Rongeurs

99 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous la peau et dans le derme de composés myorelaxants candidats, puis sont mis à mort pour l'analyse histologique des sites d'injection. Le porteur qualifie ces injections de "brèves, indolores et peu stressantes" alors qu'il déclare par ailleurs une douleur liée à l'injection et une gêne en cas d'inflammation. Il justifie l'usage du rat par la continuité avec ses études de toxicité antérieures et écarte les modèles cellulaires, jugés inadaptés à son développement.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de déterminer la bonne tolérance de nos composés après injections sous-cutanées ou intradermiques. Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, sous la peau (injection sous-cutanée) et dans les couches supérieures du derme (injection intradermique). L'observation est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Nos produits seront comparés au traitement actuel de référence.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (molécule la plus active et la plus intéréssante) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes :

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection s.c. / i.d. = 6 injections, durée 1 min / animal. - Pesée des animaux = maximum 5 pesée / animal => 30 secondes / pesée => 2.5 minutes / animal. - Observation des réactions = 1 fois / jour => 30 sec / animal.

Impact sur les animaux

Ces molécules ont déjà été injectées en intramusculaire, sans avoir provoqué le moindre signe clinique (macroscopique ou en analyse histopathologique). Nous n’attendons ainsi pas de signe clinique particulier après injection des molécules ; toutefois, afin de se prémunir de tout imprévu, nous suivrons avec attention tout signe, et avons mis en œuvre les mesures décrites dans le tableau fourni en annexe. De plus, dans cadre de nos procédures, les nuisances attendues sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection ; une douleur liée à l’injection sous-cutanée ou intradermique ; une gêne si inflammation des tissus.

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés car les sites d’injections seront prélevés pour des analyses histopathologiques.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Des modèles in vitro d'irritation locales existent bien mais ne sont pas adaptés dans notre developpement, en effet, la production d'anticorps anti-drug necessite et impliquent le système immunitaire de complet de l’hôte, ainsi aucun modèle in vitro ne peut remplacer ce système.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de Kruskal Wallis). Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 3 animaux / doses / type d’injection. De plus, les 2 flancs des animaux étant utilisés , ceci nous permet de réduire le nombre d’animaux en maximisant le nombre de site/composé (n=6/dose)

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les injections intradermiques et sous cutanée dans la peau du flanc, sont réalisés sous contention par un expérimentateur entraîné, et les observations sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux.

Choix des espèces

Nos études précédentes (preuve de l’efficacité de nos molécules et étude de toxicité GLP) ont été réalisées chez le rat. Ainsi, par continuité avec ces études, notamment sur les analyses histologiques, il nous semble important de continuer sur ce modèle. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis par continuité avec nos études précédentes fonctionnel et notre étude GLP de toxicité

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection du produit dans le cerveau ou la moelle épinière, par voie intracrânienne, intrathécale ou intraveineuse, puis sont mises à mort au plus tard soixante jours après pour prélever leurs tissus. Le porteur indique des douleurs post-opératoires possibles, un saignement lors de la descente de l'aiguille, une perte de poids ou un décès sous anesthésie, et décrit un protocole d'analgésie. Il conclut à l'irremplaçabilité de la souris, aucune culture cellulaire ne reproduisant selon lui la complexité du cerveau, pour optimiser une thérapie génique visant les maladies neurodégénératives.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles stratégies sont essentielles pour progresser dans la prise en charge des patients. Parmi ces nouvelles approches se trouve la thérapie génique. Elle utilise la génétique pour soigner ou prévenir la maladie. L’objectif est de délivrer aux cellules malades un gène à action thérapeutique (transgène) qui permet de remplacer la protéine défectueuse à l’origine de la maladie. Ce gène médicament est transporté dans les cellules grâce à un virus modifié (vecteur viral) dont les caractéristiques peuvent permettre de cibler plus ou moins spécifiquement les cellules malades. Le projet « Optimisation de l’expression d’un transgène sur modèle murin par modulation du sérotype du vecteur thérapeutique et du site d’injection en vue d’une application en thérapie génique pour les maladies neurodégénérative » a pour but de déterminer les conditions optimales d’administration (site d’injection et spécificité du vecteur médicament) pour permettre d’augmenter l’efficacité du traitement de thérapie génique en vue d’une application à l’homme. Nous testerons différents vecteurs médicaments ainsi que différents sites d’injection et testerons leur efficacité. Cette optimisation permettra d’ajuster au mieux la thérapie aux patients en ciblant de manière plus spécifique les cellules malades et en déterminant la meilleure voie. Les deux approches combinées (ciblage des cellules malades et choix de la voie d’administration) permettront d’améliorer considérablement l’efficacité de la thérapie tout en réduisant de manière significative les risques liés à l’utilisation de virus en diminuant la dose utilisée.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de : - déterminer la meilleure voie d'administration pour le traitement de maladie neurodégénérative, - déterminer la dose de virus utile pour un traitement avec pour objectif de réduire cette dose au maximum, - déterminer une stratégie thérapeutique qui réduirait le délai pour envisager une application à l’homme.

