Rongeurs
Développement d’un modèle animal d’étude des delta-virus dans le foie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection unique dans la veine de la queue destinée à faire répliquer le virus de l'hépatite D, certaines développant des tumeurs du foie avant d'être tuées pour prélever le foie et le sang. Le porteur affirme que ces tumeurs n'affectent guère l'animal, le foie étant peu innervé, et qu'il les collecte avant qu'elles ne gênent. Il indique avoir mené le maximum d'expériences sur lignées cellulaires et présente le passage in vivo comme nécessaire à l'étude de l'inflammation hépatique.
Objectifs
Le virus de l’Hépatite D (VHD), infecte le foie humain et cause de profondes modifications de l’organe. Une co-infection avec le virus de l’hépatite B (VHB) mène souvent au développement d’une cirrhose puis d’un cancer du foie (carcinome hépatocellulaire). Ce cancer, dont l’incidence est en constante augmentation, constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde, du fait d’un manque de traitement efficace. Bien qu’il existe un vaccin qui protège contre le VHB et VHD, les personnes déjà infectées (environ 20 millions de personnes dans le monde infectées par le VHD) n’ont aucune option thérapeutique. Le but de notre projet est de développer un modèle de réplication du VHD chez la souris afin de : 1- étudier les perturbations du foie liées à la réplication de ce virus, notamment déterminer les perturbations de la cellule infectée par le virus, l’hépatocyte. 2- évaluer dans ce modèle la pathologie causée par des virus de la même famille, découverts récemment dans plusieurs espèces animales (rongeur et serpent pour ce projet).
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie causé par le virus de l'hépatite D. Ils pourront aussi aider à mieux évaluer les pathologies qui pourraient être causées par les virus de la même famille (retrouvés chez les rongeurs ou les serpents), ce qui n’a jamais été évalué chez l'animal. Finalement, à plus long terme, le développement de ce modèle pré-clinique pourrait contribuer à accélérer le développement d’antiviraux très attendus, qui inhiberaient la réplication de cette famille de virus. Trouver des antiviraux efficaces contre cette famille de virus reste un besoin médical de première importance, sachant qu’aucune molécule actuelle n’arrive à éliminer complètement la réplication du VHD chez les patients infectés.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule injection dans la veine caudale (15 secondes).
Impact sur les animaux
Les effets sont, pour certains animaux, le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Les animaux sont évalués quotidiennement (avec une grille d’évaluation) pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et du sang pour analyses.
Remplacement
Nous avons effectué le maximum d’expériences sur des lignées cellulaires en testant la réplication des réplicons de différentes espèces, il est désormais nécessaire de réaliser les expériences in vivo, notamment pour l’étude de l’inflammation dans le tissu hépatique. Dès que possible, nous rebasculerons sur les lignées cellulaires pour caractériser les perturbations de la cellule induites par la réplication virale.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique. Nous avons calculé avec le service de statistiques de notre institut que le nombre minimal d’animaux par groupe doit être de 10. Nous nous sommes limités aux expériences indispensables, notamment en réduisant le nombre de points analysés après l'injection.
Raffinement
Nous avons planifié rigoureusement (notamment en suivant les recommandations européennes) et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences précédentes montrent que les procédures expérimentales proposées préservent le bien-être animal. Une grille de score a été mise en place pour l’observation quotidienne des animaux afin de d’euthanasier les animaux et collecter les foies avant le développement éventuel de gêne liée à la présence de tumeurs.
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenues par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).
Evaluation de la toxicité orale aiguë de composés naturels et de nouveaux aliments administrés chez le rat femelle Wistar
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 200 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après un jeûne de seize heures, chaque animal reçoit par voie orale une dose unique d'un des cinquante composés testés puis est observé quatorze jours avant euthanasie et autopsie, pour évaluer la toxicité de nouveaux aliments. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur ne peut être administré dans une étude de toxicité, un animal convulsant ou paralysé étant mis à mort. Il retient les femelles, jugées plus sensibles, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer la toxicité sur un "organisme entier".
Objectifs
La toxicité est la mesure de la capacité d’une substance à provoquer des effets néfastes et mauvais pour la santé ou la survie chez toute forme de vie (animale telles qu’un être humain, végétale, bactérienne...), qu'il s'agisse de la vitalité de l'entité ou d'une de ses parties (ex: foie, reins, poumons.... chez l'animal). La toxicité orale aiguë est l'effet néfaste qui se produit dans un court laps de temps et qui résulte de l'administration par voie orale d'une dose unique d'une substance. Une étude de toxicité aiguë aboutit classiquement à la détermination de la dose maximale tolérée (DMT). La DMT orale est la valeur dérivée d'une dose unique de substance dont l'administration par voie orale peut provoquer la mort de 50 % des animaux d'expérience. C'est une technique exploratoire, permettant de "trier" les produits les plus toxiques et le but d’une étude de toxicité orale aiguë est d'évaluer les effets d'une forte exposition, préalablement à la réalisation d’études de toxicité avec une exposition pendant 90 jours. L’objectif de ce projet d’une durée de 5 ans, réalisé selon les exigences réglementaires de lignes directrices, sera d’évaluer la toxicité éventuelle de 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments, administrés par voie orale en traitement unique en prenant une dose de départ selon les données d’études in vitro effectuées au préalable. Ces études seront réalisées chez des rats femelles uniquement, celles-ci étant considérées comme étant plus sensibles que les mâles aux effets toxiques potentiels de substances. Après mise à jeun la veille au soir, les animaux seront traités le lendemain matin par une administration orale unique de chacun des composés à tester. Les animaux seront ensuite observés et évalués pendant 8 heures après l’administration orale de chacun des 50 composés à évaluer, l’aliment usuel étant redonné 3 heures après l’administration orale, puis les animaux seront observés deux fois par jour au minimum au cours des 14 jours de suivi, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout comportement anormal ou atteinte de point limite pouvant nécessiter leur euthanasie. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 14 jours de suivi jusqu’à leur euthanasie avant la réalisation d'une autopsie macroscopique.
Bénéfices attendus
Un nouvel aliment, appelé également Novel Food, reste défini dans le Règlement de l'Union Européenne comme étant un aliment pour lequel la consommation humaine est restée négligeable dans l’Union Européenne avant le 15 Mai 1997, lorsque la première réglementation sur les nouveaux aliments est entrée en vigueur. Les nouveaux aliments ne peuvent pas être mis sur le marché ou utilisés dans des denrées alimentaires destinées à la consommation humaine tant qu’ils ne sont pas inscrits sur la liste de l’Union Européenne, qui stipule les spécifications du nouvel aliment et ses conditions d’utilisation dont la notion de dose, et regroupant les nouveaux aliments autorisés à être mis sur le marché dans l’Union Européenne. Une demande dite Novel Food doit prouver la sécurité du nouvel aliment et sera transmise aux autorités pour évaluation. Un tel dossier a pour objectif de caractériser le nouvel aliment et prouver sa sécurité à travers des tests toxicologiques notamment. L’enjeu social est donc de prouver l’absence éventuelle de toxicité des 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments pour une utilisation future chez l’homme et d’un point de vue économique de permettre le développement de la consommation de ces 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments par l’industrie agro-alimentaire afin de proposer de nouvelles solutions pour l’alimentation de demain.
Procédures
La totalité des rats utilisés dans ce projet, entre 300 et 1200 au maximum, sera soumise à une mise à jeun de 16 heures (20h00-12h00), une administration orale unique d’un composé à évaluer effectuée sur animale vigile nécessitant une dizaine de secondes pour être réalisée, à des observations régulières, chaque heure pendant 8 heures puis 2 fois par jour pendant 14 jours suivant l’administration orale, avec la réalisation de tests de réflexe de retournement, 1 par heure pendant 8 heures suivant l’administration orale unique effectuée, réalisé en moins d’une minute à chaque fois.
Impact sur les animaux
Au cours de l’évaluation de la toxicité orale aiguë de 45 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous avons menée sur un projet précédemment autorisé, après administration d’une forte dose unique de chacun de ces composés, nous n’avons observé aucun signe de toxicité pour l’ensemble de ces 45 composés évalués, aucune perte de poids significative, aucun comportement anomal, et surtout aucune mortalité ni directe ni retardée. Les observations effectuées sur l’ensemble des organes et tissus après euthanasie des animaux n’ont jamais montré d’anomalies liées à l’administration des 45 composés évalués, en dehors de quelques anomalies spontanées retrouvées dans la souche de rat même sans aucun traitement. Nous ne devrions pas non plus observer de toxicité pour les 50 nouveaux composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous serons amenés à évaluer dans ce projet, d'autant que des points limites stricts et spécifiques à celui-ci seront suivis afin de ne pas observer de mortalité ou dans de très rares cas.
