Rongeurs

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur osseuse leur est greffée par injection paratibiale, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaires puis un prélèvement intracardiaque avant la mise à mort. Le porteur indique que la croissance tumorale peut être douloureuse et provoquer une gêne à la marche et des difficultés respiratoires liées aux métastases pulmonaires, du paracétamol étant ajouté à l'eau de boisson. Il décrit un ostéosarcome touchant surtout enfants et adolescents et juge "indispensable" de tester ces combinaisons d'immunothérapies chez l'animal avant la clinique.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente, touchant essentiellement des enfants et des adolescents. Le traitement de l’ostéosarcome repose sur l’association de polychimiothérapies à la résection complète de la tumeur, mais l’augmentation des chimiorésistances nécessite le développement de nouvelles thérapies. Des études montrent que la composition de l’infiltrat immunitaire de l’ostéosarcome est corrélée avec la progression tumorale (chez l’homme et dans des modèles animaux) : l’immunothérapie semble donc être applicable, mais a montré des résultats limités dans les essais cliniques. Ce projet vise à valider des combinaisons thérapeutiques induisant une meilleure réponse aux immunothérapies dans l’ostéosarcome. Il doit nécessairement se faire dans un modèle in vivo qui intègre la complexité de l’environnement immunitaire et osseux de cette tumeur.

Bénéfices attendus

Au final ce projet permettra de valider des approches immunomodulatrices en combinaison pour le traitement de l’ostéosarcome, ce qui a un potentiel très important en santé humaine, sur des indications où il y a très peu d’options thérapeutiques, et où celles dont nous disposons sont loin d’être idéales. Le nombre d’animaux par groupe est calculé de manière à permettre de détecter une différence d’approximativement 25% (cliniquement significatif) avec un écart type commun de 20%.

Procédures

Les tumeurs seront induites par injection de suspension cellulaire en position paratibiale. Cette injection a lieu une fois et est pratiquée sous anesthésie générale pour une duré total de 5 min. Deux prélèvement rétro-orbitaire de sang, un avant traitement (J0) puis un 10 jours post début du traitement seont réalisés. Ce prélèvement sera effectué après application d’un colyre anesthésique (durée du prélèvement : 5 min maximum). Un prélèvement sanguin intracardiaque de sang sera effectué sur chaque souris juste avant la mise à mort des animaux. Pour cela, les souris seront placées sous anesthésie profonde (isoflurane 5% / air 1.5%).

Impact sur les animaux

L'ostéosarcome est une tumeur osseuse ; le modèle utilisé est implanté en position paratibiale (entre l'os et le muscle) et est métastatique. De ce fait la croissance tumorale peut etre douloureuse c'est pourquoi du paracétamol est ajouté dans l'eau de boisson dès avant l'implantation des cellules et pour toute la durée de l'expérimentation. Une gène à la marche peut survenir qui est surveilléeet un point limite Et du fait des possibles métastases pulmonaires des dyspnées peuvent survenir. La survenue d'une gène respiratoire est d'ailleurs un point limite de l'expérience.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mot à l'issue de chaque procédure même en cas de non atteinte de point limite

Remplacement

Des études in vitro on été réalisées et ont montré l’intérêt de ces combinaisons thérapeutiques sur des modèles cellulaires. Cette approche in vitro a permis de remplacer des études in vivo. Maintenant afin de pouvoir valider la ou les meilleures combinaisons et les amener en clinique il est indispensable de tester ces approches dans un modèle animal mimant la clinique humaine.

Réduction

Dans ce projet, au maximum 280 souris seront utilisées et réparties dans 2 procédures expérimentales. Des tests in vitro préliminaires ont été réalisés et on déjà permis de repousser le passage chez l’animal et de réduire le nombre d’animaux à inclure. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum mais dans des mesures satisfaisantes pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative à l’efficacité des médicaments. Ce nombre se justifie par le nombre de combinaisons de médicaments testées et par lx, les répétitions ne concernant que les groupes ayant montré un effet antitumoral (répétition faite pour confirmer effet antitumoral, groupe pas effet pas refait.

