Rongeurs

1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés par voie orale ou par injection, subissent des prélèvements de sang et d'urine, un placement en cage métabolique jusqu'à 24 heures, puis une autopsie avec prélèvement des os, pour le compte de clients qui développent des médicaments. Le porteur relie l'intérêt du projet à la qualité de vie de patients humains, mais renvoie ces retombées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animal ne reproduit le remodelage osseux d'un "organisme entier" et conclut que le recours au rat est "indispensable".

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’évaluer les atteintes osseuses potentielles qui pourraient survenir lors de traitements thérapeutiques. En effet, des études de pharmacovigilance ont montré que la fragilisation osseuse peut être induite par des médicaments, par carence ou pertes en calcium, phosphate et vitamine D, ou réduction de la minéralisation / densité minérale de l’os. La classe thérapeutique la plus fréquemment en cause est celle des corticoïdes mais d’autres médicaments sont aussi suspectés comme les antirétroviraux, des antiacides, des médicaments antiépileptiques, des antithrombotiques mais aussi des antidépresseurs, des neuroleptiques, et médicaments utilisés par exemple dans le traitement du cancer du sein. A noter aussi qu’un risque d’ostéoporose est évoqué pour les statines, et retrouvé significatif à forte dose. D’autre part, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques citées ci-dessus, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet et cette demande de renouvellement afin d’évaluer sur l’animal les effets secondaires potentiels de composés thérapeutiques actuellement en développement chez nos clients. Les études permettront de définir les types de lésions osseuses qui pourraient être observées, et d’améliorer les schémas thérapeutiques d’administration des composés évalués afin de réduire et/ou abolir les effets délétères, voire même de stopper le développement de certains composés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la potentielle toxicité osseuse des composés étudiés. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Les administrations orales de composés seront réalisées sur animaux vigiles (moins de 5 minutes par administration). Les fréquences d’administration (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les injections de composés en parentérale (sous cutanée ou intramusculaire ou intrapéritonéale : dans le cadrant caudal droit de l'abdomen ventral) seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Un traitement analgésique sera systématiquement appliqué aux animaux. Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant sacrifice de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 minutes par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.

Impact sur les animaux

Une possible réaction inflammatoire pourra apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ce cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

10 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation des ovaires avec pose d'un implant d'œstradiol, puis une injection de colchicine directement dans le cerveau, pour identifier les neurones impliqués dans le déclenchement de l'ovulation. Le porteur indique que la colchicine peut provoquer diarrhée et douleurs abdominales, les souris étant mises à mort vingt-quatre à vingt-sept heures après l'injection, avant l'apparition de ces effets, pour prélever leur cerveau. Il affirme que la reproduction "ne peut s'observer" que sur un organisme entier et renonce à toute analyse statistique, l'objectif déclaré étant de pouvoir publier des données descriptives.

Objectifs

Les mammifères présentent soit une ovulation spontanée soit une ovulation induite. L’ovulation dépend de la sécrétion de deux hormones la gonadolibérine ou GnRH et l’hormone lutéinisante ou LH. Les mécanismes permettant la sécrétion de la GnRH et de la LH sont encore mal connus. Chez les espèces à ovulation induite, un facteur de croissance (βNGF) semble être une molécule clé dans le déclenchement de l’ovulation, rôle qui semble tenu dans les espèces à ovulation spontanée par un autre neurotransmetteur, la kisspeptine. Nos données suggèrent l’implication du facteur de croissance aussi pour induire l’ovulation chez les espèces à ovulation spontanée via une action sur la sécrétion de la kisspeptine. Nous souhaitons établir si cette action est directe ou indirecte. Cette information est essentielle pour pouvoir publier nos données. Nous envisageons de réaliser des marquages multiples pour détecter la kisspeptine et le récepteur du facteur de croissance. Les données obtenues permettront de déterminer si le récepteur est exprimé ou non sur les cellules à kisspeptine. Dans le cas où il n’y aurait pas de co-localisation entre la kisspeptine et le récepteur, nous établirons la possibilité d’une action indirecte via des neurones à catécholamines. Nous allons donc utiliser des souris femelles et des marquages multiples pour vérifier ces hypothèses.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de comprendre si les mécanismes qui déclenche l’ovulation après la stimulation avec le βNGF comportent une stimulation directe des neurones à kisspeptine ou nécessitent d’un interneurone. Cette information nous permettra de vérifier si du point vu évolutive les mécanismes d’induction de l’ovulation sont conservés entre ovulations induites et spontanées. Ceci représente une information très importante pour la compréhension de l’évolution des modalités d’ovulation chez les mammifères.

