Rongeurs

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie crânienne stéréotaxique d'environ deux heures et demie sous anesthésie pour l'implantation d'électrodes dans une région du cerveau, puis vit isolée en cage individuelle jusqu'à la fin du protocole. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner une angoisse ou une prostration et qu'une infection reste possible, et que les souris sont tuées pour prélever le cerveau à des fins de contrôle histologique. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'existe pour étudier le sommeil et que les cataplexies nécessitent "l'animal entier vivant".

Objectifs

La narcolepsie de type 1, avec cataplexie, est une maladie neurologique rare qui se caractérise par une hypersomnolence pendant la journée et une intrusion de composantes du sommeil paradoxal pendant l’éveil. L’un des symptômes majeurs est la cataplexie. Les épisodes de cataplexie sont des pertes de tonus musculaire induites pendant l’éveil, lors d’un contexte émotionnel positif, provoquant souvent la chute de la personne. Les chutes peuvent être brutales et conduire à des blessures. Le circuit neuronal exécutif des cataplexies est encore très mal connu. Des données récentes suggèrent que le pons dorsal pourrait jouer un rôle clef. Nous testons ici l'hypothèse qu'au sein des noyaux du pont dorsal, il existe une sous-population neuronale encore non identifiée responsable du déclenchement de la cataplexie. L’objectif de notre projet de recherche est donc d’identifier les neurones du pons dorsal dont le mode de décharge électrique est modulé au cours des cataplexies. Pour cela nous utiliserons une approche d’enregistrements électrophysiologiques multi-unitaires couplée à l’enregistrement polysomnographique du sommeil.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, la prise en charge des cataplexies est uniquement symptomatique, du fait du manque de connaissance scientifique des circuits neuronaux exécutifs. L’identification précise de ce circuit permettra le développement de traitements ciblés.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une seule intervention chirurgicale stéréotaxique implantatoire, sous anesthésie générale, d’une durée approximative de 2h30. Brièvement, un dispositif d’enregistrement de l’activité cérébrale sera positionné sur la tête de l’animal. Trois électrodes seront placées sur le crâne pour enregistrer l’activité corticale. Une électrode profonde, fixée sur un petit vernier (nanodrive) et inclus dans le dispositif sur la tête de l’animal, sera positionnée dans la structure cérébrale cible (le pons). Cette électrode permettra d’enregistrer les neurones présents dans cette structure et pourra être déplacée de quelques microns grâce au nanodrive, sans aucune conséquence pour l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances expérimentales seront: - une chirurgie crânienne sous anesthésie générale. - une mise en cage individuelle après la chirurgie et jusqu'à la fin de la procédure. Les nuisances attendues sur les souris seront : - un isolement du fait de la présence de leur implant. - une maladie par infection n'est pas à exclure, bien que ce genre de cas ait été observé que très rarement (par expérience, moins d'une souris sur 100).

Devenir

Les souris seront mises à mort pour prélèver le cerveau à des fins de contrôles histologiques, étape indispensable pour la validation des résultats obtenus.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro d’études du sommeil. Le sommeil et les cataplexies sont des phénotypes complexes nécessitant l’animal entier vivant.

Réduction

Les données qui seront acquises étant originales, nous ne pouvons pas nous appuyer sur des études antérieures pour calculer la taille du lot nécessaire pour l’obtention d’une puissance statistique suffisante. La taille du lot de souris est donc définie de façon empiriquement sur la base de nos expériences physiologiques antérieures en tenant compte du nombre de cataplexies par session d’enregistrement, du nombre de neurones enregistrés par session, de la finalisation de la mise au point de la chirurgie (encombrement des électrodes sur la tête etc..), et des échecs éventuels. Les données expérimentales générées seront traitées à l’aide des tests d’analyses adoc.

Raffinement

Pour favoriser les interactions sociales, les souris sont hébergées par lot de 2-5 par cage. Des enrichissements systématiques sont mis en place pour favoriser le bien-être de l’animal. Après chirurgie sous anesthésie générale et pour toute la durée de la procédure, les animaux sont placés dans des cages individuelles et suivis régulièrement avec une attention quotidienne lors de la phase postopératoire et l’optimisation de la récupération. Notre préoccupation sera ensuite d’évaluer quotidiennement grâce à une fiche de scorage, l’évolution des paramètres physiologiques qui nous permettra de détecter toute dégradation de l’état de santé général. Celle-ci définie également le point limite des expérimentations avec mise à mort des animaux pour prévenir l’apparition d’une quelconque souffrance. Pour minimiser le stress dû au placement en cages individuelles, et éviter que les souris expérimentées soient en isolement social total, trois souris non-expérimentées seront systématiquement placées dans la pièce d’enregistrement. Les souris non-expérimentées issues d’une même cage seront placées ensemble dans un baril transparent, à côté du baril logeant la souris expérimentée. L’objectif est de préserver les interactions visuelles, auditives et olfactives.

