Rongeurs

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Déficientes en anticorps IgA ou en leur récepteur, elles reçoivent des gavages quotidiens pendant dix-huit jours et deux prélèvements de sang, avant mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. L'objet est d'étudier l'effet de ces déficiences sur le microbiote intestinal et de tester un apport oral d'anticorps. Le porteur affirme que les interactions hôte-microbiote ne sont pas reproductibles in vitro et indique qu'aucune alternative n'existe pour ce projet.

Objectifs

Les immunoglobulines A (IgA) et M (IgM) sont abondamment produites dans le chorion de la muqueuse intestinale, avant d'être sécrétées dans la lumière intestinale. Les Immunoglobuline sécrétées (SIg) comprennent donc les SIgA et les SIgM, et façonnent le microbiote intestinal, notamment en offrant une protection contre les pathogènes, en permettant l'implantation de certaines souches bactériennes, et en favorisant l'échantillonnage des bactéries commensales au niveau des plaques de Peyer ; des organes lymphoides secondaires impliqués dans la réponse immunitaire mucosale. Ainsi, la déficience en IgA chez les humains est associée à une baisse de la diversité microbienne dans les fèces, et ce malgré la compensation de cette déficience par une sécretion augmentée de SIgM. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de la déficience en SIgA seules ou en SIgA et SIgM, sur la composition du microbiote intestinal de souris. De plus, la possibilité del'administration passive d'IgA par voie orale Pour cela, nous disposons au laboratoire de deux modèles différents : - Des souris IGHA-/-, de fond génétique BALB/C, qui ne produisent pas d'IgA que ce soit en périphérie ou dans la muqueuse intestinale. De façon similaire à la déficience en IgA chez l'homme, qui est l'immunodéficience humaine la plus commune, les SIgM seront toujours présentes dans la lumière intestinale, mais les SIgA en seront absentes. - Des souris pIgR-/- de fond génétique C57bl/6, qui sont déficientes pour le récepteur pIgR, nécessaire au transport des immunoglobulines vers la lumière intestinale, et donc à la production de SIg. Ces souris n'ont ni SIgA ni SIgM dans la lumière intestinale. Ce modèle reflète plutôt les immunodéficiences transitoires chez l'homme, notamment celles induites par l'utilisation d'immunosuppresseurs. Ces souris transgéniques sont déjà présentes dans l'animalerie du laboratoire. Ces souris sont de fond génétique différent, et il est préférable de comparer chacun des modèle à des souris sauvages du même fond génétique. En effet, des différences basales du système immunitaire pourraient expliquer des variations du microbiote intestinal, qui seraient alors indépendantes de la présence ou non de SIg. Des souris contrôles différentes seront donc utilisées pour chaque modèle. Afin de limiter les différences de microbiote entre les souris, ces dernières seront traitées par antibiotiques puis traitées par transplantation fécale (FMT) à partir de fèces de souris, ou de fèces humaines.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est double : -D'un point de vue fondamental, il permettra de mieux comprendre l'impact de la compensation de la perte des SIgA par les SIgM, en comparant la dysbiose (ou déséquilibre de la flore intestinale) entre les souris pIgR-/- déficientes en SIgM et SIgA et IGHA-/-, uniquement déficientes en SIgA. De plus l'utilisation de modèles murins permet d'étudier la composition du microbiote intestinal dans les fèces, mais aussi directement dans l'intestin, ce qui permet une analyse plus précise que ce qui a déjà était fait chez l'homme. Ces résultats seront complétés par l'étude des métabolites dérivés du microbiote dans les fèces de ces souris. En effet, ces métabolites jouent un rôle important dans le métabolisme de l'hôte et dans la stimulation de son système immunitaire. - Cette étude apporte également un intérêt pour les applications cliniques d'administration orale d'IgA. La possibilité de limiter la mise en place d'un déséquilibre de la flore intestinale par un transfert passif d'IgA par voie orale a un intérêt clinique majeur. Si cette solution se révèle efficace, elle pourra en effet être testée chez des patients déficients en IgA ou sous immunosuppresseurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à des gavages par voie orale réguliers (1 fois par jour pendant 18 jours). La manipulation par animal dure entre 20 secondes et 1 minute. En début et fin d'expérimentation, du sang sera prélevé de chaque animal au niveau de la veine saphène (2 prélèvements à J4 et J18).

Impact sur les animaux

Les mutations portées par les modèles transgéniques pIgR-/- et IGHA-/- n'entachent pas la qualité de vie des animaux. Les gavages oraux réalisés fréquemment seront réalisés par un personnel particulièrement habitué au geste, de façon à ne créer aucune lésion et à diminuer la durée du geste.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale après anesthésie à l'isoflurane.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier finement les interactions entre un hôte et son microbiote intestinal. Ce dernier est composé d'une grande quantité de taxons différents, qui peuvent être aérobie ou anaérobie, et qui varient le long du tube digestif. Leur implantation dépend de nombreux facteurs parmi lesquel l'alimentation de l'hôte, la réponse immunitaire, la sécrétion de mucus, la compétition inter-espèces etc. Ces facteurs ne peuvent pas être contrôlés in vitro. Il n'y aucune possibilité de réaliser ce projet sans l'utilisation de modèles animaux.