Raffinement

Tout au court de ce projet, les précautions seront prises pour ne pas stresser l’animal. Le projet se déroule en 2 temps : Temps 1 : raffinement du modèle animal et temps 2 test des combinaisons. Toutes les injections de cellules seront effectuées sous anesthésie générale et après administration d’un analgésique. Afin de limiter le nombre d’injection faite à la souris, les composés suffisamment stables dans l’eau seront administrés dans l’eau de boisson, les autres administrés par voie IP. Afin de prévenir la douleur liée à la progression de la tumeur du paracétamol est ajouté dans l'eau de boisson 48h avant l'innoculation des cellules et est maintenu tout au cours de l'expérimentation. De l'enrichissement est ajouté dans les cages (nids, croquettes déposées au fond de la cage pour pallier aux difficultés d'accès à la grille de croquettes si boiteries. L'administration d'anesthésique, d'analgésique et d'antalgique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être (perte de poids, claudication, gêne respiratoire) permettent de limiter au maximum la souffrance animale.

Choix des espèces

L’utilisation d’anti PD1 est très bien décrite dans des modèles murins, ce qui n’est pas le cas dans les modèles de rats. Dans le modèle murin proposé, les cellules greffées sont de la même espèce que l’animal greffé ; ce modèle peut donc être établi sur un animal immunocompétent, condition nécessaire pour le test d’immunothérapies. Des modèles de xénogreffes établis chez les souris immunodéficientes ne permettraient pas d’évaluer l’effet du système immunitaire sur la progression tumorale. La lignée POS-1 et K7M2 sont dérivées de souris C57BL/6j et BALB/c. Les souris sont âgées de 7 semaines au moment de l’injection de cellules tumorales en position paratibiale. Cet âge est retenu car à un âge plus précoce, il est très difficile de greffer au niveau de ce site.

91 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, par voie sous-cutanée ou intraveineuse, censée provoquer un développement tumoral avec métastases cérébrales, avant d'être disséquées pour récupérer ces métastases. Le projet cherche à préciser le rôle d'un gène candidat dans la formation des métastases cérébrales, un processus que le porteur juge "difficilement modélisable in-vitro". Des points limites sont annoncés mais le résumé ne détaille pas les signes cliniques suivis.

Objectifs

Les métastases cérébrales surviennent chez environ 20% des patients atteints de cancers métastatiques. Leur survenue est de mauvais pronostic puisque moins de 10% des patients survivent au-delà de 2 ans. Le traitement de ces atteintes par chimiothérapie reste difficile en raison de la faible perméabilité du cerveau à de la plupart des molécules actuelles, par l’existence d’une barrière hémato-encéphalique entourant et protégeant le système nerveux central. Notre postulat est qu’il existe probablement une signature moléculaire propre liée à l’implantation des cellules tumorales sur le site métastatique cérébral. L’objectif est d’identifier, parmi cette signature, des gènes candidats potentiels que nous pourrions utiliser comme cible thérapeutique. A partir de prélèvements de patients, nous avons réalisé une étude comparative des gènes exprimés au niveau des métastases cérébrales et des métastases non-cérébrales. Ce travail a permis de mettre en évidence des gènes qui pourraient avoir un rôle dans le passage de la barrière hémato-encéphalique et/ou l’implantation des cellules tumorales dans le cerveau. Parmi ces gènes, l’un d’eux pourrait constituer une cible prometteuse de par les fonctions qui lui sont prêtées dans la littérature. L’objectif de cette demande est de déterminer le rôle fonctionnel de cette cible potentielle dans le processus métastatique cérébral.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet sont la validation de l’intérêt fonctionnel du gène identifié par l’analyse génomique et bibliographique dans le processus de métastase cérébrale ainsi qu’une meilleure compréhension du processus métastatique vers cet organe.

Procédures

Nous disposons de 2 lignées tumorales murines connues pour induire des métastases cérébrales chez la souris et qui expriment notre gène d’intérêt. Les animaux subiront une seule procédure d'injection des cellules tumorales. En fonction des types cellulaires, les injections se feront soit en sous cutané, soit en intraveineuse. Ce sont des actes peu douloureux qui ne nécessitent pas de sédation. Seule l'injection sous cutanée se fera sous anesthésie générale pour des raison techniques d'accès au site d'injection.