Choix des espèces

La souris orexin-knock-out est un modèle animal reconnu de la pathologie étudiée. Elle exprime l’ensemble des symptômes observés chez l’homme, y compris les cataplexies. L’autre modèle animal reconnu actuellement existant est le chien narcoleptique mais nous ne sommes pas en mesure d’étudier cet animal. Il s’agira de souris adultes (10-16 semaines au début de la procédure) ayant atteint leur maturité cérébrale, possédant déjà un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris dans ce domaine des neurosciences.

351 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une tumeur mammaire greffée sous la peau et reçoivent des injections intraveineuses répétées, réalisées sur animal vigile maintenu en contention, ainsi que des prélèvements sanguins. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une gêne et une douleur légère à la marche et que la contention vigile génère un stress modéré. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant" et justifie ainsi le recours à la souris pour tester des immunoconjugués ciblant HER2, dont l'intérêt pour les patientes reste renvoyé à une validation préclinique.

Objectifs

Le cancer du sein (CS) est désormais le cancer le plus fréquent chez les femmes européennes. Parmi tous les différents CS, 1 patiente sur 5 est affectée par un CS qui surexprime le récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2). Si ces cancers ont longtemps été de mauvais pronostic, la survie globale s'est nettement améliorée grâce à l’avènement des thérapies ciblées anti-HER2. Cependant, il existe des problèmes de résistance à ces traitements, notamment au stade métastatique, nécessitant le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans la perspective de développer de nouveaux traitements, de nombreuses molécules prometteuses étudiées en phase clinique ont dû être arrêtées en raison d’une toxicité élevée, générée en partie par l’utilisation de molécules actives extrêmement cytotoxiques. Ces observations ont ouvert la voie à l’utilisation de plus petites molécules moins toxiques et plus sûres pour le patient. Dans ce contexte, nous avons développé et breveté deux nouvelles méthodes de synthèse de petites molécules stables présentant des propriétés thérapeutiques optimisées et ciblant HER2. Après avoir validé in vitro leur efficacité accrue sur différentes lignées cellulaires de cancers du sein le projet proposé vise à évaluer leur efficacité in vivo (biodistribution et activité anti-tumorale).

Bénéfices attendus

La validation préclinique des immunoconjugués novateurs développés pourrait rapidement aboutir au développement de thérapies ciblées permettant de traiter des cancers agressifs et métastatiques.

Procédures

Injection sous cutanée (anesthésie gazeuse-1 fois) + Injection intra veineuse (Contention - vigile -1 fois) J+28 n=261 Injection sous cutanée (anesthésie gazeuse-1 fois) + Injections intra veineuses (Contention - vigile - 5 fois maximum avec minimum 48h entre 2 injections et alternance des veines caudales) J+28 n=60 Injection intra veineuse (Contention - vigile -1 fois) + prélèvement sanguin (Contention - vigile - 1 fois / jours pendant 3 jours avec alternance des veines caudales) n=30

Impact sur les animaux

La mise en place du modèle (tumeur sous cutanée) peut entrainer une gêne voir une douleur légère en terme de déplacement de l'animal et de ressenti cutanée. Les injections IV se faisant sur animale vigil dans un appareil de contention (durée inférieur à 1 minute), l'animal peut ressentir un stress modéré pendant la procédure.

Devenir

Des analyses ex vivo sont prévues à l'issue de chacune des procédures ainsi, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune d'entre elle.

Remplacement

Suite aux études in vitro, le développement et la validation préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques requière la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats en prenant en compte l’homogénéité du modèle. Ce nombre a été calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. De plus, l’étude dose et schéma d’administration et les examens d’imagerie permettent également de réduire le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux est de 351 souris maximum sur une période de 5 ans.

Raffinement

Les modèles animaux choisis sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale – minimum 3 animaux/cage-, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera euthanasié. De plus, les examens d’imagerie médicale permettent également de raffiner l’étude grâce d’une part au caractère non invasif de la technique et d’autre part à la possibilité d’un suivi longitudinal ou un animal est son propre contrôle au cours du temps.