Devenir
Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 1200 rats au maximum nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés avant la réalisation d’une autopsie macroscopique des organes et tissus pour s'assurer de l'innocuité des composés testés.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer la toxicité d’ingrédients et d’aliments sur un organisme entier. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ces évaluations toxicologiques permettant d’obtenir des résultats prédictifs quant aux objectifs envisagés, selon les recommandations internationales en vigueur. La dose de départ la plus élevée possible sera déterminée sur la base des résultats d’études in vitro effectuées sur les composés à évaluer afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Ainsi, et sur la base de l’évaluation de la toxicité orale aiguë de 45 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous avons menée sur un projet pécédemment autorisé et pour laquelle nous n’avons observé aucun signe de toxicité pour l’ensemble de ces 45 composés évalués à partir d’une dose de départ de 2000 mg/kg correspondant à la dose limite à utiliser, nous devrions avoir à utiliser seulement 6 animaux pour chacun des 50 nouveaux composés à évaluer, soit un maximum de 300 animaux. Cependant, en cas de toxicité avérée, ce nombre pourrait être porté au maximum à 24 animaux pour chacun des 50 nouveaux composés à évaluer, soit un maximum de 1200 animaux. Aucune analyse statistique ne sera effectuée pour l’ensemble de ce projet.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’administration orale des composés à évaluer et à la suite de celle-ci. Les animaux seront ainsi observés chaque heure pendant 8 heures après l’administration orale de chacun des 50 composés à évaluer, l’aliment usuel sera redonné 3 heures après l’administration orale, avec réalisation d’un test de réflexe de retournement toutes les heures. Ils seront ensuite observés deux fois par jour au minimum au cours des 14 jours de suivi, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout comportement anormal ou atteinte de point limite. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 14 jours de suivi jusqu’à leur euthanasie avant la réalisation d’une autopsie macroscopique. Etant donné qu’il s’agit d’études de toxicité, aucune médication ne pourra être donnée aux animaux pour soulager leur éventuelle souffrance. Par contre si un animal présente un niveau de souffrance trop important se traduisant par des tremblements importants (convulsions), une paralysie, une immobilité complète, un arrêt de prise alimentaire…, il sera mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Le jour et l’heure de son euthanasie seront notés avec le plus de précision possible et une autopise macroscopique sera réalisée pour détecter toute anomalie en terme de forme, taille et couleur sur l’ensemble des organes et tissus des cavités abdominales et thoraciques et de la surface corporelle. Une analyse des organes et tissus anormaux observés, prélevés et fixés sera réalisée. Les rats seront hébergés par 3 dans des cages transparentes (48x27x20 cm), avec pour enrichissement une maisonnette ouverte (16x15x9 cm), en matière spéciale certifiée sans contaminant, transparente, lavable, et suffisamment grande pour que les 3 rats puissent s’y positionner dessous. Cet enrichissement sera toutefois retiré lors de la mise à jeun des animaux jusqu’à la remise de l’aliment usuel dans la cage, soit pendant une durée de 16 heures, pour éviter qu’ils ne le grignotent et ingèrent des particules pouvant induire un effet toxique. Les rats étant des animaux nocturnes, actifs donc la nuit, ils seront placés en cycle de lumière jour/nuit inversé (obscurité de 8h00 à 20h00) pour respecter leur rythme biologique et observer leur comportement pendant leur phase active.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet et celle qui est recommandée par les lignes directrices suivies pour mener de telles études de toxicité orale aiguë. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 175-200 g. Cela correspond au poids de rat recommandé par les lignes directrices qui seront suivies pour mener de telles études.
Etude de l’implication de la voie de synthèse de la dopamine dans les processus motivationnels dans un contexte de stress précoce ou d’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 010 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et deux cents réutilisées dans d'autres protocoles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent un stress néonatal ou un régime obésogène, puis une chirurgie stéréotaxique injectant un virus dans le cerveau, des prises de sang à la queue et des tests comportementaux avec privation alimentaire. Le porteur attend un comportement anxieux ou dépressif chez les souris stressées ou rendues obèses, objet même de l'étude sur la dépression humaine. Il affirme que l'étude des facteurs environnementaux et du comportement ne peut se faire que sur animal vivant et rattache les retombées aux troubles de l'humeur.
Objectifs
La dépression représente un problème de santé publique majeur. Parmi les facteurs impliqués dans la vulnérabilité à la dépression, l’adversité dans l’enfance et l’obésité associée au mode de vie sédentaire et aux habitudes alimentaires occidentales sont des facteurs de risques importants. Cependant, les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la dépression restent mal connus. Des travaux récents suggèrent que des processus inflammatoires et des dysfonctions du système dopaminergique mesocorticolimbique contribuent à la physiopathologie de certains symptômes dépressifs. L’objectif de ce projet est d’examiner les effets du stress précoce et de l’inflammation liée à l’obésité dans l’apparition désordres émotionnels à l’âge adulte et de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacents. Pour cela nous utiliserons des méthodes de transfert de gènes viraux chez des souris ayant subies un stress néonatal ou rendues obèses à l’âge adulte pour moduler la transmission dopaminergique. Un total de 1010 animaux est envisagé pour ce projet. L’étude de l’impact des facteurs environnementaux et du comportement ne peut être réalisée que sur animaux vivants, rendant impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l’inconfort des animaux.
Bénéfices attendus
Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la perte de motivation associée au stress précoce et à l’obésité, et plus précisément le rôle de la voie GTP-CH1. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte d’obésité.
Procédures
- Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue (7 prélèvements sur 2 heures représentant moins de 100uL de sang) sur une partie des animaux vigiles pour mesurer différents paramètres métaboliques. - Des injections intrapéritonéales seront réalisées pour évaluer la sensibilité des animaux à l'insuline. - L’ensemble des souris sera soumis à une chirurgie stéréotaxique afin d'injecter un virus recombinant dans une région spécifique du cerveau. Cette procédure sera réalisée une seule fois sur chaque animal. - Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire.
Impact sur les animaux
- Un comportement anxieux et/ou de type dépressif est attendu chez les souris soumises au stress précoce et au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. - L’exposition chronique au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris. - La chirurgie peut être cause de douleur chez l’animal. Le stress thermique induit par l’anesthésie est contrôlé par l’installation des souris sur un tapis chauffant assurant un maintien de la température à 37°C. Le dessèchement oculaire potentiel est prévenu par l’application d’un gel ophtalmique. - Les injections et prises de sang peuvent être cause de douleur pour l’animal. - Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère et un isolement en cage individuelle le temps de la procédure.
Devenir
Les mères, mâles reproducteurs et mâles C57Bl/6 utilisés pour le screening (200 animaux) seront préférentiellement réemployés dans d’autres protocoles. Le reste des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures.
Remplacement
L’objectif du projet est de mieux comprendre chez l'animal les mécanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur induits par un stress précoce ou une exposition chronique à un régime obésogène. L’emploi de modèles animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie par l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.
Réduction
Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié. Le nombre total d’animaux est susceptible d’être revu à la baisse en fonction du succès des reproductions.
Raffinement
- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant certaines expériences, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille de score. Si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera sacrifié dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permettent un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. De plus, ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. - La procédure de stress précoce sera réalisée sur des femelles lactantes. - Concernant la cohorte impliquant la mise en place d’un phénotype obèse, les souris seront mises sous régime obésogène ou contrôle à partir du sevrage, pour une durée de 15 semaines. Ce choix repose sur les données de la littérature, notamment issues de notre laboratoire, montrant qu’un début d’exposition au régime obésogène au stade de l’adolescence induit des perturbations métaboliques mais aussi de la sphère émotionnelle, majorées, comparativement à une exposition plus tardive (stade adulte). - La suite des expériences (études comportementales, évaluation de la transmission dopaminergique) sera réalisée à l’âge adulte, 15 semaines après le sevrage.
Développement d’une solution préventive des infections urinaires chez la femme
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
70 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, vingt-quatre en gravité légère et quarante-six en gravité modérée. Elles reçoivent jusqu'à quatre administrations d'une solution non dévoilée sous anesthésie gazeuse et subissent des anesthésies répétées à l'isoflurane sur quatre semaines, avant d'être tuées pour analyse histologique. Le porteur garde le produit secret, non breveté, et le présente comme une alternative aux antibiotiques contre les cystites récidivantes. Il affirme "incontournable" le recours à l'animal, les modèles artificiels ne reproduisant pas selon lui la physiologie du système urogénital.
Objectifs
La cystite aiguë est une infection urinaire localisée au niveau de la vessie très fréquente chez la femme. Elle survient consécutivement à l’entrée de bactéries naturellement présentes dans le tube digestif (Escherichia coli dans 90% des cas) par le méat urinaire. Ces bactéries remontent dans l’urètre pour atteindre la vessie et se multiplier, ce qui provoque l’infection. Les symptômes de ces infections urinaires sont notamment une pollakiurie (envie fréquente d’uriner) et une miction douloureuse accompagnée de brûlures mictionnelles. Malgré l’existence de compléments alimentaires préventifs, conjuguée à l’application des mesures hygiéno-diététiques, ces cystites peuvent être récidivantes et impactent le quotidien des femmes. En cas d’infection, le recours à une antibiothérapie (administration orale d’antibiotiques monodoses) est la règle, exposant à des risques d’antibiorésistance. Ainsi, de nombreuses femmes utilisent déjà les différentes solutions de prévention mais aucune n’est pleinement satisfaisante. Dans ce contexte, ce projet consiste à développer une solution de prévention des infections urinaires bactériennes chez la femme. La solution que nous développons est une alternative aux antibiotiques. Nous n’en dirons pas plus sur cette dernière qui n’est pas encore brevetée et est tenue par le secret industriel.