Procédures

Pour l’ensemble de ce projet aucun prélèvement ne sera effectué sur animal vigile. Deux interventions seront effectuées sur chaque animal, l’une au moment de l’injection (IC - Intra cranienne, injection dans le cerveau), ICM - Intra Cisterna Magna, injection dans la grande citerne, cavité à l'arrière de la tête entre le crâne et la première vertèbre, IT - Intrathécale, injection au niveau de la moelle épinière par injection entre les vertèbres, ICV - IntraCérébroVentriculaire, injection dans les ventricules du cerveau, IV - Intraveineuse, injection dans le système veineux), l’autre au moment de l’euthanasie au maximum 60j post-injection. Pour les injections IC, ICM, IT, ICV une intervention inférieure à 30 minutes animal endormi, avec prise en charge analgésique 30 minutes avant la chirurgie sera effectuée. Afin d’éviter la douleur, post-chirurgie, les animaux reçoivent l’administration d’analgésique dans les 48 heures suivant la chirurgie. Pour l’injection IV une intervention de moins de 5 minutes par animal sera réalisée (5 minutes pour anesthésie et injection avec un temps d’injection de 20 secondes maximum). Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever les tissus pour analyses.

Impact sur les animaux

Cette étude ne devrait pas engendrer de nuisance ou d’effet indésirable pour les animaux (surexpression modérée des différentes protéines et un temps d’expression suffisamment court pour ne pas engendrer de toxicité à long terme). L'utilisation d'antalgique (buprénorphine) permettra de minorer les éventuelles douleurs post opératoire liées : (1) à la manipulation des animaux (placement sur appareil de stéréotaxie), (2) à l’injection (réalisation de trepan pour l'Intra Cranienne et l'Intra Cérébroventriculaire, chirurgie pour injection dans la Cisterna Magna et en Intra Thécale), (3) à un saignement suite à une lésion d’une artère ou d’une veine lors de la descente de l’aiguille au site d’injection, (4) à une perte de poids liée à l’intervention et/ou chirurgie ou un décès dû à l'anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin procédure expérimentale pour les prélèvements et leurs analyses afin de pouvoir répondre a la question scientifique de ce projet.

Remplacement

Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles.

Réduction

Des résultats précédents nous ont permis d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités. Le nombre d’animaux utilisés est donc optimisé pour obtenir des résultats statistiques. La composition des groupes d’étude a été faite pour utiliser un nombre minimal d’animaux (6 animaux, un seul sexe étudié car aucune variabilité liée au sexe n’est attendue permettant ainsi de ne pas injecter d’animaux supplémentaires pour homogénéiser le ratio sexe F/M). Leur nombre (338) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. Un groupe contrôle de 12 animaux servira pour l’ensemble de l’expérience. En cas de problème pour l’un des groupes injectés (tel qu’un décès lors de l’anesthésie par exemple), un animal du groupe contrôle sera utilisé en remplacement, ainsi aucun animal supplémentaire ne devrait être ajouté à celui indiqué précedemment pour finaliser le projet. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Un plan statistique complet a été rédigé et validé. L’analyse statistique sera réalisé à l’aide du logiciel statistique informatique.

