Rongeurs

18 rats porteurs d'un modèle de la dystrophie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des enregistrements cardiaques et respiratoires, un test de préhension et une mesure de force musculaire sous anesthésie, puis un prélèvement de sang, avant mise à mort pour analyse des organes. Le porteur teste deux composés combinés censés réguler la dynamique calcique et retarder la maladie, mais renvoie les bénéfices pour les patients au conditionnel et au long terme, après d'éventuels essais sur des animaux plus grands. Sur le remplacement, il affirme que seule la réponse de l'animal vivant avec ses organes en interrelation permet de conclure, et décrit le rat comme un modèle plus fidèle que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très mauvais et les jeunes patients meurent prématurément. L’absence de la protéine dystrophine entraîne un stress oxydatif pour les cellules, avec une anomalie de la dynamique du calcium qui engendre des défauts fonctionnels pour les fibres musculaires. Nous proposons ici de tester l’efficacité thérapeutique de deux composés chimiques innovants, identifiés comme régulateurs de cette dynamique calcique. Ces deux composés sont ici combinés en un seul produit qui a récemment prouvé son efficacité chez le poisson et la souris, modèle partiel de la DMD. Le but de ce projet est d'évaluer l'effet de ce produit dans le modèle pertinent du rat DMD, dont il a été prouvé qu’il récapitule beaucoup plus fidèlement la progression très sévère et fatale de la maladie chez l'humain. Par sa plus grande hétérogénéité génétique, le rat permet de plus d’évaluer la réponse individuelle au traitement, prémices d’une médecine de précision. En cas de succès, ce produit poursuivra son développement vers des essais précliniques chez des animaux de plus grande taille et encore plus hétérogènes au plan génétique avant, en cas de succès, d’entrer en phase d’essai clinique chez les enfants atteints de DMD.

Bénéfices attendus

Nous espérons que les résultats obtenus dans le cadre de cette étude contribueront au développement d'un traitement pharmacologique de la dystrophie musculaire de Duchenne. D'une manière générale, nos résultats permettront d'avancer dans la connaissance plus précise des mécanismes anormaux à l'oeuvre dans cette maladie. La thérapie basée sur le produit testé ici est de nature protectrice et nous espérons que ce traitement retardera l'évolution de cette maladie. Ce produit peut être administré en combinaison avec d'autres thérapies existantes ou en développement. Le produit a déjà démontré son efficacité et sa sécurité lors d'études préliminaires sur des cellules musculaires et cardiaques humaines, ainsi que sur des poissons et des souris. Il est donc attendu un bénéfice sur l'état général des animaux testés ici, ainsi qu'une absence de toxicité.

Procédures

La durée d'un enregistrement ECG, indolore, est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement pléthysmographie, indolore, est de 30 minutes. La durée d'une séquence de grip test, indolore, est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de la force musculaire est de 90 minutes jusqu'au réveil, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

L'absence de toxicité du produit a été démontrée in vitro et in vivo. Aucun effet indésirable supplémentaires à ceux causés par la maladie développée spontanément par les animaux modèles n'a été observé chez les souris traitées avec les composés du produit, sur une durée de 6 mois à la dose de 60 mg/kg/jour. Ici, le traitement sera administré par voie orale dans l'eau de boisson car il s'agit de la forme d'administration la plus pratique et la moins contraignante pour l'animal. Elle a montré une bonne biodisponibilité dans les tissus cibles (muscle, cœur et cerveau) de la souris et du rat.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires à l'évaluation complète du produit testé.

Remplacement

L'efficacité du composé testé a déjà été confirmée in vitro et sur des modèles de souris. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé testé permet-elle de protéger suffisamment les muscles pour que cela confère un bénéfice quantifiable au cœur et aux muscles squelettiques, à l’échelle de leur microstructure et de leur fonction.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats (2 muscles traités indépendamment par rat) permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des logiciels qui permettent de comparer deux groupes ou plusieurs groupes entre eux.