Bénéfices attendus
L’un des traitements en première instance des cystites aiguës est l’utilisation d’antibiotique en dose unique. L’antibiorésistance constitue un problème majeur de santé publique et il est primordial de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques ou préventives évitant l’utilisation répétée d’antibiotiques. Cette solution préventive représente une alternative prometteuse ne nécessitant pas de substance active tel que les antibiotiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1) 4 administrations maximum sous anesthésie gazeuse à raison de une fois par semaine ; 2) des anesthésies gazeuses à l’isoflurane de courte durée (5 anesthésies par semaine de 5 minutes environ, pendant 4 semaines maximum).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress léger à modérée lié à la répétition des anesthésies à l’isoflurane pour l’étude en imagerie. Dans de rare cas, les rats pourraient ressentir une gêne au niveau du site d’administration (inflammation légère à modérée) qui pourra se traduire par des comportements anormaux de léchage ou grattage excessif, auquel cas la procédure sera stoppée et l’animal mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et certains organes seront prélevés en vue d’effetuer une analyse histologique des tissus.
Remplacement
La solution de prévention des infections urinaires a été évalué dans des systèmes de simulation in vitro mais il devient nécessaire de le tester maintenant dans des conditions physiologiques et le recours à l’animal est incontournable car les modèles artificiels ne nous permettent pas de mimer parfaitement la physiologie du système urogénital. Ce dispositif étant amené à être utilisé de manière répétée pour des cystites chroniques, il est nécessaire de reproduire dans le temps son administration afin d’évaluer sa bonne tolérance (étude histologique des tissus) et ceci ne peut être réalisé que chez l’animal.
Réduction
Nous avons 6 formulations à tester (5 + 1 de référence). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé nous avons prévu une étude pilote qui permettra : 1) la mise au point technique du modèle avec la formulation de référence (12 rats au maximum) ; 2)une pré-évaluation des 6 formulations sur 2 rats pour sélectionner celles répondant au cahier des charges et d’éliminer les autres. Au maximum, les 4 meilleures formulations entreront dans la procédure 2 où nous poursuivrons l’étude sur un plus grand nombre d’animaux afin d’évaluer et valider leur performances de prévention des infections urinaires après une première administration puis, pour les formulations confirmées, après des administrations répétées, sur la base de une fois par semaine pendant un mois. L’objectif est que la solution de prévention soit efficace pour au moins 80% des animaux. Pour avoir un résultat statistiquement fiable, le nombre de rats nécessaire par groupe expérimental est estimé à 11.
Raffinement
Les procédures se feront sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les animaux seront manipulés par la personne en charge de l'expérimentation pendant la période d'acclimatation afin de les habituer et ainsi diminuer le stress le jour de la procédure. Ils seront surveillés pendant toute la durée de la procédure afin de repérer des signes cliniques éventuels de gène ou de mal-être et des points limites adaptés seront mis en place et strictement appliqués. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi afin de favoriser les interactions et leur bien-être.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats femelles Sprague Dawley qui sont largement utilisés dans les études sur les pathologies du tractus urinaire et lesquelles une large bibliographie existe. Les rats seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines, 200-250g) car le dispositif étudié est destiné pour les adultes.
cmRNAbone souris : Etude de la biocompatibilité de biomatériaux cellularisés
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
120 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau d'un biomatériau osseux, avant d'être tué pour l'analyse histologique des tissus. Le porteur indique que l'implantation peut provoquer une gêne ou une douleur légère et fixe un seuil d'euthanasie. Il décrit cette étape sur souris comme un préalable à des essais sur os de rat puis chez le "gros animal", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation.
Objectifs
En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Notre projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse, qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matériaux personnalisés qui permettraient d'aboutir à une meilleure réparation osseuse par la stimulation conjointe de la réparation des nerfs, des vaisseaux et des os. Ici, il s’agit de réaliser une première évaluation de nos matériaux en les implantant sous la peau de souris, en préalable à des expérimentations sur site osseux chez le rat. Cette évaluation servira deux objectifs : d’une part, évaluer la biocompatibilité (réaction inflammatoire, réaction à corps étranger, …), et d’autre part évaluer la fonctionnalité (formation osseuse, vascularisation, innervation) des produits, pour définir la ou les formulations les plus appropriées pour l’application chez le rat en modèle de réparation osseuse.
Bénéfices attendus
Les résultats des expériences d’implantation de nos matériaux menées sur modèle souris sont un préalable à la poursuite des travaux sur site osseux chez le rat. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau et/ou l'un des gènes administrés conduiront à l’abandon de l’élément mis en cause. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager dans un premier temps les expérimentations en site osseux chez le rat, et dans un deuxième temps le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée de 5 à 10 minutes)
Impact sur les animaux
L'implantation sous-cutanée peut entraîner une gêne voire une douleur légère. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie selon les standards européens. Au-delà d'un certain seuil, l’animal sera euthanasié sans attendre.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de leur temps expérimental pour procéder à une analyse histologique des tissus de la région opérée.
Remplacement
L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel régénératif de celui-ci. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).
Réduction
Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Les échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux. La possibilité d'implanter au moins deux matériaux par animal, de réaliser un suivi longitudinal, d'analyser plusieurs paramètres à partir des mêmes prélèvements sur animaux après euthanasie, permet de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés.
Raffinement
L’opération est réalisée sous anesthésie générale. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques sont utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. En cas de lésion sérieuse ne pouvant être traitée par suture et/ou antiseptique, l’animal est euthanasié. La cage reçoit un surcroît d’enrichissements le jour de la chirurgie de manière à distraire l’animal de la gêne liée à la présence du matériau implanté, et ainsi limiter les risques d’arrachement de l’implant, de rupture des points de suture, et d’infection de la plaie.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris présentant une immuno-déficience marquée, adaptée à l'implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Les souris seront implantées à l'âge de 7 à 12 semaines. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´implantation sous-cutanée.
Mise en place des modèles oncologiques chez la souris NSG par greffe en zone sous-cutanée auriculaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 425 souris immunodéprimées vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et soixante reproductrices réutilisées, dans des procédures de gravité légère à modérée. Elles reçoivent la greffe d'un tissu dans le pavillon de l'oreille puis l'injection de cellules tumorales humaines, suivies d'un traitement candidat et d'un suivi par imagerie, pour mettre au point un modèle de xénogreffe. Le porteur décrit des risques d'ulcération, de démangeaisons et d'automutilation au site de greffe. Il présente ce modèle comme un "raffinement" réduisant l'invasivité des greffes en oncologie et affirme "indispensable" le recours à l'animal, la culture cellulaire ne reproduisant pas l'environnement tumoral.