Raffinement

Les animaux seront regroupés par groupes de 6. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Un suivi quotidien des animaux sera effectué certifiant un contrôle régulier du bien-être des animaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance inutile. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection de lidocaïne (anesthésique local) et par protocole analgésique ratifié par le vétérinaire du service pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Toute manipulation de vecteurs thérapeutiques se fait dans les conditions optimales. Les animaux seront hébergés en zone confinée du moment de l’injection des vecteurs thérapeutiques jusqu’à leur euthanasie. Un environnement enrichi sera garanti aux animaux, : carré de coton ou des lamelles de kraft pour la nidification. Un igloo sera ajouté dans chaque cage. Tout au long de la vie des animaux un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris. Notre étude a pour but d’étudier la biodistribution, un modèle « complet » animal est donc indispensable. Le modèle murin est le modèle de référence pour des études préliminaires. Les animaux utilisés seront injectés à P50 et mis à mort 2 mois après injection. Ce projet a pour objectif de déterminer la voie d’administration optimale en fonction du sérotype et du transgène choisi. Il servira de référence en vue d’une application de cette stratégie sur l’humain adulte. Des animaux adultes sont donc utilisés. L’expression de nos vecteurs est optimale 4 à 6 semaines post injection, nous avons choisi de conserver les animaux 8 semaines post injection pour que chacun des animaux injectés exprime la protéine d’intérêt de manière optimale.

1 255 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après implantation chirurgicale d'électrodes dans le cerveau, chaque rat reçoit des stimulations électriques répétées pendant plusieurs semaines pour provoquer des crises d'épilepsie partielles évoluant vers des crises généralisées, avec redressement et perte d'équilibre, afin de tester des molécules antiépileptiques. Le porteur indique qu'un état épileptique permanent peut apparaître dans de rares cas et que les rats opérés sont hébergés seuls, et signale l'existence de méthodes sur tranches cérébrales sans les présenter comme suffisantes. Il justifie la mise à mort de tous les animaux par les crises répétées qu'ils ont subies, qui ne permettent pas de garantir leur maintien en vie.

Objectifs

Le projet consiste à tester l'efficacité de substances pharmacologiques en développement préclinique pour lutter contre les épilepsies de type partielle, c'est-à-dire qui sont localisées dans une région spécifique du cerveau. Les épilepsies partielles sont à l'origine de décharges électriques anormales dans une région cérébrale spécifique et de symptômes qui peuvent se traduire par des contractions involontaires des membres supérieurs ou inférieurs, des hallucinations, des troubles du langage ou encore des troubles du rythme cardiaque et respiratoire. De plus, ce type d'épilepsie altère la qualité de vie des patients avec une perte progressive de contact avec l'extérieur et une perturbation de la mémoire. Dans certains cas, les épilepsies partielles peuvent progresser vers des épilepsies généralisées, avec l'apparition de symptômes convulsifs plus intenses et conduire à la mort. Il existe des traitements médicamenteux qui permettent de traiter une partie des patients. Néanmoins, environ 30 % des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux et sont dits "pharmaco-résistants". Dans ce projet, un modèle murin de crises épileptiques partielles évoluant vers des crises généralisées sera utilisé afin d'évaluer l'efficacité de nouvelles substances pharmacologiques en développement.

Bénéfices attendus

Le modèle de kindling est recommandé pour identifier et tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients épileptiques. A l'heure actuelle, les traitements antiépileptiques existants sont uniquement symptomatiques. Néanmoins, 10 à 30% des patients interrompent leur traitement initial en raison des effets secondaires indésirables ou les traitements sont inefficaces (résistance aux traitements). En plus du développement de nouveaux antiépileptiques, un des enjeux majeurs de la recherche sur l’épilepsie est de découvrir des traitements prophylactiques contre cette pathologie, c’est-à-dire des traitements ayant un effet antiépileptogène. Il n’en existe aucun à ce jour alors qu'il est possible d’identifier les personnes présentant un risque de développer une épilepsie.