Raffinement

Le phénotype dommageable des animaux consiste en une faiblesse progressive de leur musculature, sans effet indésirable jusqu'à l'âge de 6 mois, au-delà de l'âge atteint par les rats en fin de cette procédure. Les animaux seront donc considérés comme des animaux capables d'une vie normale en espace confiné et seront stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées, monitorées et conformes à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrières. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 6 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 300g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux par l'utilisation d'agents anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la même classe que l'être humain. À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD dont la valeur demeure inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Nous utiliserons des animaux à l'âge d’un à 4 mois (3 à 15 semaines). Notre étude de caractérisation ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 3 semaines permettra d’évaluer la capacité du composé testé à différer l’installation progressive de la fibrose (traitement préventif) et ses conséquences fonctionnelles sur la musculature striée. Le bon état général des animaux à l'âge maximal de 4 mois justifie notre suggestion de classer cette procédure en procédure modérée.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire humaine est greffée dans leurs glandes mammaires, puis elles reçoivent des injections de traceurs radiomarqués et passent plusieurs séances d'imagerie sous anesthésie avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que l'inoculation de la tumeur peut engendrer du stress, que la croissance ou la nécrose tumorale peut provoquer une gêne et que les anesthésies répétées peuvent affecter les animaux. Il affirme que les résultats in vitro ne suffisent pas et qu'un modèle animal porteur de tumeurs est "indispensable" pour valider le ciblage de ces peptides.

Objectifs

Le récepteur NeuroTenSine-1 (NTS-1) a été précédemment identifié comme étant une excellente cible dans les tumeurs primaires et les métastases ganglionnaires chez des patients atteints d’un cancer de la prostate et de cancer du sein avec un pronostic plus sombre. Des résultats prometteurs ont été obtenus au cours d'études d'imagerie préclinique PET (Tomographie par Emission de Positons) avec des analogues peptidiques radiomarqués au 68Ga (émetteur beta+). Afin d’optimiser ces séries d’analogues, 2 peptides radiomarqués au gallium-68 et au fluor-18 pour le diagnostic PET et 1 peptide radiomarqué au lutétium-177 pour la radiothérapie ont été étudiés et validés in vitro. Le présent projet de recherche préclinique vise à tester in vivo ces radiopeptides sur des modèles murins de cancers du sein exprimant ces récepteurs NTS-1.

Bénéfices attendus

Si un patient métastatique est imagé avec succès par tomographie par émission de positons suite à une injection de radiopharmaceutique dédié, celui-ci pourrait alors bénéficier d’un traitement ciblé par radionucléides (TRT : Targeted Radionuclide Therapy) utilisant le même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique. Le projet vise à optimiser une série d’analogues en modifiant le radionucléide associé à un peptide sur un modèle de cancer du sein triple négatif.

Procédures

Les différentes interventions sur les 80 souris Balb/c nude sont les suivantes : - xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales (cancer du sein) dans les glandes mammaires sous anesthésie gazeuse (10min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue de 200µl de solution saline contenant les radiotraceurs sous anesthésie gazeuse pour les 80 souris (5 min) - 1 acquisition PET/CT (18F-FDG) pour les 80 souris sous anesthésie gazeuse (5min CT + 15 min PET) - 1 acquisition PET/CT pour 1 souris sur 2 soit 20 souris du groupe "diagnostic" sous anesthésie gazeuse (5min CT + 15 min PET) - 1 acquisition SPECT/CT pour les 40 souris du groupe "thérapie" sous anesthésie gazeuse (5min CT + 20 min SPECT) - 1 ponction cardiaque terminale pour les 80 souris sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau des glandes mammaires pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies répétées pour la mise en place du modèle et pour l'imagerie ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 80 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur NTS1 est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique des 3 peptides.

Réduction

les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. 2 peptides « diagnostic PET » et 1 peptide «thérapie » seront étudiés. Pour chaque peptide « diagnostic PET », il est nécessaire de visualiser leur biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs NTS-1. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et 10 souris avec le radiopeptide + 150 µg de neurotensine pour le « blocking ». Pour l’étude du peptide thérapeutique radiomarqué au 177Lu, 40 souris seront incluses dans le protocole de biodistribution : 1 lot « radiopeptide seul » et 1 lot « blocking » ; 4 temps par lot ; 5 souris par temps.