Choix des espèces

Le modèle souris est classiquement utilisé en expérimentation animale dans le domaine de la recherche contre le cancer. De plus, les souris immunodéficientes porteuses de greffe de lignée tumorale humaine (xénogreffe) sont adaptées pour les études fondamentales et appliquées de développement de traitements des cancers humains. Souris adultes âgées de 5 à 6 semaines pour optimiser la prise de greffe.

1 942 souris vont être utilisées, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent par une chirurgie stéréotaxique pour injecter un virus, la pose d'une fenêtre crânienne d'une à deux heures et des séances éveillées la tête fixée, et certaines reçoivent du chlorure de lithium qui leur donne une nausée, pour un test d'aversion gustative de onze jours. Le titre présente ce projet comme le second volet, "(2/2)", d'une étude du cortex insulaire postérieur, dont l'équipe espère des "notions fondamentales" sur le traitement du goût. Le porteur annonce aussi une perte de poids due à une restriction hydrique dont il ne donne ni la durée ni le motif, et des "tests comportementaux spécifiques" qu'il ne nomme pas, hors l'aversion gustative.

Objectifs

L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H. L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement. L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.

Devenir

Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

1 942 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie, et celles qui passent le test d'aversion gustative conditionnée y restent onze jours, après une injection de chlorure de lithium qui induit une nausée transitoire. Selon les procédures, elles subissent une chirurgie pour injecter un virus dans le cerveau, une chirurgie d'une à deux heures pour poser une fenêtre crânienne, puis des séances éveillées, la tête fixée, pendant lesquelles l'équipe active ou inhibe des groupes de neurones par la lumière ou par des molécules. Hors cette aversion gustative, les "tests comportementaux spécifiques" annoncés ne sont pas décrits. Pour justifier l'effectif, le porteur invoque la "solidité de nos hypothèses de travail" et une "expertise reconnue de l'expérimentateur", sans calcul ni effectif par groupe.

Objectifs

L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H - L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours.

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.

Devenir

Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence.Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

Tués pour un prélèvement terminal s'ils réagissent à la sensibilisation, gardés en vie pour d'éventuelles études futures s'ils n'y réagissent pas, 1 080 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et 180 d'entre eux sont déclarés réutilisés. En règle générale, chacun reçoit quatre injections de sensibilisation puis une injection test, et ceux qui réagissent subissent une injection du même réactif dans les deux narines, qui déclenche éternuements, frottements du museau, larmoiement et écoulement nasal, observés pendant deux heures en isolement. Les candidats médicaments contre la rhinite allergique leur sont donnés une seule fois ou jusqu'à 28 fois en quatre semaines, avec au plus deux prises de sang en cours d'étude. Le porteur retient le cobaye parce qu'il présente, "contrairement à la souris et au rat", une réaction allergique précoce et tardive comme chez l'humain.

Objectifs

La rhinite allergique est une maladie chronique des voies respiratoires très fréquente. Sa prévalence a augmenté considérablement ces dernières décennies, au point de constituer un problème de santé publique. 25% de la population est affectée dans les pays développés. La rhinite allergique constitue un problème de première importance en raison de sa prévalence élevée, des coûts qu’elle occasionne, de son évolution vers l’asthme et de ses effets considérables sur la qualité de vie des personnes affectées. La rhinite est déclenchée par une réaction excessive du système immunitaire en présence d’un allergène, comme le pollen ou les acariens. Pour défendre l’organisme, le système immunitaire libère divers composés, notamment de l’histamine, qui sont responsables des symptômes allergiques. Le traitement le plus efficace est l’éviction de l’allergène en cause, mais ceci est difficilement possible en pratique (e.g. cas d’une allergie aux pollens). Différents traitements sont disponibles. Cependant, les corticoïdes en suspension nasale ont des d’effets indésirables, tels que saignement de nez, irritation, fragilisation de la muqueuse nasale en cas de traitement prolongé. Les antihistaminiques peuvent également entrainer de la sédation. L’immunothérapie spécifique ou désensibilisation permet aussi d’induire une tolérance à un ou plusieurs allergènes. Dans ce contexte, le présent projet aura pour objectif d'évaluer l’efficacité préclinique de candidats médicaments susceptibles de lutter contre l’inflammation et les symptômes (éternuement, écoulement nasal,…) de la rhinite chez le cobaye.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer l'efficacité de substances en cours de développement sur l'apparition des symptômes de la rhinite mais également sur la réponse inflammatoire. En effet, si les symptômes de la rhinite ne sont pas graves en soi, leur association peut les rendre difficiles à supporter et avoir un impact non négligeable sur la qualité de vie des patients (troubles du sommeil, fatigue chronique, difficultés de concentration, baisse de performance,…). Sans compter que les allergies peuvent exacerber les maladies suivantes : asthme, infection des voies respiratoires supérieures, sinusite ou bronchite. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer un traitement efficace afin d’inhiber les symptômes de la rhinite et améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Dans ce projet, les cobayes seront sensibilisés à 4 reprises en standard par l'injection d’un réactif (durée d’environ quelques secondes). Une semaine a minima après la dernière sensibilisation, les animaux répondants seront sélectionnés par injection (durée de quelques secondes) du même réactif (observation non invasive pendant 40 minutes de l’apparition d’une réaction inflammatoire au point d’injection). La rhinite est ensuite induite par une injection du réactif au niveau des 2 narines, durée de quelques secondes. Les symptômes de la rhinite seront évalués par observation du comportement de l’animal (en général pendant 2 heures après le challenge, après une période d'habituation de 30 minutes). Des prélèvements sanguins (durée de quelques secondes) peuvent être réalisés au cours de l’étude (maximum 2 prélèvements). Après l’évaluation des symptômes, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements, e.g. sang, liquide nasal ou organes d’intérêt (durée de quelques secondes). Les candidats médicaments seront administrés (durée de quelques secondes) de manière aigue (une administration unique) ou chronique (durée maximum de 4 semaines selon le composé, soit 28 administrations).