Procédures

Le projet consiste à opérer l'animal pour placer des électrodes dans une structure cérébrale spécifique ainsi qu'à à la surface du cerveau. L'implant va permettre de stimuler l'animal dans une structure cérébrale spécifique pour le sensibiliser à l'induction de crises partielles. La phase de sensibilisation correspond à une période de 2 à 3 semaines, 1 à 2 stimulations de 2 secondes par jour ,5 jours par semaine. Dans certains cas, une phase de stabilisation à la stimulation est ajoutée et correspond à une série de 3 à 20 stimulations de 1 seconde, une fois par jour, 5 jours par semaine sur 2 semaines. Lors de la phase de test, l'électroencéphalogramme est enregistré sur 10 à 20 minutes avec une seule stimulation de 2 secondes ou une série de stimulation (entre 3 et 20) de 1 seconde sur 2 ou 3 jours consécutifs lors d'un traitement aigu. Dans le cadre d'un traitement chronique, 3 ou 4 enregistrements peuvent être réalisés sur une semaine (1 enregistrement par jour). Des prélèvements sanguins terminaux ou d'organes peuvent également être envisagés pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques. Concernant l'administration des candidats traitements, les administrations par bolus rapide (voies orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire) durent quelques secondes; l'administration par perfusion lente (intraveineuse) peut durer de quelques minutes à plusieurs heures en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Un traitement peut également être injecté par voie intracranienne, au moment de l'implantation des électrodes.

Impact sur les animaux

Le protocole décrit dans ce projet conduit à l'apparition d'une crise partielle (clignement des yeux, mastication, mouvements des vibrisses ou de tête, mouvements involontaires des pattes avant) qui est suivie d'une crise généralisée (redressement de l'animal et perte d'équilibre) suite à une stimulation éléctrique de faible intensité, puis ce dernier récupère très rapidement. Dans de rares cas, un état épileptique permanent peut apparaitre. L'animal sera euthanasié s'il ne récupère pas rapidement après une stimulation. Les animaux sont hébergés seuls pendant toute la durée de la procédure, dès lors que les animaux sont opérés afin de protéger l'implant de leurs congénères. Néanmoins, les animaux peuvent se voir, se sentir et s'entendre lorsqu'ils sont hébergés en animalerie conventionnelle. Pour les animaux ayant reçu un OGM, ils sont isolés pendant une semaine dans des cages ventilées où les animaux peuvent se voir. Ils sont ensuite replacés en animalerie conventionnelle.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque étude. Des crises épileptiques ont été induites de manière répétée chez les animaux soumis à une procédure de kindling, leur maintien en vie dans de bonnes conditions ne peut pas être garantie (même s’il n’est pas attendu de crises épileptiques spontanées chez ces animaux)

Remplacement

Il existe des techniques alternatives in silico ou ex-vivo permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et l'activité cérébrale.