Procédures

Les animaux seront soumis a des procédures chirururgicales pour enlever les ovaires et positionner un implant sous-cutanée d'oestradiol. Cette procedure durera environ 15 minutes. Entre 7 et 10 jours plus tard les animaux seront soumis à une deuxième intervention pour réaliser une injection intracerebroventriculaire de colchicine. Cette procédure aussi aura une durée d'environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

L’ovariectomie avec implant d’oestradiol est une technique largement utilisée dans les recherches en neuroendocrinologie de la reproduction et des douleurs peropératoires au site d’opération et de suture sont envisagées. Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies, ainsi qu'une douleur localisée en post-opératoire au niveau du site d'incision de la peau du crâne. Les effets indirects peuvent découler de la chirurgie (trouble comportemental, baisse d'activité locomotrice) et du produit injecté (diarrhée). Les effets directs sont de courte durée (de quelques heures à quelques jours). Les effets indirects peuvent survenir après quelques heures mais se poursuivre sur plusieurs jours. L’administration de colchicine sera effectuée par injection intracerebroventriculaire. L'injection de colchicine peut induire des effets indésirables tel que la diarrhée, des douleurs abdominales, des troubles du système nerveux. L’euthanasie des animaux sera effectuée dans les 24-27 heures après l’injection de colchicine et donc préalablement à la manifestation de ces effets.

Devenir

Dans la première partie de l'expérience toutes les souris (10) seront soumis aux chirugies indiquées dans le protocole détaillé. Par la suite toutes les souris (10) seront euthanasiées pour prélever le cerveau et rélaiser l'immunocytochimie.

Remplacement

La fonction de reproduction étant une fonction intégrée (sous influence de facteurs environnementaux et hormonaux endogènes) contrôlée par l'hypothalamus, elle ne peut s'observer que sur des organes entiers provenant d’un organisme vivant. Nous ne pouvons donc pas remplacer l’utilisation d’animaux pour notre expérience.

Réduction

Notre étude ce base sur l'analyse des données descriptives : coexistence ou non de marquage et éventuelle pourcentage de cellules marques par rapport à l’ensemble de la population. Nous n’avons donc pas besoin de réaliser des analyses statistiques pour cette expérience. Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure. Les souris utilisées seront ovariectomisées. Les ovaires produisent les hormones stéroïdes qui rétroagissent au niveau cérébral pour moduler le cycle ovarien. Ces hormones présentent des fluctuations endogènes de leurs taux au cours du cycle, l'ovariectomie (suivie d'un traitement substitutif : implant d’estradiol) va permettre de standardiser les taux endogènes circulants et donc de réduire l'effectif d'animaux à inclure dans l’expérimentation. Pour établir le nombre d’animaux à utiliser nous avons prix en considération le fait que les animaux seront soumis à deux chirurgies, à une perfusion intracardiaque et aux aléas de la coupe après congélation. Nous estimons que pour pouvoir obtenir 6-7 échantillons exploitables de la région d’intérêt, nombre que nous permettra d’avoir des données solides, nous devons partir d’un groupe de 10 animaux. L’utilisation d’un nombre moindre d’animaux pourrait être suffisant, mais vu le risque d’avoir à répéter l’expérience, suite aux aléas liés aux différentes manipulations, et donc augmenter ultérieurement le nombre de souris, ce choix nous semble le plus pertinent pour réduire aux minimum le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris seront hébergées par trois ou cinq par cage en présence d'objets en carton (boites à œufs, frisottis en papier). Une semaine d' habituation à la manipulation par l'expérimentateur est prévue pour réduire le stress lors des différentes manipulations prévues par le protocole. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant la neurochirurgie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de référence utilisée en routine par de nombreux laboratoires est aussi l'espèce sur la quelle nous avons obtenu les résultats d'induction de l'ovulation avec le beta-NGF. Pour étudier l'ovulation nous avons besoin de souris femelles adultes.