Raffinement

Les souris sont placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour/nuit 12h/12h, enrichissement des cages) au sein d’une animalerie de recherche agréée. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la greffe orthotopique de tumeur humaine. Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. Le suivi de la croissance tumorale peut être réalisée en externe par mesure à l’aide d’un pied à coulisse. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, une première acquisition [18F]-FDG sera effectuée pour suivre la croissance tumorale et les métastases potentielles. Les études de 3 radiopeptides pourront être initiées minimum 2j après la première étude PET.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le lendemain de leur naissance, les souriceaux reçoivent deux injections quotidiennes d'une molécule inflammatoire pendant cinq jours, puis subissent des tests de tolérance à l'insuline et au glucose avec prélèvements de sang à la queue et un isolement d'une semaine en cage métabolique. Le porteur indique une mortalité de 5 à 10 % pendant les injections, un retard de croissance, des troubles du comportement et une douleur locale. Il affirme qu'aucune approche in vitro ou informatique ne peut reproduire les connexions entre le cerveau et le métabolisme et tue tous les animaux pour prélever leurs organes.

Objectifs

La naissance prématurée (avant la fin normale de la grossesse) est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons prématurés qui survivent au-delà de l’enfance est en hausse. Il existe néanmoins une inflammation importante chez 20 à 40% de ces enfants à la naissance, qui peut entraîner des lésions du cerveau. Ces lésions sont à l’origine de handicaps, de déficits des certaines capacités intellectuelles et de troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte et sont regroupées sous le terme d'Encéphalopathie du Prématuré (EDP). En plus de ces déficits, des études récentes ont démontré qu’1 enfant prématuré sur 5 développe de l’obésité pendant l’enfance. L'obésité est le principal facteur de risque pour le diabète de type 2. Pour comprendre comment une inflammation au moment de la naissance peut favoriser le développement d’une obésité et du diabète, nous utiliserons un modèle de EDP chez le souriceau combiné avec un régime hypergras. Les mères seront soumises jusqu’au sevrage de leurs petits soit à un régime hypergras soit à un régime contrôle sous forme de croquettes plus ou moins riches en graisse.

Bénéfices attendus

Comprendre pourquoi la naissance prématurée et l’inflammation à la naissance peuvent favoriser ensuite l’apparition d’une obésité et d’un diabète peut permettre de proposer des régimes alimentaires ou des traitements pour prévenir et éviter ces maladies chez l’homme.

Procédures

Les souriceaux recevront deux injections intrapéritonéales (au niveau de l’aine) par jour de la molécule inflammatoire ou du contrôle (matin et fin d’après-midi) du jour après la naissance (P)1 à P4, puis une le matin du P5. Cette injection prend quelques secondes. Pour savoir si les animaux développent un diabète, un lot de souris recevra de l’insuline et la glycémie sera mesurée à t=0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 30’, 40’, 60’, 90’ et 120’ sur une goutte de sang récupérée par légère piqure au bout de la queue (animal éveillé). Le même test sera reproduit 48h plus tard, en remplaçant l’insuline par du glucose. D’autres animauxseront utilisés pour l’analyse de leur métabolisme. Ceci nécessite leur isolement pendant 1 semaine dans des cages individuelles spéciales appelées « cages métaboliques », permettant le recueil des urines, des selles et des gaz. Une semaine d’habituation en cages individuelles classiques sera réalisée auparavant.

Impact sur les animaux

Site 1: - Une mortalité de 5 à 10% peut survenir en période d’injection de la molécule inflammatoire. - LUne douleur due à infection locale dans la zone d’injection intra-péritonéale - Un retard de croissance, - des manifestations de stress : troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible...), accélération de la fréquence respiratoire. Lors du test de résistance à l’insuline ou au glucose réalisé à 4 semaines : sensation modérée de faim due à la privation de nourriture pendant 5h, puis douleur légère au bout de la queue pour permettre les prélèvements de sang. Comme il y a une seule incision, il y aura peu d’inconfort pour les animaux, à part le stress généré par la manipulation répétée. - Site 2 uniquement : L’isolement en cage métabolique peut induire un stress.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prélèvement des organes et du sang, et comprendre si l’inflammation au début de la vie peut causer un diabète. Le rôle du cerveau, du foie, du pancréas et du système immunitaire sera analysé.