Objectifs
La recherche en oncologie est principalement menée sur la souris en injectant des cellules en sous cutanée ou en réalisant des greffes au niveau des organes concernés. Ces protocoles éprouvés permettent de réaliser la recherche de nouveaux traitements toujours plus efficaces. Cependant, ces méthodes présentent des limites qui sont le tissu non spécifique pour les injections en sous cutanée et l’inaccessibilité des cellules tumorales suite à la greffe de celles-ci. Ce projet vise à générer un nouveau modèle en oncologie qui permettrait de réduire et raffiner les approches d’expérimentation animale avec techniques de greffe et d’injection de cellules, mais également de se rapprocher toujours plus des conditions physiopathologiques des cancers dans lesquels le microenvironnement de la tumeur joue un rôle important. Il s’agit d’un modèle de xénogreffe humanisée dans le pavillon de l'oreille de souris immunodéprimées : un tel site, directement accessible à une observation facile in vivo notamment par imagerie par transparence, offre la possibilité d’un suivi dans le temps par imagerie in vivo ce qui de facto réduit le nombre d’animaux nécessaires. Pour élaborer notre modèle, nous utiliserons une lignée de souris immunodéprimée NSG et donc tolérante à différents types de greffe ou d’injection. Dans un premier temps, le tissu cible des cellules tumorales sera greffé afin de créer l’environnement favorable facilement accessible pour y injecter dans un second temps les cellules tumorales. Les cellules tumorales se retrouveront alors directement dans leur tissu de prédilection, au plus proche des conditions retrouvées lors des pathologies. Si ce modèle se montre concluant (croissance tumorale et vascularisation), des molécules à visée pharmaceutique connues seront testées. Grâce à l'étude de tissus humains dans un environnement in vivo, un tel modèle peut offrir une méthode au plus proche des conditions physiolopathologiques retrouvées chez les patients atteints par un cancer. Dans une logique de médecine du futur, ce modèle permet d’envisager une étude personnalisée de la maladie d’un patient afin de déterminer le traitement le plus efficace.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont tout d’abord de proposer un modèle innovant en oncologie et tout autre champ d’application comme par exemple les maladies neurodégénératives, la virologie etc... Ce modèle utilise l’oreille de la souris comme tissu cible de la greffe ou de l’injection. Les feuillets très fins qui composent ce tissu le rendent presque transparent ce qui permet de réaliser, de manière simplifiée, un suivi in vivo des processus cellulaires par fluorescence. Ces suivis sont déjà réalisables mais nécessitent une procédure expérimentale lourde pour l’animal, ou un faible niveau de résolution optique. Avec des cellules préalablement marquées à l’aide de fluorochromes, ce modèle permet une accessibilité facilitée à l’acquisition des processus cellulaires in vivo et donc à la réalisation d’études cinétiques du suivi de l’évolution tumorale. Ce projet permettra aussi d’étudier différents types de cellules tumorales dans un tissu humanisé et préalablement greffé. En effet, une grande partie des études en oncologie utilise des injections sous-cutanées pour faciliter l’étude des cellules tumorales. Ici, il est proposé d’injecter des cellules tumorales directement dans leur tissu cible, afin d’avoir un modèle plus proche des conditions pathologiques. De plus, ce modèle permettra un raffinement des greffes chez la souris puisque seule l’oreille sera opérée, avec une cicatrisation très simple, en remplacement d’interventions chirurgicales plus invasives en fonction du type de greffe. En plus de faire progresser et d’étoffer les connaissances scientifiques en oncologie, ce projet permettra d’établir un nouveau modèle qui permettra à terme de limiter le nombre d’animaux utilisés, d’alléger les interventions, et de faciliter l’accès à l’imagerie in vivo
Procédures
En fonction de la procédure, les animaux seront soumis au maximum à une intervention chirurgicale d’une trentaine de minutes pour greffer le tissu dans le pavillon de l’oreille. Cette greffe pourra être suivie par une injection de cellules tumorales dans le greffon 2 semaines après (intervention d’une quinzaine de minutes). Ces deux actes seront effectués sous analgésie et anesthésie générale. Deux semaines après, les souris seront soumises à minima à une contention de quelques minutes et à maxima à une anesthésie générale de 15 minutes pour réaliser l’imagerie. L’acquisition des images n’est pas invasive pour l’animal et sera répétée toutes les deux semaines jusqu’à la fin de la procédure. Une semaine après l’injection des cellules tumorales, l’administration d’une molécule candidate pour un traitement sera réalisée par injection sous anesthésie (15 minutes).
Impact sur les animaux
Des effets indésirables suite à la greffe de tissu dans l‘oreille pourraient être observés chez les animaux, même si une procédure expérimentale récente rapporte qu’en pratique ce n’est pas le cas. Les souris pourraient présenter une ulcération au niveau de la greffe deux à trois semaines après celle-ci, ou une gêne pouvant conduire à des phénomènes de démangeaisons voire, à l’extrême, de la mutilation. Les souris seront surveillées quotidiennement suite à la greffe. L’implantation de tumeurs chez la souris est une technique éprouvée et publiée par de nombreux laboratoires depuis plusieurs années, ce qui nous permet d’avoir du recul sur les nuisances ou effets indésirables attendus. Il se peut que ces souris perdent du poids une à deux semaines après l’injection des cellules tumorales ou qu’elles présentent une ulcération au niveau de la tumeur deux à trois semaines après l’injection des cellules tumorales. Le développement de ces tumeurs et/ou l’apparition de métastases ont un impact sur la santé de l’animal, dont les premiers signes sont un amaigrissement et des modifications comportementales. De ce fait, le suivi du poids des animaux et d’une échelle d’évaluation du bien-être animal informeront sur l’état des animaux. Ces points limites sont susceptibles d’évoluer dans le but d’être plus performants à détecter la moindre souffrance de l’animal.
Devenir
A l’exception des animaux reproducteurs qui n’auront reçu aucune chirurgie ni injection (élevage et production des animaux pour d’autres procédures), les animaux entrant dans les procédures seront euthanasiés, ce qui s’avère nécessaire pour rechercher et étudier les mécanismes permettant le maintien de la greffe mais aussi l’évolution des cellules tumorales en fonction de l’environnement dans lequel elles sont assignées. Les animaux reproducteurs seront réutilisés, toujours en tant qu’animaux reproducteurs pour d’autres projets ou le maintien de la lignée dans l’animalerie.
Remplacement
Ce projet propose d’optimiser un modèle murin pour les études en oncologie. De ce fait, l’utilisation d’animaux pour mettre au point ce nouveau modèle et indispensable. Au niveau oncologique, de nombreuses caractérisations ont déjà été effectuées en culture cellulaire, comme l’analyse des biomarqueurs ou l’activité des cellules immunitaires. Il s’agit maintenant d’évaluer la croissance tumorale et son développement in vivo. Pour ce faire, le modèle animal est requis afin d’évaluer la croissance tumorale dans un environnement adéquat. En effet, les greffes de tissu et/ou les cellules cancéreuses ont besoin de multiples signaux pour croître correctement, d’une interaction avec les différents tissus et en particulier avec le système vasculaire de l’hôte, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. De plus, nous nous intéressons ici à l’environnement tumoral et son influence sur le développement de la tumeur. Pour évaluer toutes ces interactions avec les différents tissus et/ou types cellulaires, le modèle animal ne peut être remplacé par un autre modèle qui ne représenterait que partiellement un organisme.
Réduction
Dans la littérature spécialisée, les expérimentations de mise au point sont habituellement réalisées sur des groupes de 5 à 15 souris immunodéficientes par condition. Chaque procédure ayant des objectifs distincts, le nombre d’animaux ainsi que le nombre de répétition maximum sont amenés à varier. Les procédures « preuve de concept » nécessite un nombre d’animaux moindre que les procédures visant à valider une hypothèse. Pour les procédures suivantes, la significativité des résultats sera obtenue par des tests appropriés . Pour ces expériences, si les résultats statistiques se montrent significatifs après une répétition, la seconde (et dernière) répétition ne sera pas effectuée.
Raffinement
Ce projet a pour objectif le raffinement des procédures expérimentales appliquées aux les animaux. En effet, pour des études avec des cellules tumorales dans le tissu homologue de la souris, il s’agit d’effectuer une chirurgie invasive (par exemple pour le cancer du rein). Ici nous proposons un raffinement avec une opération limitée au niveau l’oreille de la souris, et ne nécessitant que de la colle chirurgicale pour refermer le feuillet tissulaire décollé, ce qui est de facto moins traumatique. Du fait de la translucidité liée à la finesse des feuillets tissulaires de l’oreille, il sera possible d’étudier des processus à l’échelle cellulaire par imagerie in vivo, sans procédure expérimentale lourde pour l’animal ou avec une résolution supérieure grâce à la transillumination du tissu. De plus ce modèle permettra aussi de réduire le nombre d’animaux lors d’études cinétiques dans le temps, le même animal étant suivi de manière non invasive à différents points de la cinétique. Les animaux seront hébergés par groupes de 5, dans un environnement adapté à leur statut immunodéficient (litière et nourriture stérilisées, eau sur filtre antibactérien d’exclusion, cages avec couvercle filtrant à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. Les animaux seront examinés quotidiennement par les zootechniciens avec la mise en place de point limite , sous la supervision du vétérinaire clinicien, également en charge du bien-être animal au niveau de l’équipe locale de la structure. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Un environnement enrichi sera fourni aux animaux, selon nos procédures standards. Suite à une procédure expérimentale, une attention particulière aux signes de douleurs et de stress sera portée tout au long de l’expérimentation. Les souris présentant ces signes recevront des analgésiques, en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le modèle murin (souris) est le modèle de référence dans le domaine de l’oncologie. Pour réaliser notre projet, nous nous appuyons sur des bases bibliographiques solides et différentes données déjà publiées, que nous comparerons à celles obtenues avec notre nouveau modèle. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 8 semaines et pesant de 20 à 25g, ce qui, d’après la littérature scientifique, correspond au stade de développement optimal pour réaliser des greffes de tumeur chez les souris immunodéprimées .
Evaluation de la modulation de l’activité neuronale et de la neurotransmission par les ultrasons focalises chez le rat sain par Tomographie par Emission de Positons (TEP)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
22 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, six en gravité légère et seize en gravité modérée. Chaque animal est anesthésié jusqu'à quatre fois pour recevoir un cathéter dans la veine de la queue, une injection puis une stimulation par ultrasons de trente minutes et une imagerie cérébrale, avant d'être tué pour prélever le cerveau. Le porteur indique un stress lié au jeûne et aux anesthésies répétées. Il décrit une première phase menée sur neurones en culture mais affirme "indispensable" le recours à l'animal pour cartographier l'activation cérébrale, en vue d'applications cliniques contre Parkinson, la dépression et Huntington.
