Rongeurs

2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses puis des chimiothérapies et immunothérapies répétées, la tumeur pouvant gêner leurs déplacements, avant d'être tuées quand elle dépasse un seuil ou pour prélèvement. Le porteur fixe des points limites, perte de poids supérieure à 20 %, léthargie ou ulcération de la tumeur, déclenchant la mise à mort. Il présente l'organisme vivant comme le seul cadre "prédictif" pour évaluer des combinaisons thérapeutiques en oncologie.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer le rôle de CXCL10 (une chimiokine permettant le recrutement des lymphocytes T CD8) sur l’efficacité antitumorale d’une immunothérapie (anti-PD-1), des chimiothérapies ou d’une association des deux thérapies utilisées en clinique, dans différents modèles de cancers chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Ainsi nous pourrons 1) évaluer l’efficacité des traitements en présence ou non de CXCL10 et 2) déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée en fonction du traitement. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

En 2018, les cancers du côlon du pancréas et du poumon font partie des cancers les plus fréquents avec le cancer de la prostate et du sein. Ces 3 types de cancers représentent les cancers causant le plus de décès. Actuellement, le traitement des cancers colorectaux, du pancréas et du poumon repose sur l’utilisation de chimiothérapies. Bien que ces chimiothérapies aient un effet antitumoral avéré, elles ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. En effet, l’activation de certaines cellules immunitaires pourra favoriser la réponse des patients au traitement, alors que leur blocage conduira à son inefficacité. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas et pour certains cancers colorectaux. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de CXCL10, une chimiokine impliquée dans le recrutement des lymphocytes T CD8 cytotoxiques, sur l’efficacité anti-tumorale de l’immunothérapie ou de la chimiothérapie ou d’une association des deux thérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par l’immunothérapie et/ou la chimio-immunothérapie (immunomonitoring, Nanostring). L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, la chimiothérapie et/ou la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection par voie sous-cutanée de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée 5 minutes - Nombre de souris : 2800 - Traitements par chimiothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 2400 - Traitements par immunothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 2400

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. On note que lorsque le volume tumoral est supérieur à 2000 mm3 (~300mm2), ou que la tumeur parait gêner le déplacement de la souris celle-ci sera sacrifiée. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage… Si un point limite est atteint, la souris sera sacrifiée. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies et immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Surveillance régulière de l’état général et des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, soit parce que la taille de la tumeur dépassera 2000mm3, soit parce que les tumeurs seront prélevées pour les tests biologiques.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Le nombre de souris par groupe a été estimé en utilisant un test bilatéral et en considérant qu’un traitement sera efficace s’il modifie la moyenne des valeurs de 20% avec une différence significative (test de Student). Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés (absence de recrutement de lymphocytes CD8 dans les tumeurs surexprimant CXCL10 visualisé par immunomonitoring dans la partie I) ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné dès la partie I.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. Points limites : - perte de poids dépassant 20% par rapport au poids maximum enregistré : arrêt des traitements ; si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - posture ou autre expression de la douleur : arrêt des traitements ; si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - absence de toilettage : arrêt des traitements et surveillance de l’apparition d’autres points limites ; - léthargie, immobilité : si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - une mauvaise cicatrisation ou une ouverture des sutures : mise à mort de l’animal. - Points limites spécifiques à la présence de tumeurs et dont l’atteinte entrainera l’euthanasie des animaux : - volume tumoral supérieur à 2000 mm3 (300mm2) ; - tumeurs gênant les fonctions vitales et motrices ; - ulcération ou nécroses de la tumeur sous-cutanée supérieure à 20% de la surface totale de la tumeur ; - difficultés respiratoires. Le projet se déroule en 3 parties. L’absence de faisabilité (points limites atteints) ou de résultats (absence de recrutement de CD8 dans les tumeurs surexprimant CXCL10) conduira à l’arrêt de certains modèles.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

