreille externe. Sa fonction principale est la transmission des sons. L'otite moyenne chronique est une cause fréquente de perte auditive, voire de décès dûs à des complications intracrâniennes, notamment dans les pays en développement. L'administration d'antibiotiques à large spectre induit des effets secondaires et est en partie responsable de l'augmentation de la résistance aux antibiotiques. Si la perforation ne se répare pas d'elle-même, une intervention chirurgicale (sous anesthésie générale) est nécessaire mais son accès peut être compliqué dans les pays en développement qui ne sont pas bien équipés (par exemple, absence de loupe binoculaire pour la chirurgie). Ce projet propose une nouvelle approche de soins combinant une procédure simple de réparation du tympan et une alternative aux antibiotiques. Des biomatériaux actifs de type gel ou patch avec des propriétés mucoadhésives et cicatrisantes faciles à administrer et contenant des probiotiques seront introduits dans l’oreille pour fermer la perforation du tympan et ainsi faciliter sa cicatrisation tout en restaurant le microbiote local. Nous faisons l'hypothèse qu'une telle stratégie sans chirurgie associée à des probiotiques pourrait être une approche pertinente pour traiter l’otite moyenne chronique chez l'enfant et prévenir les récidives d'otites. Cette étude a pour objectif de tester différentes stratégies de réparation tympanique (gel ou patch ou patch+gel, avec ou sans probiotiques) sur un modèle animal afin de trouver la solution la plus adaptée et efficace possible.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels de l’otite moyenne chronique chez l'enfant sont confrontés à plusieurs limitations : résistance croissante aux antibiotiques, accès à des chirurgiens et des centres médicaux experts, procédures coûteuses et longues, risque de complications anesthésiques, inégalité d'accès aux traitements dans les friches médicales et les pays en développement. Compte tenu de la forte prévalence de cette pathologie chez les enfants et de son impact négatif sur la qualité de vie et le développement de ces jeunes patients, il est crucial d'ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques. Ce projet vise à développer un dispositif biomédical pour régénérer le tympan perforé en utilisant des gels et des patchs aux propriétés mucoadhésives et cicatrisantes associés à des probiotiques. Ce projet est particulièrement novateur car il va au-delà de l'état actuel de l'art. À notre connaissance, il n'existe pas de système permettant simultanément l'administration de probiotiques dans l'oreille moyenne et la réparation du tympan. En cas de succès, ce projet serait poursuivi par des études cliniques en collaboration avec des hôpitaux pédiatriques. L'approche probiotique locale pourrait également être proposée en cas de perforation recente dans les pays en développement.

Procédures

Les cobayes seront soumis à différents gestes techniques : une chirurgie sans incision sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes; une mesure de l’audition sous anesthésie générale d’une durée de 10 minutes, répétées 3 fois sur 11 semaines (procédure non douloureuse); des prélèvements du microbiote du conduit auditif et de l’oreille moyenne sous anesthésie générale, répétés deux à trois fois, d’une durée de quelques secondes (procédure non douloureuse); une administration des traitements sous anesthésie générale, par voie locale, d’une durée de 5 minutes; un examen otoscopique du tympan une fois par semaine sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes pendant 11 semaines (procédure non douloureuse).

Impact sur les animaux

Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. La perforation du tympan peut entrainer une douleur faible à modérée qui sera traitée par des antalgiques. Elle peut aussi induire une perte auditive légère. Dans des cas exceptionnels, un écoulement purulent de l’oreille qui marque une infection peut apparaitre.

Devenir

Tous les cobayes seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. Des analyses histologiques sur les organes d’intérêt seront réalisées.

Remplacement

L’oreille est un organe complexe et il n'existe pas, à ce jour, de modèle cellulaire permettant de reproduire le tympan qui est une membrane séparant deux compartiments aériens. Le seul moyen permettant d’étudier des traitements pour soigner l’otite moyenne chronique impliquant la cicatrisation du tympan perforé reste l’utilisation d’un modèle animal vivant. Le maintien d’une bonne audition est aussi un paramètre primordial et seul l’animal nous permet de mesurer et d’évaluer la fonction auditive. Ainsi, le recours à l’animal est incontournable pour évaluer des traitements innovants sur la capacité régénérative du tympan et la fonction auditive.