Objectifs
Les ultrasons à basse énergie focalisés offrent la possibilité de stimuler de manière non invasive des régions spécifiques du cerveau avec une grande sélectivité spatiale en focalisant le faisceau ultrasonore sur un volume de l'ordre du millimètre cube, offrant ainsi des avantages techniques par rapport aux autres technologies concurrentes. Malgré le grand nombre d'études soulignant les effets des ultrasons dans la stimulation ou la modulation de l'activité neuronale, peu d'études ont exploré et caractérisé les mécanismes de génération et transmission des réponses créées par ce traitement. L’objectif de ce projet est d’étudier la capacité d’un traitement à ultrasons non-invasif pour activer sélectivement des régions du cerveau animal ciblées, tout en libérant de la dopamine par imagerie TEP (Tomographie par Emission de Positon). Une première procédure permettra de mesurer les effets des ultrasons sur l’activité métabolique cérébrale globale, puis, une seconde procédure mesurera ces effets sur la neurotransmission.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de cette proposition est de développer et de décrire un mécanisme unificateur, mesurable depuis les neurones individuels jusqu'aux cerveaux entiers des modèles animaux, par lequel les ultrasons peuvent affecter temporairement ou définitivement la fonction neuronale. Les connaissances obtenues tout au long du projet proposé auront un impact important sur le développement de la technologie de la neuromodulation par ultrasons en clinique pour le traitement de divers troubles neurologiques caractérisés par des déséquilibres dans la sécrétion de neurotransmetteurs (la maladie de Parkinson, les troubles dépressifs et la maladie de Huntington).
Procédures
Les animaux seront anesthésiés jusqu’à quatre fois. Pendant ces anesthésies, un cathéter sera placé dans la queue, un produit sera injecté par ce cathéter et un traitement par ultrasons sera appliqué pendant 30 minutes. Enfin de l’imagerie sera effectuée pendant 30 à 70 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés jusqu’à quatre fois. Pendant ces anesthésies, un cathéter sera placé dans la veine caudale, un produit sera injecté par ce cathéter et un traitement par ultrasons sera appliqué pendant 30 minutes. Enfin de l’imagerie sera effectuée pendant 30 à 70 minutes. Les animaux subiront un stress lors de la mise à jeun et l’anesthésie (nécessaires à la réalisation de l’imagerie).
Devenir
La mise à mort des animaux sera nécessaire pour permettre le prélèvement post mortem du cerveau et la réalisation d’analyses complémentaires.
Remplacement
Une première partie de ce projet a été réalisée sur des neurones en culture in vitro pour permettre de définir les paramètres de stimulation permettant une modulation des neurotransmetteurs sans induire d’effets néfastes. En outre, l’utilisation de ces paramètres de stimulation sera confirmée par des expériences incluses dans d’autres protocoles d’expérimentation animale déjà réalisés. Le recours à l’animal reste cependant indispensable à cette étape, elle nous permettra de cartographier et décrire la distribution spatiale de l'activation neuronale par une stimulation focalisée par ultrasons à basse énergie.
Réduction
L’utilisation de méthodes d’imagerie permet un suivi longitudinal des animaux ce qui entraine une réduction notable des effectifs nécessaires à l’obtention de résultats significatifs, ceci augmenté par le fait que chaque animal inclus est son propre contrôle (diminution de la variabilité inter individuelle). Dans une étude publiée précédemment, une augmentation statistiquement significative de l’activité cérébrale produite par la stimulation par ultrasons, mesurée par une technique similaire à celle proposée dans notre projet, a été obtenue avec n=7. Cependant cette étude a été réalisée uniquement sur des mâles. Compte tenu des statistiques publiées et d’un calcul de puissance, nous estimons que n = 8 (4 femelles et 4 mâles) nous fournira les données nécessaires pour tirer les conclusions recherchées. Nous prévoyons cependant un lot supplémentaire dans le cas où le sexe impliquerait des différences nous empêchant de moyenner les résultats obtenus chez les mâles et les femelles. La seconde partie du projet portant sur la neurotransmission (contrairement à la première qui étudie le métabolisme), nous attendons une mesure plus sensible et donc anticipons un effectif moindre permettant d’obtenir une différence significative (n=6). Cette étude préliminaire pourra être complétée par un projet ultérieur en cas de résultat prometteur.
Raffinement
La mise à jeun sera précisément de 4h pour tous les individus, sans stress supplémentaire lié à un isolement (mise à jeun séquentiellement et dans une cage commune). Les stimulations LEUS et les imageries seront réalisées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane avec un monitorage continu du rythme respiratoire. Cette méthode d’anesthésie permet de régler finement, et en temps réel, la quantité nécessaire à la sédation de l’animal et limite les risques de surdose. Tout au long du protocole, les animaux seront suivis quotidiennement avec une grille de score permettant de détecter précocement tout signe de mal-être.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats dans ce projet. Ce modèle a été choisi parce que le niveau d'anesthésie, paramètre clé pour une activation cérébrale réussie par ultrasons à basse énergie focalisés, est relativement facile à contrôler chez ces animaux. Le modèle de rat est également très sûr pour garantir des résultats préliminaires réussis car : 1) c'est un modèle qui a été utilisé par plusieurs équipes pour mettre en évidence la neurostimulation et la neuromodulation par ultrasons à basse énergie focalisés ; 2) nous disposons de résultats préliminaires in vivo de stimulation ultrasons à basse énergie focalisés réussie dans notre laboratoire 3) le cerveau du rat possède les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et a une taille qui permet d’étudier de nombreuses aires cérébrales retrouvées également chez l’homme et de les cibler précisément par la focalisation du traitement par ultrasons. Pour toutes les expériences, des rats âgés de 10 semaines seront utilisés afin de maintenir la cohérence de l'âge entre les expériences de ce projet et les expériences précédemment réalisées au laboratoire.
Etude des mécanismes d’action d’un nouveau traitement contre l’insuffisance cardiaque dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras et sucré sur vingt-quatre semaines, elles subissent des tests de tolérance au glucose après jeûne, un test d'endurance sur tapis, des échographies sous anesthésie et l'introduction d'une sonde dans la carotide avant d'être tuées pour analyse des organes. Le porteur affirme que l'obésité et la dysfonction cardiaque n'entraînent pas de surmortalité sur la période. Il indique étudier le mécanisme d'action des gliflozines, un traitement déjà utilisé chez les patients, pour l'optimiser à terme.
Objectifs
Le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Or, le diabète est en pleine expansion dans notre société, ce qui confirme la nécessité de constantes recherches pour mieux cibler les solutions thérapeutiques. Récemment, les gliflozines, i.e. des inhibiteurs des co-transporteurs sodium-glucose (SGLT2), ont démontré un effet bénéfique sur la diminution de la survenue d’évènements cliniques majeurs chez les patients insuffisants cardiaques. Les résultats prometteurs d’un nouveau traitement de l’insuffisance cardiaque par les gliflozines ouvrent une nouvelle voie thérapeutique pour les patients. Néanmoins, pour optimiser les molécules actuelles, nous devons d‘abord identifier leurs mécanismes d’action. En effet, en plus de leur action au niveau des reins, les gliflozines semblent avoir un effet cardiaque direct, notamment sur le métabolisme. Ainsi, notre projet a pour objectif de comprendre comment la gliflozine agit sur la cellule cardiaque, notamment sur la communication du signal calcium entre le réticulum, réservoir de calcium, et la mitochondrie, source d’énergie au sein de la cellule cardiaque dans un modèle chez la souris de cardiomyopathie diabétique. Ces informations permettront de préciser le mécanisme d’action de cette molécule en vue de l’optimiser.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de préciser le mécanisme d’action des gliflozines au niveau cardiaque, mais aussi dans les autres organes, afin d’envisager à terme le développement de nouvelles molécules plus spécifiques et avec une meilleure efficacité pour un plus grand nombre de patients insuffisants cardiaques.
Procédures
Le protocole dure au total 24 semaines. La moitié des souris seront mises sous régime standard pendant 24 semaines et l’autre moitié sera mise sous régime enrichie en lipides et en sucrose. Au bout de 16 semaines, la moitié de chaque groupe aura une supplémentation dans leur nourriture avec la gliflozine, pour mimer le traitement chez les patients. Le développement du diabète chez les souris sera mesuré par un test à 15 et 22 semaines. Pour cela, les souris seront mises à jeun pendant 6 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure. Un test d’endurance sera également effectué à 23 semaines sur tapis de course (durée du test : 20min). Les souris auront été au préalable habituées au tapis de course, 1 fois par jour pendant 3 jours (2mn par session). Une échographie sera effectuée à 16 et 23 semaines sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie générale :30min) pour étudier la fonction contractile du cœur. Pour étudier la communication du calcium, la moitié des souris de chaque groupe recevra une injection pour exprimer un senseur du calcium (durée anesthésie générale :11min ; durée injection : 30s). Pour mesurer la pression artérielle, la moitié des souris de chaque groupe seront anesthésiées sous analgésie pour introduire une sonde de mesure dans la carotide (durée anesthésie générale :30min) et seront ensuite mises à mort pour prélèvements des organes à analyser.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons durant ce régime riche en sucre et en gras à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque caractérisé par un cœur plus gros et un remplissage du cœur par le sang diminué, raison de l’étude. Toutefois, l’obésité et la dysfonction cardiaque/métabolique n’entrainent pas de surmortalité, ni d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (24 semaines). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale, ni à l’injection réalisée sous analgésie et anesthésie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes.