3 000 souris, rats et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par un dysfonctionnement des glandes de Meibomius, avec administrations souvent quotidiennes de produits par gouttes, injections ou voie intraconjonctivale, entraînant picotements, brûlures, rougeurs et gonflements des paupières, avant mise à mort pour des analyses ex vivo. Le porteur présente les examens comme non invasifs et proches de ceux pratiqués en cabinet. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne mime l'œil "dans sa globalité" et retient trois espèces pour couvrir leurs particularités anatomiques.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de proposer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. L’œil sec est une maladie multifactorielle des larmes et de la surface oculaire, plus fréquente chez les femmes et les personnes âgées. Elle concerne 5 à 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont relativement bien décrits dans la littérature. Les dysfonctionnements des glandes de Meibomius (DGM ou MGD) sont des troubles chroniques répandus affectant la santé et le bien-être de millions de personnes dans le monde. Ces dysfonctionnements constituent une anomalie chronique et diffuse des glandes de Meibomius, caractérisée, en principe, par une obstruction des canaux excréteurs et/ou des modifications qualitatives/ quantitatives des secrétions glandulaires, dont les conséquences potentielles sont : Altérations du film lacrymal, symptômes d’irritation oculaire, inflammation clinique, maladie de la surface oculaire. Les DGM sont classifiés selon deux grandes catégories, en fonction des sécrétions meibomiennes : hypoexcrétion (la cause la plus fréquente du DGM) et hyperexcrétion. En conclusion, les DGM peuvent provoquer des altérations du film lacrymal, des symptômes d’irritation, d’inflammation et de sécheresse oculaires. C’est de loin la première cause de sécheresse dite « évaporative ».

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.

Procédures

Les procédures expérimentales nécessitent l'administration, le plus souvent quotidienne, de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intraconjonctivale. Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles, sous anesthésie locale ou sous anesthésie légère. Leurs durées sont réduites au maximum pour le bien-être de l'animal. Ces examens ne durent que quelques secondes pour la plupart, 5 minutes environ pour le plus long.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont essentiellement celles observées dans la maladie à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, des rougeurs palpébrales, des gonflements des paupières. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives comme on peut le constater chez l’homme.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour permettre des réalisés les évaluations ex vivo (évaluations histologiques sur tissus, dosages de produits...).

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide des tests statistiques Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 3 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant quatre semaines des instillations intra-trachéales d'un agent pro-inflammatoire sous anesthésie et, pour certains, une exposition continue à un air appauvri en oxygène simulant 4 300 à 5 000 mètres d'altitude, avant d'être tués par exsanguination pour prélever cœur et muscles. Le porteur décrit une baisse transitoire de prise alimentaire et d'activité, sans douleur attendue selon lui. Il affirme que ce dialogue entre organes ne peut s'étudier que sur "l'organisme entier" et retient le rat pour la quantité de muscle qu'il fournit.

Objectifs

Le tissu musculaire squelettique est doté d'une plasticité particulièrement sollicitée en réponse à des contraintes comme l'entraînement, la réhabilitation, la nutrition ou l'environnement permettant une amélioration de la performance sportive mais aussi de la santé au sens large. De nombreux travaux montrent une corrélation entre la masse musculaire et la survie des individus âgés, qu'ils soient en bonne santé ou porteurs de pathologies chroniques. Ainsi, dans les pathologies chroniques, le maintien voire l'amélioration de la masse et de la fonction musculaires sont considérés comme des outils de santé, justifiant le recours à la réhabilitation par l'activité physique. Cependant, que ce soit dans le cadre de l'optimisation de la performance ou dans la prise en charge des patients, on note une fraction non négligeable de personnes ne répondant pas ou pas bien à de tels programmes qui peut aller jusqu'à 30% dans le cas de la maladie respiratoire chronique. Cette non-réponse est encore mal expliquée. A côté des mécanismes classiques de régulation de gènes d'intérêt dont l'expression peut varier fortement avec l'exercice, l'hypothèse d'un rôle significatif du micro-environnement musculaire sur le contrôle de ces adaptations, s'appuyant sur l'existence de régulations d'ordre épigénétique, semble privilégiée, que ce soit chez le sportif de haut niveau ou chez le patient. Ces modifications pourraient conduire à des difficultés à activer les voies de signalisation classiques contrôlant la masse musculaire (protéosynthèse, protéolyse) selon des critères qui restent à préciser (prédisposition, mode de vie, environnement, niveau d'activité physique). Ces critères agiraient via des modifications épigénétiques sur le développement musculaire et en particulier sur les limitations des capacités hypertrophiques du muscle en présence d'hypoxie et d'inflammation. Il convient maintenant de disséquer les mécanismes qui pourraient être à l'origine de ces réponses différentielles. Dans le cadre de la maladie respiratoire, ces échecs pourraient être liés à des modifications de la chromatine (ADN+histones) qui contrôleraient négativement la régulation de la masse musculaire mais dont on ne sait pas comment elle obéit au stress hypoxique et/ou inflammatoire associé. Notre objectif est de déterminer ces modifications pour ensuite proposer des solutions de contournement pour rendre plus efficace la réponse du tissu musculaire des patients au réentrainement à l'effort.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer la signature épigénétique du tissu musculaire ainsi que ses signaux de réponse à l'exposition à l'hypoxie et/ou à l'inflammation d'origine pulmonaire, pouvant expliquer les niveaux de réponse variables du muscle à un stimulus hypertrophique observée dans des travaux précédents. Nos résultats permettront de relier les caractéristiques de l'épigénome associé à une contrainte environnementale (hypoxie et/ou inflammation) en fonction du type de muscle (oxydatif ou glycolytique) à des indicateurs métaboliques déterminés sur fibres isolées ou mitochondries isolées. L'objectif est ensuite d'utiliser des perturbations du métabolisme énergétique afin de modifier cet épigénome pour le rendre plus favorable, constituant ainsi un outil de personnalisation de la prise en charge de la fonction musculaire dans un contexte similaire d'hypoxie et d'inflammation comme chez le malade respiratoire.

