Rongeurs

36 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections intramusculaires sous anesthésie et une mesure de force musculaire, avant d'être tués pour analyses histologiques. Le porteur décrit une dystrophie spontanée avec perte de masse et comportement de "freezing", et présente le rat comme un modèle plus fidèle que la souris. Il situe à long terme l'usage de la protéine testée chez les enfants atteints, en complément de la thérapie génique.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. Cette maladie entraîne une dégénérescence de l’ensemble des muscles (squelettique, cardiaque ou lisse). Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique prometteuses sont en cours d’évaluation dans des essais cliniques. Néanmoins, nous savons aujourd’hui que la restauration de la dystrophine devra s’accompagner d’une stratégie permettant un meilleur maintien de l’intégrité musculaire qui favoriserait la croissance musculaire. En effet, chez les patients DMD, les fibres dépourvues de dystrophine se cassent et dégénèrent. La force musculaire diminue et le tissu musculaire laisse la place aux tissus conjonctif et graisseux. Les stratégies thérapeutiques utilisant les vecteurs viraux sont confrontées à des limites comme leur disparition consécutive aux cycles répétés de nécrose-régénération des fibres musculaires dystrophiques. La protéine-médicament testée dans ce projet a été décrite comme étant un acteur clé du maintien de la masse musculaire en inhibant la dégradation et en stimulant la synthèse protéique. Nous avons donc comme objectif d’évaluer le supposé bénéfice de sa supplémentation dans le muscle dystrophique de rats modèles de la DMD, avec pour objectif de renforcer le dossier préclinique préparatoire au montage d’un essai clinique chez les enfants attteints de DMD.

Bénéfices attendus

Nos laboratoires cherchent à identifier des traitements combinés pour optimiser la restauration fonctionnelle des muscles dystrophiques. La protéine testée joue un rôle dans le maintien de la masse musculaire en maintenant plus longtemps actif le processus de régénération des fibres musculaires. A court terme, nous attendons chez les rats DMD traités un bénéfice avec une amélioration du phénotype histologique et fonctionnel du muscle dystrophique traité. A moyen terme, nous envisageons en cas de succès de combiner l’utilisation de cette protéine avec une restauration de dystrophine, induite par un vecteur viral codant la microdystrophine, une forme raccourcie de la dystrophine utilisée aujourd’hui dans des essais cliniques. A long terme, nous projetons d’utiliser cette protéine comme traitement utilisable chez le patient DMD en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront injectés par voie intramusculaire une fois dans le muscle de la patte gauche puis une fois dans celui de la patte droite. Cette intervention est rapide (moins de 10 minutes). La durée d'un enregistrement de la force musculaire est de 90 minutes, anesthésie comprise (une injection sous cutanée avec une aiguille hypodermique très fine). Il n'y a pas de chirurgie prévue. Les animaux seront également prélevés une fois pour récupérer un millilitre de sang, en vue de quantifier des biomarqueurs de la maladie. Ce prélèvement sera réalisé pendant l’anesthésie de la mesure de force, le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes). La séquence d'enregistrement de la force musculaire dure au total 1 heure (jusqu'au réveil).

Impact sur les animaux

Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. L’injection intramusculaire pouvant être douloureuse, des analgésiques seront utilisés avant et poursuivis après l’intervention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires à l'évaluation complète du produit testé.

Remplacement

Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour le maintien de l’intégrité musculaire dans le muscle dystrophique. Nous avons préalablement contrôlé que les voies de la protéine testée étaient bien activées en utilisant in vitro des cellules stimulées avec cette protéine et nous avons réalisé les premières expériences in vivo chez un modèle de souris de la DMD. Nous souhaitons aujourd’hui, tester son efficacité sur un modèle plus sévère et plus proche de l'affection humaine. L’utilisation du rat DMD nous parait donc indispensable pour évaluer un éventuel bénéfice de cette protéine sur des processus tels que la régénération et le maintien de la masse musculaire pendant plusieurs semaines au cours de la phase active du processus pathologique.

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats (2 muscles traités indépendamment par rat) permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Pour réaliser cette estimation, nous utilisons des tests statistiques en prenant en compte des paramètres tels que la différence à mettre en évidence entre les différents lots, la puissance et le risque du test. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des logiciels qui permettent de comparer deux groupes ou plusieurs groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre un maximum de 3 rats par cage. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux par l'utilisation d'agents anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).

175 animaux, lapins, souris, rats et hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à la formation continue du personnel aux gestes techniques, prélèvements sanguins, injections et parfois chirurgie sous anesthésie, sans autre finalité que l'entraînement. Le porteur indique que ces animaux seront tués faute de pouvoir être inclus dans un autre protocole et qu'une partie provient d'animaux de réforme ou surnuméraires. Il reconnaît l'existence de simulateurs en plastique mais affirme qu'une formation sur "animal entier vivant" reste nécessaire.