Impact sur les animaux

Dans ce type de procédure, il est attendu le développement des symptômes de la rhinite après le challenge par voie nasale, i.e. principalement éternuement, frottement du museau, larmoiement, rhinorrhée et sécrétion de mucus. Il n’est pas attendu d’effets indésirables pendant la phase de sensibilisation des animaux. Pendant la phase d’observation des animaux, ces derniers sont isolés afin de mieux les observer. Des prélèvements intermédiaires réalisés au cours de l’expérience chez les animaux vigiles pourraient également constituer un stress.

Devenir

Tous les animaux répondants sont euthanasiés en fin de procédure car ils sont soumis à un prélèvement terminal (prélèvement du liquide nasal, de sang et/ou d'organes) afin d'évaluer l'effet des candidats médicaments sur la réponse inflammatoire. Les animaux non-répondants à la sensibilisation sont maintenus en vie car ils ne présentent pas de symptômes particuliers et pourront donc être utilisés dans de potentielles études futures.

Remplacement

Dans le cadre du développement des médicaments testés, de nombreux tests in vitro et in silico ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité de l’environnement biologique et du système respiratoire chez l’Homme. De même, il n'est pas possible de prédire les effets secondaires des substances utilisées. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études (otamment, les prélèvements terminaux systématiques permettent d'éviter d'utiliser d'autres animaux). Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe non sensibilisé, à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif 8-10 animaux par groupe est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites permettant l'euthanasie précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce est basé sur la bibliographie scientifique. Le cobaye est reconnu comme un bon modèle d'asthme ou inflammation pulmonaire, car contrairement à la souris et au rat, il démontre une réaction allergique précoce et tardive comme c'est le cas chez l'humain. C'est également l'espèce classiquement utilisée pour l'évaluation des symptômes de rhinite ou toux. Les études sont principalement réalisées chez des cobayes sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément à la bibliographie scientifique.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, des injections répétées d'une cytokine et d'anticorps jusqu'à trois fois par semaine, parfois de la chimiothérapie, et des prélèvements sanguins répétés à la queue, une partie subissant un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que la croissance tumorale peut gêner la locomotion et provoquer une ulcération menant à un état moribond. Il affirme que les méthodes sans animaux ne peuvent pas remplacer la souris à ce stade et renvoie les retombées pour les patients, validation d'anticorps avant essais cliniques, au conditionnel.

