Rongeurs

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une intervention chirurgicale sur la trachée leur injecte un composé qui déclenche une fibrose pulmonaire, précédée d'injections d'anticorps ou d'aspirine visant les plaquettes, avec un risque de gêne respiratoire. Les animaux sont tués au bout de quatorze jours pour des lavages des bronches et le prélèvement des poumons. Le porteur affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité d'un "organisme entier" et qu'il est "nécessaire" d'utiliser des animaux vivants.

Objectifs

Les plaquettes sont des éléments du sang connus pour leurs rôles dans la coagulation et la cicatrisation. Ce rôle cicatriciel est accompli par liaison des plaquettes au collagène via des molécules de liaison appelées récepteurs. Or, la fibrose peut se définir par une accumulation pathologique excessive de fibres de collagène. Le but du projet est donc d'étudier l'implication des plaquettes dans le développement de la fibrose pulmonaire et pouvoir identifier les récepteurs favorisant ce développement afin d'en faire des cibles thérapeutiques potentielles.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de pouvoir fournir des éléments supplémentaires sur les mécanismes des plaquettes impliquées dans la fibrose pulmonaire, qui est une pathologie pour laquelle il n'existe encore aucun traitement curatif. Nous allons utiliser des souris dont certains récepteurs plaquettaires ont été modifiés. Nous pourrons comparer les résultats obtenus dans les différentes lignées de souris afin de pouvoir mettre en évidence l'implication d'un récepteur en particulier dans cette pathologie, ce qui permettra peut-être de trouver un traitement.

Procédures

Les animaux, sous anesthésie et analgésie subiront une légère intervention chirurgicale d'une durée totale de 15 minutes consistant en une petite incision au niveau de la trachée qui permet d'y injecter un composé chimique induisant une fibrose pulmonaire. Avant cette chirurgie, certains animaux auront une injection intraveineuse d'anticorps ciblant les plaquettes sanguines, qui sera répétée 2 ou 4 fois en fonction de l'anticorps, ou auront de l'aspirine dans l'eau de boisson en continu afin d'inactiver les plaquettes. Juste avant la chirurgie et à la fin de la procédure qui dure 14 jours , les animaux auront également un prélèvement sanguin sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Des projets menés au laboratoire sur le thème du développement de la fibrose pulmonaire nous indique que le bien être de l'animal n'est pas altéré, les souris sont alertes et dynamiques. Cependant, il est possible dans de rares cas que la souris ressente une légère gêne respiratoire. Les injections intraveineuses répétées et la suture (3 points) au niveau de la trachée peuvent également engendrer une gêne modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de laprocédure s'ils n'atteignent pas les points limites défini dans ce projet avant. Cela est nécessaire pour effectuer les prélèvements (sang, lavages broncho-alvéolaires et poumons) qui vont permettre d'analyser la fibrose pulmonaire et les marqueurs plaquettaires et inflammatoires .

Remplacement

Nous n'avons pas la possibilité de remplacer les animaux dans ce projet. En effet, même si la culture cellulaire nous permet, au sein de ce projet, d'étudier les molécules inflammatoires produites par les cellules pulmonaires impliquées dans la pathologie que nous étudions, elle ne permet pas de reproduire la complexité de fonctionnement d'un organisme entier en cas de développement d'une fibrose pulmonaire. Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres conduisant à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour étudier le rôle des plaquettes dans cette pathologie.

Réduction

Nous ferons appel à des techniques permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement. En effet, nous réaliserons un lavage des bronches et des alvéoles puis nous récupèrerons les poumons afin de procéder à différents marquages plaquettaires ainsi qu'un dosage du collagène. Nous pourrons donc réaliser des analyses histologiques et des dosages sur le poumon d'une même souris afin de limiter le nombre de souris à utiliser. Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la littérature et au sein de notre laboratoire lors d'études précédentes. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis tout au long du protocole et tout sera mis en oeuvre pour éviter toute souffrance (anesthésie, analgésie). La douleur post-opératoire est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Les jours suivant la chirurgie, l'apparence des souris (cicatrisation de la plaie, posture de la souris, souris prostrée ou pas, déplacements ou pas, vitesse de respiration) et leur poids seront suivis quotidiennement et des points limites précoces ont été mis en place pour leur éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Notre modèle de fibrose pulmonaire chez la souris est le plus utilisé et le mieux décrit dans la littérature scientifique. En effet, il est utilisé depuis plusieurs décennies et permet de retrouver des caractéristiques proches de la pathologie humaine . Les animaux sont utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines, la pathologie étant trop sévère chez des souris âgés. De plus, l'utilisations de souris jeunes permet de diminuer le risque de mortalité dû au développement de la fibrose.