520 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans un autre projet après accord vétérinaire. Chaque animal reçoit l'implantation chirurgicale d'un émetteur de télémétrie sous anesthésie, puis des administrations de candidats médicaments et des prélèvements sanguins, avec des périodes d'isolement pouvant atteindre plusieurs jours, pour évaluer la sécurité cardiovasculaire de ces molécules. Le porteur indique que les effets indésirables des produits testés ne sont "pas prévisibles" au départ. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante et présente même l'étude comme bénéfique pour l'animal par le développement d'outils de raffinement.

Objectifs

Ce projet a pour but d'évaluer les effets de différents candidats médicaments sur les paramètres cardiovasculaires chez le cobaye vigile en utilisant la télémétrie dans le cadre réglementaire de l'évaluation de la sécurité des médicaments sur les fonctions vitales de l'organisme. La télémétrie permet de mesurer différents paramètres physiologiques chez l'animal vigile libre de ses mouvements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la vérification de l'absence d'effet ou la détermination du seuil d'effet de nouveaux médicaments sur le système cardiovasculaire, qui permettront par la suite une utilisation sécurisée du médicament en médecine humaine ou vétérinaire. Pour l'animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée (le cobaye) par le développement d'outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l'espèce la plus prédictive en fonction de l'objectif scientifique attendu.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : - une anesthésie générale pour l'implantation chirurgicale d’un dispositif de télémétrie avec une analgésie morphinique (1 implantation dans leur vie - durée maximale 1h30) et un suivi postopératoire suivant les bonnes pratiques vétérinaires - une administration du produit à tester par différentes voies d'administration (-2 minutes) à un volume respectant les recommandations éthiques. - des prélèvements de sang (maximum 2 prélèvements /24h, 1 min/prélèvement) en respectant les recommandations éthiques pour les volumes et la récupération entre les séries de prélèvement. - des périodes d'isolement en environnement restreint sur 48h maximum (généralement 24h) pendant les périodes d'enregistrement de télémétrie. - une mise à jeun éventuelle de 16 et 24h avant administration du produit à tester.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés pour l'implantation de l'émetteur de télémétrie. Les animaux seront isolés pendant la période de récupération post-opératoire (6 à 8j) et chaque jour d'enregistrement (48h max). Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements de sang (durée environ 1min/prélèvement), et à une mise à jeun éventuelle de 16 et 24h avant administration du produit à tester. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. La nuisance pour l’animal est réduite à son maximum. Après récupération, les animaux sont maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le cobaye car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la fonction cardiovasculaire. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le cobaye est l’une des espèces de rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d'effectuer des analyses statistiques robustes. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés. De plus, un même animal pourra recevoir plusieurs doses d'un même produit, ce qui permettra également de reduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Le cobaye est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur la fonction cardiovasculaire. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent par chirurgie stéréotaxique une inoculation cérébrale de trois formes d'alpha-synucléine agrégée, dont des extraits de cerveau de patient, pour comparer la maladie induite dans un modèle de Parkinson. Le porteur indique que l'inoculation conduit à une démarche saccadée et une perte d'équilibre, et que les souris sont mises à mort dès ces premiers signes pour éviter une paralysie du train postérieur. Il affirme que le projet "ne peut être réalisé qu'in vivo" et qu'aucune méthode alternative n'existe aujourd'hui.