Remplacement
Notre projet ayant pour but d’étudier la cardiopathie diabétique impliquant un mauvais fonctionnement contractile du cœur suite à un dérèglement d’origine métabolique et multi-organe, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire. Cependant, l’isolation de cellules contractiles du cœur des souris de cette étude permettra de réaliser de nombreuses analyses en limitant le nombre d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables, soit au maximum 72 animaux sur 2 ans. Par ailleurs, les prélèvements des autres organes en parallèle du cœur ont été mutualisés sur chaque procédure afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis. Les souris sont soumises à une période d’habituation sur le tapis de course. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale).
Choix des espèces
La physiologie de la souris étant « proche » de celle de l’Homme, pour la problématique étudiée ici, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Les animaux C57BL/6-Ola-Hsd auront 5 semaines lors de la mise en place de la diète pour 6 mois, menant à un âge de 29 semaines à l'issue de la procédure. La mise en place de la diète dès cet âge permet le développement d’une cardiopathie diabétique.
Etude du rôle des récepteurs astrocytaires dans la mémoire.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié en gravité modérée et la moitié en gravité sévère. Elles subissent une chirurgie cérébrale avec craniotomies et injections dans les deux hippocampes, parfois l'implantation d'une canule optique, une restriction alimentaire avec isolement et des chocs électriques aux pattes lors d'un conditionnement de peur. Le porteur décrit la douleur des chocs comme "peu intense et très brève" et fixe la non-reprise de poids comme point limite. Il affirme "indispensable" le recours à l'animal vivant, les cultures cellulaires et les modèles bioinformatiques ne permettant pas selon lui d'étudier la mémoire, et rattache les retombées à la maladie d'Alzheimer.
Objectifs
Depuis maintenant plusieurs décennies, de nombreuses études indiquent que l’astrocyte joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule gliale détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) grâce à la présence de nombreux récepteurs. En retour, les astrocytes sont capables de réguler cette communication via la libération de transmetteurs, notamment des purines qui pourraient jouer un rôle clé dans la régulation de la plasticité synaptique à long terme, considérée comme la base cellulaire de la mémoire. Dès lors, il est indispensable de déterminer la contribution de ces récepteurs astrocytaires dans les processus de mémoire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 : • Chirurgie pour injections intra-hippocampiques : les animaux seront anesthésiés sous isoflurane durant toute la chirurgie (soit environ 30min par animal, ou 1h pour les études nécessitant l’implantation de la canule optique). Deux craniotomies permettant la descente de l’électrode d’injection au niveau des deux hippocampes seront réalisées. Les animaux subiront donc au total 2 injections (5min chacune). La totalité des animaux seront concernés, soit 440 animaux. Pour les études nécessitant la photométrie, une canule optique sera implantée à travers une des craniotomies (20min). Un animal sera implanté une seule fois. Le système sera laissé en place le temps de réaliser les tests comportementaux. Au total, 320 animaux sont concernés par l’étude de photométrie. • Légers chocs électriques : ils sont au nombre de trois, et seront appliqués uniquement lors de la première étape du comportement de conditionnement de peur (soit 1 jour). • Anesthésie pour immunohistochimie : Les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale unique d’un mélange kétamine/xylazine (
Impact sur les animaux
Les effets stressants chez les animaux sont liés à : - une chirurgie - une restriction alimentaire - un isolement pour contrôler de manière fine la quantité de nourriture de chaque animal - à l'application de chocs électriques. Concernant les procédures chirurgicales, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares. Concernant les chocs électriques, lors de la phase de conditionnement (un seul jour), l’animal ressentira une douleur peu intense et très brève au niveau de ses pattes. Après l’application de ces chocs, aucun autre effet indésirable n’est attendu. Si au cours de l’expérience de photométrie la canule d’implantation se détache, ce qui arrive très rarement, aucun effet indésirable n’est attendu puisque cela n’engendre aucune douleur.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.
Remplacement
Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires dans le contexte de la mémoire, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo est donc indispensable.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au cours de la chirurgie, pipette utilisée pour injecter le virus bouchée, injection dans la mauvaise structure cérébrale, problème au moment de la dissection, mauvais apprentissage lors de l’habituation aux tests mnésiques,mauvaise implantation de la canule optique, problème rencontré lors de l’enregistrement photométrique).
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront classiquement hébergés dans des cages enrichies, en petits groupes sociaux de 8 individus. Ils auront accès à l’eau et nourriture ad libitum jusqu’au début des tâches comportementales. Les animaux seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée. Un changement de litière sera effectué une fois par semaine. Pour les procédures avec restriction alimentaire, les animaux sont hébergés par deux une semaine avant le début de la restriction, afin de contrôler le rationnement alimentaire de chaque animal. Ces animaux sont surveillés et pesés quotidiennement à partir du moment où les animaux seront en restriction alimentaire. Leur perte de poids sera ainsi progressive et contrôlée. Si la perte de poids dépasse les 12%, alors on augmentera la ration alimentaire. Si l’animal continue à perdre du poids, alors on rajoutera de la nourriture en poudre. Si malgré ces mesures conservatoires, l’animal ne reprend pas son poids initial, ceci sera considéré comme un point limite et l’animal sera sacrifié. Outre le poids, d’autres indices seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures et des points limites précis et adaptés ont été définis. En cas de présence d’individus agressifs avec leurs congénères, l’individu agressif sera isolé. Nous regarderons également l’apparence du pelage et le comportement. Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, nous administrerons immédiatement en sous-cutané de méloxicam (5 mg/kg) pour calmer la douleur. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2.
Choix des espèces
La souris est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’homme, dont les comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Enfin, la souris offre une possibilité plus grande de manipulations génétiques. Les souris seront âgées de 7 semaines au moment des injections intra cérébrales. Ensuite, les diverses études comportementales et d’imagerie seront réalisées 9 à 13 semaines après les injections intra cérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 16 à 20 semaines.
Etude des voies de signalisation du post-conditionnement ischémique dans un modèle d’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
245 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque d'environ 80 minutes sous anesthésie générale pour provoquer un infarctus du myocarde, une injection de molécules testées, puis une mise à mort dans les 24 heures pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'un infarctus massif peut conduire au décès de l'animal pendant la chirurgie et que des points limites encadrent les complications au réveil. Il affirme les modèles in vitro "inadaptés" à l'étude de ces voies de signalisation et espère reproduire par voie pharmacologique une cardioprotection qui, obtenue par conditionnement ischémique, n'est pas applicable en clinique.
Objectifs
La sévérité de l'infarctus du myocarde peut être réduit, expérimentalement, en réalisant de très courtes séquences « d'occlusion-désocclusion » de l'artère coronaire avant de la désocclure définitivement. Cette méthode de "cardioprotection" s'appelle le " conditionnement ischémique" et n'est malheureusement pas adapté à la clinique. Il y a donc un besoin médical à pouvoir mimer cet effet cardioprotecteur par d'autres stratégies, dont la pharmacologie. Cela nécessite néanmoins de bien comprendre les mécanismes moléculaires à l'œuvre dans la cardioprotection. Ce projet de recherche vise à identifier les mécanismes moléculaires qui participent à la modulation bénéfique de la réponse inflammatoire contrôlée par le conditionnement ischémique. En cas de réussite du projet, nous espérons identifier une nouvelle stratégie de traitement de l'infarctus du myocarde, qui puisse être transférée vers la clinique.
Bénéfices attendus
Du point de vue clinique, l'infarctus du myocarde est encore aujourd'hui l'une des principales causes de décès dans le monde et le facteur principal de développement de l'insuffisance cardiaque dans les pays développés. Ce projet permettra d'identifier des cibles moléculaires d'intérêt visant à mimer pharmacologiquement (applicable chez l’Homme) la protection générée par le conditionnement post-ischémique (non applicable chez l’Homme) de sorte à reproduire l’effet cardioprotecteur chez le patient humain
Procédures
L’expérimentation consiste en une chirurgie cardiaque sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée (durée : environ 80mn). Pour certains groupes expérimentaux, une injection intraveineuse de molécules tests non toxiques est prévue pendant la chirurgie (
Impact sur les animaux
La chirurgie est réalisée intégralement sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée. Les conséquences directes d’un infarctus massif conduisent à un décès rapide pendant la chirurgie (sous anesthésie et analgésie). Les complications au réveil sont rares et connues et font donc l’objet d’un suivi adapté et de points limites établis en conséquence pour permettre d’interrompre l’expérimentation en cas de douleur/stress/angoisse/dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou soulager.