Procédures

Les animaux utilisés pour ce projet subiront soit des instillations intra-trachéales bi-hebdomadaires d'un agent pro-inflammatoire, sous anesthésie gazeuse de courte durée (inférieure à 2 min/session), pendant 4 semaines (groupes Inflammation seule et Hypoxie+Inflamation) représentant un total de 8 instillations. De plus, le groupe Hypoxie+Inflamation sera exposé en continu durant les 2 dernières semaines à un environnement appauvri en oxygène (similaire à une altitude de 4300m à 5000m) ainsi que le groupe Hypoxie seule. Après cette période de conditionnement, les animaux seront endormis (anesthésie gazeuse) et mis à mort immédiatement par exsanguination et prélèvement du coeur, suivis de prélèvements de divers organes ou tissus d'intérêt pour analyses ultérieures in vitro.

Impact sur les animaux

Le statut nutritionnel des animaux exposés à l'hypoxie continue peut être légèrement impacté avec une prise alimentaire diminuée dans les premiers jours en dépit d'un accès à l'eau de boisson et à la nourriture ad libitum mais qui revient ensuite à une quantité de nourriture consommée normale. L'activité locomotrice spontanée peut également être légèrement diminuée les premiers jours d'hypoxie pour revenir à la normale, facilitée en cela par l'hébergement qui se fait dans les mêmes cages que la stabulation normale, en groupe, avec enrichissement du milieu. L'instillation pulmonaire de LPS, génératrice d'une inflammation pulmonaire (avec présence de signes d'atteinte de l'épithélium pulmonaire) n'engendre pas de douleurs ou limitation physiologique chez l'animal au repos sur une période aussi courte (4 semaines). Le laryngoscope utilisé pour insérer la canule pour l'instillation de LPS est adapté à l'anatomie des animaux (diamètre, longueur) et n'est pas susceptible d'induire de gêne ou souffrance. L'exposition à l'hypoxie se faisant dans une enceinte accueillant les cages d'hébergement qui est installée dans une pièce d'hébergement où les paramètres environnementaux sont régulés, aucune nuisance relative à l'environnement thermique ou lumineux n'est attendu.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever divers tissus et organes d'intérêt étudiés in vitro ensuite.