Impact sur les animaux

L'injection des cellules devrait conduire à un développent tumoral avec une possibilité de métastases cérébrales. Pour limiter au maximum les nuisances sur les animaux, un suivi quotidien et l'évaluation des signes clinique doivent nous permettre de suivre le développement tumoral dans le respect des points limtes fixés et de prévenir les domages aux animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés pour permettre leur dissection et la récupération des métastases cérébrales et non-cérébrales. Les cellules issues de ces métastases seront ensuite utiliéses pour des analyses moléculaires et fonctionnelles in-vitro.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à la poursuite de notre projet. Le phénomène métastatique est un phénomène plastique qui fait appel à des mécanismes complexes difficilement modélisables in-vitro. Si nous souhaitons mettre en évidence des différences fonctionnelles entre les cellules ayant envahis le cerveau et celle n’ayant pas envahis le cerveau, il est impératif que nous puissions les récupérer sur le site de la métastase.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé pour nécessiter le moins d'animaux possible tout en atteignant les objectifs scientifiques fixés. Pour ce projet, nous avons prévu 91 souris Balb/c Ann. Nous injecterons 2 lignées tumorales murines décrites pour induire des métastases cérébrales. Lors des dissections, nous récupèrerons les cellules tumorales de métastases cérébrales et des métastases non cérébrales pour effectuer des tests moléculaires et fonctionnels in-vitro. Une analyse informatique nous a permis de déterminer le nombre d'individus nécessaires sur la base d'une comparaison de 2 moyennes d'échantillons non appariés. L'évaluation des résultats obtenus se fera par la comparaison de 2 moyennes de groupes d'échantillons non appariés par un test de Mann withney.

Raffinement

Pour le raffinement, les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs. Si les points limites sont atteints avant la fin de l'expérimentation, l'animal sera euthanasié. Une période d'acclimatation de 7 jours sera observée à réception des animaux. Un enrichissement des cages sera systématiquement proposé. pour les souris, nous disposerons dans les cages des abris et des fagots en carton.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur des modèles murins car c’est un modèle pour lequel nous disposons de lignées cellulaires dont il a déjà été décrit qu’elles avaient un tropisme pour le système nerveux central. Nous utiliserons des souris Balb/c car il s’agit d’un modèle syngénique (H2d) pour les lignées utilisées, limitant les rejets des cellules tumorales. Souris adultes de 6 semaines. Les animaux sont identifiés par baguage à l’oreille. L’identification est réalisée 7 jours après leur arrivée. L’âge des animaux n’influe pas sur les capacités de développement tumorales et il n’est pas non plus rapporté d’influence de l’âge sur l’apparition des métastases cérébrales pour ces modèles. Aussi, nous choisirons des animaux adultes jeunes.

60 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale sous anesthésie, puis reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur indique attendre une perte de poids de J+1 à J+6 sans autre symptôme, et présente le hamster doré comme le "modèle de choix" pour évaluer une molécule, AM-001, déjà jugée efficace en culture cellulaire. Le recours à l'animal est qualifié de "nécessaire" pour valider une preuve de concept.

Objectifs

La protéine AM-001, est une molécule qui cible la protéine de l'hôte EPAC1 qui est elle-même une protéine impliquée dans la signalisation cellulaire dans un large éventail de processus biologiques et qui est activée en particulier par l'AMPc. Cette molécule, développée à l'institut I2MC, INSERM de Toulouse a montré qu’elle avait la capacité, en agissant comme un inhibiteur pharmacologique d’EPAC1, de protéger le cœur de pathologies aigues et chroniques (PMID: 32700175 et 30873562). Un précédent inhibiteur d’EPAC1 a été montré comme efficace contre le SARS-CoV-1 et le MERS lors de précédentes études (Blocking of Exchange Proteins Directly Activated by cAMP Leads to Reduced Replication of Middle East Respiratory Syndrome, Tao and al., 2014). Ainsi nous avons décidé de tester AM-001 contre le SARS-CoV-2. Cette molécule s'est révélée efficace en culture cellulaire avec un très bon index thérapeutique et nous avons maintenant le souhait de la tester dans un modèle animal. Des essais chez la souris dans des modèles de maladies cardio-vasculaires ont montré que cette molécule était efficace et très bien tolérée, à la fois en IV et IP.