Remplacement

Notre étude s’intéresse aux liens entre le cerveau et l’utilisation des lipides par l’organisme. Il est impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques) toutes les connexions concernées.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire a été obtenu grâce aux données du laboratoire, de la littérature et d’une estimation statistique. Si les résultats obtenus à mi-projet sont suffisamment clairs, il sera réduit de moitié.

Raffinement

Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Des grilles de surveillance en fonction de l’âge des animaux seront utilisées pour s’assurer de leur bien-être et déterminer l’atteinte éventuelle des points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, et jusqu’à P10, on surveillera quotidiennement l’apparence, le poids, et le positionnement des animaux au sein du nid. A partir de P10, avant sevrage, la surveillance aura lieu deux fois par semaine. Les scores de surveillance prendront également en compte une éventuelle prise de poids susceptible de gêner la locomotion de l’animal. Si le score atteint le niveau du point limite, l’animal sera euthanasié selon les méthodes réglementaires. Le transport d’une partie des animaux entre deux laboratoires sera nécessaire à 3 semaines. Il sera assuré par un transporteur agréé, garantissant les bonnes conditions de trajet pour les animaux. Une semaine d’habituation en cage individuelle classique sera réalisée avant celle passée en cage métabolique.

Choix des espèces

Dans le cas de l’étude de l’inflammation cérébrale, les études scientifiques montrent que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau, car les régions principales de cet organe (qui correspondent aux fonctions motrices et intellectuelles), et ses cellules sont très proches de celles de l’homme. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; les observations pourront donc être extrapolables au nouveau-né humain. Les différents temps d’exploration et de prélèvements choisis ensuite permettent de suivre les animaux jusqu’au stade jeune adulte.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colique humaine est greffée sous leur peau, puis elles reçoivent une injection quotidienne cinq jours par semaine pendant trois semaines et sont suivies plusieurs mois. Le porteur indique une possible douleur d'injection, une perte de poids et des tumeurs pouvant gêner la locomotion ou se nécroser. Il affirme que les mécanismes d'échappement à la chimiothérapie sont "impossibles à recréer in vitro" et vise à tester des nanoparticules d'acheminement de médicaments anticancéreux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'optimiser les propriétés pharmacocinétiques et la vectorisation sous forme de nanoparticules de silices de molécules induisant la dégradation ciblée d'un facteur transcriptionnel. La dégradation de cette proteine est cruciale car elle a été identifiée comme un marqueur de mauvais pronostic dans de nombreux cancers dont le cancer colorectal. Nous avons démontré que ce facteur de transcription était préférentiellement activé dans les cellules souches cancéreuses et qu’une diminution de son niveau d’expression sensibilise ces cellules à la chimiothérapie et retarde significativement la récidive tumorale. A ce jour il n’existe aucun inhibiteur pharmacologique utilisable en clinique. Ainsi, l’optimisation de molécules capables d'induire sa dégradation ciblée serait une avancée très prometteuse afin d’améliorer l'efficacité thérapeutique des traitements anti tumoraux.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra dans un premier temps de tester et d’optimiser l’efficacité in vivo de nanoparticules dans un modèle préclinique murin. A plus long terme, si ces résultats sont concluants, ils pourront potentiellement bénéficier aux patients comme stratégies adjuvantes afin d’optimiser l‘efficacité des traitements actuels.

Procédures

A l’âge de 7 semaines, les souris seront dans un premier temps greffées (une intervention de

Impact sur les animaux

Nous anticipons de légères nuisances (douleurs provoquées par la piqure avec une aiguille) liées à l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée ou aux injections intrapéritonéales des molécules testées, ainsi qu'une possible perte de poids (

Devenir

A l'issue des procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever et d'analyser les tumeurs résiduelles : analyses histologiques, analyses moléculaires et étude du potentiel tumorigène.

Remplacement

La croissance tumorale et les mécanismes d’échappement aux chimiothérapies sont des phénomènes complexes, mettant en jeu une multitude de paramètres, impossible à recréer in vitro d’où la nécessité de poursuivre la validation de ces stratégies avec une étude préclinique chez la souris immunodéprimée, modèle permettant de réaliser des greffes de cellules humaines. Cependant nous avons préalablement optimisé les informations obtenues, via notamment la mise en place de procédures de remplacement par des modèles in vitro et in cellulo afin de confirmer et de renforcer les résultats obtenus.