Objectifs

Les avancées en termes d’immunothérapies dans les cas de cancers sont très encourageantes mais une recherche accrue est toujours de mise afin d’une part de découvrir de nouvelles cibles mais également d’améliorer les traitements déjà existants. Ce projet a ainsi pour but de continuer à approfondir nos données sur les actions de notre cible, une cytokine (protéine messagère et régulatrice du système immunitaire naturellement présente dans chaque organisme), de son blocage à l’aide d’anticorps candidats et ce dans un contexte de développement tumoral (multiplication des cellules tumorales) chez la souris. Grâce à nos modèles de développement tumoraux, nous pourrons analyser la biodistribution et la dégradation de cette cytokine ainsi que l’impact de son blocage en synergie (effet cumulé) avec d’autres immunothérapies et chimiothérapies déjà connues en clinique. Ces étapes sont indispensables pour valider les anticorps candidats avant de futurs essais cliniques antitumoraux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal de ce projet, par des études de suivi de la cible en présence ou absence d’anticorps, sera de connaitre les cinétiques d’action de ces différentes molécules. Ces approches sont indispensables pour pouvoir amener ces technologies dans des essais précliniques réglementaires puis des essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet seront greffés une fois en injection sous-cutanée (15 secondes/souris). Les animaux recevront ensuite différents traitements en commençant par l’injection unique de la cible (la cytokine) (en injection intrapéritonéale : 10 secondes, en injection sous-cutanée : 10 secondes, ou en injection intraveineuse dans de rares cas : 3 minutes). L’anticorps dirigé contre la cible sera ensuite injecté jusqu’à 3 fois par semaine par l'une de ces trois voies. Dans certains cas, les souris auront également une injection de chimiothérapie en dose unique (en intrapéritonéale ou en intraveineuse suivie de l’immunothérapie 2 fois par semaine (en injection intrapéritonéales, en injection sous-cutanée ou en injection intraveineuse). Des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine de la queue en gestes répétés sur 24h (sans dépassement du volume maximum autorisé) ou une fois par semaine sur 4 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute / souris. Certains animaux subiront un prélèvement de sang terminal à la veine cave (animal sous analgésie + anesthésie profonde et sans réveil) afin de collecter un volume de sang suffisant pour des analyses plus fines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs chez la souris avec un problème de locomotion possible au-delà d'un certain volume ou une ulcération de la tumeur pouvant entrainer un état moribond de l’animal si elle évolue trop rapidement. Les injections de chimiothérapie et d’immunothérapie observées lors des études précédentes ne montrent quant à elles aucun effet délétère observable sur l’état clinique de l’animal

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, pour prélever la tumeur et les organes immunitaires périphériques afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments (à l’aide de technique d’histologie, de cytométrie ou encore de biologie moléculaire).

Remplacement

Il s’agit du suivi de croissance tumorale, il n’existe pas de méthode alternative à ces expériences in vivo. Ces preuves de concept et ces études de mécanismes d’action ne peuvent s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui a démarré par des études bibliographiques, suivies d’études In Vitro approfondies ayant permis d’affiner et de réduire efficacement les pistes de recherches. Cependant, compte tenu des avancées actuelles, à ce stade du projet, il n’est pas possible de substituer l’animal par un modèle in vitro pour continuer ces recherches.

Réduction

L’analyse statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés est réalisée en collaboration avec une équipe de recherche spécialisée dans les études de biostatistique. L’étude de l’efficacité des traitements testés induit deux types d’analyse : -modélisation de la croissance tumorale et -analyse de la survie des animaux. Compte tenu de ces analyses et des données obtenues lors de précédentes expériences réalisées au sein du laboratoire le nombre de souris est limité à 10 par groupe et chaque étape est reproduite une fois afin de supprimer le biais pouvant être induit par un problème technique et ainsi avoir un résultat de deux expériences indépendantes.

Raffinement

Pour la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats obtenus dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et le suivi clinique des animaux se fera quotidiennement sur la base de la fiche de scoring. Les souris seront surveillées quotidiennement y compris les week-ends et jours fériés : suivi du développement de la tumeur (point limite volume >1500 mm3 ou nécrose tumorale précoce), pesée (toute perte de poids ne devra pas excéder 20% du poids normal attendu de l’animal) et détection du moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. En fonction des observations, des décisions allant de l’adaptation des conditions d’hébergement à l’injection d’analgésique jusqu’à une décision d’euthanasie, seront prises. D’autre part, une fiche de soins est utilisée pour la prise en charge des animaux. Pour l’ensemble du projet nous avons prévu un nombre total de 1440 souris incluant (par type de souris = 480) : 480 souris immunodéprimées et 960 souris immunocompétentes.