Réduction

Dans chaque groupe, le nombre d’animaux a été fixé afin de s’affranchir des variations individuelles et garantir la validité statistique de l’étude. La mise au point (procédure 1) permettra de valider le modèle de perforation chronique de la membrane tympanique et nécessitera au maximum 25 animaux. Le tympan est une membrane avec des fortes capacités de régénération et un modèle chronique de perforation (> 8 semaines) est difficile à obtenir. Dans la littérature, le pourcentage de succès varie de 0 à 84% selon les études Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui a permis de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Une étude pilote avec un nombre limité d’animaux permettra la mise au point du modèle avant de tester les différents traitements. Un plan d’expérience rigoureux a été pensé afin d’optimiser les groupes expérimentaux et réduire le nombre d’animaux. Si les traitements ne présentaient pas l’efficacité escomptée, la procédure serait arrêtée.

Raffinement

La semaine précédant l’expérimentation, les cobayes seront manipulés afin de les habituer au contact de l’expérimentateur et ainsi minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. Chaque geste chirurgical sera court et réalisé sous anesthésie générale par un chirurgien ORL expert. D’après notre expérience, l'altération potentielle de la fonction auditive n'entraine pas de trouble du comportement ni d'agressivité chez le cobaye. Les points limites seront déterminés, à partir d’une grille d’évaluation de l’état général de l’animal, pour détecter une éventuelle souffrance, détresse ou inconfort et seront strictement appliqués. Des mesures de gestion de la douleur seront mises en place en fonction du score avec un protocole antalgique adapté. Les cobayes seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi afin de favoriser des comportements naturels.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est le cobaye. C’est une espèce très utilisée dans la littérature en recherche ORL. L’anatomie du tympan est similaire à celle de l’homme et la surface du tympan est adaptée à la réalisation des gestes techniques. Son conduit auditif court permet un accès facile et une bonne visualisation du tympan. Des cobayes adultes, avec un poids entre 300 et 350 grammes seront utilisés. La taille du tympan chez le cobaye adulte est plus adaptée pour ce travail.

8 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de la tumeur, du foie, de l'intestin, des ganglions et de la rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les procédures, elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à huit administrations orales de bactéries et quatre d'acides biliaires, une injection d'un traceur dans un ganglion et une prise de sang finale. L'équipe veut savoir si des acides biliaires déjà présents dans la pharmacopée humaine pourraient restaurer l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses chez les patients traités par antibiotiques, un bénéfice que le porteur formule au conditionnel. Il dit avoir défini un "nombre maximal théorique d'animaux par groupe", sans en donner la valeur ni le nombre de groupes qui mène à 8 256 souris.

Objectifs

Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant une dysbiose intestinale. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise d'antibiotiques ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit à une accumulation de cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Nous nous intéressons aux acides biliaires car nos travaux ont montré que la dysbiose induite par antibiotiques est responsable d’un déséquilibre de la composition en acides biliaires au niveau du foie et de l’intestin. De plus, il a été décrit le lien indissociable entre la composition du microbiote intestinal et la production des acides biliaires par le foie (et inversement). Nous avons été en mesure de montrer in vitro sur des lignées de cellules endothéliales (murines) que certains acides biliaires sont associés à la disparition de l’expression de la protéine d'intérêt alors que d’autres ont la capacité d’en augmenter son expression. Nous estimons que l’apport de certains acides biliaires par voie orale est susceptible de normaliser la composition d’un microbiote intestinal. Ainsi, dans ce contexte, les acides biliaires sont enclins à normaliser l’expression de notre protéine d’intérêt, dans l’intestin, et donc à diminuer la recirculation de cellules néfastes depuis l’intestin vers la tumeur.

Bénéfices attendus

Au final, cela permettrait de restaurer l’efficacité des immunothérapies malgré la prise d’antibiotiques et la dysbiose intestinale. Nous souhaitons comprendre quels types d’acides biliaires seraient bénéfiques et si certains pourraient être délétères (comme constaté in vitro). Cela a une importance pour la prise en charge des patients. Pour cela, nous envisageons d’administrer différents acides biliaires par voie orale.Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunosuppressives intestinales vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose intestinale et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, certains acides biliaires, déjà disponibles dans la pharmacopée humaine semblent être de bonnes cibles d’étude pour atteindre cet objectif.