Réduction

Les effectifs de 6 souris par groupe représentent la quantité minimale de souris nécessaire pour avoir assez de puissance pour conclure.

Raffinement

Les souris sont suivies attentivement par un personnel qualifié. Leur douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont. Les animaux sont hebergés en groupes harmonieux (par 2) et dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). L'eau et la nourriture sont mis à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée pour couvrir les bruits parasites.

Choix des espèces

La souris présente plusieurs avantages pour ce projet. Premièrement, elles produisent des IgA à la structure proche des IgA2 humaines (la sous classe majoritairement retrouvée dans les sécrétions mucosales), ce qui n'est par exemple pas le cas des modèles invertébrés. De plus, la grande majorité des travaux effectués sur les SIgA est conduite chez la souris, et notre travail pourra être analysé plus finement grâce à la vaste littérature qui existe sur ce sujet et avec ce modèle. Enfin, Les modèles IGHA-/- et PIGR-/- sont déjà présents dans notre animalerie, et permettront d'observer l'effet des IgA administrées oralement. Les souris auront entre 5 semaines et 6 mois, car avant 5 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complet et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un gène de l'autophagie invalidé, elles subissent une série de tests de développement puis des tests comportementaux nommés, dont l'activité locomotrice, l'anxiété, la résignation et la communication, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. L'objet est d'étudier le rôle de l'autophagie dans les troubles du neurodéveloppement comme l'autisme, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'effet d'un tel défaut sur le comportement ne peut s'étudier autrement qu'in vivo.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier à différents âges le développement du système nerveux central chez un modèle souris pour lequel un gène de l’autophagie a été invalidé, par des approches complémentaires d’études du comportement et d’analyses des tissus prélevés. En particulier, nous étudierons le développement sensoriel et moteur chez le jeune animal pendant les trois premières semaines de vie, par la mise en place de tests successifs classiquement utilisés ; puis nous étudierons un ensemble de registres comportementaux individuels ou sociaux chez l’animal adolescent et adulte, tels que le niveau d’activité locomotrice, l’anxiété, les capacités cognitives, les comportements compulsifs, la résignation et les capacités de communication. Les échantillons prélevés nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de développement ou de comportement non invasifs. Ils sont tous soumis à une procédure sans réveil de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans les procédures du présent projet, les animaux subissent exclusivement des tests non invasifs de développement et de comportement, jusqu’à l’euthanasie, pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place.

Devenir

A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux sont soumis à la procédure 4 (sans réveil). La procédure 4 décrit une perfusion intracardiaque réalisée afin de prélever les tissus d’intérêt. Les procédures 1, 2 et 3 sont classées en degré de gravité « modéré » et la 4ème est une procédure sans réveil. Les 3 premières procédures concernent chacune 120 animaux, la 4ème est réalisés sur l’ensemble des 360 animaux soumis à l’une des 3 premières procédures modérées. Nous comptons donc dans cette demande d’autorisation de projet 360 animaux en procédure modérée et 0 en procédure sans réveil. Les animaux ne sont donc pas maintenus en vie à l’issue de la procédure 4.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 360 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, quand cela est possible, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et la réalisation de séries de coupes par cerveau nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement : La normalité de la distribution des data obtenues sera analysée par le test de Shapiro-Wilk, et des tests paramétriques (ANOVA et test a posteriori de Bonferroni pour les données issues des tests de développement et comportement ou test t de Student pour les analyses des échantillons) ou non paramétriques (test de Kruskal-Wallis puis Mann-Whitney) seront ensuite appliqués. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié par décapitation avant PND14 et dans une chambre à CO2 après PND14. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place (procédure 4). Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en oeuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement (voir 3.3.2). Plusieurs stades de développement seront analysés : nous nous intéressons en effet aux conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, correspondant chacun à un temps d’euthanasie, seront étudiés : jeune (procédure 1 de PND4 à 17), adolescent (procédure 2 de PND25 à 34) et adulte (procédure 3 de PND70 à 89).

105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes et greffées avec des cellules souches humaines, elles reçoivent des injections répétées à doses croissantes d'un traitement anticancéreux, des prélèvements sanguins et une imagerie par bioluminescence une à deux fois par semaine, avant euthanasie. L'objet est le développement préclinique d'une immunothérapie contre des cancers du sang avant un essai clinique, les retombées pour les patients restant renvoyées à ce projet futur. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut se modéliser in vitro et invoque l'effet de l'organisme entier.