Devenir
Les animaux sont mis à mort dans chaque procédure car les mesures effectuées nécessitent le prélèvement du cœur (pour les mesures de tailles d’infarctus ou les analyses du tissu cardiaque)
Remplacement
Des données préliminaires obtenues in vitro ne correspondent pas du tout à ce qui est connu in vivo dans la littérature, nous laissant penser que les modèles in vitro classiquement utilisés sont inadaptés pour l’étude des voies de signalisations dans ce contexte particulier d’infarctus. Par ailleurs, Il est question dans cette étude de mesurer un effet généralisé sur tous les types cellulaires composant le tissu cardiaque. Le recours à l’animal est donc nécessaire. Néanmoins, afin de limiter l'utilisation des animaux, lors d’une partie préliminaire à ce projet, la mise au point d'analyses et la caractérisation des doses efficaces des molécules d’intérêt ont été réalisées sur cellules (ex vivo). Suite à celle-ci, une phase test a été réalisée pour vérifier l'absence de toxicité aigüe et la réalité de l'efficacité de l'injection de ces molécules d’intérêt chez les animaux. La stratégie de recherche développée par l'équipe inclue, depuis plusieurs années, la standardisation des protocoles, de sorte à pouvoir réutiliser les données dans des « méta-analyses ». Ce projet s'inscrit dans cette même stratégie.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d'animaux, les différents temps choisis pour l’infarctus seront basés sur une précédente étude mise en place au laboratoire. Les effectifs ont été calculés au plus juste (tests statistiques) pour permettre l’exploitation des résultats. Les différentes étapes se succèdent, permettant de réajuster si besoin à chaque étape en fonction des résultats de l’étape précédente (en réduisant les effectifs prévus initialement, en abandonnant la réalisation d’un groupe expérimental qui s’avèrerait finalement superflu ou en arrêtant le projet, en cas de résultats non concluants). De même, quand cela est possible, la réduction du nombre de groupes expérimentaux est réalisée. Enfin, des données obtenues lors de précédents projets seront utilisées pour éviter d’avoir à réaliser certains groupes dans ce projet. Les échantillons organiques résiduels sont conservés dans une « biobanque » (banque d’échantillons), de sorte à pouvoir être ré-exploités autant que possible, 1) pour répondre aux questions des rapporteurs validant la publication de l'article, 2) pour réaliser des tests préliminaires servant à construire de futurs projets. Deux mises au point seront réalisées dans ce projet, de sorte à augmenter notre capacité d'exploitation des prélèvements et permettre ainsi d'obtenir plus d'informations avec un nombre d'animaux restreint. Si cette approche fonctionne, elle pourra être appliquée aux futurs projets.
Raffinement
Pour réduire au maximum la souffrance et la douleur imputables à la chirurgie, cette dernière est effectuée sous anesthésie profonde et couverture analgésique adaptée. Une attention particulière est apportée aux soins post-opératoires des animaux. Un suivi renforcé dans les heures suivant le réveil est assuré à l'aide d'une fiche d'observation éprouvée, spécifique à cette chirurgie, consistant en la détermination d'un score de symptômes bien déterminés, dans le but d'intervenir de manière rapide et efficace, le cas échéant, en concertation avec le chef de projet et le vétérinaire référent. Le fait de réaliser les prélèvements au plus tard 24h après la chirurgie, permet de s’affranchir des complications éventuelles à long terme d’un infarctus du myocarde.
Choix des espèces
Le modèle murin d’infarctus, parfaitement maîtrisé au laboratoire, permet de reproduire et d'étudier au mieux l'infarctus du myocarde. Il a été largement éprouvé dans la littérature, et est particulièrement adapté à l'étude des voies de signalisations. C'est par ailleurs ce modèle qui a été utilisé lors de la précédente étude, sur laquelle nous nous sommes appuyés pour choisir les temps clefs d'ischémie-reperfusion. Le recours au même modèle permettra ainsi de mettre en corrélation les résultats obtenus. L'expérimentation portera sur des animaux de 8 à 14 semaines, afin de comparer les résultats avec ceux obtenus dans le laboratoire, en particulier ceux du précédent projet.
Evaluation de l’activité anti-tumorale de traitements anticancéreux innovants sur des modèles de xénogreffes de tumeurs hormono-résistantes
- Recherche appliquée
- Cancers
6 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes et castrées chirurgicalement, elles reçoivent la greffe d'un fragment de tumeur humaine puis jusqu'à trois administrations quotidiennes, pour tester des traitements contre des cancers hormono-résistants du sein, de l'ovaire et de la prostate. Le porteur présente ces xénogreffes issues de patients comme "les seuls" modèles reconstituant la complexité des tumeurs humaines et affirme que ce travail sur animal "ne peut être remplacé". L'efficacité clinique des molécules testées reste hypothétique, l'objectif immédiat étant de les sélectionner avant un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
Le cancer représente la deuxième cause de mortalité dans les pays développés et de nombreux cancers sont connues pour être favorisé par certaines hormones, il s’agit principalement des cancers du sein et des ovaires chez la femme et de la prostate chez l’homme. Ces tumeurs hormonodépendantes, qui présentent des récepteurs hormonaux peuvent être traitées par hormonothérapie, cependant, ce traitement hormonal n'a qu'un effet transitoire, d'une durée variable, et bloque la prolifération du cancer sans le guérir. En dépit de l’amélioration constante de la prise en charge de ces patients, de nombreux progrès restent à faire et de nombreux travaux sont actuellement menés afin de mettre sur le marché de nouveaux traitements thérapeutiques anti-tumoraux visant ces tumeurs hormono-résistantes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de déterminer in vivo sur des animaux castrés porteurs de tumeurs hormonorésistantes, les propriétés anti-tumorales de traitements innovants (petite molécule et/ou biothérapie) afin d’identifier ceux potentiellement efficaces en clinique. L’évaluation de ces traitements innovants permettra de définir leur efficacité anti-tumorale ainsi que les informations nécessaires pour choisir leur posologie en vue de leur utilisation future en clinique. Ce projet se base sur l’utilisation de modèles de tumeurs humaines greffées sur souris castrées ou PDX pour Patient Derived tumor Xenografts. Ces modèles développés au cours des dernières années sont donc des souris castrées porteuses d’une tumeur humaine. Ce sont actuellement les seuls qui permettent de reconstituer sur animal la complexité des tumeurs humaines. Les résultats obtenus sur ces modèles permettent ainsi une réelle extrapolation en médecine humaine. Nous disposons actuellement d'une collection de 24 PDX différentes représentatives des tumeurs hormono-résistantes.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 procédures chirurgicales distinctes d’une durée de 30 minutes maximum par souris, toutes deux réalisées sous anesthésie générale : 1/ Implantation interscapulaire d'un fragment tumoral 2/ Castration chirurgicale par incision cutanée bilatérale inférieure à 1cm au niveau de l’aine pour les mâles ou au niveau des reins pour les femelles. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées minimum 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. Selon les traitements, les animaux recevront au maximum 3 administrations quotidiennes. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles, des prélèvements de sangs pourront être effectués, dans le respect des directives européennes.
Impact sur les animaux
Actes chirurgicaux d’implantation tumorale et de castration. Hypothermie au moment de l’anesthésie. Stress physique au moment des prélèvements sanguin.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. Leur réutilisation n'est pas possible compte tenu des procédures expérimentales que ces animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, traitement par des molécules) qui pourraient avoir un impact négatif sur les résultats d'une autre étude.
Remplacement
Il est essentiel, avant toute administration à l’Homme, de valider le potentiel thérapeutique de chaque traitement innovant dans des modèles permettant d’étudier tous les paramètres observables, depuis l’administration jusqu’à l’élimination des composés administrés tout en prenant en compte les interactions possibles avec les cellules non-tumorales de l’organisme. Ces études in vivo constituent une des nombreuses étapes du développement préclinique d’un médicament mais ce travail sur animal ne peut être remplacé.
Réduction
Les modèles de PDX utilisés sont parfaitement maitrisés et permettent de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats pertinents. Les traitements retenus pour ce projet auront été sélectionnés au préalable lors d’études in vitro permettant la réduction du nombre de groupe à tester. Il sera, de plus, possible d’évaluer plusieurs traitements au sein d’une même étude, sur un même modèle tumoral (1 seul groupe contrôle pour plusieurs traitements différents) et ainsi réduire le nombre total d’animaux inclus dans le projet. Toujours d’après les résultats in vitro, seuls les traitements démontrant les meilleurs effets anticancéreux seront testés in vivo permettant au mieux de réduire le recours aux études in vivo aux traitements ayant le meilleur potentiel thérapeutique anticipé.