Procédures

Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute), d’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’acides biliaires (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 5 min).

Impact sur les animaux

Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acides biliaires (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. Si certaines hypothèses ne se vérifient pas, le nombre d'animaux sera diminué. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi clinique. Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, les cancers cibles touchant l'adulte.

196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules humaines de glioblastome dans le cerveau par chirurgie, puis passent trois séances d'imagerie sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses post-mortem. Le porteur indique que l'injection peut provoquer une neuroinflammation, un état fébrile, une perte d'appétit et une léthargie pendant une douzaine d'heures. Les bénéfices avancés, un biomarqueur d'imagerie utile pour évaluer de futures thérapies contre un cancer de mauvais pronostic, sont renvoyés au conditionnel.

Objectifs

Les cancers du cerveau sont encore aujourd’hui de mauvais pronostic, et notamment le plus agressive le glioblastome qui est aussi le plus fréquente. Ces cancers sont classés et identifiés grâce à des analyses réalisées directement sur le tissu malade à partir de biopsies cérébrales. L’un des critères majeurs est la présence d’une mutation spécifique sur le gène appelée IDHmut. Cette mutation apporte des éléments pronostics important pour les patients puisque les tumeurs cérébrales IDHmut ont un meilleur taux de survie que les IDH non mutés. La greffe de cellules humaines de glioblastome est un modèle animal de cancer du cerveau largement utilisé depuis plusieurs décennies pour disséquer les mécanismes de croissance du cancer. Ce modèle permet aussi de tester d’évaluer de nouvelles thérapies. Des lignées cellulaires portant la mutation IDHmut seront greffées sur des souris afin de créer un modèle se rapprochant des caractéristiques des cancers humains. Ce projet permettra de caractériser les différences entre les souris portant la mutation et des souris témoins et fournira de nouvelles méthodes d’imagerie in vivo. Ces nouvelles méthodes en imagerie médicale sur les souris seront utilisées pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les glioblastomes (GBM) sont les plus fréquents et les plus grave des gliomes diffus de l’adulte, avec une médiane de survie globale qui ne dépasse pas 15 mois. Ce projet permettrait de caractériser un nouveau biomarqueur d’imagerie (mesuré en spectroscopie par résonance magnétique) dans un modèle bien connu de GBM chez la souris. Ce biomarqueur sera ensuite associé à d’autres marqueurs fonctionnels (grâce aux ultra-sons ou aux biomarqueurs d’imagerie pat tomographie d'emission de positrons) qui pourront servir pour évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, la possibilité d’obtenir ces biomarqueurs sur des modèles précliniques sera une aide précieuse pour une évaluation précoce de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule chirurgie d'une durée de 30 minutes. Par la suite les animaux auront 3 examens d'imagerie non invasive de 1 heure maximum chacun pendant lesquels les animaux seront anesthésiés et endormis.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur ces animaux sont l’inflammation locale et en particulier le déclenchement de médiateurs de l’inflammation dans le cerveau. Cette neuroinflammation modérée et locale peut provoquer un état fébrile temporaire dans les heures suivant l’injection, se traduisant par une perte d’appétit et une léthargie. Cette nuisance exclusivement liée à l’injection stéréotaxique ne sera pas répétée et ne durera pas plus de 12 heures.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure afin de permettre des analyses post-mortem in vitro. En effet, les données d’imagerie in vivo doivent être complétées par les analyses in vitro qui permettent d’apporter des mesures plus variées et précises sur les problématiques métaboliques et vasculaires.