Choix des espèces

Ce projet nécessite des modèles de souris immunocompétentes et immunodéficientes afin de comprendre le rôle du système immunitaire et de suivre la cinétique de la cible au sein de la tumeur et dans la circulation sanguine. Le choix s’est porté sur les modèles les plus caractérisés et sur lesquels nous avons déjà un recul important : C57Bl/6, BalbC (immunocompétentes) et athymic nude (immunodéficientes). Les souris seront au stade de développement adulte et âgées de 6 à 12 semaines afin d’avoir des animaux d’âge mûr avec un système immunitaire complètement fonctionnel (pour les souris immunocompétentes) et permettant une prise tumorale optimale.

624 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules de cancers pédiatriques qui forment des métastases au foie, elles reçoivent jusqu'à sept injections d'anticorps testés et des prélèvements de sang sous anesthésie, avant d'être tuées pour évaluer l'efficacité thérapeutique. Le porteur indique que les effets indésirables liés à la croissance tumorale touchent surtout les groupes témoins non traités. Il décrit un test in vitro concluant sur ces anticorps mais présente le modèle animal comme "indispensable et non substituable" avant les essais chez l'enfant.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d’anticorps thérapeutiques ou des anticorps bispécifiques correspondants dans un modèle de souris greffées avec des cellules de cancers pédiatriques. Cette possibilité de combiner les anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Les versions chimériques (=construit pour être toléré par la souris) de ces anticorps ont déjà été testés lors de précédents projets dans un modèle de souris (immunocompétentes) optimisé et ont prouvé leur efficacité et leur bonne tolérance dans ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester les versions humanisées (=construit pour être administré chez l'Homme) de ces anticorps thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le meilleur anticorps thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles biothérapies (anticorps humanisés, anticorps bispécifiques) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Injection intraveineuse sur animal vigile (7 injections maximum, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 21 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (4 prélèvements maximum, 2 minutes maximum chacun + prélèvement, soit 8 minutes au total).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liée à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration des traitements (injections intraveineuse) Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation de métastases hépatiques, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs métastatiques). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe 1 attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps et de réaliser également des analyses complémentaires.

Remplacement

Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cancéreuse cible et provoquer sa destruction via des cellules effectrices. Nous avons réalisé ces tests sur les candidats anticorps humanisés notifiés dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cette étude donc nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation du modèle syngénique dans un précédent projet, nous a permis d’optimiser les injections, de prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 3 à 5 souris par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de lidocaïne sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, l’O-Acétyl GD2 est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus diabétiques, ils reçoivent des injections quotidiennes d'une molécule tenue secrète, la "myokine X", subissent des prises de sang répétées à la queue, un test de mémoire en piscine de Morris et une exposition au froid à 4 °C pendant 24 heures, avant d'être tués pour analyse des organes. Le porteur attend une perte de poids, des désordres intestinaux et une détérioration de la queue liés aux prélèvements. Il compare sa molécule, en cours de brevet, au liraglutide déjà utilisé chez les patients et affirme "indispensable" le recours à l'animal.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (diabète de type 1, DT1), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit (diabète de type 2, DT2). Ainsi, dans les 2 cas, il y a un trouble de l’utilisation et du stockage du glucose apporté lors des repas, entrainant une hyperglycémie. Cette dernière peut au fil du temps provoquer des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des altérations cognitives (perte de mémoire) … La régulation de la fonction sécrétoire des cellules à insuline et leur survie jouent un rôle central dans la progression du diabète. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme et joue donc un rôle majeur dans l'équilibre glycémique de l'organisme puisqu’il constitue le site majoritaire de stockage du glucose sous l'action de l'insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une communication croisée entre le muscle squelettique et les cellules à insuline par le biais de facteurs appelés myokines. Nous avons montré in vitro (îlots pancréatiques de Rat et Humain) et in vivo, dans un modèle de transplantation d’îlots chez le rat DT1, qu’une myokine, appelée myokine X, permettait d'améliorer la survie, la fonction des îlots pancréatiques et l’équilibre glycémique des animaux diabétiques transplantés. Par ailleurs, dans une autre étude in vivo réalisée récemment, nous avons montré qu’une injection quotidienne de notre Myokine X chez un modèle de rat DT2, permettait de prévenir l’apparition de cette pathologie. En particulier, les premiers résultats montrent un impact intéressant de la myokine X sur le tissu adipeux brun. Ce dernier représente un intérêt important de par sa capacité thermogénique qui améliore l’homéostasie glucidique grâce à une importante consommation des substrats dont le glucose. Le nom de cette myokine, représentant un intérêt thérapeutique important pour le patient diabétique, reste anonyme car un brevet est en cours de dépôt. Désormais, le premier objectif de cette demande est de déterminer si notre Myokine X pouvait également avoir un effet curatif sur un modèle de Rat DT2 ainsi que sur les complications citées précédemment. Le second objectif de cette étude est de comparer les effets de notre Myokine X avec les effets du Liraglutide, qui est aujourd’hui un antidiabétique largement utilisé chez l’Homme mais qui peut présenter certains effets secondaires.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est d’obtenir un effet curatif du DT2 par la Myokine X. De plus, cette étude permettra de comparer les effets de notre molécule avec ceux du Liraglutide, qui est très largement utilisé chez le patient diabétique. Néanmoins, le Liraglutide peut présenter un certain nombre d’effets indésirables tels que des désordres intestinaux qui peuvent amener le patient à vouloir arrêter son traitement. Par ailleurs, nos études précédentes in vivo menées chez le rat diabétique n’ont pas montré de tels désordres. Ainsi, notre traitement pourrait constituer une biothérapie innovante pour le DT2.