Remplacement

Nous voulons explorer les conséquences d'une perturbation de la disponibilité en oxygène associées à une inflammation pulmonaire similaires à celles engendrées par la maladie respiratoire, sur des tissus périphériques comme les muscles squelettiques en utilisant un modèle combinant une hypoxie et une inflammation environnementale reproduisant les principales conséquences de la maladie respiratoire chronique. Cette relation inter-organes n'est pas possible sur un modèle autre que l'organisme entier. En raison de la quantité de tissus nécessaire pour un rendement d'isolement de mitochondries musculaires ou de fibres perméabilisées suffisant, nous avons choisi le rat qui propose une taille adaptée, par rapport à la souris.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux pour atteindre le seuil de significativité lors de l'analyse statistique des résultats avec une puissance de test cible de 0.8. Les méthodes d'exploration utilisées introduisent une variabilité qui reste limitée à 5%. Les changements attendus sur les paramètres mesurés sont de l'ordre de + ou - 15% par rapport à la valeur moyenne contrôle. Avec ces différents critères pris en compte, notre approche statistique donne un calcul d'effectif de 10 animaux par groupe. Par mesure de précaution, afin de tenir compte des aléas expérimentaux, nous incluerons 12 animaux par groupe soit un total de 48. Nous profiterons de ce protocole pour prélever et stocker des tissus qui ne seront pas directement utilisés dans ce projet. Cependant, ils seront stockés pour éventuellement être analysés dans le cadre d'un projet portant sur le foie, évitant de reconditonner de nouveaux lots d'animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe, en cages ouvertes, avec un enrichissement du milieu (cachettes, litière) dans des locaux où les paramètres d'ambiance (température, hygrométrie, lumière, cascades de pression) sont suivis et enregistrés en continu, avec remontée d'alarme en cas d'écart avec les valeurs de consigne. L'exposition à l'hypoxie sera réalisée dans le même matériel d'hébergement, dans une enceinte pouvant accueillir plusieurs cages de plusieurs animaux. L'instillation intra-trachéale se fera après une légère anesthésie gazeuse d'une durée maximale de 2 min/session et l'animal sera observé jusqu'à son réveil complet avec de retrouver ses congénères. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long du projet et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés 2 fois par jour après chaque procédure ou 3 fois par jour en cas de symptômes cliniques jusqu'à leur disparition ou la mise à mort de l'animal. Les gestes techniques seront réalisés par des personnes compétentes et formées pour leur exécution. Ceux-ci comprennent l'observation de l'apparition éventuelle de signes cliniques (troubles du comportement, prostration, manque de toilettage) ou une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids de départ. Ils seront alors mis à mort et exclus de l'étude. Un examen post-mortem sera pratiqué pour identifier d'éventuelles lésions pouvant expliquer cet état afin de trouver des mesures de correction pour de futurs projets. Le volume à instiller sera limité à 1 µL/g de poids corporel.

Choix des espèces

Ce projet porte sur les conséquences d'une exposition environnementale à l'hypoxie et/ou à une inflammation pulmonaire sur le tissu musculaire squelettique. Le seul moyen d'étudier ce dialogue interorganes et l'influence d'un tissu ou d'un organe sur le fonctionnement d'un autre est d'utiliser l'organisme entier. Il n'existe actuellement aucune alternative scientifiquement validée. Le rat de laboratoire est l'espèce la plus adaptée car sa taille adulte permet d'obtenir des quantités de muscle adaptées aux mesures à réaliser, limitant le nombre d'animaux à utiliser par rapport au recours à d'autres espèces plus petites (souris..). De plus, la littérature scientifique montre que cette espèce présente des signes d'adaptation musculaire et cardiaque à ces facteurs environnementaux semblables à ce que l'on peut observer chez l'être humain dans un contexte de maladie respiratoire chronique, en faisant ainsi un modèle d'étude pertinent. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte moyen (âge en début de projet : 6 à 8 mois), de façon à se rapprocher de l'âge moyen d'apparition de la maladie respiratoire chez l'homme (âge adulte moyen) correspondant à l'entrée dans la 2ème partie de la vie.

1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis subissent injections, gavages, huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et des mesures de tumeur, avant d'être tuées pour les analyses. Le porteur reconnaît une douleur liée à la croissance tumorale, souvent associée à une perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle de choix et de référence" pour valider in vivo un agent censé renforcer les lymphocytes T contre le cancer.

Objectifs

Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.

Procédures

Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins (1 goutte), la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes - 6 mesures de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse, la durée de ce geste est évaluée à 2 minutes - 4 administrations par gavage, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 9 injections intrapéritonéales, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 injection sous-cutanée, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 1 injection intraveineuse, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute

Impact sur les animaux

Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale qui est souvent associée à une perte de poids

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux permettra de valider in vivo, dans des modèles précliniques, le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature montrant que 18 à 24 souris par groupe permettent de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les interventions (injections intraveineuses et prélèvements sanguins) seront précédées d'une anesthésie générale, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).

2 904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent injections répétées, régimes gras, mises à jeun, tests métaboliques avec prélèvements sanguins et hébergement en cage calorimétrique, pour développer une cholangite sclérosante ou une stéatose hépatique, avant mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur qualifie l'induction de ces maladies de "strictement nécessaire" et présente les pathologies comme asymptomatiques. Il affirme que la complexité cellulaire du foie ne peut être répliquée in vitro et qu'il faut un "organisme entier".