Remplacement

Le projet a été construit après un passage en revue de la littérature actuelle et une comparaison détaillée des données expérimentales mises à notre disposition. Le projet contient des protocoles d’imagerie in vivo (TEP, IRM, ultrasons) permettant d’étudier le métabolisme tumoral au sein de son microenvironnement, ce qui implique l’utilisation d’animaux vivants. Les équipements d’imagerie (microTEP, microIRM et sonde ultrasonore) sont adaptés à la souris. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour assurer le caractère translationnel des résultats. En effet, les lignées utilisées sont d’origine humaine et les mesures en imagerie in vivo sont similaires à celle obtenues chez les patients. Ainsi, notre projet permet l’étude comparée des phénomènes physiopathologiques étudiés, et constitue un élément essentiel pour la recherche future de biomarqueurs et de thérapies utilisables chez l’humain.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux est réalisée grâce au suivi longitudinal, en imagerie non invasive IRM, de la taille de la tumeur. Ce type de suivi augmente la puissance statistique et les tests statistiques permettent de réduire de 51 à 34 le nombre souris. Ce projet permettra de contrôler le bien-être des souris en rapport avec le volume de la tumeur cérébrale. Cette étude pilote guidera les étapes suivantes qui seront adaptées en fonction des résultats observés. L’ensemble du projet nécessite 196 souris. Les expérimentations se dérouleront en blocs expérimentaux : l’ensemble de l’étude étant constitué de 2 groupes (un groupe contrôle et un groupe test), chaque groupe sera divisé en blocs (de 5 à 7 souris s) ce qui permettra d’analyser par des tests statistiques les résultats après les données obtenues sur chaque bloc. Si les analyses montrent des données significatives, les blocs suivants ne seront pas utilisés, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille d’évaluation neurologique et des points limites adaptés. La mutation portant sur le gène IDH n’apportera pas de changement majeur par rapport à la lignée sauvage, dite wild-type "wt", (si ce n’est une vitesse de croissance diminuée), les points limites seront les mêmes pour tous les animaux. Il a été démontré que la lignée utilisée dans ce protocole ne provoque pas de déficits moteurs chez les souris avant le jour 27 après injection intracérébrale en comparaison des souris contrôles. Les actes chirurgicaux (injection stéréotaxique) seront réalisés sous anesthésie générale avec analgésie adaptée (buprénorphine), thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. La douleur sera réduite au maximum par l’administration répétées d’analgésiques en cas d’apparition de signes de souffrances. En cas de signes de détresse, la procédure sera interrompue et si nécessaire, l’euthanasie sera effectuée. Les séances d’imagerie avec ultra-sons seront réalisées avec une sonde de taille adapté aux crânes des souris.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est optimale car l’organisation neurochimique du cerveau de la souris est proche de celle de l’humain. Ce modèle est aussi pertinent car le model de greffe de glioblastome humain chez la souris est très bien décrit. Enfin, l’imagerie par ultrasons fonctionnels peut être réalisée chez la souris à travers le crâne directement car les os du crâne sont suffisamment fins pour ne pas provoquer d’atténuation du signal. De la même façon que l’échographie, le signal ultrasonore est atténué grandement par les os. Souris adultes de 2 mois afin de modéliser les gliomes diffus de l’adulte.

30 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une puce sous-cutanée, un gavage de microbiote humain et une injection d'azoxyméthane, un composé cancérigène destiné à déclencher des lésions précoces du côlon, puis subissent trois prélèvements de fèces avant d'être tués pour analyse. Le porteur décrit ces gestes comme générant un stress et une douleur "minimes" et affirme que l'injection du cancérigène n'engendrera pas de douleur. Les retombées annoncées, une piste nutritionnelle contre le cancer colorectal moins coûteuse que le médicament, restent formulées comme une possibilité.

Objectifs

Le risque de cancer colorectal (CCR) est fortement affecté par l’alimentation, avec un risque augmenté par la consommation de viande rouge et un risque réduit par un régime pesco-végétarien (sans viande mais avec des oeufs et des produits laitiers en plus des végétaux, auquel on ajoute des produits de la mer comme les poissons, les crustacés et les mollusques). Le projet porte sur l’étude de la contribution du microbiote intestinal dans ces effets de l’alimentation sur le risque de CCR.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de contribuer à documenter (i) le rôle du microbiote intestinal en lien avec le régime alimentaire dans le développement du cancer colorectal, (ii) la possibilité d’intervenir à l’échelle du régime alimentaire pour favoriser un microbiote limitant le risque de cancer colorectal. Ces bénéfices ont donc un intérêt dans le domaine de la santé humaine, mais aussi dans le domaine de l’économie de la santé, dans la mesure où des interventions nutritionnelles visant à préserver ou restaurer l’équilibre du microbiote intestinal sont moins coûteuses que le développement de médicaments.