Objectifs

Le but du projet est de comparer les caractéristiques de la maladie induite par trois formes d’alpha-synucléine de structures différentes au cours de passages successifs par inoculations dans un modèle de souris modifiées génétiquement. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines associées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy, atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée. L’étude implique la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine agrégée, ainsi que la localisation et l’étude morphologique des dépôts de cette protéine dans le cerveau des souris.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées lors de la maladie chez les souris.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris modifiées génétiquement (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 84 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’extraits cérébraux des souris malades contenant l’alpha-synucléine agrégée, de trois origines distinctes (fibre synthétique, cerveau de souris modifiée génétiquement malade, cerveau de patient humain), est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers symptômes, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et à décrire l’extension et les caractéristiques des lésions du cerveau, ainsi que les altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d’incubation de la maladie par un test Log-Rank, permettant de mesurer une différence de survie de l’ordre de 20-25%, de la distribution des différents types d’immunomarquages cellulaires et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Ces effectifs permettent de déterminer par un test unilatéral si la moyenne des valeurs observées dans une situation est égale ou différente de la moyenne observée dans une autre condition. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle de souris.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. L’analgésie est prolongée par une injection sous-cutanée de buprenorphine. Les animaux sont maintenus en groupe et dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris, dans lesquelles l’expression de l’alpha-synucléine humaine mutée A53T permet les comparaisons des durées de survie et de la neuropathologie, en particulier suite à l’inoculation d’AMS. Les souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettent l’inoculation des extraits cérébraux dans une région précise du cerveau, et celles-ci qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie caractéristique de cette lignée de souris, lors de laquelle elles sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise à un régime riche en graisse pendant treize à seize semaines pour développer obésité, diabète et athérosclérose, avec implantation d'une sonde de télémétrie, mesures de pression artérielle, injections et induction d'une fibrillation cardiaque. Le porteur indique que le régime réduit la mobilité des souris et que la chirurgie et les manipulations génèrent du stress, les animaux étant mis à mort pour prélever leurs tissus. Il affirme qu'il n'existe "aucun moyen de remplacer" de telles études portant sur l'ensemble de l'organisme.

Objectifs

L’obésité est associée avec une inflammation chronique de faible intensité impliquée dans le développement des facteurs de risque du diabète de type 2. La consommation d’un régime riche en graisse s’associe en effet à une inflammation précoce d’une partie du cerveau, l’hypothalamus, contrôlant la dépense énergétique, suggérant son rôle critique dans le développement de l’obésité et de ses conséquences. Cependant, les mécanismes impliqués dans l’initiation de l’inflammation hypothalamique ne sont pas totalement connus. Dans ce projet, en utilisant une nouvelle stratégie ciblant spécifiquement les cellules hypothalamiques, nous cherchons à diminuer l’inflammation associée à la prise d’un régime riche en graisse utilisant différents modèles de souris avec prédisposition à l’inflammation et au diabète. L’expérimentation animale prévue dans ce projet permettra d’obtenir des données pour améliorer les altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l’obésité ainsi que favoriser le développement de thérapies plus effectives.

Bénéfices attendus

Démontrer l'implication de la protéine NLRP3 dans le processus inflammatoire associé au développement de l’obésité et du diabète au niveau hypothalamique. En plus, la confirmation de l’implication de NLRP3 dans la dérégulation hypothalamique de la prise de poids et les dépenses d’énergie impliquerait sa validation en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de l’obésité.

Procédures

Six interventions : - Régime riche en graisse : 13 (procédure 1) ou 16 semaines (procédure 2) – Implantation sous-cutanée : 1 implantation/animal, durée 20 minutes (procédure 2) - Mesure pression artérielle : 6 mesures (6 jours, procédure 1) et 12 mesures (28 jours, procédure 2), durée : 10 minutes/mesure - Prélèvement de sang : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime (procédure 1), durée de chaque prélèvement < 5 minutes. - Injections intraveineuses : 2 ou 12 injections (une injection tous les 3 jours pendant les dernières 7 jours dans la procédure 1 ou 4 semaines dans la procédure 2), durée de chaque injection < 5 minutes. - Induction d’une fibrillation atriale : une fois (procédure 2), durée 20 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Prise de poids liée à un régime enrichi en graisse ; 2) Développement de maladies liées à cette alimentation spécifique : obésité, diabète de type 2, athérosclérose ; 3) Mobilité réduite dans des cages à cause de la prise de poids ; 4) Stress liée à la chirurgie après l’implantation de la sonde de télémétrie ; 5) Stress lié aux manipulations (échographie, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, pris de la température au niveau rectal, prise de sang de la queue, injection de vésicules extracellulaires). Les 3 premiers effets concerneront 288 souris sur 672, qui seront nourris avec le régime riche en graisse. L’effet 4 concerne 168 souris puis l’effet 5 concerne l’ensemble des souris.

