Rongeurs

660 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de tumeur colique sous anesthésie, des traitements par voies multiples, parfois une irradiation, et des mesures répétées de tumeur, la croissance tumorale pouvant provoquer occlusion, ascite et perte de poids. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, propose ces modèles à des clients pour sélectionner des molécules anticancéreuses avant essais chez l'humain. Sur le remplacement, il affirme que les méthodes alternatives ne prédisent pas l'efficacité in vivo et que la reconstruction 3D de tumeurs reste marginale.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers colorectaux. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Identification des animaux par implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage, sous anesthésie (1 fois, moins de 1 minute). Induction tumorale : sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieur à 30 min). Des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée (sous anethésie pour une durée maximale d’1 heure. Les animaux sont traités sous anesthésie générale par voie : - intra-veineuse -intrapéritonéale -sous cutanée -intra-musculaire ou intra-dermique avec analgésie Les animaux sont traités vigile par voie : - per os faite sous contention La palpation et la mesure au pied à coulisse des tumeurs nécessite la contention des animaux (inférieur à 30 secondes) Des prélèvements de sang pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Des prélèvements d’urine peuvent être réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention.

Impact sur les animaux

La greffe tumorale pourra engendrer une douleur et un stress modérés sur 1-2j. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur, une gêne, une occlusion intestinale, un envahissement de la cavité abdominale ou pelvienne, de l’ascite et une perte de poids. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Les animaux recevront des traitements par voie intra-musculaire, intradermique, sous cutané, intra-veineuse, orale, per os ou intra-péritonéale et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. Il est estimé que 9 études seront réalisées sur 5 ans. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 10 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux sont pesés minimum 2 fois par semaine. Le volume tumoral est estimé, minimum 2 fois par semaine par palpation. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids supérieur à 10% sera observée. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages. La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse avec administration préalable d’un analgésique opiacé. L’implantation de la greffe nécessite l’incision de la peau, la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection d’anti inflammatoire non stéroïdien en préopératoire ainsi que le lendemain, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Toutes les procédures invasives et la plupart des procédures peu invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés dont les compétences ont été validées. Les administrations/prélèvements sont réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire et intradermique) sont réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements sont effectués en suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter le développement tumoral ainsi que les éventuels effets secondaires des composés testés.

2 000 souris et 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués pour prélever organes et sang, 250 pouvant être gardés vivants et réutilisés. Les composés sont administrés par de nombreuses voies, dont intracérébrale, intravésicale et intrapéritonéale, avec mises à jeun jusqu'à 16 heures et une phase in vivo pouvant durer douze mois. Le porteur présente ce travail comme une étape de biodistribution préalable à des études d'efficacité, dans un contexte de cancer colorectal. Sur le remplacement, il affirme que les tests in vitro ne suffisent pas à prédire la biodistribution réelle et qu'il faut la vérifier chez le rongeur.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon). Des administrations intravésicales (par cathéterisation de l’urètre) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vie sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, nous attendons n’attendons pas d’effets indésirables particuliers chez les animaux. Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité, ce qui sera surveillée.

Devenir

Dans une grande partie des cas, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer la cinétique et la biodistribution des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible sélectionnées au préalable dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes, etc.) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex. collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de criblage de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une de l’alimentation et de l’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. • Entre 10 et 15% du poids : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique (document de référence) sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Les administrations intracérébrales, intrathécales ou intravésicales seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire (analgésique opioïde et alpha2 agoniste au préalable). Les administrations intramusculaire et intradermique seront réalisées après administration d’un analgésique (analgésique opioïde et alpha2 agoniste).

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

Une injection de lentivirus dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique de trente à quarante minutes, provoque chez chaque souris une tumeur cérébrale de type glioblastome. 460 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de la tumeur dans leur cerveau. Elles reçoivent ensuite des séries d'injections renouvelées toutes les deux semaines, drogues sénolytiques ou anticorps bloquants, pendant que la tumeur peut entraîner fonte musculaire, prostration, déshydratation et lésions cutanées. Le porteur indique que ces tumeurs se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles, et retient les femelles parce qu'elles sont "moins agressives et donc plus faciles à manipuler".