Réduction

Les animaux peuvent être utilisés pour l'évaluation de 2 candidats médicaments (2 études) sur plusieurs semaines (maximum 10 semaines), une fois sensibilisés et stabilisés, le cas échéant. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux pour une même étude (différentes doses ou traitements comparables) ou pour deux études (deuxs candidats médicaments). Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique. Une analyse de puissance réalisée sur les paramètres mesurés dans le test du kindling avec stimulation constante indique qu'un minimum de 10-12 rats est nécessaire par groupe.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Lors de la procédure chirurgicale, une analgésie est assurée par l’administration de Carprofene à 5 mg/kg ou équivalent avant le début de la chirurgie et pendant les 48 heures après l'opération. De la lidocaïne est également appliquée sur le crâne de l'animal pour limiter la douleur. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'oeil. Une attention particulière sera portée sur la récupération des animaux à la suite de la chirurgie. Ces derniers seront pesés 24 et 48 heures suite à la chirurgie. L’implant sera désinfecté, le cas échéant et une antibiothérapie sera réalisée en cas de suspicion d’infection. L’administration d’huile naturelle peut être préconisée dans le cas d’un ralentissement du transit intestinal. Au cours du test, l'enregistrement de l'électroencéphalogramme permet de compléter l'analyse comportementale et raffiner le modèle. L'ajout d'une phase pour déterminer le seuil de stimulation pour induire une crise partielle et une crise généralisée permet de réduire le seuil de stimulation pour chaque animal testé, et par conséquent, limiter la douleur chez ce dernier. Le seuil de stimulation minimum pour une crise partielle correspond à l'apparition d'une crise de quelques secondes sur l'électroencéphalogramme, en présence ou non de symptômes comportementaux mesurés d'après l'échelle de Racine. Des points limites stricts ont été définis pour chaque procédure. Notamment, dans de rares cas, un état épileptique peut apparaître. L’animal sera euthanasié s’il ne récupère pas dans les 10 minutes suite à la stimulation électrique. Les animaux isolés sont hébergés dans un environnement enrichi avec du matériel à ronger. Les cages sont transparentes afin que chaque animal puisse voir ses congénères. Il est envisagé de placer un animal compagnon dans chaque cage, une fois que les plaies autour de l'implant seront bien cicatrisées afin d'améliorer le bien-être des animaux dans ces procédures. Un essai sera réalisé pour évaluer la faisabilité et sera généralisé si l’implant n’est pas endommagé.

Choix des espèces

Le modèle du kindling par stimulation électrique d'une structure cérébrale est utilisé principalement chez le rat, en raison de la taille de l'animal (implantation chirurgicale d'électrodes de stimulation et d'électrodes pour enregistrer l'électroencéphalogramme). Les rats sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. La procédure décrite dans ce projet peut être utilisée de façon longitudinale sur des rongeurs sevrés jusqu'à l'âge adulte.

1 320 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules immunitaires humaines qui attaquent leurs propres tissus, elles perdent du poids et se dégradent cliniquement, puis reçoivent trois fois par semaine des anticorps à tester, pour évaluer une nouvelle thérapie contre les maladies auto-immunes et inflammatoires. Le porteur précise que toutes les souris sont euthanasiées à l'atteinte des points limites, y compris celles où un effet bénéfique pourrait apparaître, faute de pouvoir les réutiliser. Il présente ce modèle de souris humanisée comme un moyen d'éviter le recours au primate.

Objectifs

Les maladies auto-immunes et les maladies inflammatoires n’ayants pas de traitements satisfaisants aujourd’hui, la recherche de nouvelles thérapies est nécessaire. Ce projet s’inscrit dans ce but afin de tester une nouvelle cible thérapeutique et d’en comprendre les mécanismes. La plupart des maladies auto-immunes sont traitées avec des traitements qui bloquent de façon non spécifique le développement de la maladie et induisent des effets secondaires. Parfois, certains patients sont traités avec des molécules qui induisent la mort cellulaire d’un type cellulaire à l’origine de la pathologie mais cela entraine le plus souvent des effets indésirables. Notre objectif est de développer une nouvelle thérapie qui pourrait éliminer les cellules impliquées dans la chronicité de l’inflammation mais cela de manière spécifique en gardant un système immunitaire compétent pour se défendre contre de nouveaux pathogènes.

Bénéfices attendus

L’objectif est de développer une nouvelle thérapie qui ciblerait une population cellulaire à l’origine de la pathologie afin de la bloquer ou de l’éliminer dans les maladies inflammatoires ou les maladies auto-immunes. Il est important de noter qu’actuellement la plupart des traitements utilisés ne sont pas spécifiques et ils réduisent la capacité des patients à se défendre contre de nouveaux pathogènes. La technologie que nous développant a pour objectif d’être plus spécifique et plus efficace. En étant plus spécifique, on réduit la probabilité d’avoir des effets indésirables et en étant plus efficace on donne la capacité aux patients de se défendre contre de nouvelles infections. Chez l’animal nous espérons pouvoir observer un blocage, une élimination ou une réduction des cellules pathogéniques à l’origine de la maladie. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’Homme afin de traiter les patients ayant des maladies auto-immunes ou inflammatoires et de leur proposer une nouvelle stratégie thérapeutique spécifique et plus sûre. Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique.