Devenir

A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux mis à mort. Il est nécessaire d'analyser chaque tissu pour évaluer les effets du régime riche en graisse.

Remplacement

Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l’obésité et au diabète, comme la formation de la plaque d’athérome depuis ses phases les plus précoces.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide du logiciel statistiques avec un écart-type de 20%, un risque alpha=5% et une puissance beta=95%, il est nécessaire d’inclure 12 animaux par groupe. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserions un même animal pour plusieurs mesures.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera donc évalué de façon hebdomadaire en observant leur comportement. Les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses) seront surveillés. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (évolution du poids, suivi des plaies, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores. La grille de scoring des points limites est montrée dans chaque procédure. De plus, comme les animaux vont prendre du poids et pour favoriser leur sociabilisation, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Cependant, dans certains cas, il est possible d’avoir un animal mâle isolé. Dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. De même, ils auront à disposition des bâtonnets de peuplier afin de leur permettre de ronger quelque chose de dur puisque le régime riche en graisse rend les croquettes moins dures que leur nourriture habituelle. Les souris diabétiques étant polyphagiques, polydispisques et polyuriques, elles seront placées avec une litière abondante et absorbante. La fréquence du changement de litière sera augmentée en fonction des besoins des animaux.

Choix des espèces

Ce projet vise à analyser les mécanismes moléculaires impliqués dans la favorisation de l'inflammation au niveau hypothalamique responsables des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées à l'obésité et au diabète. À cette fin, nous avons choisi d'utiliser l'espèce Mus musculus modèles de souris sauvage C57BL/6, en tant que contrôle, et des souris transgéniques knock-out pour plusieurs protéines ainsi que des souris présentant une mutation spontanée du récepteur de la leptine, les souris db/db. L’étude comparative de l’effet du régime riche en graisse dans ces modèles de souris permettra de relier directement le processus inflammatoire avec le développement de l’obésité et le diabète. L'utilisation de ces modèles animaux est une condition nécessaire à l'avancement de la recherche à la suite d’études déjà réalisées in vitro dans le laboratoire avec des échantillons de patients et différents types de cellules. Les souris seront utilisées à l’âge de 6-8 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme adultes et peuvent être nourris avec un régime riche en graisse sans risque de compromettre leur développement.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique pour implanter une minipompe diffusant des inhibiteurs dans le cerveau, puis des tests répétés de tolérance au glucose et à l'insuline, pour étudier un lien entre diabète et marqueurs de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que l'isolement en cage individuelle peut induire un stress chronique et que tous les rats sont mis à mort au bout de cinq semaines pour des études post-mortem. Il affirme que l'étude d'un organisme vivant "dans son intégralité" est "indispensable" et que des approches in vitro ne renseigneraient que sur les cibles moléculaires.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est associé à la maladie d’Alzheimer (MA). Réciproquement, le DT2 est fréquent chez les patients atteints de la MA. Des marqueurs moléculaires associés à la MA sont présents chez le rat Goto-Kakizaki (GK) spontanément diabétique. La surexpression de ces marqueurs est associée à la MA et au diabète. L’objectif de notre projet sera de rechercher si l’inhibition de ces marqueurs, directement au niveau du cerveau, peut améliorer l’état diabétique du rat GK. Pour cela, nous allons administrer des inhibiteurs de ces marqueurs pendant 14 jours, dans le cerveau de rats diabétiques (GK) et contrôles Wistar (W) de 3 mois. Cette étude nécessitera au total 96 rats mâles et 96 rats femelles et sera réalisée sur une durée de 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en avant le rôle de ces marqueurs dans le cerveau sur la régulation du métabolisme du glucose et son implication dans le diabète du rat GK. La modulation de ces cibles moléculaires pourrait ouvrir la voie à un traitement du diabète.