Objectifs

Conformément à la réglementation, tous les personnels impliqués en expérimentation animale, quelle que soit leur fonction, doivent suivre une formation continue, afin d'assurer le maintien et l’actualisation de leurs compétences, et ce, tout au long de leur carrière. L’objectif de ce projet est de décrire tous les gestes techniques utilisés dans le cadre de formation et d’entraînement. Dans le but d'assurer une traçabilité complète de l'apprentissage des gestes techniques réalisés sur des animaux de réforme ou animaux commandés, le présent projet vise à décrire des méthodologies et des gestes techniques. Ces formations, réalisées en interne au sein de l’établissement utilisateurs seront validées par le Responsable du suivi des compétences de l’établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

L'entraînement continu des personnels développe une pratique plus sûre des actes sur les animaux, permettant de réaliser ces actes avec le minimum de douleur et de stress pour les animaux. Les résultats obtenus lors des expérimentations suivantes seront donc fiables.

Procédures

Il n’y a pas de dommage escompté dans le cas de prélèvement sanguin unique. Dans le cas de prélèvements sanguins répétés, une attention particulière sera apportée au niveau des sites de prélèvement afin d’éviter tout point de nécrose pouvant entrainer une douleur chez l’animal. Un seul type de prélèvement sera effectué par animal afin de limiter au maximum le stress chez l'animal. Pour chacun des gestes techniques d'administration ou de prélèvement, le temps est estimé à 5 minutes par animal dans le cas d'une manipulation vigile. Dans le cas où l'animal devrait être anesthésié, ce temps est estimé à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Le tuteur veille au respect des règles de contention des animaux et à la bonne exécution des manipulations/gestes réalisés ; le stress et la souffrance sont donc très limités. La surveillance de l'animal par le tuteur durant la manipulation/gestes exécutés permet le cas échéant d'interrompre ceux-ci s’ils induisent un stress ou une souffrance chez l'animal. Les administrations et les prélèvements (fréquences et volumes) seront effectués selon les recommandations en vigueur pour respecter le bien-être animal et sont détaillés dans chaque procédure. Il n’y a pas de dommage escompté dans le cas de prélèvement sanguin unique. Dans le cas de prélèvements sanguins répétés, une attention particulière sera apportée au niveau des sites de prélèvement afin d’éviter tout point de nécrose pouvant entrainer une douleur chez l’animal. Les manipulations les plus invasives (exemple : administration intradermique, pose de cathéter, prélèvement de biopsies seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture antalgique en cas de nécessité. Une surveillance particulière sera portée sur l’état général de l’animal en cas de réveil, des tapis chauffants peuvent être utilisés durant la phase de révail. Certains actes nécessitent la pratique d’une chirurgie et portent atteinte à l’intégrité physique par l’incision. Elle requière des compétences particulières qui s’acquièrent par des connaissances de base et un apprentissage des gestes auprès de personnes compétentes et habilitées à la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des étapes de formations car ils ne pourront pas être inclus dans un autre protocole scientifique.

Remplacement

Un modèle d'expérimentation artificiel a été conçu utilisant un matériau de type plastique permettant à l’expérimentateur d'acquérir les compétences préliminaires nécessaires pour manipuler un rat ou une souris de manière éthique, sans la nécessité d'utiliser un animal vivant. Néanmoins, il n’existe pas de méthode de remplacement permettant de se substituer à la totalité des gestes techniques, une formation sur animal entier vivant reste nécessaire avant la réalisation des procédures expérimentales incluant des animaux.

Réduction

Dans la mesure du possible, ces formations / maintien des compétences sont réalisées dans la mesure du possible sur des animaux surnuméraires ou issus d’un projet précédent avec avis favorable du vétérinaire, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux nécessaires. Le nombre d'animaux utilisés est réduit au maximum tout en permettant la répétition des actes expérimentaux dans le respect des volumes et du nombre d’administration tolérés.

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des sites d'injection...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Lors des gestes sur les animaux, des anesthésiques et analgésiques seront employés en fonction du geste pratiqué. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, une grille de score permettant d'évaluer les points limites est établie en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement: - Changement du poids corporel (Normal : 0, perte de poids 20 % du poids normal maintenue sur 72h : 3) - Apparence physique (Normale : 0, manque de toilettage : 1, pelage terne et écoulements nasaux et lacrymaux : 2, pilo érection, dos arrondi :3) - Abreuvement et alimentation (Normal : 0, incertain: 1, diminution: 2, aucune prise d'aliment et de boisson: 3)- Examen clinique (Normal : 0, Faibles modifications de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 1 , modifications modérées de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 2, modifications importantes de la température, de la fréquence cardiaque et respiratoire : 3). Grille allant de 0 à 12 points. De 0 à 3 : observation attentive des animaux, de 4 à 8 : souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement l'animal et demander un deuxième avis, de 9 à 12 : souffrance sévère considérer que les points limites sont atteints entrainant une mise à mort de l'animal. A cela il faudra également veiller aux points suivants : plaie nécrosée, purulente ou exsudative, animaux voutés, yeux mi-clos, faiblesse de membres.