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l'effet de drogues dites sénolytiques (drogues qui éliminent les cellules sénescentes) seules ou en combinaison avec d'autres traitements, dans un nouveau modèle immunocompétent de tumeur cérébrale de type glial appelée glioblastome. Le modèle de glioblastome de type mésenchymateux proposé dans le projet récapitule au mieux les altérations moléculaires identifées chez les patients en utilisant une nouvelle technologie d'invalidation de l'expression de gènes.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait générer un modèle préclinique immunocompétent de glioblastome de type mesenchymateux qui récapitule au plus près les altérations moléculaires des glioblastomes de patients. En effet, afin de traduire de façon efficace nos résultats de recherches fondamentales à la clinique il est indispensable de se rapprocher au plus près de la pathologie humaine. Nos résultats devraient permettre de proposer des nouvelles aprroches thérapeutiques pour la prise en charge des patients avec un glioblastome.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 4 actes techniques incluant une injection intra-crâniale de lentivirus nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par bioluminescence et des traitements. La chirurgie prendra environ 30-40min par animal. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines.

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale est invasive, il s'agit d'une injection stéréotaxique de lentivirus dans le ventricule latéral effectué sous anesthésie/analgésie mais qui entraîne des nuisances (risques anesthésiques, douleur post-opératoire, risque infectieux). Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant la mobilité ou les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration ou décubitus, déshydratation, lésions cutanées). Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et les animaux seront pesés quotidiennement pendant les 5 jours suivant la chirurgie et deux fois par semaine par la suite.

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris et d'analyser la tumeur cérébrale induite pendant la procédure, au niveau moléculaire et histologique.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractériserons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patient collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare car la survie des patients après diagnostic est inférieure à 15 mois. Cette étude fondamentale demeurera néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans un modèle animal. Dans un souci de remplacement et réduction, nous projetons de générer des organoides à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle d'organoides conservant le microenvironnement global (notamment, la microglie, les monocytes et les cellules T infiltrants, les cellules endothéliales et les péricytes). Notre équipe de recherche participe activement à un projet collaboratif visant à générer des organoides de glioblastomes incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, leur nombre est de 460 pour cette prodédure. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 10 animaux. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, ganglions, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescence sera localisée dans le cerveau disséqué à la loupe binoculaire. Immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux conformément à la réglementation. L'enrichissement initial de la cage est composé bandes de papier kraft pliées en accordéon. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée pour détecter toute anomalie potentielle de la procédure anesthésique. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. A cet effet, nous avons mis en place une grille de score afin d'établir un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine.s

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour induire de novo des glioblastomes. En effet ce type de tumeur est diagnostiqué chez des sujets adultes d'âge médian de 59 ans, cette tumeur se développe donc à l'âge adulte. Notre projet, qui vise à évaluer l'effet de drogues sénolytiques dans un nouveau modèle immunocompétent de glioblastome, utilisera uniquement des souris femelles. En effet, les modèles de glioblastomes murins se développent de façon similaire chez les mâles et les femelles. De façon plus importante dans une étude récente, nous avons montré que l’enrichissement de la signature murine de sénescence chez les patients avec un glioblastome est un facteur de mauvais pronostique quel que soit le sexe. Ces résultats montrent donc que l’étude de la sénescence dans le contexte des glioblastomes peut être réalisée sur un seul sexe. Nous avons choisi pour ce projet de travailler sur des femelles en effet, elles sont moins agressives et donc plus faciles à manipuler, ne se battent pas et peuvent être regroupées dans une même cage si besoin.

636 souris vont être utilisées, toutes tuées au soixantième jour ou plus tôt si elles atteignent un point limite, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau du flanc une greffe de cellules tumorales, trois injections de virus et deux prises de sang d'une vingtaine de minutes, et la tumeur qui grossit peut entraîner perte de poids, mobilité réduite et défaut de toilettage. Les vésicules étudiées, libérées par des cellules infectées par un virus thérapeutique, "pourraient devenir des vaccins très efficaces", écrit le porteur, qui en espère à terme un candidat médicament pour "soigner certaines tumeurs chez l'Homme". La mise à mort anticipée dépend de signes observés trois fois par semaine : posture, toilettage, vocalisations, aspect des tumeurs. Aucun seuil chiffré de taille tumorale ni de perte de poids n'est donné.