Procédures

Afin d’évaluer l’évolution du diabète, différents tests seront effectués sur l’ensemble des animaux pour suivre la glycémie. Tout d’abord, celle-ci sera mesurée quotidiennement et l’acte ne durera que quelques secondes. Par ailleurs, nous complèterons ce suivi par une prise de sang hebdomadaire afin de mesurer des marqueurs en liens avec la glycémie. La durée de la contention pour la prise de sang est de moins de 2 minutes. Pour évaluer le fonctionnement de l’ensemble des organes impliqués dans la régulation de la glycémie, un test de sensibilité à l’insuline sera réalisé la moitié des animaux et sur l’autre moitié un test de tolérance au glucose sera effectué. Ces deux tests dureront chacun 2h et avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l’eau ad libitum). De plus, nous évaluerons les effets de notre traitement sur les altérations cognitives pouvant être induites par le diabète à l’aide du test de la piscine de Morris. Ce test durera 2 min et sera réalisé 3 fois de suite pendant 3 jours au cours de 3 sessions réparties au cours des 15 semaines de l’étude sur 64 animaux. Enfin, nous étudierons sur 40 animaux l’effet de notre traitement sur l’activation du tissu adipeux en réponse au froid. Pour cela, les animaux seront exposés au froid (4°C) pendant 24h.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de Myokine X et de Liraglutide. - Désordres intestinaux liés au Liraglutide. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Hypoglycémie. - Hypothermie post test comportemental. - Hypothermie au cours de la mise au froid 4°C–8°C. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie liée au prélèvement sanguin. – Inflammation au point d’injection due aux injections répétées.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Le diabète est une pathologie complexe où de nombreux organes sont impliqués (pancréas, muscles, tissu adipeux…) et communiquent entre eux, ce qui ne peut être modélisé in vitro. De plus, l’impact de la Myokine X a déjà été évalué in vitro sur des ilots pancréatiques. Il est maintenant primordial d’évaluer ses effets dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostaie glucidique sont présents. Pour cela, le recours à une étude in vivo est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux qui sera utilisé par groupe est déterminé selon une étude récente qui a démontré que seulement 75% des rats ZDSD devenait diabétique. Ainsi, pour pallier à ce pourcentage d'obtention de rats diabétiques, à ces variations glycémiques et afin d'obtenir des données statistiquement analysables, nous utiliserons 15 rats par groupe. Par ailleurs, ce nombre est basé sur notre longue expérience obtenu au cours des nombreuses études métaboliques réalisées au laboratoire. Cette étude nécessitera donc 120 rats. De plus, la stratégie d’expérimentation est établie tenant en compte la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d’animaux et le stress que pourrait engendrer l’ensemble des procédures sur chaque animal, une attention particulière est portée sur le fait que tous les animaux ne seront pas utilisés pour l’ensemble des procédures. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque procédure a été défini d’après notre expérience dans le domaine du diabète ainsi que d’après la littérature.

Raffinement

Le raffinement a principalement lieu au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. Ainsi, les animaux développant un diabète après alimentation enrichie en gras seront traités par insulinothérapie. Un suivi quotidien sera réalisé afin de mesurer la glycémie afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Si les animaux présentent des signes de douleur, des antalgiques seront administrés en fonction du degré déterminé.