Choix des espèces

Les rats, souris, hamsters et lapins sont les animaux les plus utilisés dans notre société pour réaliser des études chez l'animal. Nos projets d'étude utilisant des animaux adultes, les gestes techniques s'effectueront sur des animaux de 6 semaines minimum.

Sous anesthésie, chaque souris reçoit sous la peau du cou une minipompe osmotique qui diffuse son traitement pendant 28 jours, de la prolactine à haute dose quand il s'agit de mimer l'hyperprolactinémie et l'infertilité qui l'accompagne. Du 8e au 28e jour, les 168 souris, réparties en 24 groupes de 7 et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, reçoivent 21 ou 7 injections, quotidiennes ou tous les trois jours, pour tester un analogue de la kisspeptine produit par le laboratoire. Aux 11e et 20e jours, chacune subit des prises de sang en série, de 40 minutes avant à 600 minutes après l'injection, 16 prélèvements au total selon le porteur, chacun suivi d'un morceau de cookie. Il prévoit des douleurs, une perte de poids et une perte de mobilité possibles, qu'il dit anticiper par des analgésiques. Au 28e jour, toutes sont mises à mort par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde, pour l'étude de leurs tissus fixés.

Objectifs

Dans certains contextes physiologiques, les taux de prolactine (une hormone produite par les cellules lactotropes situées dans l’hypophyse) augmentent induisant ainsi une infertilité permettant le bon déroulement des processus physiologiques associés (notamment lors de la grossesse ou des périodes d’allaitement). Cependant, des phénomènes pathologiques peuvent également induire une augmentation importante des taux de prolactine sanguine, avec des valeurs supérieures à 25ng/ml (contre 5 à 10 ng/ml en situation non pathologique) et induisant alors une hyperprolactinémie. Parmi les symptômes associés, la fonction de reproduction se retrouve être le principal processus physiologique impacté. A ce jour, l’hyperprolactinémie est principalement traitée par des agonistes dopaminergiques La reproduction est principalement contrôlée au niveau du système nerveux central, notamment grâce à la kisspeptine, un neuropeptide produit et sécrété par des neurones spécifiques de l’hypothalamus. De nombreuses études rapportent un lien fonctionnel entre la prolactine et la kisspeptine dans le cerveau. L’une d’entre elle a d’ailleurs mis en évidence l’inhibition drastique de l’expression de kisspeptine en cas d’hyperproduction de prolactine, ce qui réduit la sécrétion de l'hormone gonadotrophique (GnRH) et, ainsi, un hypogonadisme hypogonadotrophique et l’infertilité. Dans notre laboratoire, nous avons produit un analogue de la kisspeptine (ayant une demi vie plus importante que la kisspeptine endogène) et qui a déjà démontré des effets positifs sur la reproduction des animaux d’élevages et les rongeurs. Nous suggérons alors d’utiliser cet analogue de la kisspeptine dans le traitement de l’hyperprolactinémie en utilisant un modèle de souris dans laquelle les taux de prolactine seront très nettement supérieurs à la normale (à l’aide de mini pompes osmotiques délivrant de la prolactine à haute dose de façon continue, pour mimer la pathologie). Dans ce modèle, déjà utilisé dans d’autres études, l’augmentation de la production de prolactine mime ce qui est observé en cas d’hyperprolactinémie hypophysaires avec notamment l’absence de fertilité, l’inhibition de l’expression de la kisspeptine et la baisse importante de la sécrétion des hormones liées à la reproduction.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à utiliser notre analogue de la kisspeptine, comme traitement d’une pathologie affectant la reproduction, l’hyperprolactinémie. En termes de bénéfices, le présent projet permettrait ainsi d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de notre molécule dans le traitement d’une pathologie humaine (mimé par un modèle murin), qui pourrait, in fine, être appliqué à d’autres pathologies associées à un dysfonctionnement de la reproduction chez l’Homme.

Procédures

Les 168 animaux inclus dans cette procédure seront soumis, sous anesthésie, à la pose d'une mini pompe osmotique sous la peau de leur cou et diffusant le traitement souhaité pendant 28 jours. Ils seront ensuite soumis à des injections répétées, tous les jours ou tous les 3 jours, à partir du 8ème jour de diffusion du traitement par la minipompe et jusqu'au 28ème jour, correspondant à 21 ou 7 injections de traitements. Au 11ème et 20ème jour de diffusion du traitement, des prélèvements de sang sériés seront réalisés 40 et 20 minutes avant l'injection du traitement puis 20, 40, 60, 80, 100, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540 et 600 minutes après l'injection pour un total de 16 prélèvements afin de doser la concentration plasmatique d'une hormone cible. Au 28ème jour de diffusion du traitement, les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde.