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique sont des maladies ne disposant d’aucun traitement pharmacologique formel validé. La stéatose hépatique non-alcoolique va devenir la première cause de transplantation hépatique et la cholangite sclérosante primitive est une maladie dont les mécanismes moléculaires sont très mal caractérisés, il est dit d’elle que c’est la dernière boîte noire de la médecine qui s’intéresse à l’étude du foie. Ce projet a donc pour objectif de mieux caractériser rôle de la mort des différentes populations cellulaires dans le développement de ces maladies. Il permettra d’identifier et de cibler des populations clés dans le développement de la maladie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques dans ces pathologies pourra constituer la base d’un dépôt de brevet.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux caractériser des maladies du foie sans traitement pharmacologique disponible actuellement. D’un côté la cholangite sclérosante primitive, maladie rare mais grave exposant au risque de cirrhose et de cancer. Actuellement, le seul traitement efficace de cette maladie est la transplantation hépatique. Or ce traitement est réservé aux patients avec une maladie avancée et n’est pas toujours possible en cas de cancer. Il est donc primordial d’étudier d’autres pistes thérapeutiques. De l’autre côté, la stéatose hépatique non alcoolique est la maladie hépatique la plus commune car elle suit la courbe de progression de l’obésité. Bien que sa prévalence explose, aucun traitement n’est disponible à ce jour, et le nombre de patients au stade terminal de la maladie (c’est-à-dire cirrhose) nécessitant une transplantation hépatique est en croissance perpétuelle. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique de l’inhibition de la mort cellulaire sur le développement de ces maladies.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de pathologies hépatiques et à leurs traitements. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime)+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (1 à 8 semaines de régime)+Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 3-Injections intrapéritonéale (1x/j/pendant 5 jours/5 sec animal vigile)+Utilisation de régimes spéciaux (1 à 8 semaines de régime)+Administration d’inhibiteurs via l’aliment (de 8 à 16 semaines)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 4-Utilisation de régimes spéciaux (8 à 16 semaines de régime) )+Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests - 2 tests par mois espacé d’une semaine minimum - 4 fois maximum)+Mesure de la composition corporelle (5-10 minutes animal vigile ) et cages calorimétrie (maintien 5j maximum)+ Prélèvement sang sous anesthésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. L’induction de ces pathologies est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet et trouver des thérapies innovantes. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies du foie étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les molécules sont bien tolérées par les souris. Les administrations par gavage, les injections intra-péritonéales, et les prélèvements sanguins nécessaires durant les tests métaboliques peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. De façon extrêmement rare, ils peuvent induire des microlésions ou des irritations. Les tests métaboliques effectués peuvent également induire un stress pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun ou encore l’isolement en cas d’utilisation de cage métabolique. De même, le transport des animaux qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=2904) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

L’animal dans son intégrité est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de la cholangite sclérosante primitive ou la stéatose hépatique non-alcoolique, la complexité cellulaire ne pouvant être répliqué in vitro. Nous avons besoin étudier spécifiquement l’influence de l’inactivation de nos gènes d’intérêts dans un type cellulaire donnée, sur les autres types cellulaires dans le développement de la maladie. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Un total de 2904 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). La principale contrainte concerne le développement des pathologies du foie induites génétiquement ou par des régimes alimentaires qui sont malheureusement nécessaires pour mener à bien ce projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement des pathologies étudiées avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités puisque les inhibiteurs sont bien tolérés par les souris. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et le vétérinaire pourra être sollicité, le cas échéant.

Choix des espèces

JJustification de l’espèce/modèle : Le projet a pour objectif d’étudier le rôle de la nécroptose dans les processus physiopathologiques aboutissant à la cholangite sclérosante primitive et la stéatose hépatique non-alcoolique. Afin de répondre à cet objectif, l’expression de certains gènes d’intérêts dans les modèles animaux utilisés doit être altérée génétiquement dans des types cellulaires choisis, ce qui justifie le choix de cette espèce (souris). Justification des stades : Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 et 8 semaines pour chaque procédure. Cela correspond à l’âge adulte, deux semaines après le temps du sevrage. De plus, les variations entre les souris sont minimales ce qui permet de diminuer la variabilité (aspects métaboliques) entre animaux avant le début des traitements. Cet âge de départ permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Justification du sexe : Nous favoriserons l’utilisation des deux sexes (idéalement 50/50) afin de ne pas introduire un biais dans nos études notamment lors des tests d’inhibiteurs pharmacologiques dans le développement des maladies étudiées. En effet, il est maintenant établi que lors des expérimentations et autres tests médicamenteux, les souris mâles sont plus exploitées que les souris femelles. Cela introduit donc un énorme gap puisque les femelles peuvent réagir différemment sur le plan de toxicité, du métabolisme ou encore de la biodisponibilité. Étant donné que notre but est de proposer de nouveaux traitements, il nous apparait essentiel d’analyser les deux sexes afin que les résultats puissent être transposés à l’homme.