Objectifs

Les vésicules extracellulaires (EVs) circulent dans l’organisme et agissent comme des messagers entre les cellules. Elles suscitent un intérêt croissant lié à leur capacité à transférer du contenu biologique entre cellules. En effet, les EVs ouvrent la porte à de nouveaux concepts et opportunités tant biologiques que thérapeutiques. Les cellules cancéreuses sont particulièrement de bonnes productrices d’EVs. Elles peuvent favoriser la croissance tumorale ou jouer un rôle dans l'inhibition de la croissance tumorale. Ainsi, les EVs ont un double rôle dans la régulation du cancer. Les données actuelles montrent que l'immunothérapie basée sur l’utilisation d’EVs est une approche prometteuse dans le cadre du cancer, suggérant que les EVs pourraient devenir des vaccins très efficaces. Ainsi, des études récentes avec un virus candidat dans le cadre de la thérapie contre le cancer ont montré l'apparition d'EVs contenant des protéines codées par ce virus thérapeutique. Le but de ce projet est donc d’analyser l'effet des EVs libérées par des cellules infectées par des candidats viraux et leur utilisation potentielle dans la thérapie anticancéreuse. Ce projet vise ainsi à mettre en évidence l'effet des EVs sur des lignées de tumeur greffées dans un modèle de Souris. Les effets seront suivis sur la croissance tumorale mais aussi sur les facteurs circulant au niveau sanguin. Les données générées nous permettront d'améliorer notre compréhension des mécanismes d'action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d'action et son efficacité en fonction de la vitesse de croissance tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des effets d'un candidat médicament sur une lignée tumorale. Nous pourrons ainsi comprendre sa capacité d'action et l'impact sur des lignée tumorales déjà installées. Cette connaissance nous permettra de mettre en place un candidat médicament permettant de soigner certaines tumeurs chez l'Homme.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par injection sous-cutanée, durée 1 minute. Par la suite, des injections de virus seront pratiquées (3 fois), durée moins d’une minute. Deux prélèvements sanguins seront aussi effectués chacun durant environ 20 minutes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous anticipons l'apparition de tumeurs sous-cutanées, qui pourra déclencher une éventuelle perte de poids, une mobilité réduite, un mauvais toilettage. Ce protocole aura une durée maximale de 60 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à J60 ou à l'atteinte d'un point limite. Ils ne sont pas réutilisables du fait de la présence de cellules tumorales et de candidats médicaments dans leur organisme.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l'oncologie ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèle non animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexe à l'oeuvre dans la mise en place de tumeurs ou la réponse immunologique associée.

Réduction

Ce projet a été mise en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Ainsi, pour l'étude pilote 6 animaux par condition seront utilisés. De plus, nos connaissance des modèles tumoraux sous-cutanés chez la Souris nous permet de dimensionner les groupes à 15 animaux par condition pour la deuxième étude. Cet effectif nous permettra de disposer de conclusions statistiquement relevantes. Nous mesurerons les tailles de tumeurs et le poids de manière répétées. Nous analyserons ces données par analyse de variance à deux paramètres (avec ou sans EVs/ concentration de celulles) en mesures répétées.

Raffinement

Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement avec la présence d'un enrichissement (Maisonnettes en carton ou de kraft). Nous injecterons les cellules tumorales sur le flanc. Ensuite l'apparition de tumeurs et leurs croissances seront mesurées trois fois par semaine afin de suivre la progression ainsi que l'effet possible du candidat médicament sur celle-ci. Nous suivrons à chaque pesée (trois par semaine) l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation, les sites d'injection et l'aspect des tumeurs. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer la mise à mort de l'animal pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le modèle Souris constitue un bon modèle pour l'étude de modèle tumoraux. En effet, il s'agit de mammifère au système immunitaire assez proche de l'Homme pour disposer d'une apporche translationnelle valide. Nous analyserons des animaux agés de 8 semaines au moment de l'injection. A cet age, le système immunitaire est suffisamment développé.

84 souris subissent jusqu'à trois séances d'IRM de trois heures sous anesthésie, avec quatre prises de sang par séance dans l'une des procédures, et une partie d'entre elles reçoit pendant six semaines un régime riche en graisses. Elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue pour le prélèvement du cerveau, d'autres organes comme le tube digestif pouvant aussi être prélevés. Le but est de mesurer l'effet de l'inflammation cérébrale liée à ce régime sur l'activité et la connectivité du cerveau, en lien avec le comportement alimentaire. Le titre annonce une exposition à une "inflammation aigüe", et le résumé ne dit pas comment elle est provoquée, ni ce que contient la procédure 2, qui n'est pas décrite.