Impact sur les animaux

En termes de manipulation des animaux, les chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets tels que des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent être observés mais sont anticipées par l'injection d'analgésiques au moment des procédures. De plus un suivi journalier sera mis en place pour prévenir ce genre d'effets et pouvoir traiter les animaux en conséquence.

Devenir

Afin de pouvoir réaliser des études immunohistochimiques sur tissus fixés, tout les animaux seront perfusés par la voie intracardiaque.

Remplacement

Il nous est impossible d'utiliser des modèles in vitro pour des études mécanistiques de ce type. L'étude de l'effet de l'analogue de la kisspeptine sur la fonction de reproduction en cas d’hyperprolactinémie nécessite un système complexe et vivant tel que le modèle murin afin d'avoir une compréhension complète des mécanismes mis en jeu (effet de la molécule sur la sécrétion des hormones liées à la reproduction, effet sur l’expression de gènes cibles dans des tissus périphériques, …). Aussi, ce genre d’étude n’à, à ce jour, aucun équivalent qui n’emploi pas de modèle animal.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Ainsi, nous aurons besoin de 7 animaux par groupes afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Avec la formation de 24 groupes nous aurons donc besoin de 168 animaux au total.

Raffinement

Les animaux impliqués dans cette étude sont élevés dans les conditions d'élevage classique dans des cages en présence d'enrichissement (de type carton pour la mise en place d'un nid, petite cabane en carton...). De plus, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l’expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Aussi, une attention toute particulière sera portée aux points limites. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence des souris sera suivi avec attention et les animaux seront pesés tous les jours pendant 3 jours après les chirurgies, injections ou prises de sangs puis tous les 2 jours jusqu'aux prochains prélèvements sanguins. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Afin de de réduire le stress lié aux prélèvements de sang et permettre l'habituation des animaux à cette procédure, un morceau de cookie sera apporté aux animaux après chaque prélèvement sanguin. De plus, lors des chirurgies (implantation de mini pompes), réalisées sur un tapis chauffant, des traitements seront apportés aux animaux pour réduire leur douleurs au maximum.

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle pour analyser les effets de composés sur la physiologie et le comportement tout en offrant la possibilité de réaliser des parallèles avec d’autres espèces qui permettront d’avoir un bon aperçu de l’effet de la kisspeptine sur le long terme. Les mécanismes d’action de la kisspeptine, de façon aigüe chez la souris sont très bien documentés au niveau de la physiologie de la reproduction et les mécanismes sous-jacents sont bien décrits et conservés chez les mammifères. Ces études font suite à des manipulations in vitro et permettront, in fine, de poursuivre avec des expérimentations sur l'espèce humaine et constituent alors un chainon essentiel au développement de notre approche de façon optimale et rigoureuse L'approche expérimentale nécessite un système reproducteur complètement développé et mature, les animaux employés devront donc avoir atteint la maturité sexuelle, avec un âge minimal de 9 semaines

Des souris de deux lignées génétiquement modifiées, porteuses de formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, la CMT2A et la CMT4H, présentent selon le porteur une dégénérescence des axones, des défauts de myéline et des troubles de la locomotion. 530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un classement qui cumule selon lui ce phénotype, les injections et les tests. Toutes reçoivent sous courte anesthésie gazeuse des injections de vecteurs viraux, dans l'espace intrathécal au niveau lombaire ou dans les muscles des pattes arrière, puis passent à 3, 6 et 12 mois trois ou quatre tests de démarche, de sensibilité des pattes et de force musculaire, à raison d'un par semaine. À l'issue de ces études comportementales, toutes sont mises à mort pour examiner les tissus atteints. Pour les souris qui se dégradent avant, le porteur écrit que des points limites "seront définis", sans en donner aucun.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester des approches de thérapie génique "ciblant le gène et le type cellulaire atteint " sur des modèles souris de la maladie de Charcot marie tooth (CMT). Il s'agit notamment de déterminer l'effet bénéfique d'injections de vecteurs viraux médicament exprimant un gène thérapeutique.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si les approches de thérapie génique proposées ont un effet bénéfique pour améliorer ces deux formes de Charcot Marie Tooth (CMT). Il s'agit d'une étude préclinique qui permettra, en cas de bénéfices thérapeutiques, d'établir la preuve de concept de l'efficacité de ce type d'approche de thérapie génique ciblée pour la maladie de Charcot marie tooth (CMT). A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour les patients atteints de CMT.