164 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une chirurgie crânienne de quatre à six heures avec ouverture d'un volet crânien et implantation d'électrodes, puis des enregistrements répétés pendant le sommeil, certaines étant soumises à un conditionnement associant un lieu à des stimulations électriques de la paupière avant d'être tuées pour localiser les électrodes. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie, d'infection du tissu cérébral et de prostration liée au conditionnement aversif, tout en indiquant que les animaux disposent de zones de repli. Il décrit ces travaux sur la mémoire comme "incontournables" et juge la souris "centrale" faute de modèle in vitro ou invertébré équivalent.

Objectifs

La mémoire est une faculté essentielle qui permet d’acquérir et de stocker des informations pour ensuite adapter un comportement en fonction de l’expérience. De nombreuses études ont montré que les oscillations cérébrales jouent un rôle crucial dans la consolidation de la mémoire pendant le sommeil. Étudier ces mécanismes permet de mieux comprendre le rôle des différents états de vigilance afin de préserver nos capacités cognitives dans un contexte général de réduction du temps de sommeil, mais aussi pour envisager des pistes thérapeutiques aux pathologies telles que l’insomnie chronique. Les techniques standards d’enregistrement de l’activité cérébrale pour l’étude du sommeil sont l’IRM fonctionnelle chez l’homme et les primates non-humains d’une part, et les enregistrements électrophysiologiques dans les modèles rongeurs, d’autre part. Ces deux techniques présentent des inconvénients de taille : l’IRM fonctionnelle est coûteuse et bruyante, tandis que l’électrophysiologie souffre d’une faible résolution. Une nouvelle modalité, l’imagerie ultrasonore fonctionnelle, permet de mesurer les variations de flux sanguin cérébral dans plusieurs régions du cerveau simultanément, avec une bonne résolution spatiotemporelle. Elle est facile à mettre en place, portable et abordable. A ce jour, l’imagerie ultrasonore couplée à l’électrophysiologie est tres prometteuse pour observer finement l’ensemble des régions cérébrales activées lors des processus de consolidation. Les études précédentes en imagerie ultrasonore fonctionnelle ont été réalisées sur des rats vigiles ou pendant le sommeil paradoxal : nous manquons donc de données précises sur le sommeil lent. Or, c’est précisément pendant le sommeil lent que les mécanismes de consolidation mnésique (appelés réactivations) ont été mis en évidence. Les corrélats à grande échelle de ces réactivations n’ont été examinés que chez le singe, d’où la pertinence de ce projet. Le but de ce projet est donc double : 1- imager les réseaux associés aux réactivations à l’échelle du cerveau entier et 2- examiner les dynamiques spatiotemporelles de l’apprentissage aversif/appétitif, qui module fortement ces réactivations. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes de consolidation de la mémoire sur le plan fondamental, ainsi que le développement de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de pathologies comme le syndrome de stress post-traumatique ou la maladie d’Alzheimer