Réduction

Grâce à nos études antérieures, nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux requis pour ces expériences sans que cela se traduise par l'obtention de résultats moins fiables.

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux et nerveux, voici les conditions de raffinement qui seront mises en place: - elles seront hébergées en groupe, à raison de 5 souris cage, - l'environnement sera enrichie avec de la litière absorbante, la présence d'une petite maison en carton et ainsi que du matériel (copeaux, cotons) afin qu'elles puissent se fabriquer des nids. Nous allons aussi évaluer au moins deux fois par semaine l'état de santé de chaque souris (poids, taille des tumeurs, locomotion, posture) afin de déceler toute douleur subie. Nous avons aussi identifié des points limites justifiant l'euthanasie des animaux si nécessaire.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est le modèle utilisé couramment pour étudier l’initiation tumorale ou l’efficacité de traitements sur la croissance tumorale. Ne possédant pas de thymus, elle accepte la greffe de cellules tumorales humaines sans présenter de phénomène de rejet. Nous utilisation des souris adultes , âgées de 7 semaines minimum, afin de pouvoir réaliser des greffes avec une bonne prise de greffe tout en assurant aussi la bonne récupération des animaux après l'injection des souris ou les traitements par chimiothérapie.

1 224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de mélanome leur sont injectées et laissées proliférer pendant douze à quatorze jours, avec des injections complémentaires et un prélèvement de sang par incision de la queue le jour de la mise à mort. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer du stress et une douleur et altérer l'état général des animaux. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'étudier ces structures immunitaires tumorales et prélève tumeurs et organes après dissection.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur maligne agressive de la peau dont l’incidence ne cesse d’augmenter, représentant aujourd’hui près de 4% des cancers chez l’homme. L’immunothérapie est un nouveau traitement qui représente aujourd’hui l’un des piliers de la prise en charge thérapeutique du mélanome. Malgré les progrès de la prise en charge clinique et thérapeutique au cours des dix dernières années, les réponses obtenues restent insuffisantes et les patients échappent aux traitements lorsque la tumeur est métastasique. Aujourd’hui, des thérapies alternatives plus ciblées sont envisagées en prenant en compte le micro-environnement tumoral. Dans certains types de cancers et notamment dans le cas du mélanome, il a été montré la présence de structures particulières au sein même de la tumeur (TLS) qui sont des agrégats de cellules immunitaires très organisés. Ces structures se forment lors d’une inflammation notamment associée à la croissance tumorale. La présence, le nombre et l’organisation de ces TLS sont des facteurs prédictifs de la réponse au nouveau traitement par immunothérapie Le système endocannabinoïde (ECS) a montré un potentiel anticancéreux en modulant plusieurs voies impliquées dans la croissance, la différenciation, la migration et l'angiogenèse cellulaires et est, de fait, une nouvelle voie thérapeutique potentielle lors de pathologies cancéreuses. Nous avons récemment découvert au laboratoire un nouvel acteur dans l’ECS, l’enzyme GDE3. Nous avons montré que cette enzyme joue un rôle clé dans la migration de cellules immunitaires lui conférant un rôle protecteur lors de pathologies infectieuses et inflammatoires. Le but de ce projet est d'étudier le rôle de l'enzyme GDE3 dans les évènements clés de la progression du mélanome telles que la prolifération cellulaire, la migration des cellules tumorales et immunitaires ainsi que la résistance aux traitements anticancéreux par immunothérapie.

Bénéfices attendus

La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du mélanome et notamment pour l'amélioration de la réponse au traitement de patients montrant une résistance lors d'une immunothérapie.

Procédures

Les animaux utilisés dans ces procédures seront soumis à une injection de cellules en intra-péritonéale ou en intradermique suivies en fonction des lots par une injection en intra-péritonéale. Ils pourront être soumis à un prélèvement de sang par légère incision de la queue afin de réaliser des dosages biochimiques le jour de la mise à mort. Après la mise à mort, les tumeurs et les organes tels que la rate, les ganglions et la peau seront prélevés.