Procédures

L'ensemble des animaux (n=530) subiront des injections de type intrathécales au niveau lombaire ou intramusculaires dans les pattes arrières. Ces interventions sont de courte durée (de l'ordre de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les deux types d’injections se feront sous courte anesthésie gazeuse. Ces injections seront réalisées au moyen de fines seringues à insuline et ne nécessite pas d’incision de la peau ou du muscle au préalable. En se basant sur notre expérience et celle de nos collaborateurs ,ces injections entrainent peu d'effets indésirables. Nous espérons notamment retarder voire prévenir l'apparition des symptômes grâce à l'approche thérapeutique que nous proposons. Néanmoins, elles peuvent occasionallement induire une inflammation locale ou légères irritations et ainsi un léger inconfort qui sera surveillé dans les jours suivants l’intervention. Par la suite, les fonctions locomotrices de ces souris seront évalués au cours du temps au moyen de 3 ou 4 tests permettant d'analyser la démarche de la souris, la sensibilité de ces pattes ou encore la force de ces muscles. Ces tests entrainent peu d’inconfort aux souris. L’ensemble de ces tests pour un stade donné, seront effectué sur 3 ou 4 semaines afin de ne réaliser qu’un test par semaine et assurer une récupération aux animaux. Une grille de score sera utilisée pour évaluer différents critères (poids, apparence, comportement général, blessure etc.) rendant compte de l'état de santé général de l'animal. La classification modérée des procédures prend en compte le cumul du phénotype de la souris CMT et des injections et tests effectués chez ces animaux.

Devenir

A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT) (diminution de la dégénérescence axonale, réduction des défauts de myéline, etc.).

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann) et particulièrement les cellules de Schwann qu'il est impossible de différentier à partir de cellules pluripotentes humaines. Ainsi seuls des modèles souris nous permettent à l'heure actuelle d'établir la preuve de concept des thérapies que nous proposons pour envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion, force musculaire et vitesse de conduction nerveuse. De plus il s'agit d'une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,6 et 12 mois) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies.

Raffinement

Afin d'améliorer le bien être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe, analgésiques après injection). Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu'ils atteindront le critères d'interruption.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, les lignées utilisées pour la CMT2A et la CMT4H reproduisent la majorité des anomalies cellulaires et comportementales observés chez ces patients telles que une dégénérescence axonale, des défauts locomoteurs et des anomalies de myéline.

4 258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la bactérie de la listériose, par gavage ou injection intraveineuse, puis pesées quotidiennement, certaines recevant du tamoxifène ou des anticorps, et peuvent développer diarrhées et infections d'organes dont le cerveau. Le porteur situe le projet dans la recherche fondamentale sur les interactions entre la bactérie et son hôte, et indique que les souris seront tuées faute de pouvoir être réutilisées, replacées ou adoptées. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité d'un "organisme vivant dans son intégralité".

Objectifs

Listeria monocytogenes (Lm) est la bactérie responsable de la listériose, maladie humaine d'origine alimentaire. Lm peut atteindre le cerveau et induire des méningites et encéphalites, en particulier chez les personnes âgées de plus de 65 ans, avec un taux de mortalité d'environ 30 %. La listériose peut aussi se traduire par une infection materno-fœtale chez les femmes enceintes, provoquant fausses-couches, accouchements prématurés ou infections néonatales. Les objectifs de ce projet sont de déterminer les rôles des facteurs bactériens et de l’hôte, y compris le microbiote intestinal, dans la listériose. L’étude de la listériose est importante pour comprendre cette pathologie, mais également pour mieux appréhender la réponse de l’hôte à un pathogène intracellulaire facultatif.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre de recherches fondamentales sur les maladies infectieuses et en particulier sur la listériose. Cette maladie tue chaque année plus de 300 personnes en France. Elle constitue donc un problème de santé publique ainsi que pour l’industrie agro-alimentaire. Elle est également un modèle précieux pour la compréhension des interactions entre une bactérie intracellulaire facultative et son hôte. Une meilleure compréhension du mécanisme de dissémination des bactéries dans l'organisme et de la réponse immunitaire mise en place est en soi importante pour l’évolution des connaissances et constitue un prérequis indispensable pour le développement de stratégies thérapeutiques multi-cibles innovantes et efficaces. Même si nos recherches se focalisent sur Lm, une grande partie de nos approches et résultats pourrait être étendu à l’étude d’autres pathogènes..