Procédures

- 1 implantation sous-cutanée d’une puce électronique destinée à identifier les rats de manière unique et pérenne (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes. - 1 gavage unique de microbiote humain dilué (1 ml) (rats vigiles, tous les rats), durée : 10 secondes - 1 injection intra péritonéale unique d’un composé cancérigène (rats vigiles, tous les rats), durée : 5 secondes - 3 prélèvements de fèces (2 semaines après l’inoculation, à 7 semaines, et à 14 semaines après l’inoculation). Pour cela, chaque rat est placé quelques minutes dans un grand pot en plastique transparent ; les rats émettent spontanément et rapidement les 1-2 crottes nécessaires (rats vigiles, tous les rats)

Impact sur les animaux

Le projet porte sur les liens entre alimentation, microbiote intestinal et cancer colorectal. Il est donc attendu que les rats présentent, suite à l’injection d’azoxyméthane, une augmentation des marqueurs de cancérogenèse au niveau du côlon. Toutefois, il s’agit d’une procédure établie pour étudier les stades précoces de la cancérogenèse (foyer de cryptes aberrantes, lésions prénéoplasiques…) qui n’engendreront pas de douleur. Les interventions sur les animaux seront d’une part l’inoculation des microbiotes par gavage et d’autre part l’injection intra-péritonéale d’une solution tamponnée d’azoxyméthane. Ces gestes sont assurés par des personnels expérimentés et généreront un stress et une douleur minimes. LLes prélèvements fécaux n’occasionneront que peu de stress ou douleur aux animaux puisqu’il s’agit de selles spontanément émises.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure pour étudier différents paramètres biologiques associés au développement du cancer colorectal.

Remplacement

A l’heure actuelle, étudier l’effet du microbiote et de l’alimentation sur le cancer colorectal nécessite de recourir à l’animal car il n’existe pas d’alternative technique suffisamment sophistiquée pour le remplacer.

Réduction

Nous utiliserons 10 rats par groupe. Notre expérience, et celle d’autres groupes de recherche, dans l’étude de l’effet du régime alimentaire et/ou du microbiote intestinal sur la cancérogenèse colique, indique qu’un effectif de 10 rats par groupe est nécessaire pour mettre en évidence des effets statistiquement significatifs. En particulier, les résultats obtenus lors d’un protocole similaire (mais avec transfert de microbiotes de rats) ont montré que ce nombre d’animaux permettait de mettre en évidence des effets du microbiote sur certains marqueurs de la cancérogenèse.

Raffinement

La solution du composé cancérigène est préparée de façon à ce qu’elle évite une douleur au point d’injection. Il n’y aura pas d’autres manipulations provoquant de la douleur pendant cette procédure, et l’étude est arrêtée au stade de lésions précancéreuses qui ne provoquent pas de douleur. Tous les rats auront dans chaque cage un enrichissement de milieu par l'ajout de feuilles de cellulose (pour faire le nid), d'un bâton de bois à ronger et des cylindres en plastique où se cacher et sur lesquels grimper. Les rats seront 2 par cage pour éviter l'isolement et auront libre accès à la nourriture et à l'eau. Tous les rats recevront de l'eau stérilisée à l'autoclave et un régime alimentaire standard irradié.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études épidémiologiques mais aussi des approches expérimentales in vivo qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus utilisé est l’injection unique d’un composé cancérigène qui a l’avantage de provoquer des stades précoces du cancer colorectal comparable à la situation humaine. Nous utiliserons des rats adultes, âgés de 5 semaines au début de l’expérimentation, l’objectif étant d’étudier la relation alimentation-microbiote-cancer colorectal chez l’adulte.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'une protéine dans une maladie rénale inflammatoire. Une glomérulonéphrite est induite par injection d'un sérum, avec collecte d'urine par pression sur la vessie et prises de sang, une partie des souris étant irradiée pour détruire leur moelle osseuse ou opérée du rein pour y injecter des particules virales. Le porteur décrit une présence de protéines dans les urines et un gonflement du ventre, et fixe une durée limitant l'aggravation de la maladie, avant mise à mort pour analyser les reins. Il affirme que la fonction rénale et la circulation sanguine ne peuvent se reproduire in vitro.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de determiner si notre protéine d'intêret, un inhibiteur d'enzymes vasculaire, joue un rôle dans le développement d'une maladie rénale, la glomérulonéphrite. Notre hypothèse est que cette protéine pourrait être protectrice et limiter l'insuffisance rénale liée à cette maladie. De plus nous voulons déterminer quelles cellules de l'organisme produisant cette protéine sont importantes pour la régulation de la glomérulonéphrite. Nous souhaitons également tester la possibilité de bloquer le développement de la glomérulonéphrite en modulant l'expression de cet inhibiteur.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de determiner si notre protéine d'interêt, qui bloque l'activité d'enzymes dans les vaisseaux, régule le développement de la glomérulonéphrite et pourrait représenter une nouvelle cible pour les maladies rénales. Les bénéfices attendus du projet sont de mieux comprendre son rôle dans le développement de maladies inflammatoires rénales chez l'homme et son mécanisme d'action, pour pouvoir cibler cette protéine au cours de la maladie afin d'améliorer la santé des patients.