Impact sur les animaux

Durant l'expérimentation, les animaux seront soumis à 1 injection en intra-péritonéale ou intra-dermique suivie, en fonction des lots par 1 injection en intra-péritonéale pouvant provoquer du stress chez l'animal. D'autre part, des cellules tumorales de mélanôme murin étant injectées et laissées proliférer durant 12 ou 14 jours, il est possible que l'augmentation du volume tumoral induisent des nuisances telles que du stress et une douleur chez les animaux. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.

Devenir

Tous les animaux inclus dans chaque procédure seront mis à mort et disséquer afin de collecter les organes et la tumeur pour les différentes analyses.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative pour analyser le rôle du système endocannabinoïde dans la progression du mélanome et de la réponse immunitaire anti-tumorale. La formation des structures lymphoïdes tertiaires associées à l'efficacité de la thérapie de point de contrôle immunitaire ne peuvent avoir lieu que sur des modèles in vivo.

Réduction

Nous utiliserons des souris C57BL6 sauvages ou génétiquement modifiées permettant le développement de tumeurs par injection de cellules murines cancéreuses. Le nombre de 12 animaux par groupe expérimental avec 3 expériences indépendantes semble être le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs adaptés.

Raffinement

Pour les 2 procédures, et dans le but d'éviter et atténuer toute forme de souffrance des animaux, un contrôle quotidien sera effectué durant les 14 jours d'expérimentation. Après une pesée initiale le jour de l’injection des cellules tumorales, les animaux seront pesés tous les 2 jours. Durant toute la période d'expérimentation, l'état général et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement par le personnel de zootechnie. Un enrichissement du milieu sera ajouté (igloo, carrés de coton) pour permettre aux animaux de faire leur nid. Dans le cas où un animal montrerait une altération de son état général, il sera euthanasié. Tout le personnel de zootechnie et les expérimentateurs sont particulièrement bien formés et attentifs au bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle du fait de la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés déjà disponibles au laboratoire. Pour les deux procédures expérimentales, nous utiliserons des souris âgées d'au moins 8 semaines, c'est à dire adultes et matures notamment pour leur système immunitaire et qui correspond à ce qui est décrit dans la littérature.

1 296 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes, une infection chronique par le parasite Toxoplasma pouvant provoquer un syndrome fiévreux de sept jours, jusqu'à deux chirurgies sous anesthésie dont une injection intracrânienne bilatérale, puis des tests comportementaux d'anxiété, d'activité locomotrice, de force et de mémoire. Le porteur indique que les chirurgies stéréotaxiques peuvent entraîner angoisse ou prostration et que les souris sont tuées par dislocation cervicale pour prélever le cerveau. Il affirme que le remplacement "n'est pas applicable" car les études in vitro ne renseignent pas sur le comportement et la cognition.

Objectifs

La réponse aux cassures double-brin de l'ADN (CDB) et les facteurs qui y sont associés jouent un rôle majeur dans les mécanismes liés à l'apprentissage et la mémoire. Dans ce cas, les cassures sont transitoires et efficacement réparées par des mécanismes encore mal compris dans les neurones. Des dérégulations de la production ou de la réparation de ces cassures, qui aboutissent à leur accumulation, contribuent directement aux troubles mnésiques dans la maladie d'Alzheimer. Le projet a pour objectifs de déterminer l’importance de la détection, ou de la réparation des CDB dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, et les processus pathologiques liés à la neuroinflammation chronique ou à des infections du système nerveux central, que ce soit dans un modèle trangénique entrainants les symptomes de la maladie d'Alzheimer, ou d'une infection par Toxoplasma ou par l'expression isolée de médiateurs de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle de la détection des CDB, et de leur réparation dans les neurones au cours des infections du système nerveux central et la réponse neuro-inflammatoire, permettra, sur le plan fondamental d'élucider les mécanismes clés de la réponse aux CDB mis en jeux dans les neurones et leur importance pour la fonction cognitive. Sur le plan médical, ces recherches pourraient déboucher sur de nouvelles stratégies thérapeutiques contre des maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer pour laquelle aucun remède n'est connu.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections intrapéritonéales répétées journalièrement pendant 5 jours, sur animaux vigiles (Proc 1+2+3=648 souris, 5 jours, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection intrapéritonéale d'un parasite, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (Proc 2=216 souris, une injection de quelques secondes); iii) à deux types de chirurgies sous anesthésie générale: une de moins de 15 minutes (chirurgie cutanée, Proc 2+5= 324 animaux), ou/et une de moins de 40 minutes par animal (injection intracrânienne bilaterale, Proc 3+4+5 = 972 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété, l'activité locomotrice, la force et les processus cognitifs ( toutes les souris = 1296, sur 15 jours au total), la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde terminale (sans réveil, 1296 animaux, moins de 2 minutes).