Procédures

L'injection des cellules sera réalisée une seule fois et dure quelques secondes. Les traitements administrés aux animaux durent quelques secondes et seront réalisés 3 fois par semaine durant plusieurs semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés une fois par semaine durant plusieurs semaines et durent quelques secondes. Les traitements administrés aux animaux (3X semaine) ainsi que les prélèvements sanguins (1X semaine) seront variables en nombre de semaines (ils pourront aller de 1 à 12 semaines) mais pas en durée (toujours quelques secondes) et dépendra de chaque groupe de souris et du succès du traitement.

Impact sur les animaux

Ce modèle d’injection de cellules humaines de type T/B provoque une prise de greffe des cellules humaines chez la souris à cause de la réactivité des cellules effectrices humaines dirigées contre le tissu de la souris. Il va s’en suivre une perte de poids associée à un score clinique important qui pourrait induire chez la souris une modification du comportement. Le comportement et le poids des souris peuvent être impactés et pour palier à cela, un suivi 3 fois par semaine et 2/jours lors des pics sera réalisé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés une fois les points limites atteints. En effet, l'injection des cellules humaines chez la souris va entrainer une prise de greffe des cellules de façon importante et cela va entrainer une perte de poids, un changement dans le comportemant chez la souris. Cela va se produire dans les groupes contrôles et dans les groupes dont les molécules n'ont pas d'effets bénéfiques. Dans les groupes ou un effet bénéfique pourrait être observé, les souris seront quand même sacrifiées car cela n'est pas possible d'utiliser les mêmes souris pour un second protocole car l'âge de la souris ne sera plus adéquat pour favoriser la prise de greffe des cellules humaines et car il risque d'y avoir des cellules résiduelles de la première manipe qui pourrait alterer l'interprétation d'une future manipe.

Remplacement

Les nouvelles thérapies passent par le modèle animal avant d’envisager de tester la molécule dans un essai clinique. Vu la complexité du système immunitaire et des différences entre espèces, il est nécessaire d’étudier l’impact d’une molécule sur son action ainsi que ses effets thérapeutiques sur un modèle proche de l’Homme. Pour cette première nécessité le primate est souvent utilisé, ici, nous avons la possibilité d’éviter l’utilisation de primate, donc nous étudierons ces paramètres chez la souris humanisée. Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour les récepteurs mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux.

Réduction

Les tests statistiques qui seront réalisés seront des tests qui permettront de comparer chaque groupe en fonction du groupe contrôle. Il pourra également être réalisé des tests pour comparer tous les groupes les uns avec les autres ou tous les groupes en fonction du groupe contrôle. Nous avons réduit chaque groupe au minimum de 5 souris, cela est nécessaire à l’obtention d’une différence statistique. Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut permettent de réduire l’utilisation de l’animal lorsqu’un axe ne démontre pas d’efficacité thérapeutique.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un animal se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec un dôme. Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs lors de l’expérience recevront des molécules permettant d'atténuer cette souffrance. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront mis à mort par dislocation des cervicales après anesthésie. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire.