Procédures

Les 192 animaux subiront une procédure chirurgicale, par stéréotaxie, pour l'implantation de la canule équipant la minipompe osmotique. Cette chirurgie dure 60 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux dans le cadre de tests métaboliques de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline et lors du suivi de la glycémie. Chacun de ces tests dure 2h. Pour le test de tolérance au glucose, des prélèvements de sang de 30 microlitres aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes sont réalisés afin de mesurer la glycémie et l'insulinémie. Pour le test de tolérance à l'insuline, une goutte de sang (10 microlitres) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes. Les 2 tests seront séparés de 2 jours pour permettre la récupération.

Impact sur les animaux

L’isolement des animaux en cage individuelle après l'implantation de la minipompe reliée à une canule dans le cerveau pourrait induire un état d’anxiété tel qu’un stress chronique qui pourrait se manifester par une modification de la réactivité comportementale des rats. La pose de la minipompe entraîne une gêne et une possible douleur pour l'animal. L'injection en intrapéritonéal dans le cadre des tests métaboliques de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline est à l'origine d'une petite douleur liée à la piqûre. Une éventuelle hypoglycémie peut arriver dans le cadre du test de tolérance à l'insuline, mais cela est très rare chez le rat.

Devenir

A l’issue de notre procédure, au bout des 5 semaines, tous les animaux seront mis à mort pour des études post-mortem.

Remplacement

Le métabolisme glucidique dont nous cherchons à mettre en évidence la régulation suite à la modulation de cibles dans le cerveau nous conduit à devoir travailler sur un organisme vivant dans son intégralité. Des approches in silico et in vitro, notamment sur des neurones en culture, ou ex vivo, sur une structure cérébrale spécifique isolée telle que l’hypothalamus, nous permettraient uniquement de mettre en évidence la modulation de nos cibles d’intérêt (DYRK1A et GSK3β) par les traitements pharmacologiques (EMD92 et LiCl respectivement), mais pas d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme aux traitements suite au dialogue entre le cerveau et les tissus périphériques. Ainsi pour atteindre les objectifs spécifiques de notre projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques paramétriques et non paramétriques montrant au mieux la différence entre les groupes, et il permet de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse au traitement.

Raffinement

Afin de réduire au mieux l’apparition d’une éventuelle douleur, angoisse et stress chez les animaux nous prendrons toutes les précautions nécessaires (recours à l’analgésie, l’anesthésie, maintien de l’enrichissement (morceau de bois et sopalin), habituation, récupération). Pendant la chirurgie, la respiration, l'obstruction des voies respiratoires, le pouls et la température corporelle seront surveillés. Une injection en sous cutané d'anesthésique local, sera effectuée 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la chirugie, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Des points limites adaptés d’évaluation de la douleur et des critères d'arrêt de souffrance seront déterminés. Pour les rats diabétiques GK une litière adaptée sera mise dans les cages et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 3 mois. A cet âge, le diabète s’est bien développé et stabilisé chez les rats GK.

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée qui devient aveugle par dégénérescence de la rétine, elles sont exposées à une lumière bleue jusqu'à huit heures par jour pendant une à quatre semaines et soumises à un test de préférence entre compartiment éclairé et compartiment sombre, pour étudier la photophobie. Le porteur indique que les souris adoptent un comportement de fuite face à la lumière bleue, et qu'elles sont mises à mort pour prélever la rétine et des structures cérébrales. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ni in silico ne peut reproduire la complexité des circuits neuronaux en jeu.