Objectifs

Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR in vivo (stratégie d’immunothérapie cellulaire) ciblant un marqueur tumoral que nous souhaitons mener jusqu’à la démonstration de sa sécurité et de son efficacité thérapeutique dans des indications de cancers du sang. Ces résultats sont un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2022. Il s’agit d’évaluer l’efficacité anti-tumorale lorsque notre CAR in vivo est injecté et distribué entre les différents compartiments de l'organisme dans un modèle murin humanisé. Ce projet nous permettra également de démontrer chez l’animal que la modification des cellules sanguines est bien spécifique des lymphocytes T (globules blancs du système immunitaire) ciblés et que notre CAR in vivo est bien toléré lors d’administrations répétées à des doses croissantes. Ces problématiques ne peuvent être abordées que via l’expérimentation animale. Aussi nous explorerons l’efficacité anti-cancéreuse, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines. Le choix de la souris NSG-hCD34+ est justifié car c’est un modèle de référence en oncologie très largement caractérisé́ et dont la prédictibilité a été démontrée dans de nombreuses études en immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR T-cell in vivo dirigé contre le marqueur tumoral CD19 qui doit nous permettre de démontrer sa sécurité et son efficacité thérapeutique dans des modèles de cancers hématologiques. Cette preuve de concept d’efficacité anti-cancéreuse est un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2023 chez les patients atteints de cancers hématologiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins à 5 temps différents (J-7, J+3, J+10, J+17, fin de projet). Ils seront aussi soumis à des injections par perfusions ou injections, ces perfusions/injections seront au nombre de 3 à 5 d'affilé. Ils passeront ensuite des examens d'imagerie par bioluminescence 1 à 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Suite aux protocoles expérimentaux et aux anesthésies, une perte de poids peut être observée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie générale à l'isolflurane

Remplacement

La biodistribution d'un composé implique une interaction forte entre les différents compartiments de l'organisme, c'est à dire un échange entre le sang et les organes. Actuellement, il n'est pas possible de modéliser cette répartition tissulaire in vitro. Par ailleurs, même si l'innocuité des composantes de notre produit (lentivecteur + polymère + agent de ciblage anti-CD3) a déjà été vérifiée dans nos tests cellulaires et in vivo (par d’autres groupes), l'effet de l'organisme entier sur le lentivecteur associé au polymère ne peut être complétement évalué. Afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines, nous explorerons l’efficacité, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris NSG (NOD scid gamma) immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines. L’expérimentation chez la souris est nécessaire pour démontrer que la transduction des cellules cibles est toujours efficace quand notre produit injecté en systémique et distribué entre les différents compartiments de l'organisme.

Réduction

Afin de minimiser la consommation inutile des 105 souris qui pourraient être exposées à des doses dépassant la dose maximale tolérée, nous avons prévu 3 procédures qui seront lancées de manière séquentielle après avoir vérifié que les doses et protocoles d’injections de la procédure précédente ne présentent pas de toxicité macroscopique particulière. Le nombre de souris par groupe nécessaire et suffisant pour pallier à la forte variabilité interindividuelle observée en imagerie de bioluminescence et en cytométrie de flux a été défini. De plus il permet de démontrer l’efficacité du traitement par rapport aux groupes contrôles grâce à l’analyse statistique des résultats (tests one-way ANOVA et Kaplan-Meier) avec une signification suffisante (valeur p

Raffinement

Afin de raffiner nos procédures et limiter le stress et la souffrance chez les animaux, nous utiliserons des protocoles précis d'anesthésie et de prise en charge de la douleur par l'injection d'analgésie. Nous respecterons les points limites établis par la surveillance quotidienne des animaux et le suivi de leur état via une fiche de scoring. Leur environnement est aussi quotidiennement contrôlé et l'enrichissement est présent et adéquat au vue de l'espéce (batonnet de coton, sizzle ball, demi dôme de cellulose)

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches dont le système immunitaire a été très largement caractérisé. La multitude de références bibliographiques en fait donc un modèle de choix. Par ailleurs, de nombreuses études en immunothérapie ont montré de bons résultats dans le modèle murin NSG-hCD34+. Ces animaux sont greffés avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines et se caractérisent par une excellente maturation des cellules T et la présence de cellules CD4+ et CD8+ dans la circulation et autres tissus. Cette souche constitue un modèle idéal pour vérifier in vivo la spécificité pour les lymphocytes T des promoteurs humains et des aptamères anti-CD3 développés en interne. Enfin le modèle de lymphome choisi et basé sur l’injection systémique de cellules Ramos humaines exprimant la Luciférase est également un modèle reconnu qui a été utilisé pour l’évaluation préclinique de différents agents anti-cancéreux. Les animaux utilisés seront adultes. Ce choix est nécessaire pour pouvoir injecter des volumes d’au moins 250 µL en iv ou 450 µL en perfusion contrôlée et lente (22,5 µL/min) étant contraints par les titres (nombre de particules virales infectieuses) de nos préparations de lentivecteurs. Après réception dans l’animalerie et observation de la quarantaine, une période supplémentaire de 2 semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et régime alimentaire sera respecté afin de réduire autant que possible l’état de stress des individus et ainsi avoir des animaux dans un état général optimal pour supporter des anesthésies générales répétées.