Bénéfices attendus

Résultats attendus: ce projet nous permettra d'évaluer l'efficacité de la protéine soit en utilisation thérapeutique, soit en utilisation prophylactique vis-à-vis du SARS-CoV2. La réduction de la perte de poids, de la charge virale dans les poumons et appareil respiratoire supérieur, des lésions pulmonaires (histopathologie) seront évalués.

Procédures

Infection intranasale sur animaux anesthésiés à l'isoflurane (J0) Administration quotidienne par voie IP sur animaux vigile (4 ou 8 injections IP selon les groupes)

Impact sur les animaux

Une perte de poids, progressive et s’étalant sur une période allant de J+1 à J+6 post-infection, est attendue chez les hamsters infectés avec du SARS-CoV2. Hormis cette perte de poids, il n’y a pas de symptômes cliniques attendus durant la période d’infection. L’infection n’aboutit jamais à des décès non désirés. A partir de J+7, les animaux commencent à reprendre du poids.

Devenir

Mise à mort afin de procéder à la collecte de divers organes/sang pour caractériser l'infection et la réussite du traitement étudié en prophylactique et thérapeutique.

Remplacement

Le recours à des animaux est nécessaire afin de valider la preuve de concept d'un usage prophylactique et ou thérapeutique de la proteine.

Réduction

le nombre d' animaux par groupe a été fixé à 6 qui est le minimum généralement requis pour obtenir des résultats d'infection virale statistiquement significatifs (p

Raffinement

Les hamsters seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette), cellulose, et de bâtonnets de bois à ronger. Un contrôle de leur état de santé sera assuré tous les jours. Des points limites précis et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis.

Choix des espèces

Les études scientifiques menées sur le SARS-CoV-2 ont maintenant largement démontré que le hamster doré était un modèle expérimental qui présentait une forte sensibilité au virus (atteintes respiratoires, perte de poids) ainsi qu'une forte réceptivité (multiplication du virus dans les poumons). Le hamster est donc le modèle de choix pour l'évaluation de l'efficacité de nouvelles thérapeutiques ou de nouveaux vaccins. Nos précédentes expérimentations nous ont permis de caractériser la réceptivité et la sensibilité des hamsters adultes vis à vis des souches SARS-CoV utilisées au laboratoire. Nous utiliserons donc des hamsters adultes de 8 à 10 semaines à réception.

8 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'intestin leur est provoquée par un agent chimique, par gavage d'une bactérie ou par injection de cellules inflammatoires, puis des composés leur sont administrés par gavage. Le porteur indique que les animaux développeront les signes des maladies inflammatoires de l'intestin, diarrhée, sang dans les selles et perte de poids. Il qualifie le recours aux modèles animaux d'"indispensable" pour tester des molécules déjà "testées et validées in vitro", les bénéfices pour les patients restant renvoyés au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles caractérisés par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices. Ces maladies sont caractérisées par une forte migration de cellules inflammatoires de types granulocytes au niveau de la paroi du tube digestif. L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur sur-activation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de MICI. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et approuvées in vitro. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat et la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par un agent chimique ou par le gavage d’une bactérie ou par l’injection de cellules inflammatoires. Certains de ces modèles utiliserons des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable.. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques des MICI qui se caractérisent par une diahrée, du sang dans les fèces et de la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analagésie sera envisagé. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies pour implanter puis retirer une pompe diffusant de la bléomycine sous la peau, avec prélèvements sanguins et imagerie, afin de tester des candidats-médicaments contre la sclérodermie. Le porteur indique que les souris développent une fibrose cutanée et interne accompagnée d'une perte de poids. Présentant le projet comme celui d'une "compagnie", il affirme que le recours aux modèles animaux est "indispensable" pour tester l'efficacité de ces thérapies.