Choix des espèces

Des formats d’anticorps permettant d’induire la cytotoxicité des cellules de la lignée B ou le blocage des lignée T ont été validées in vitro. Les animaux sont indispensables à cette étape d’évaluation thérapeutique du traitement car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité de (des) format(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est (sont) efficace (s). De plus, dans ce projet, le modèle utilisé repose sur ce qui est utilisé en modèles précliniques de développement d’anticorps chez l’homme. Nous travaillerons avec la souris (NSG/NXG) qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il est nécessaire de travailler avec cette souche car elle est immunodéficiente en compartiment T, B et NK de souris ce qui permet une meilleure prise de greffe des cellules humaines T et des cellules de la lignée B. En outre, les anticorps développés ne peuvent pas être utilisés chez la souris immunocompétente car le format de l’anticorps ne permet pas de reconnaitre les antigènes de la souris, donc une autre souche n’aurait pas pu être utilisée. En outre, avant de passer aux travaux généralement réalisés chez le primate, il est impératif de valider au préalable l’efficacité de cette thérapie chez la souris humanisée afin de réduire au maximum le nombre de format d’anticorps, la dose ainsi que la voie d’injection qui pourrait être testés chez le primate. Les souris seront utilisées autour de 4 à 10 semaines car les souris ont une meilleure prise de greffe des cellules humaines à cet âge ainsi qu’un risque moins élevé de mortalité à la suite de l’irradiation.

108 souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique, puis plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie jusqu'à un prélèvement terminal à huit semaines, pour comparer quinze constructions et sélectionner les plus efficaces. Le porteur affirme que l'injection de ces vecteurs est bien tolérée chez le rongeur et ne provoque aucun effet indésirable. Il présente cette étude pilote comme un moyen de réduire le nombre d'animaux d'une seconde étude à venir, affirme qu'aucune méthode ne remplace l'essai in vivo, et euthanasie toutes les souris pour prélever leurs tissus.

Objectifs

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique liée au chromosome X affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD qui code pour une protéine appelée Dystrophine. La Dystrophine est essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité de l'ensemble des muscles de l'organisme (y compris le coeur). L’absence de Dystrophine dans les muscles provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. Aucun traitement n’est disponible à ce jour pour la DMD. La thérapie génique, qui vise à corriger ou remplacer le gène DMD est aujourd’hui une approche prometteuse pour le traitement de cette maladie. Pour réaliser un transfert de gène efficace, il est possible d'utiliser des vecteurs viraux dérivés des Virus Adéno-Associés (AAV). Ils assurent un transfert de gène thérapeutique sûr et efficace dans différents tissus/organes, notamment le muscle et le cœur. Le gène de la dystrophine étant trop grand pour être inséré dans un vecteur AAV, des transgènes miniaturisés de la Dystrophine ont été générés. Ils permettent une récupération partielle de la fonction musculaire dans les modèles animaux de la DMD. Cependant, un rejet immunitaire contre ces produits thérapeutiques est parfois observé, avec une perte de l’effet thérapeutique. L’objectif du présent projet est d’évaluer de nouveaux produits de thérapie génique, qui pourraient permettre de combler le déficit en Dystrophine, tout en évitant ce rejet immunitaire. Ces nouveaux produits pouvant être plus ou moins stables ou plus ou moins fonctionnels dans les cellules musculaires, nous en testerons plusieurs, afin d'évaluer leur efficacité après injection intraveineuse chez la souris mdx, modèle murin de la DMD.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats obtenus dans cette étude pilote nous permettront de sélectionner les nouveaux produits de thérapie génique les plus efficaces (en termes d’efficacité du transfert de gène dans différents muscles, de niveau d'expression du produit thérapeutique, et de l’efficacité à corriger la pathologie musculaire des souris mdx au niveau histologique), afin d'ensuite évaluer la ou les meilleures (entre 1 et 3 maximum) pour leur efficacité thérapeutique et leur immunogénicité dans un autre modèle animal de la DMD, présentant un phénotype DMD marqué, et cela avec un nombre d'animaux plus important par groupe expérimental afin d'assurer la robustesse de ces évaluations phénotypiques. Cette seconde étude fera l'objet d'une autre demande d’autorisation de projet. A long terme, les bénéfices attendus de ce projet pilote sont de développer un candidat présentant un fort potentiel thérapeutique pour le traitement de la DMD par thérapie génique AAV. En cas de succès, le produit sera évalué dans une étude de toxicologie réglementaire, afin de pouvoir ensuite prétendre à réaliser un essai clinique chez des patients DMD.