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes électrophysiologiques impliqués dans la consolidation de la mémoire notamment dans le cas de la mémoire émotionnelle. Ces travaux apparaissent comme incontournables afin de pouvoir améliorer notre compréhension de la dynamique spatiale et temporelle de la consolidation de la mémoire, mais aussi des régions cérébrales associées spécifiquement la mémoire aversive et la mémoire appétitive. Les données acquises dans le cadre de ce projet permettront à court terme de mettre en lumière de nouvelles régions d’intérêt pour l’étude de circuits par des techniques comme l’optogénétique ou l’électrophysiologie et dans le long terme pour l’évaluation de troubles mentaux permettant d'anticiper leur apparition et d'améliorer la prise en charge des patients. Par l'utilisation du modèle rongeur, nous serons donc en mesure de mettre nos résultats en lien avec une littérature fournie et de constituer une nouvelle base de données pour d’autres laboratoires. De plus, l’anatomie du modèle souris étant bien décrite, nous serons en mesure de transposer les résultats de nos travaux non seulement aux patients atteints de troubles mentaux, mais aussi à d'autres espèces animales comme les animaux de production ou domestiques. En effet, les résultats de ces travaux pourront également permettre une meilleure évaluation de l'état émotionnel de l'animal, thématique d'importance croissante dans l'amélioration du bien-être animal.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet subiront une chirurgie sous anesthésie générale comprenant une implantation d’électrodes ainsi qu’un volet crânien, pour une durée moyenne de 4h à 6h. Une période stricte de récupération de 7 jours sera observée au cours de laquelle un suivi et une prise en charge de la douleur post-opératoire sera effectué. A l’issue de cette période, un premier groupe d’animaux ne subira aucun enregistrement réel, mais des enregistrements simulés avec une ‘fausse’ sonde afin d’évaluer les effets du port répété de celle-ci. Un suivi longitudinal permettant d’évaluer visuellement la qualité du volet crânien, la stabilité de l’implant et le comportement de l’animal sera effectué, ainsi qu’un suivi de la douleur. Pour un autre groupe, à l’issue de cette période d’habituation de 2 à 5 jours, les animaux suivront un protocole d’enregistrement de 2h30, pendant leur sommeil directement dans leur cage et du comportement dans un labyrinthe enrichi, ce qui permettra d’établir des cartes d’activations associées au sommeil. La durée maximale de ces enregistrements sera de 8 semaines au total (10 semaines après la chirurgie). Un dernier groupe d’animaux subira à la place un protocole d'association d'un endroit de l’environnement à des stimulations agréables, désagréables ou mixtes. Les stimulations agréables seront des récompenses directes comme de l’eau chocolatée (selon les préférences individuelles). Les stimulations désagréables seront des stimulations électriques calibrées (stimulation électrique bénigne de la paupière) n’occasionnant qu’un inconfort bref et générant un comportement de fuite caractéristique puis de ‘freezing’. Les animaux bénéficieront toujours d’une large zone neutre vers laquelle se réfugier pour ne plus subir de stimulation désagréable. Ils seront ensuite replacés dans leur cage afin d’étudier les réactivations associées à cette expérience. La durée maximale de ces enregistrements sera de 8 semaines au total (10 semaines après la chirurgie). Tous les animaux seront enfin euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes.

Impact sur les animaux

Pour réaliser les travaux de ce projet, il est nécessaire de réaliser des procédures invasives sur les animaux impliquant notamment une procédure chirurgicale. Les autres effets indésirables sont liés au protocole d’enregistrement et à l’isolement des animaux. Cela implique donc un suivi longitudinal soutenu et une évaluation quotidienne de la douleur de l’animal. Les effets indésirables liés à la chirurgie sont, à court terme, liés aux risques per-opératoires (hémorragie, hypovolémie, etc.) et à moyen terme, aux risques de complications post-opératoires et d’infection locale du tissu cérébral. Dans une moindre mesure, le tissu cérébral (bien que protégé) est plus vulnérable aux chocs mécaniques, en l’absence de barrière osseuse au-dessus de la zone d’imagerie. A long terme, les effets indésirables majeurs sont liés au poids et à la taille de l’implant, ainsi qu’au stress mécanique pouvant résulter des chocs répétés contre les parois de la cage. Les effets indésirables liés au protocole d’enregistrement lui-même sont limitées en termes de douleur : le matériel d’enregistrement étant miniaturisé, le poids sur la tête de l’animal est réduit. Cependant, l’utilisation d’un câble, même souple, restreint la liberté de mouvement de l’animal et peut occasionner son enroulement, ce qui augmente l’inconfort de l’animal. La répétition de sessions d’enregistrement quotidiennes peut aussi détériorer la stabilité de l’implant, ce qui peut, à terme, diminuer la qualité des enregistrements et favoriser les risques cités plus-haut. Enfin, le protocole de conditionnement aversif implique d'utiliser des stimulations désagréables (ou très légèrement douloureuses) pour l'animal (nécessaire afin d’étudier la mémoire aversive) ce qui peut modifier le comportement de l’animal sur le long terme et occasionner des comportements telle que la prostration. Ces animaux bénéficieront cependant toujours de larges zones de « repli » dans lesquelles ils ne subiront pas de stimulations.