Objectifs

La sclérodermie est une maladie chronique d'étiologie inconnue, caractérisée par une fibrose diffuse, des anomalies vasculaires de la peau, des articulations et des organes (œsophage, voies digestives basses, poumons, cœur et reins). Les symptômes fréquents comprennent le phénomène de Raynaud, les polyarthralgies, la dysphagie, le pyrosis et la tuméfaction et, finalement, des sténoses cutanées et des rétractions des doigts. L'atteinte du poumon, du cœur et des reins est la cause de la plupart des décès. Le diagnostic est clinique, mais les examens biologiques confortent le diagnostic et facilitent l'établissement du pronostic. Le traitement spécifique est difficile et l'accent est souvent mis sur le traitement des complications. Le but de notre compagnie est de développer de thérapies capables d'inhiber ces cibles et d'interférer avec l'évolution de la maladie. Grâce à la miniaturisation, nous avons pu mener plusieurs campagnes de criblage à haut débit qui ont permis d’identifier des molécules chimiques ou des cibles biologiques capables de bloquer ces voies de signalisation in vitro. Ces molécules vont être optimisées dans le but d’en faire des médicaments. Dans le cadre de ce projet, les candidats-médicaments qui auront montré un potentiel significatif d’inhibition des voies de signalisation ciblées dans les différentes pathologies seront retenus pour être évalués in vivo sur des modèles animaux de sclérodermie. Ce programme de découverte de médicaments sera mené avec plusieurs séries chimiques agissant via des modes d’action moléculaires différents, mais tous pertinents dans l’objectif de diminuer les symptômes des différentes pathologies d’intérêt. Des combinaisons entre ces modes d’actions seront envisagées au cours de ce programme et testées sur les modèles animaux. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies utilisées. Les études in vitro apportent des informations sur l’efficacité, la puissance et la sélectivité de nouveaux agents thérapeutiques potentiels. En complément de ces modèles, les expérimentations chez l’animal qui permettent de préserver l’intégrité des organes impliqués dans la pathologie, leurs interactions cellulaires et leurs interactions avec les systèmes nerveux, endocrine, circulatoire, gastro-intestinal, immunitaire sont indispensables.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de sclérodermie.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie conduisant à l’implantation puis une deuxième chirurgie pour l’explantation d’une pompe osmotique contenant de la bléomycine sous la peau du dos. Chirurgies réalisées sous anesthésie gazeuse puis suivie d’une administration de buprénorphine (locale et/ou eau de boisson). Un prélèvement sanguin (100µl) sera réalisé à la veine submandibulaire sous anesthésie gazeuse au cours de l’étude. Un suivi de la pression partielle en oxygène pourra être réalisé (jusqu'à 3 fois) au cours de l’étude sur animal vigile (5min) Une évaluations de la fibrose pulmonaire pourra être réalisées par imagerie au rayon X sur animal anesthésié à l’isoflurane (jusqu'à maximum 3 fois au cours de l'étude).

Impact sur les animaux

Les animaux développeront les signes cliniques de la sclérodermie qui se caractérisent par une fibrose cutanée diffuse ainsi qu’une augmentation de la fibrose des organes internes associée à une perte de poids.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour les besoins de prélèvements.

Remplacement

La fibrose tissulaire est une pathologie complexe mettant en scène de nombreux acteurs cellulaires, fibroblaste, cellule épithéliales, cellule endothéliale et cellules immunitaires. Dans ce contexte, l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité de thérapies anti-fibrotique innovantes pouvant interagir à diffèrent niveaux de la cascade de la pathologie. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro puis leur tolérance a été validée avant d’être utilisées dans des études plus larges.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature . Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Les paramètres mesurés seront gardés ou exclus selon qu'ils suivent une distribution normale et présentent une variabilité acceptable. L'analyse statistique concerne des séries indépendantes, supérieures à 2 groupes. L'analyse de variance (ANOVA) sera suivie d'un test paramétrique ou non paramétrique en fonction de la configuration de l'étude, permettant des comparaisons multiples (e.g. Dunnett). Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié à la procédure incluant de la chirurgie cutannée, un programme d'anesthésie sera envisagé par inhalation d’isoflurane (induction 4%, maintien 2%) et un schéma à base de buprénorphine à 0,01-0,2 mg/kg/8h en sous cutanée sera utilisée avant et après la chirurgie. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans le cadre de ces recherches est la souris. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour ce modèle, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-fibrotique, sur un système immunitaire mature