Procédures

La glomerulonephrite sera induite par injection intraveineuse d'un serum (2 injections de 1min, 1 par jour pendant 2 jours) sous anesthésie et nous suivrons le développement de la maladie pendant 14 jours. Pour cela, de l'urine, émise spontanément par la souris pendant quelques secondes en pressant la vessie, sera collectée tous les 3 jours et un prélèvement sanguin durant quelques minutes sera effectué après 7 jours. Un groupe de souris sera auparavant exposé à des rayons X afin d'éliminer les cellules de la moelle osseuse qui sont remplacées le lendemain par injection intraveineuse de cellules de la moelle d'autres souris qui n'ont pas notre protéine d'interêt. Un autre groupe de souris sera auparavant injecté soit par voie intraveineuse, soit directement dans le rein par une procédure chirurgicale avec des particules virales qui permettent de modifier la production de notre protéine d'intêret. A la fin des procédures,un prélèvement de sang sera fait après anesthésie et analgésie par voie chirurgicale et les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Le protocole expérimental a un effet modéré sur le bien être de l'animal. La maladie rénale est associée à la présence de protéines dans les urines et à un gonflement du ventre (oedème rénal). La durée du protocole est établie pour éviter un développement trop important de la maladie et donc éviter au maximum la souffrance des animaux. Ils sont cependant anesthésiés plusieurs fois pour réaliser des injections et prélèvements sanguins et certains auront une petite chirurgie qui peut engendrer un inconfort et une douleur modérée.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir analyser les reins.

Remplacement

L'étude des cellules, celle de la fonction de l'inibiteur vasculaire étudié et l'étude des fonctions rénales nécessitent la présence des conditions caractéristiques de la circulation sanguine que l'on ne peut retrouver que dans un être vivant. Ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature scientifique. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés. Nous prévoyons de faire les expérimentations en deux fois sur deux groupes de souris. Si le premier groupe montrait l'absence flagrante d'effet de notre protéine d'interêt ou de l'injection des particules virales, nous ne ferons pas de deuxième groupe.

Raffinement

La prise en charge d’une éventuelle douleur s’effectuera par une surveillance quotidienne (visuelle) et un suivi tous les 3 jours avec la mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille de score. Si une douleur est avérée, un analgésique sera donné 2 fois par jour. Si les signes de douleurs persistent, les animaux seront euthanasiés. Les prélèvements sanguins et la chirurigie seront effectuées sous anesthésie et analgésie. Un antibiotique est donné après l'exposition aux rayons X pour éviter toute infection.

Choix des espèces

La souris présente un système vasculaire, immunologique et cellulaire très proche de l’Homme, permettant une transition vers la pathologie humaine plus facile. De plus, le modèle de glomerulonephrite est bien établi chez la souris adulte. Les souris de 10-12 semaines sont donc les plus adaptées pour étudier notre protéine d'interêt, avec de surcroit la disponibilité des lignées avec des déficits spécifiques de cette protéine. Les souris ont à ce stade atteint une maturité sexuelle mais restent assez jeunes pour analyser comme il se doit les processus pathologiques qui peuvent être favorisés par l'age.