Choix des espèces

Le modèle de rat diabétique utilisé est celui qui mimique le mieux le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l'obésité trouvé chez l’Homme. Les autres modèles de rongeurs actuellement disponibles pour le diabète et le syndrome métabolique manquent de translationnalité à la condition humaine. Ainsi, nous utiliserons ce modèle de rat. L’utilisation en parallèle de rats sains servira de contrôle afin d’évaluer l’impact de notre molécule en situation non pathologique. Ceci nous permettra de comprendre les mécanismes d’action physiologique impliqué notamment dans la régulation de la glycémie de notre Myokine X, encore à élucider à ce jour. Nous utiliserons des rats âgés de 16 semaines au commencement du protocole (Arrivée dans notre animalerie à 14 semaines donc 2 semaines d’habituation). En effet, le DT2 apparaitra à partir de 16 semaines de vie chez les rats de ce modèle. Ainsi, comme le projet consiste à étudier l'effet curatif de notre Myokine X sur le DT2, il faut que les animaux aient au moins 16 semaine de vie avec un statut diabétique établi avant le commencement des traitements.

56 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées puis soumises à un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt-cinq injections sous-cutanées d'un analogue hormonal, un test de tolérance au glucose par gavage avec prélèvements à la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le porteur affirme que le régime carencé n'induit ni faim ni stress anormal chez les jeunes souris. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit un "organisme entier" en contexte de malnutrition et rattache les retombées à la prise en charge des enfants.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études récentes ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté par l'appauvrissement en nutriments et qu'une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permettait de compenser partiellement le retard de croissance dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits dans le contexte de la malnutrition, un déficit en protéines pendant l'enfance résulte en des déficits neurocognitifs, métaboliques et immunitaires sévères qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations métaboliques exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique chronique, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique dans ces conditions, sont encore mal connus. Des études portant sur les cellules productrices d’hormones de l’intestin (appelées entéroendocrines), ont permis d’identifier une sous-population de cellules particulièrement impactée par la malnutrition protéique juvénile. Le but de ce projet est 1) D’évaluer comment les effets bénéfiques d’une intervention probiotique en contexte de malnutrition sont dépendants de ces cellules et 2) de caractériser plus finement les modifications de la signalisation d’une hormone produite par ces cellules dans un contexte de malnutrition protéique juvénile par rapport à un régime contrôle. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d’un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l’étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C’est pourquoi cette étude nécessite l’expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s’agit d’un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi que, pour certains animaux, à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. La moitié des animaux recevra 5 jours par semaine pendant la durée de la procédure une injection sous-cutanée d’un analogue hormonal (soit 25 injections au total). L’autre moitié des animaux recevra, une seule injection sous-cutanée d’un antagoniste de cette même hormone. Un test de tolérance au glucose durant 120 minutes sera réalisé sur les animaux vigiles (voie orale par gavage) et 7 prélèvements sanguins de 2-3 μL (5 prélèvements toutes les 15 minutes puis 2 prélèvements toutes les 30 minutes) et 3 prélèvements de 20 µL post gavage seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer respectivement la glycémie ou l’insulinémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé en fin de procédure. Pour cela, 30 minutes après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. Le prélèvement en veine porte durera deux minutes. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 56 animaux femelles appartenant à deux procédures.

Impact sur les animaux

Ces procédures devraient entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de ces procédures a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’agressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poids sera surveillé de façon régulière et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière quotidienne. Le test de tolérance au glucose implique des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection sous-cutanée peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée. Pour la procédure impliquant des injections sous-cutanées de sémaglutide : les injections sous-cutanées peuvent induire de l’inflammation, les points d’injection seront surveillés quotidiennement.

Devenir

L'ensemble des femelles ayant subi la procédure expérimentale seront mises à mort à la fin de la procédure. En effet, la mise à mort est nécessaire afin de réaliser des prélèvements de sang et d'organes qui seront analysés par la suite.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition, nécessaire pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité entre individus. Le nombre de 7 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité au vu de nos résultats précédents. Dans une optique de réduction, l'ensemble des organes impliqués dans le métabolisme, mais qui ne seront pas directement utilisés dans le cadre de ce projet, seront conservés au congélateur pour d'éventuelles analyses ultérieures. Le protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée en pesant la nourriture présente pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. A la suite des injections, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection sous-cutanée ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés cinq fois par semaine et pourront donner lieu à l’application locale d’antiseptiques le cas échéant. Des points limites suffisamment prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Les animaux recevront une analgésie et une antalgie avant le prélèvement en veine porte.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). L'objectif du projet est d'étudier la signalisation GLP-1 en condition de malnutrition pendant la période juvénile. Il faut donc utiliser des animaux juvéniles après leur sevrage.