1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une société prestataire greffe des tumeurs sous la capsule du rein pour améliorer la prise tumorale, puis administre des traitements par de multiples voies, avec imagerie, irradiation possible et prélèvements répétés, certaines tumeurs pouvant provoquer des métastases pulmonaires et des difficultés respiratoires. Les animaux sont tués parce qu'ils portent des tumeurs. Le porteur propose ces modèles comme prestation commerciale pour la sélection de molécules anticancer, et présente les méthodes de remplacement comme "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveaux composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Les modèles de ce projet sont des modèles orthotopiques rénaux ou des modèles dont la prise tumorale est faible dans des tissus communément utilisés (sous cutané par exemple) et dont la greffe en sub-capsulaire rénale améliore la prise tumorale, grâce à la forte vascularisation du rein. Pour certains modèles, les masses tumorales primaires greffées peuvent disséminer et créer des métastases. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme dans le cas des tumeurs de rein greffées par voie orthotopique, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tumorale tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie avec administration d’un anesthésique local et d’un anti inflammatoire (

Impact sur les animaux

Il pourra être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1-2 jours. La greffe tumorale en sub-capsulaire rénal (réalisée sous anesthésie générale et analgésie) pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner un développement de métastases pulmonaires causant des difficultés respiratoires, une perte de poids. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie IM (avec analgésie), ID (avec analgésie) , SC, IV (bolus), orale, IN, IT, IP et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans le cas de l’imagerie, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’imagerie et imagés sous anesthésie générale. Cela pourra entrainer un stress léger. Les prélèvements de sang peu invasifs (veine faciale, jugulaire, caudale) seront effectués sous anesthésie générale à l’Isoflurane. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans certains cas, comme par exemple pour le prélèvement à la veine caudale ou à la veine saphène, le geste pourra être effectué sans anesthésie, uniquement sous contention. Cela pourra entrainer un stress modéré pendant le prélèvement. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Etant porteurs de tumeurs les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule, et un groupe avec tumeur traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés seront testés au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de taux de prise tumorale variable et afin de pouvoir former des groupes homogènes en poids et/ou en volume tumoral, il sera en général nécessaire d’inclure au moins 10% d’animaux non randomisés. Le nombre d’animaux par groupe (en général 6 à 15 animaux) est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront placés au fond de toutes les cages dès qu’une perte de poids >15% sera observée sur certains animaux en étude. La greffe sub-capsulaire rénale, la pose d’implants hormonaux ou la thoracotomie seront réalisés sous anesthésie profonde avec injection pré-opératoire d’un opiacé et un alpha2 agoniste. Suite à la greffe du matériel tumoral en sub-capsulaire rénal ou suite à la pose d’un implant, les animaux recevront 2 injections d’opiacépendant 48, et éventuellement sur 24 heures supplémentaires si besoin. Les autres administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (IM, ID) seront réalisées avec analgésie préalable, et sous anesthésie si besoin. Les points limites concernant le poids sont adaptés en cas de tumeurs cachectiques. Dans les modèles connus pour induire des métastases pulmonaires, ou les modèles inconnus pouvant causer des métastases pulmonaires, une attention particulière sera portée à la respiration des animaux (posture, fréquence respiratoire). Les difficultés respiratoires marquées constitueront un point limite. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans la procédure. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus suite à l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité sur l’animal, un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie pour sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou induites) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une greffe de cellules cancéreuses sous la peau leur fait développer une tumeur, dont la croissance est suivie au pied à coulisse, puis elles reçoivent jusqu'à six injections d'un vaccin à ARN messager sous anesthésie. Les animaux sont tués pour prélever les tumeurs et les organes. Le porteur renvoie le bénéfice, une nouvelle stratégie anticancer chez l'humain, au conditionnel et au long terme, et affirme que la réponse immunitaire complexe rend l'étude in vitro impossible.