Raffinement
Nous utiliserons toutes les données compilées préalablement dans le cadre du développement préclinique du traitement à évaluer. Ceci permettra de prédéfinir les doses potentiellement efficaces et minimisant les effets secondaires. Nous pourrons ainsi raffiner l’étude en étant certain de travailler à des doses permettant d’évaluer l’efficacité des traitements et non leur toxicité, en minimisant ou supprimant tout effet secondaire indésirable pouvant masquer l’objet de l’étude. Les animaux seront acclimatés au moins 7 jours avant d’être greffés, puis seront greffés sous anesthésie avec un mélange d'anesthésique et de tranquillisant. Seuls les animaux présentant des tumeurs en croissance et inclus dans la phase de traitement seront castrés. Outre la surveillance quotidienne post-greffe et castration, les animaux seront surveillés au moins une fois par jour pendant le traitement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement dans le comportement ou l’état de santé des animaux. En cas de modification du comportement normal ou de l’état de santé des animaux surveillés, des actions visant à prévenir douleur ou angoisse comme par exemple interruption du traitement seront appliquées. Le projet dont la durée sera de 5 années sera constitué de 40 études visant à évaluer différents traitements innovants sur différents modèles de PDX. Les études comprendront chacune 163 animaux au maximum, soit un total de 6520 animaux au maximum.
Choix des espèces
Différentes souches de souris toutes immunodéficientes, afin de ne pas rejeter les fragments tumoraux d’origine humaine, provenant d'éleveurs agréés, peuvent être utilisées dans le cadre du projet. Les animaux seront tous des souris adultes âgées de 5 à 13 semaines en fin de période d'acclimatation, afin d’optimiser la prise de greffe car le système immunitaire résiduel qui se développe avec l’âge peut empêcher les tumeurs de pousser. La majorité des études (90%) nécessitant une castration sera réalisée sur des souris mâles (modèles prostates).
Implication de la signalisation lipidique dans la modulation de la pression artérielle par l’apport alimentaire en sel chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour altérer une voie de signalisation lipidique, elles alternent des régimes pauvres puis riches en sel, passent jusqu'à quatorze heures par semaine en cage métabolique et subissent des prélèvements de sang et d'urine ainsi que des mesures de pression, avant d'être mises à mort pour analyse des tissus. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort anticipée par dislocation cervicale. Il affirme que l'étude d'une voie de signalisation dans un contexte d'"échanges cellulaires complexes" ne peut être menée in vitro et renvoie les retombées contre l'hypertension au long terme.
Objectifs
L'hypertension artérielle représente une des causes majeures de mortalité et de morbidité dans le monde ainsi qu’un problème majeur de santé publique. L'identification et la caractérisation physiopathologique qui l’entoure est donc importante afin de développer de nouvelles thérapies contre ces maladies. Des études génétiques et physiologiques effectuées chez l'homme ou le primate, ont démontré qu'une alimentation riche en sel représente le facteur de risque le plus répandu d'hypertension. Les mécanismes responsables de cette sensibilité au sel ne sont cependant toujours pas clairement identifiés. Des études récentes ont montré que la signalisation lipidique contribue à la régulation de la pression artérielle chez les souris nourries avec un régime alimentaire normal. Ce projet vise à déterminer si la signalisation lipidique est également impliquée dans la modulation de la pression artérielle en réponse aux modifications de l'apport alimentaire en sel. Le choix de l'espèce murine nous permet d’avoir conjointement accès à des animaux génétiquement modifiés tout en permettant de moduler les apports en sodium et étudier l'impact sur la pression artérielle. Nous allons générer des souris chez lesquelles la signalisation lipidique a été génétiquement altérée dans différents types de cellules et les nourrir avec des régimes riches ou faibles en sel. Cela nous permettra d'évaluer l’implication de la signalisation lipidique dans la modulation de la pression artérielle par le sel alimentaire. Ce projet nous permettra de faire varier les régimes sodés chez les souris mutantes et leurs témoins respectifs afin d’effectuer des analyses de la tension artérielle, des protéines et des électrolytes sanguins. Il nécessite 480 souris sur 5 ans et a été élaboré afin de respecter les règles éthiques des 3R : Les méthodes alternatives in vitro ne nous permettent pas de tester nos hypothèses et nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance régulière. Enfin, des points limites ont été établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. A terme, les résultats de ce projet seront utiles pour le développement de nouvelles stratégies pour le traitement de l'hypertension.
Bénéfices attendus
A cour terme les resultats de cette étude permetrons d’évaluer le rôle de la signalisation lipidique dans la régulation de la pression artérielle chez la souris. A long terme, le nouvel aperçu physiopathologique fourni par les résultats de ce projet sera utile pour le développement de nouvelles stratégies pour le traitement de l'hypertension.
Procédures
Les souris seront soumises à différentes procédures tout au long de ce projet : Tous les animaux seront soumis à des changements de régimes alimentaires (pauvre en sodium pendant 3 semaines puis riche en sodium ou en potassium pendant 3 semaines). Des prélèvements d’urine de manière hebdomadaire sur 7 semaines (recueil en continu en cage métabolique, 14h par semaine). Des prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse (3 fois sur 7 semaines, environ 5 minutes par souris). Tous les animaux subiront également des mesures de pression sanguine (3 séries sur 7 semaines, environ 10 minutes par souris).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress supplémentaire attenant au changement de régime alimentaire (3 semaines par régime), à la mesure de pression sanguine ainsi qu’à la mise en cage métabolique 14 heures par semaine durant les phases de régime pauvre ou riche en sel.
Devenir
Les animaux, après avoir subi le régime riche en sel seront mis à mort afin de permettre l’analyse de tissus prédéterminés pour analyses immuno histo chimiques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet car nous évaluons l'impact de la perturbation des voies de signalisation dans des types cellulaires distincts dans un contexte où les autres types cellulaires de l'organisme restent inchangés. Dans ce contexte d’echanges cellulaires complexes, ces études ne peuvent donc pas être réalisées in vitro (mesure de la pression sanguine, modification de régime alimentaires, analyse de sang et d’urine).
Réduction
De nombreux paramètres de natures variées sont à prendre en compte dans cette étude (Pressions sanguines, taux de calcium et de potassium, numération sanguine, dosage de S1P sur plasma, immuno-histochimie) ce qui rend difficiles tout calculs statistiques concernant le nombre minimum d’animaux requis. Pour cela nous nous sommes basés sur les études reportées dans la littérature utilisant les mêmes approches expérimentales afin d’utiliser la même approche statistique. Afin de réduire le nombre total de souris nous soumettrons les groupes à 2 régimes différents avec une phase de récupération d’une semaine entre les 2 plutôt que d’utiliser un groupe pour chaque régime alimentaire.
Raffinement
Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, toutes les étapes de la procédure se dérouleront avec une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie et tout comportement anormal sera renseigné à la personne en charge du protocole. Deux fois par semaine (avant et après la mise en cage métabolique), l’un des responsables ira observer et peser tous les animaux entrés dans la procédure et remplira la grille de score établie durant toute la durée de l’expérience : Le poid de référence sera celui relevé une semaine avant le passage en régime pauvre en sodium. - Variation du poid corporel : 0= Normal 1= Perte de poid inferieur à 10% 2= Perte de poid entre 10% et 20% 3= Perte de poid supérieur à 20% - Variation de l’aspect général : 0= Normal 1= Mauvais état du pelage 2= Position anormale (dos voûté, couché sur le côté) 3= difficultés respiratoires (sifflements, râle) - Blessures éventuelles : 0= Pas de blessure 1= Réduction de la mobilité, atrophie musculaire 2= Hémorragie, automutilation Tout animal ayant un score égal à 2 subira des soins adaptés (gelée nutritive, surveillance accrue, traitement des plaies). Tout score supérieur ou égal à 3 atteint pour l’un ou l’ensemble des critères ci-dessus par un animal entrainera la mise à mort de manière anticipée par dislocation cervicale par le personnel compétent. Pendant les phases de régimes salés (HSD) les souris seront dans des cages à double litière et double coton afin d’améliorer leur confort. Lors de la perfusion intra cardiaque les animaux seront mis sous anesthésie profonde par injection IP d’un mélange de 180 mg/kg Kétamine et 10 mg/kg Xylasine. Afin de prévenir une douleur éventuelle, ils seront également sous traitement d’analgésique lors de cette procédure (Buprénorphine, injection IP de 0,05 à 0,1 mg/kg).
Choix des espèces
Nous étudions les souris car elles se prêtent particulièrement à des manipulations génétiques. Par exemple : Les souris chimériques que nous avons créées, nous permettent d'aborder spécifiquement le rôle de S1P circulant dans le sang plutôt que S1P dans les tissus rénaux, chez la souris adulte. Par ailleurs, la physiologie de la souris est maintenant bien caractérisée et de nombreux tests ont été développés pour mesurer les paramètres cardio vasculaires, dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Nos études portent sur la régulation de la pression artérielle. Elles sont donc menées sur des animaux adultes (souris agées au minimum de 8 semaines).