Procédures

1128 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), avec un ou des composants du microbiote (ou PBS en contrôle) puis, 30 jours après, à un nouveau gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes, pathogène pour l’homme et l’animal. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement, et les fèces prélevés (durée d’environ 2 minutes dans une boîte individuelle). 600 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 240 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 324 souris seront soumises à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces animaux recevront 10 injections de tamoxifène ou de solvant contrôle (huile d’olive) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). 5 injections avant et 5 injections après inoculation de Listeria. L’injection de tamoxifène pourra être remplacée par l’ajout de tamoxifène dans la nourriture, si ce mode de délivrance est efficace pour notre modèle. Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 480 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) avec Listeria monocytogenes. Parmi ces souris, 240 recevront 3 injections d’anticorps anti-Il-10 (ou anticorps contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 2 injections avant et une injection le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris). 60 souris seront soumises à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute) et 60 à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes) avec Listeria monocytogenes. Ces 120 souris recevront 3 injections d’inhibiteur d’EVH1 (ou contrôle) par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes, 1 injection avant et 2 après le jour de l’inoculation par Listeria). Les animaux seront ensuite pesés quotidiennement (durée d’environ 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. Les animaux sont susceptibles de développer des diarrhées, des infections de différents organes y compris le cerveau.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Ce projet a pour but l’étude de la physiopathologie de la listériose. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité d’un organisme vivant dans son intégralité, y compris les conditions très spécifiques pour maintenir un microbiote sous conditions physiologique. Seul les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus d’infection dans sa globalité et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. Nous utilisons en parallèle des approches in vitro ou ex vivo (organoïdes) pour répondre à des questions plus spécifiques.

Réduction

Les moyennes de CFU entre les groupes seront comparées à l'aide de tests de comparaison de moyenne (ANOVA ou test non paramétrique). Les effectifs par groupe (n=5) sont associés à des tailles d'effet de 2, pour un test de comparaison de 2 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Lorsque cela est possible, les animaux sont infectés avec un mélange de souches (index de compétition), afin de comparer leur virulence au sein du même animal, ce qui permet de diminuer le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Des points limites incluant la prostration/faciès de souffrance ou Body score 1, la perte de poids>20% du poids initial, ainsi que les signes d'infection du système nerveux central (paralysie partielle) sont appliqués pour ce projet. Les animaux seront mis à mort dès qu'un de ces points limites est atteint. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) sera effectuée et de l’eau gélifiée sera mise à disposition pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané).

Choix des espèces

La souris n’est pas permissive à une infection orale par Lm du fait d’une spécificité d’espèce de l’interaction entre InlA et la E-cadhérine. La lignée murine permissive à Lm, qui exprime une E-cadhérine reconnue par InlA, sera dont principalement utilisée. L’interaction InlA-E-cadhérine n’étant pas impliquée après le passage de la barrière intestinale, des souris non permissives pour cette interaction, dont des C57BL/6J, pourront être également utilisées pour des infections intraveineuses afin de tester le rôle de facteurs bactériens ou de l’hôte indépendamment de la traversée de la barrière intestinale. Différentes lignées mutantes pourront ainsi être utilisées. Le recours à ces lignées permettra d’identifier et de caractériser les processus d’interactions hôtes / bactéries de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. Selon les procédures, les animaux suivants seront utilisés : Souris adultes (âge > 7 semaines), pour lesquelles le système immunitaire est mis en place. Souris gestantes pour étudier la listériose materno-fœtale et l’infection des fœtus. Souris âgées (plus de 18 mois) pour caractériser l’augmentation de la susceptibilité à la neuro-listériose liée à l’âge et au changement de microbiote.

1 750 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à quatre injections de candidats vaccins contre l'allergie et trois prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire, une ponction derrière l'oeil que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des douleurs oculaires, un blépharospasme et des écoulements. Il indique que les souris gardent une mémoire immunitaire des vaccinations et ne peuvent donc être réutilisées, d'où leur mise à mort. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode in vitro" pour remplacer ce type d'évaluation immunitaire.

Objectifs

Les allergies sont aujourd’hui un problème de santé publique. Ces affections très répandues, particulièrement dans les pays développés, touchent 25 % de la population européenne. Elles sont dues à un dérèglement du système immunitaire qui devient hypersensible à des substances généralement inoffensives. Ceci se traduit par la surexpression ou dérégulation de certaines cytokines (comme l’IL4 et l’IL13) et conduit à l’apparition de la pathologie. Ce projet s’inscrit dans le cadre de développement de vaccins contre les allergies. Au sein de notre société, nous avons développé une stratégie d’immunothérapie active (stimulation du système immunitaire du patient) reposant sur la production d’anticorps contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s) après administration d’un vaccin appelé ‘Kinoïde™’. Ce dernier peut se présenter soit sous forme de proteine mélangé à un adjuvant, soit sous forme d’un acide ribonucleique messager (ARNm) encapsulé dans des particules lipidiques. Il n’existe pas à ce jour de méthodes in vitro permettant d’évaluer la réponse immunologique à un vaccin, ce qui nous contraint à les tester chez la souris. L’efficacité du vaccin Kinoïde™ est évaluée selon sa capacité à induire une réponse immunitaire capable de neutraliser l’activité biologique de la cytokine. Dans nos précédentes études, nous avons démontré que le vaccin kinoide (protéique ou ARN) murin induit une réponse immunitaire neutralisante contre la ou les cytokine(s) surexprimée(s). Nous avons également démontré que le vaccin kinoide protéique humain induit une réponse immunitaire dans une lignée murine humanisée. Dans cette nouvelle étude, nous avons 2 objectifs : -Optimiser la réponse immunitaire induite par le vaccin kinoide protéique humain en testant différentes doses de vaccins -Tester 27 candidats vaccins kinoides ARN humains Pour cela, nous utiliserons la lignée murine humanisée hIL-4/hIL-13KI ; hIL-4RαKI.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à définir les meilleures conditions d’immunisation du vaccin kinoide protéique, à savoir, la dose de vaccin à injecter. Il permettra également de sélectionner les meilleurs candidats vaccins kinoides ARN ainsi que la meilleure formulation de particules lipidiques. Les candidats vaccins sélectionnés seront ensuite évalués pour leur efficacité dans des modèles expérimentaux d’allergies developpés chez la souris.