Impact sur les animaux

Entre nos mains, nous n'avons observé aucun phénotype dommagable du fait de l'expression de transgène entrainant les symptomes de la maladie d'Alzheimer. Les souris iH2A.X KO ne présentent aucun phénotype délétère au cours de leur vie, ce que nous avons confirmé lors de leur utilisation dans le cadre du premier protocole APAFIS autorisé pour cette lignée. Dans le cas d'infection par Toxoplasma ou l'infusion chronique de cytokines pro-inflammatoires par implantation de pompes sous cutanées, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies stéréotaxiques peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Du fait que les animaux sont acclimatés à l'environnement des tests comportementaux et sont habitués aux expérimentateurs par manipulations régulières des animaux dans les semaines précédents les tests, aucune nuisance n'est constatée durant les tests comportementaux. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes, où les souris doivent être hébergées individuellement, l'hébergement pourrait devenir anxiogène mais des mesures d'enrichissiment du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

Quelle que soit la procédure de 1 à 5, les 1296 animaux au total seront en fin de procédure mis à mort par dislocation cervicale. La mise à mort est nécessaire afin de prélever les organes en post-mortem (dont le cerveau) des animaux pour comprendre ensuite au niveau cellulaire et moléculaire, les causes et mécanismes des changements observés au niveau comportemental, et limiter le double-emploi au maximum. Ces prélèvements post-mortem sont aussi nécessaires afin de confirmer l'efficacité de la procédure (KO de H2A.X, infection chronique par le parasite du cerveau, présence de cytokine dans le parenchyme cérébral, expression localisée de l'amyloid beta ou des FR).

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant aux cassures doublebrins de l’ADN. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 3 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 3 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement, cachettes et objets à ronger) . Une surveillance journalière par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences).

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel du parasite Toxoplasma gondii, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques la réponse aux CDB dans les neurones dans le cadre d’une infection naturelle. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés (KO inductibles, et modèles exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux déficients pour H2A.X n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieurs à 4 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulation sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.

238 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de cadmium cinq jours par semaine, des greffes sous-cutanées de cellules de cancer du pancréas ou du foie et des injections de candidats-médicaments. Le porteur indique qu'un point limite est fixé au volume tumoral de 1 500 mm3, à une perte de poids dépassant 20 % ou à une ulcération de la tumeur, seuils au-delà desquels les souris qui se dégradent sont mises à mort. Il affirme que la cinétique de cette progression cancéreuse ne peut être reproduite in vitro et prélève tumeurs et organes après la mise à mort.

Objectifs

Les différents objectifs sont de tester l’effet du cadmium sur l’apparition et la progression des stades néoplasiques (appelés pancreatic intraepithelial neoplasia = PanIN) et de caractériser les rôles des gènes d’intérêt et de tester de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires du cancer et identifier à terme de proposer de nouveaux candidats médicaments dans une pathologie qui manque de traitement efficace.

Procédures

Nous réaliserons un modèle d'exposition au Cadmium (par injection intrapéritonéale) sur des souris normales et sur un modèle préclinique de lésion néoplasique pancréatique . (Procédure 1) Lot1: Effet Cadmium sur souris contrôles. Injection 5x par semaine pendant 2 (4 condtions = 24 souris) ou 4 semaines (24 souris) Lot2: Effet Cadmium sur souris développant des lésions néoplasiques dans le pancréas. Injection 5x par semaine pendant 1 mois (4 conditions = 40 souris) ou 3 mois (40 souris) Nous réaliserons un modèle de xénogreffe sous cutanée de cellules d'adénocarcinome pancréatique (par injection sous cutanée sur le flanc des souris) (Procédure 2). Certaines de ces souris recevront des injections hebdomadaires de candidats médicament (ciblant des interactions de recepteurs à la surface cellulaire) (Procédure 3). Lot3 à 6 xénogreffes de cellules de cancer pancréatiques (panel de 4 lignées représentatives de l'hétérogénéité des cancer pancréatiques) non traité (PBS) et molécule X (traitement 1 fois par semaine pendant 6 semaines). Les lots 7, 8 et 9 sont un modèle de xénogreffe sous cutanée de cellules de cancer du foie. (Procédure 2). Ces souris sont ensuite suivies pendant 2 mois jusqu'à la fin de l'expérience (mesure du volume tumoral). Le Lot10 concerne des souris développant des lésions néoplasiques dans le pancréas pour lesquelles une injection heddomadaire du candidat médicament est réalisé (procédure 3). 2 conditions (traitées, non traitées) = 20 souris suivies pendant 2mois. Récapitulatif des durées: procédure 1: 4 semaines à 3 mois (selon la condition, voir ci dessus); procédure 2: 6 à 8 semaines (selon la condition); procédure 3: 2 mois