Objectifs

L'un des plus grands défis dans un environnement obésogène tel que nos sociétés modernes est la gestion du poids à long terme, la plupart des tentatives de perte de poids se soldant par une reprise de poids ultérieure (effet "yo-yo"). Le système nerveux central joue un rôle clé dans le maintien de la balance énergétique en régulant les apports (comportement alimentaire, incluant les dimensions homéostatiques et hédoniques) et les dépenses énergétiques. La plupart des études se sont intéressées à la régulation homéostatique du comportement alimentaire. De nombreuses études ont ainsi montré chez la souris mais aussi chez l’Homme qu’une exposition chronique à un aliment riche en lipides (connue pour conduire à terme à une surchage pondéral voire une obésité) conduit à des modifications neuro-anatomiques, une neuro-inflammation, et ce particulièrement au niveau de l’hypothalamus. Malgré l'accumulation de preuves révélant les interactions entre les régulations homéostatiques et non-homéostatiques du comportement alimentaire, des données manquent sur l’effet d’une exposition chronique à une alimentation hypercalorique sur les réseaux cérébraux sous-jacents. De plus peu de données existent concernant l’effet de la neuro-inflammation induite par un régime riche en lipides sur l’activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension de l’effet de la neuro-inflammation induite par le régime hyperlipidique sur l’activité cérébrale et la connectivité fonctionnelle et éclaireront sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les modifications du comportement alimentaire (y compris dans l’addiction à la nourriture, le « binge eating » ou l’anorexie). De plus, l’approche par imagerie dans le modèle animal est non seulement une méthode non-invasive mais également une approche facilement transférable à l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à des anesthésies pour l'acquisition par IRM. Une session d'acquisition durera au maximum 3h et une souris réalisera au maximum 3 sessions d'acquisition. Dans la procédure 1, des prises de sang seront effectuées pour mesurer la glycémie. Elles dureront quelques secondes et seront au nombre de 4 par session d'acquisition IRM pour chaque animal. Dans la procédure 3, une partie des souris sera exposée à un régime hyperlipidique pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment HFD conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des modifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition au HFD de 6 semaines dans notre projet perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux. Les nuisances liées à l'IRM étant de nature sonores, des protections auditives en mousse seront positionnées dans le conduit auditif des animaux afin d'éviter une dégradation de leur audition.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. Le contrôle de l'intensité de l'inflammation par des approches de biologie moléculaire nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux. D'autres organes pourront être prélevés pour des analyses tissulaires post-mortem complémentaires (par ex: tractus digestif). Un entraînement et le raffinement des gestes techniques employés seront réalisés en amont des prélèvements décrits précédemment.

Remplacement

Cette étude de mesure de la neuroinflammation, de l’activité cérébrale et la de connectivité fonctionnelle entre des structures cérébrales ne peut être réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, le nombre, la complexité des structures cérébrales mises en jeu, leur activité et leurs interactions dans un contexte intégré ne permet pas de réaliser cette étude sur des modèles cellulaires qui sont insuffisamment représentatifs à l'heure actuelle. De plus, dans la perspective de pouvoir transposer les données générées dans cette étude à l'Homme, l'utilisation d'animaux présentant une bonne analogie fonctionnelle ainsi qu'une bonne homologie anatomique, physiologique et génétique avec l'Homme est requise. Dans cette étude, les travaux seront menés sur la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données publiées générées par les responsables du projet. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point. Plus précisément, pour les différents paramètres d'imagerie considérés, des tests statistiques permettant une analyse temporelle et/ou de l'effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou de l'effet sexe des animaux lors de mesures répétées en utilisant des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données. Grâce à l'utilisation d'un suivi longitudinal (mesures répétées chez un même animal), le nombre total d'animaux inclus dans l'étude est réduit.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues sont non-invasives. Les prélèvements pour l’analyse histologique sont post-mortem. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. La durée d’exposition à l’aliment HFD permet de limiter les conséquences négatives sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.