Procédures

1) Administration du vaccin : L'injection du vaccin est réalisée sur animaux vigiles maintenus par contention pendant 30 secondes. -900 animaux seront injectés par voie intramusculaire avec du vaccin (50 à 100 μl). Parmis ces animaux, un groupe de 810 souris recevra 3 injections de vaccin aux jours 0, 7 et 28 et un groupe de 90 souris recevront 4 injections de vaccin aux jours 0, 7, 28 et 48. -810 animaux seront injectés par voie sous-cutanée avec du vaccin (50 à 100 μl). Ces 810 souris recevront 3 injections aux jours 0, 7 et 28. Il a déjà été démontré dans la littérature que pour obtenir une réponse immunitaire efficaces 2 ou 3 injections de vaccins ARN étaient nécessaires. De plus, des études préliminaires ont montré que chez les souris humanisées triple KI 3 à 4 injections étaient nécessaires pour obtenir une réponse immunitaire efficace. 2)Prèlévement sanguin: Les animaux sont anésthésiés à l'isoflurane pendant 5min. Ensuite, le prélévement de sang est réalisé en moins de 30 secondes. L’ensemble des 1710 souris subira 3 prélèvements sanguins aux jours -7, 38 et 58.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus à l’injection ou au prélèvement au sinus retro orbitaire. Les effets secondaires liées au candidat vaccin ne sont pas attendus. Le principe du vaccin étant de provoquer une réponse immune, des effets indésirables de type inflammatoire peuvent se produire principalement au site d’injection et se manifester par des oedèmes et érythèmes pouvant durer quelques heures à quelques jours. L’injection par voie intramusculaire se faisant dans le muscle de la patte arrière, une douleur musculaire localisée pourra être détectée quand l'animal a tendance à se mordre au niveau de la zone douloureuse. Les prélèvements sanguins se faisant au niveau du sinus rétro-orbitaire, des effets indésirables sur l’oeil peuvent se produire. La survenue de contractions répétées et involontaires des muscles des paupières (blépharospasme), la sécrétion lacrymale éventuellement accompagnée de photophobie, les écoulements, la survenue d'oeil rouge ou opaque seront examinés, puisqu'ils traduisent des douleurs oculaires et l'état des yeux.

Devenir

Le système immunitaire des souris utilisées ayant été stimulé par les candidats vaccin, celles-ci conserveront une « mémoire » des vaccinations précédentes. Nous ne serons donc plus dans la possibilité d’obtenir chez ces souris, une réponse immunitaire comparable à des animaux nouvellement vaccinés. De surcroit les souris ont une durée de vie assez courte et l’utilisation d’animaux âgés n’est pas recommandé pour l’obtention d’une bonne réponse immunitaire. L'ensemble des animaux sera donc mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

La stimulation du système immunitaire par vaccination ne peut s’effectuer que sur animaux vivants. Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de remplacer le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Ce protocole suit la condition pour laquelle un nombre de 10 animaux par groupe procure une puissance statistique suffisante (tests statistiques classiques).