Objectifs

Les rétinopathies pigmentaires affectent environ 1,5 million de personnes dans le monde et se traduisent par une diminution progressive de la vue aboutissant à la cécité. Les patients perdent les bâtonnets puis les cônes dans un second temps avec l’apparition fréquente d’une photophobie. L’exposition chronique à la lumière artificielle de type LEDs pourrait jouer un rôle délétère dans l'épidémiologie et l'évolution des symptômes de la photophobie. Les cellules ganglionnaires rétiniennes photosensibles (ipRGCs) seraient capables de transmettre l’information douleureuse avec le complexe trigéminé via le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP). Bien que la découverte des cellules ganglionnaires rétiniennes semble aider à la compréhension de la photophobie, les mécanismes physiopathologiques de la photophobie liée à la rétinopathie pigmentaire restent encore de nos jours largement méconnus. Nous proposons donc dans ce projet d’élucider par quels mécanismes ce peptide lié au gène de la calcitonine et les cellules ganglionnaires rétiniennes photosensibles participeraient à la photophobie associée à une rétinopathie pigmentaire. Ainsi, nous proposons de combiner des études anatomiques et comportementales d’exposition des souris mâles à diverses bandes spectrales afin mieux comprendre ces mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans la photophobie liée à une dégénérescence rétinienne et d’évaluer la participation du peptide lié au gène de la calcitonine et des cellules ganglionnaires rétiniennes. Ces résultats pourraient conduire au développement de nouvelles évaluations d’étude de la prise en charge thérapeutique de la photophobie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’élucider par quels mécanismes le peptide lié au gène de la calcitonie et des cellules ganglionnaires rétiniennes participerait à la photophobie associée à une dégénérescence de la rétine. Pour ce faire nous disposerons d’un modèle murin qui développe naturellement une cécité par la perte progressive des cellules dela rétine, que l’on comparera à un modèle sain. Nous souhaitons montrer que ces animaux pathologiques présentent 1/un comportement aversif lorsqu’ils sont exposés à une lumière bleue. 2/ Quel(s) rôle(s) le peptide lié au gène de la calcitonie et les cellules ganglionnaires rétiniennes joue dans la réponse à l’exposition à une lumière bleue et 3/ mettre en évidence comment le le peptide lié au gène de la calcitonine et les cellules ganglionnaires rétiniennes modulent des marqueurs d’activation et souffrance neuronales ainsi que des marqueurs d’inflammation chez la souris aveugle. En retraçant les différentes voies impliquées dans la photophobie depuis la rétine jusqu’au cerveau, nous espérons ainsi pouvoir non seulement mieux comprendre et décrire ce phénomène pathologique mais également identifier de potentiels marqueurs/voies à visée thérapeutique pour la prise en charge de la photophobie.

Procédures

Dans le cadre de ce projet les animaux développant la pathologie de dégénérescence rétinienne ou leur contrôle seront exposés à différentes conditions de lumière (jaune ou bleu) durant des périodes de 8h/jour durant 7 jours (exposition aigue) ou 28 jours (exposition chronique). Certains groupes seront injectés avec différentes molécules/agents par injection intra-péritonéale sur animal vigile : 3 fois pour les groupes « exposition aiguë » (J5 à J7) ou 3 x 3 jours pour les groupes « exposition chronique » (de J5 à J7, de J12 à J14, de J19 à J21) Les animaux seront ensuite euthanasiés pour réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Exposition à la lumière bleue : Les souris pathologique et sauvage devront être exposées individuellement à la source lumineuse afin d’éviter toute interaction avec leur congénaires. Elles adoptent un comportement d’isolation/fuite face à la lumière bleue. L’injection des antagonistes et anesthésiques sera réalisée en intraperitoénale et l’analgésique en sous cutannée, cela induira une douleur mineure au niveau du site d’injection.