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante par chirurgie 64 électrodes intracérébrales, puis ils cherchent de la nourriture dans des environnements variés sous restriction alimentaire maintenant leur poids à 90 %, pour enregistrer l'activité de l'hippocampe et du thalamus visuel. Le porteur précise que les rats sont hébergés seuls pour préserver l'appareillage et qu'ils sont pesés chaque jour, l'alimentation redevenant libre au-delà de 15 % de perte. Il affirme que ces enregistrements invasifs sont incompatibles avec l'humain et qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut remplacer l'animal.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment des structures cérébrales, bien connues par ailleurs pour leur rôle dans le traitement des informations visuelles, participent à la construction de la représentation spatiale chez le rongeur. La représentation de l'espace constitue une question centrale dans le domaine de la recherche en cognition. Près de cinquante années de recherche en neurophysiologie, reposant pour l'essentiel sur l'utilisation du modèle rongeur, ont permis d'identifier les structures cérébrales indispensables à la construction de cette représentation spatiale. L'hippocampe est l'une de ces structures. Les études électrophysiologiques visent à essayer de comprendre le fonctionnement d'une structure cérébrale en analysant l'activité des neurones en relation avec le comportement de l'animal. Les principales cellules hippocampiques sont des neurones pyramidaux qui montrent une intense activité lorsque l'animal se trouve à un endroit particulier de l'espace dans un environnement donné. Ces cellules de lieu permettent donc collectivement à l'animal de savoir où il se trouve et dans quel environnement il se trouve. Nous savons désormais que l’activation de ces cellules repose sur des informations de nature multimodalitaire (par exemple olfactive, tactile, visuelle, etc.) ce qui fournit au système de navigation un fort potentiel adaptatif. Néanmoins, les relations fonctionnelles entre les structures spécialisées dans le traitement des informations visuelles et celles spécialisées dans le traitement des informations spatiales restent très largement méconnues. Le but de ce projet est donc d’enregistrer l’activité neuronale simultanément dans deux structures cérébrales, l’une spécialisée dans le traitement des informations spatiales (hippocampe), l’autre dans le traitement des informations visuelles (corps genouillé dorso-latéral), et d’observer les interactions neuronales en réponse à des manipulations environnementales. Pour ce faire, les animaux seront implantés avec des microdescendeurs équipés de 64 électrodes et devront se déplacer dans des environnements plus ou moins complexes à la recherche de nourriture. Un deuxième volet de l’étude consiste à établir une cartographie des champs récepteurs visuels de ces deux populations neuronales chez l’animal anesthésié. D'une durée de 5 ans, ce projet nécessitera l'utilisation de 24 rats (mâles et femelles) de souche Long-Evans adultes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de clarifier le rôle des informations visuelles dans la consolidation mnésique telle qu’observée au niveau hippocampique. Les expériences de cartographie des propriétés visuelles des neurones thalamiques nous permettront, quant à elles, de confirmer la présence de cellules de lieu dans cette région sous-corticale. L’ensemble de ces résultats nous amènera éventuellement à reconsidérer le rôle du corps genouillé dorso-latéral dans les processus de mémorisation et plus simplement dans le traitement des informations visuelles.

Procédures

Procédure chirurgicale (Procédure 1). Implantation chronique d'électrodes intra-cérébrales. Procédure unique. 4 heures en moyenne. Procédure facultative de réparation des implants (Procédure 2). Anesthésie de courte durée. Procédure facultative, de 0 à 2 fois par animal. Entre 10 et 15 minutes en moyenne. Procédure comportementale (Procédure 3). Tâche de recherche aléatoire de nourriture chez l'animal libre de ses mouvements. Maximum 3 fois par jour pendant 3 mois. 12 minutes par session. Procédure d'enregistrement de l'activité cérébrale (Procédure 4). Recueil des données électrophysiologiques au cours de la tâche comportementale. Maximum 3 fois par jour pendant 3 mois. 12 minutes par session. Procédure de cartographie des propriétés visuelles (Procédure 5). Anesthésie de l'animal et caractérisation des propriétés visuelles des neurones thalamiques. Procédure unique. 5 heures en moyenne.