Raffinement

Les animaux disposent d'une période d'acclimatation conséquente (minimum 7 jours), avant l'initiation de tout protocole, afin de limiter leur angoisse. Ils subissent ensuite des contraintes très modérées. Les injections, réalisées en intramusculaire et en sous-cutanée et les prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse, ont lieu de façon ponctuelle et n’induisent pas de modification de leur bien-être. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis. De plus, des antalgiques sont prévus si l’animal présenté un signe de souffrance. Si un animal présente l'un des points limite à un seuil critique, il est mis à mort afin d'abréger sa souffrance. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux. Le bruit dans les zones d’hébergement ainsi que dans la zone d’expérimentation sera réduit au maximum. Les souris seront hébergées par groupe de 5 souris maximum par cage. Ce milieu sera enrichi (tunnel + coton) et la nourriture et l’eau seront fournis ad libitum afin de s’assurer du bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus approprié du fait de sa physiologie proche de l’Homme (taux d’homologie 90 %) et de la grande quantité de données disponibles dans la littérature et au sein du laboratoire. Souris adulte, c’est-à-dire de 7 semaines, soit environ 20-25g. En effet, nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire mature pour tenir compte de la réponse humorale.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques puis soumises à un régime hyperprotéiné pendant douze semaines, elles reçoivent un gavage quotidien pendant vingt-huit jours et des incisions répétées de la veine caudale pour mesurer la glycémie, et sont hébergées seules en cage métabolique lors des dernières semaines. Le porteur indique un point limite de mise à mort à partir de 10 % de perte de poids accompagnée de signes de morbidité, et prévoit une réhydratation pour les animaux déshydratés. Il affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur "l'organisme vivant en entier" pour étudier la néphropathie diabétique.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique (IRC) touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Actuellement, la prise en charge des patients souffrant de néphropathie diabétique (ND) reste insuffisante malgré le développement récent de nouveaux médicaments dont les inhibiteurs de SGLT2. Ces derniers n’offrent qu’une protection partielle et freinent l’évolution de la ND sans pour autant la guérir. Dans ce contexte, le récepteur aux cannabinoïde-1 (CB1R) est actuellement une cible potentielle très prometteuse pour la prise en charge de la ND mais là encore, les données pré-cliniques montrent une protection partielle uniquement. Ainsi, l'idée d'utiliser une approche pharmacologique permettant de combiner le blocage de CB1R et l’inhibition de SGLT2 au cours de la ND pourrait être une stratégie thérapeutique prometteuse. L’objectif principal de ce projet sera donc de déterminer si cette approche poly-pharmacologique est viable en utilisant un modèle de souris diabétique présentant les caractéristiques cliniques de la ND. Cette double approche pharmacologique devrait conduire à un niveau plus élevé de protection contre le développement de la néphropathie.

Bénéfices attendus

Le diabète représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. Sur le long terme, le diabète est la cause de nombreuses complications dont la néphropathie conduisant à l’insuffisance rénale chronique. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’apparition de la néphropathie. Actuellement les traitements disponibles freinent le développement de la pathologie dans 39% des cas et une approche poly-pharmacologique semble appropriée en ce qui concerne le blocage des récepteurs CB1 et les inhibiteurs SGLT2. Ces derniers semblent exercés des effets bénéfiques différents mais complémentaires sur la néphropathie diabétique et leur combinaison devrait permettre d’obtenir une protection plus importante vis-à-vis de cette pathologie.

Procédures

Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement n’aura lieu que 3 fois par animal et durera 3-4 secondes. Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé de façon régulière car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. Depuis leur arrivée du fournisseur jusqu’à 12 semaines de régime hyper-protéiné, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. Cependant, au cours des 4 dernières semaines correspondant aux interventions pharmacologiques, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre la collection individuelle de la production urinaire (cages métaboliques) et l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. De ce fait, les souris auront accès à un enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaire au bon déroulement du prélèvement de sang caudal servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des gavages orogastriques, et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

Le diabète de type 2 est une pathologie multifactorielle entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.

Réduction

Les analyses étant basées sur le degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux, ces derniers seront répartis dans les groupes placebo, INV202, Empagliflozine ou INV202+Empagliflozine de manière à ce que ces 2 paramètres soit similaire dans les 4 groupes. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 15-20. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte. Nous avons ainsi fait le choix d’inclure aussi bien des souris mâles que femelles (à raison d’1/4 de l’effectif) pour prendre en compte les 2 sexes tout en limitant le nombre d’animaux finaux.

Raffinement

Depuis leur arrivée du fournisseur, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique (500 µL, 1 fois par jour) ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. En plus des critères d'intervention spécifiques au projet, les critères suivants s'appliquent à tout le projet et les animaux seront mis à mort si : La perte de poids corporel dépasse 10% et s'accompagne d'une mauvaise condition physique ou de signes de morbidité. Incapacité de mouvement empêchant l'animal d'avoir accès à la nourriture ou à l'eau. Inappétence prolongée (par exemple> 48 heures) et / ou preuve de déshydratation clinique. Diarrhée chronique (par exemple> 48 heures) ou constipation. Perte de conscience inattendue sans réponse à des stimuli externes tels qu'un pincement des orteils. Dermatite ou traumatisme auto-induit inadapté au traitement palliatif. De plus, pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local à base de lidocaïne quelques minutes avant l’incision.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction du diabète se fera chez des souris de 6 semaines. Deux semaines plus tard, le degré d’hyperglycémie sera évalué (8 semaines) les souris présentant une glycémie ≥ 250 mg.dL seront mises sous régime riche en protéines pendant 12 semaines. Ainsi, les souris seront âgées de 20 semaines lors du début des traitements pharmacologiques et de 24 lors de la mise à mort. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.