Devenir

A l'issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation) des neurones qui ont été réactivés.

Remplacement

Notre objectif est d’étudier les réactivations neuronales à l’échelle du cerveau entier suivant un apprentissage spatial neutre, ou aversif. Ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Ces études ne peuvent pas non plus être réalisées chez les invertébrés, qui ont une structure cérébrale et un comportement trop simple. De plus nous souhaitons étudier à la fois les réponses électrophysiologiques et vasculaires mais aussi les paramètres physiologiques comme la respiration ou le rythme cardiaque pour pouvoir faire un parallèle avec l’Homme (notamment pendant l’apprentissage). Enfin, les tests comportementaux, mécanismes de la consolidation mnésique et disponibilité des modèles génétiquement modifiés rende le modèle souris central a l’étude de la mémoire. C’est donc le seul modèle réunissant tous ces critères.

Réduction

Afin de minimiser l’utilisation d’animaux dans chacun des groupes, nous améliorerons l’efficacité de la procédure chirurgicale et le suivi longitudinal des animaux. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire, pour pouvoir réaliser des tests statistiques, à partir de nos résultats. Les comparaisons entre groupes expérimentaux seront réalisées avec des tests paramétriques (student ou Anova). Si les données ne suivent pas une loi normale, nous utiliserons des tests équivalents non-paramétriques (Mann- Whitney, Friedmann). Dans la littérature ainsi que selon nos précédentes publications, le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats significatifs au niveau histologique est de 5 animaux/groupe pour les groupes contrôle et de 15 animaux/groupe pour les groupes test. Étant donné que nos résultats dépendent de l’efficacité des implantations d’électrodes et de la qualité des images obtenues, de l’efficacité de l’apprentissage spatial et de la volonté des souris à explorer l’environnement, nous nous attendons à 50% de succès, pour l’approche histologique, soit un nombre total d’animaux de 10/groupe pour les groupes contrôles et de 30/groupe pour les groupes où une quantification histologique sera effectuée. Pour les études comportementales couplées à l’électrophysiologie, il est cependant préférable de disposer d’au moins 12 animaux/groupe. Pour améliorer l’utilisation des animaux, nous utiliserons des analyses basées sur des réseaux de neurones artificiels qui nécessitent 3 sous-groupes : pour entrainer le réseau de neurones, adapter les hyper- paramètres et pour obtenir les résultats. Il est donc nécessaire de disposer d’un nombre suffisant d’animaux pour chaque sous-groupe (le nombre minimum est de 4), mais la puissance des analyses en sera très fortement augmentée. De plus plusieurs hypothèses sur les modifications des réseaux de neurones pourront être testées sans avoir besoin de refaire des expériences sur de nouvelles souris. En plus des 50% de succès décrits précédemment d’autres facteurs limitant interviennent. L’implantation optimale des électrodes, le maintien de l’intégrité du connecteur et de la fenêtre crânienne diminuent le taux de succès des expériences comportementales de 30% supplémentaires. Les lots d'animaux expérimentaux à prévoir pour la tâche 2 comprendront donc 36 animaux/groupe.

Raffinement

Nos procédures seront optimisées afin de minimiser la douleur et la souffrance des animaux. Les chirurgies se feront en conformité avec la règlementation (anesthésie et analgésie appropriées). Le contact entre l’animal et l’expérimentateur sera facilité par une période d’habitation et de manipulation simple (2 expositions quotidiennes pendant 5 jours) permettant de réduire le stress de l’animal au contact de l’expérimentateur et donc la variabilité des résultats expérimentaux. Les animaux recevront un soin optimal après les chirurgies. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.

Choix des espèces

Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionnelle transposables aux humains. Le modèle souris est en particulier adapté aux études comportementales pour sa rapidité d’adaptation. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données électrophysiologiques préexistantes et pour laquelle l’outil pharmacogénétique et les modèles génétiques sont les plus développés ce qui permettra de faire le lien avec les études existantes et réduire in fine le nombre d’animaux. Nous utiliserons des souris sauvages C57Bl/6. La procédure de fenêtre crânienne et de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance de l’os du crâne est stabilisée. C’est pourquoi, en accord avec la littérature, nous choisirons un âge compris entre 8 et 10 semaines pour réaliser les implantations d’électrodes. Les enregistrements seront réalisés jusqu’à 4 mois après l’implantation.