Procédures

(i) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal sous contention, sans anesthésie, mais sous analgésie afin de limiter le stress de l'animal. Durée de l'intervention: maximum 5 min. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine mandibulaire le jour de l'injection, puis à 2 semaines et 4 semaines post-injection (3 prélèvements par animal). Prélèvements effectués sous anesthésie, pour un volume correspondant à 10% maximum du volume sanguin circulant de l'animal. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave, à 8 semaines post-injection. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

(i) Injection intraveineuse: l'injection intraveineuse réalisée dans la veine caudale se fera sous contention et pourra provoquer un stress léger le temps de l'injection (maximum 5 min), et une petite douleur au niveau du site de ponction. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur AAV chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Prélèvements sanguins au niveau d'une veine mandibulaire: les animaux pourraient être stressés par les anesthésies, mais celles-ci seront donc espacées d'au moins 2 semaines, et les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. (iii) Prélèvement sanguin terminal au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour l’animal, puisque cet examen sera réalisée sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement précèdera la mise à mort des animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure décrite dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents tissus: muscle squelettique, coeur, foie et autres tissus majeurs) et sur un tissu pathologique dans toute sa complexité (différents types de lésions). Ce projet, qui vise à évaluer le niveau d'expression et l'efficacité de nouveaux produits thérapeutiques pour notamment réduire les lésions musculaires liées à la pathologie DMD, ne peut donc être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie génique lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses de tolérabilité et d'expression qui seront réalisées ici. Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. D'autre part, par l'identification des constructions les plus efficaces, cette étude pilote permettra de réduire le nombre total d'animaux qui seront à inclure dans l'étude qui suivra et qui visera à évaluer l'efficacité thérapeutique des meilleurs de ces nouveaux produits de thérapie génique dans un autre modèle animal de la DMD, présentant un phénotype plus marqué. En effet, tester d'emblée l'efficacité thérapeutique de l'ensemble des 15 constructions différentes dans cet autre modèle animal aurait demandé l'inclusion d'un nombre très important d'animaux, supérieur au nombre qui sera inclus au total via ces 2 études.

Raffinement

Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (cages équipées de mezzanine et mise à disposition d’éléments d'enrichissement comme des carrés de coton, des tunnels en carton, des sizzle dry (papier) et des morceaux de bois) 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative). 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).

Choix des espèces

L'objectif de cette étude requiert l'utilisation d'un modèle animal de la DMD, dans lequel l'expression de Dystrophine est absente, et cela afin de pouvoir évaluer l'efficacité de nouveaux produits de thérapie génique. Il existe 3 modèles animaux majeurs de la DMD: la souris mdx, le rat DMD et le chien GRMD. La souris mdx présente des lésions musculaires typiques de la DMD, mais assez peu de symptômes de la maladie. Cette dernière limitation n'aura pas d'impact sur les objectifs de cette étude, puisqu'aucune évaluation phénotypique ne sera réalisée dans cette étude pilote. L'intérêt du modèle de la souris mdx pour cette étude repose par contre sur la facile disponibilité des animaux, ainsi que sur leur petite taille, réduisant les quantités de vecteurs nécessaires pour les injections (les vecteurs étant injectés en dose/kg d'animal). Les animaux seront injectés à l'âge adulte, entre 10 et 12 semaines d'âge. Avant l'âge de 8 à 10 semaines, la souris mdx présente des phénomènes de régénération musculaire qui peuvent avoir un impact négatif sur l'efficacité du transfert de gène à l'aide vecteurs viraux AAV. Les souris devront donc être âgées à minimum de cet âge. L'évolution de la pathologie chez les souris mdx étant ensuite lente, nous nous donnons une fourchette de 3 semaines d'âge de différence pour les animaux à inclure (mini 10 semaines, maxi 12 semaines), afin de simplifier la gestion de l'inclusion des animaux dans l'étude, qui sera adaptée selon la disponibilité des animaux chez l'éleveur, sans que cela n'ait d'impact sur les résultats de l'étude.