Impact sur les animaux

Les injections de cadmim (procédure 1) sont réalisées en intra-péritonéal. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Les xénogreffes sous cutanées (procédure 2) sont réalisées par une injection en sous cutanée. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Les injections de candidat médicament (procédure 3) sont réalisées en intra-péritonéal. induction éventuelle d'une douleur légère de très courte durée. Concernant les xénogreffes, un point limite (1500mm3) sera appliqué (taille de la tumeur au-delà de laquelle, l’expérimentation est stoppée). (1) la masse de la tumeur ne devrait augmenter ni au point d’interférer significativement avec les fonctions normales du corps ni au point d’induire, du fait de son emplacement, souffrance et/ou détresse (tumeurs solides). (2) une perte de poids dépassant 20 % du poids du corps d’un animal normal (en tenant compte de la masse tumorale) ; (3) une ulcération/infection à l’emplacement de la tumeur ; - la charge tumorale ne devrait pas excéder 10 % (typiquement à un diamètre de 17 mm pour une souris de 25 g).

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures. Nous prélevons la tumeur et/ou le pancréas et les sites majeurs de métastases (foie, poumon) pour des études de biologie moléculaire et de biochimie.

Remplacement

Il s’agit de l’étude d’un modèle physiopathologique préclinique de progression carcinogénétique dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro. Toutefois, la selection des gènes d'intéret et des candidats médicaments ciblant MUC4-ErbB2 sera réalisée au préalable sur des modèles in vitro et d'organoïdes d'adénocarcinomes pancréatiques ou hépatiques

Réduction

e nombre d’animaux par groupe est prévu pour avoir un effectif suffisant (suivant la règle des 3R) permettant une analyse statistique significative. Pour l'apparition de lésions néoplasiques (appelées PanIN), nous analyserons 6 souris par groupe car il s'agit d'une analyse qualitative (présence ou absence de PanIN). Pour l'étude de progression des lésions néoplasiques, nous analyserons 10 souris par groupe car les modèles transgéniques de cancer pancréatiqeus présentant une plus grande hétérogénéité de surface de lésions néoplasiques . Les effectifs ont été calculés statistiquement. Pour l'analyse Les xénogreffes donnant des résultats homogènes seront étudiées sur des cohortes de 6 souris par groupe.

Raffinement

Le nombre de cohorte a été optimisé pour réduire le nombre de souris. Une surveillance accrue est effectuée avec un suivi régulier de l'état général des souris. Nous serons particulièrement attentifs à la détection précoce de tout signe de douleur. Nous surveillerons les courbes de poids de souris et rechercherons les signes de stress et de douleur. Une injection sous cutanée de buprénorphine sera realisée en cas de douleur. Si les signes de douleur persistent, un sacrifice anticipé sera effectué. Pour les xénogreffes, un point limite sera appliqué (taille de la tumeur au-delà de laquelle, l’expérimentation est stoppée).

Choix des espèces

Modèle de souris transgénique référence pour l'apparition de lésions néoplasiques pancréatiques (appelées souris KC). Les expériences seront réalisées sur des souris agées de 3 mois pour les souris KC. Ces souris présentent une mutation Kras constitutivement active qui contruit à pancréas comportants des lésions néoplasiques (appelées PanIN). Modèle standard de xénogreffes en souris immunodéprimées (Scid) permettant l’implantation de lignées cellulaires