Impact sur les animaux

Les animaux après chirurgie sont placés individuellement dans des cages standard dont la grille est réhaussée de 13 cm. Cette mesure d'hébergement particulière est indispensable afin d'assurer le bon état de fonctionnement des microdescendeurs porte-électrodes. L'hébergement de plusieurs animaux dans une même cage pourrait aboutir à l'endommagement irréversible de cet appareillage et rendre ainsi impossible le bon déroulement des expérimentations. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré.

Devenir

A l'issue des procédures 1 à 4 incluse, tous les animaux sont gardés en vie. La décision de maintien en vie découle des objectifs de l'expérimentation, à savoir enregistrer les modifications de l'activité cérébrale en réponse à des modifications environnementales au cours des procédures comportementales. Ce n'est qu'à la fin du projet, (après la procédure n°5), que tous les animaux sont mis à mort de façon à pouvoir prélever le cerveau pour analyse histologique. Ce contrôle histologique est indispensable pour confirmer la position des électrodes au niveau des structures cérébrales d'intérêt.

Remplacement

Ce projet repose sur des méthodes invasives d'enregistrement de l'activité cérébrale, incompatibles avec une approche chez le sujet humain. De plus, de par la nécessité d'enregistrer l'activité cérébrale au sein d'un système complexe intégré, il est impossible de remplacer l'animal par des expériences in vitro, in silico ou ex vivo.

Réduction

L'utilisation de microdescendeurs indépendants à haute densité d'enregistrement permet de réduire considérablement (près de 50%) le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages rehaussées (+13 cm) spécifiquement à cette occasion. Cette hauteur permettra aux animaux de pouvoir se redresser complètement dans leur cage sans que l'implant ne gêne leurs mouvements. Les implants seront équipés d'un système de connexion magnétique ce qui permettra à l'expérimentateur de connecter les animaux sans avoir à les restreindre. Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées à l'aide de produits anesthésiques et analgésiques adaptés. Les animaux sont surveillés pendant toute la période post-opératoire en utilisant une grille d'évaluation adaptée pour détecter d'éventuels signes de douleur ou de mal être et une injection supplémentaire sous-cutanée d'analgésique est réalisée en cas de besoin. Les autres traitements éventuels sont établis par le vétérinaire de notre établissement d'expérimentation. Puisqu’un contrôle alimentaire est prévu pendant toute la durée de l’expérience afin de réduire le poids des animaux à 90% de leur poids initial, les rats sont pesés tous les jours afin d'éviter des réductions trop importantes de leur poids. Si la perte de poids d'un animal est trop importante (e.g. >15%), l’alimentation de l’animal devient ad libitum jusqu’au retour du poids désiré. Notre grille de score permet de caractériser l'état général de l'animal sur la base d'un certain nombre de paramètres auxquels des points sont attribués (apparence générale, abreuvement et alimentation, examen clinique, comportement naturel, comportement provoqué) et, selon le score obtenu en additionnant les points correspondant aux paramètres, permet de conduire les actions suivantes : 0-4 Normal, pas d’action requise. 5-9 Observer attentivement, envisager l’utilisation d’antalgiques (Kétoprofène 5mg/kg, PO ou Carprofène 5mg/kg, SC). En cas de dermatite au niveau du scalp, l’application d’une pommade nettoyante, antiseptique et cicatrisante peut être envisagée (Acide Malique, DERMAFLON). Si présence d’infection, envisager l’utilisation d’antibiotiques à large spectre (Oxytetracycline, 10 mg/kg, SC) pendant trois à cinq jours. 10-14 Souffrance, administration d’antalgiques (Buprenorphine, 0.05 mg/kg, SC) et observer régulièrement. Demander un deuxième avis (SBEA et/ou Vétérinaire référent). 15-17 Souffrance sévère. Mise à mort.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix pour les études du comportement spatial qui est à la base des protocoles comportementaux qui seront utilisés. Il présente d'excellentes performances dans les tâches de navigation spatiale. Par ailleurs, 90% des études portant sur les bases neurales de l'apprentissage et des comportements de choix réalisés chez le rongeur reposent sur l'utilisation du rat, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, tous nos travaux antérieurs ont été réalisés chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats entre eux. Le projet vise à établir le rôle de certaines structures cérébrales chez le rat jeune adulte. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les travaux antérieurs, nous utiliserons des animaux qui auront 3 mois au début de l'expérience.