Devenir

Les animaux seront analgésiés et anesthésiés puis euthanasiés en fin d’expérimentation comportementale afin de récolter les différents tissus qui serviront aux études neuroanatomiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut 1) mimer la pathologie de dégénérescence rétinienne et la photophobie qui lui est liée. 2) la complexité et l’intéraction des circuits neuronaux mis en jeu (rétine, ganglions trigéminés et système nerveux central) ne peuvent être étudiées et remplacées par un modèle in vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la photophobie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à l’aide d’un modèle experimental realisé sur les rongeurs (souris). De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre étude étude sera longitudinale et utilisera plusieurs structures (rétine, ganglions trigéminés, tronc cérébrale, hypothalamus) de chaque animal soit les 1280 animaux compris dans cette étude. Nous avons également estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données des résultats obtenus dans une étude précédente. Le nombre d’animaux sera gardé le plus petit possible tenant compte de 1/ la variabilité préssentie des résultats expérimentaux et 2/ de la nécessité de valider statistiquement les résultats obtenus afin de les publier dans des journaux scientifiques. Pour chaque étude et test réalisés, nous comparerons statistiquement les lots de souris de taille raisonable entre eux.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : enrichissement dans les cages (maison, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 21°C et suit un cycle d’éclairage non inversé (12h /12h). Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur, qui seront évalués à l’aide de points limites validés en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie, nous permettant de modifier la procédure en cours en procédant à l’euthanasie de l’animal. Pour les sessions d’illuminations, afin de minimiser le stress et la variabilité lors du test de boite illuminée/noir les animaux suivront une session d’habituation au test durant 5 jours avant le début de l’exposition à la lumière bleue ou jaune. L’animal aura libre accès à l’ensemble du complexe dans une période de 5 minutes, c’est-à-dire les deux compartiments (illuminé ou sombre) et le couloir central reliant les deux compartiements. Dans sa globalité le projet ne présente pas de gestes très invasifs, seulement une injection en i.p pour l’administration des traitements (antagonistes) et l’analgésie/anesthésie en sous cutanné avec une douleur minime ressentie au site d’injection. Enfin les points limites suivant seront suivis de près afin de déterminer l’état général de l’animal et des traitements/mesures à appliquer : Apparence physique, comportement, changement du poids corporel.

Choix des espèces

La souche Rd1 est un choix privilégié car ces souris développent naturellement une cécité par la perte progressive de leurs photorécepteurs, ce qui fait de cette souche un modèle parfait pour mimer la pathologie de rétinodégénérescence avec photophobie induite. La souche Rd1 étant naturellement mutante, nous somme contraint de la comparer à une souche sauvage comme les souris C57BL/6. De plus, le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Les deux souches de souris seront utilisées aux stades de développement à 30 et 90 jours car les souris pathologiques Rd1 sont complètement aveugles à 90 jours et nous souhaitons voir l’effet du vieillissement dans la réponse aux traitements effectués.

560 rats âgés de quatre semaines vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons et de leur cœur. Ils passent trois semaines dans un air à 10 % d'oxygène pour induire une hypertension artérielle pulmonaire, reçoivent une injection quotidienne dans l'abdomen pendant deux ou trois semaines, et sont anesthésiés pour une échocardiographie puis, en fin de traitement, pour un cathétérisme. Les molécules testées ont donné de "premiers résultats in vitro" que le porteur dit "encourageants", et il qualifie de "bénins" les effets de l'hypoxie. Il annonce trois méthodes complémentaires d'induction de la maladie et n'en décrit qu'une, sans nommer le produit de l'injection sous-cutanée prévue.

Objectifs

L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme). Les rats seront en hypoxie à 10% d’oxygène pendant 3 semaines consécutives afin de mimer l’air ambiant en altitude. Les traitements effectués seront en intrapéritonéales et seront de la fréquence suivante : 1 fois par jour pendant 2 semaines pour la procédure 1 ; 1 fois par jour pendant 3 semaines pour la procédure 2.

Impact sur les animaux

Les procédures appliquées à ce projet nécessitent d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Ces injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'une crème lidocaïne. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie et cathétérisme. L'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée. Le modèle implique une exposition à 3 semaines d'hypoxie (10% d'oxygène) afin de mimer l'effet de l'altitude. Ces effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce.

Devenir

Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.

Remplacement

Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique. L'HTAP est une maladie multifactorielle où plusieurs organes sont impliqués dont le coeur et le poumon. C'est pourquoi, le recours à des modèles animaux, différents et complémentaires, sont indispensables pour établir une preuve de concept avec cette molécule.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Egalement, nous réutiliserons les animaux non malades traîtés avec les différentes molécules d'un projet en cours pour ne pas réutiliser des rats similaires dans cette demande. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche en cours.

Raffinement

Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure. Les rats seront anesthésiés 2 fois pour valider le modèle et les traitemants avec de l'isoflurane. Lors des traitements, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.