Objectifs

Chaque année, les cancers provoquent le décès de plusieurs dizaines de milliers de personnes. Jusqu'alors, les traitements classiques (chirurgie, chimiothérapie, radiothérapie) ciblent directement la tumeur, offrant de bonnes chances de survie aux malades présentant des cancers localisés. Cependant, ces traitements ne sont pas assez efficaces, pour les cancers généralisés. C’est pourquoi, les chercheurs se penchent vers une nouvelle approche : l’immunothérapie. Cette approche permet de traiter le cancer en utilisant le propre système immunitaire du patient. Les vaccins de type ARN messager (ARNm) sont devenus des outils prometteurs pour l'immunothérapie du cancer. Ce projet de recherche a pour but d'évaluer les capacités thérapeutiques d'un vaccin ARNm nouvelle génération dans un modèle de tumeur de côlon. L’idée principale est donc d’induire une réponse immunitaire grâce à l’injection intramusculaire de ce vaccin ARNm nouvelle génération, afin de lutter contre le développement de la tumeur chez la souris.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu du projet est de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice d'une approche par un vaccin à ARNm, sur le développement de tumeurs cancéreuses. Cet outil pourrait être applicable à différents types de cancer.

Procédures

Des cellules cancéreuses sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est maintenue environ 15 sec, une seule injection de 0.1ml. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 sec. Les composés sont administrés par voie intra-musculaire sur animal anesthésié au maximum 6 anesthésies sur une période de 2 semaines. Le volume d'injection est de 0.05 ml dans le muscle de la cuisse, temps 1 min (anesthésie comprise).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. La tumeur pourrait entrainer dans de très rare cas une gêne à la locomotion. L'immunisation est réalisée par une injection intra-musculaire dans le muscle de la cuisse. Au maximum, 6 immunisations sur une période de 2 semaines. Une inflammation au site d'injection ou une réaction à l'injection est très peu probable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs et des organes pour analyser les réponses immunitaires.

Remplacement

L'efficacité d'un vaccin contre le cancer dépend de sa capacité à induire une réponse immunitaire permettant de réduire le taux de croissance de la tumeur, avec un mécanisme d’action spécifique. C'est un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types de cellules immunitaires et une organisation particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.

Réduction

Une étude préliminaire pour vérifier la capacité des cellules à développer une tumeur est conduite sur un nombre restreint de souris. Si le résultat est concluant, l'étape 2 sera mise en oeuvre pour déterminer l'efficacité d'une vaccination préventive par un vaccin ARNm nouvelle génération sur le ralentissement de la croissance tumorale. Si et seulement si un ralentissement significatif de la croissance tumorale est constaté, alors l'étude d'un traitement curatif sera mise en oeuvre (les cellules cancéreuses sont injectées puis le traitement débute).

Raffinement

Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. De l'aliment humidifié en fond de cage sera disposé si un animal présente une gêne de la mobilité due à la croissance de la tumeur (très rare). Les immunisations (injection intra-musculaire ) se feront sur animal anesthésié. L'injection intra-musculaire est la voie la plus utilisée pour les vaccins à ARNm, permettant la stimulation de la réponse immunitaire. Certains animaux pourront recevoir jusqu'à 6 immunisations maximum. Ce nombre pourra être réduit à 5 en fonction de la croissance tumorale. Ces injections intramusculaires pourront être administrées alternativement sur la patte droite et la patte gauche. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunocompétentes car l'objectif de l'exprimentation est d'activer le système immunitaire en vue de réduire la croissance de la tumeur. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines. Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge-là et non veillissant.

300 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie du crâne pour injecter un virus dans l'hippocampe, des contentions prolongées avec incisions de la queue et prélèvements sanguins répétés pour mesurer le stress, et un test de mémoire en labyrinthe aquatique où l'animal nage pour retrouver une plateforme immergée. Les cerveaux sont prélevés après mise à mort. Le porteur étudie le rôle des nouveaux neurones dans les troubles de mémoire liés à l'âge, et affirme qu'une approche in vitro ou in silico ne pourrait convenir.

Objectifs

Il est maintenant bien établi qu’il existe une formation de nouveaux neurones tout au long de la vie dans l’hippocampe des mammifères (y compris l’Homme), et que ce phénomène joue un rôle dans la mémoire. L’hippocampe est une structure clé impliquée dans les processus de mémoire. Les nouveaux neurones nés à l’âge adulte s’intègrent aux réseaux des neurones formés au cours du développement. Ces nouveaux neurones, appelés néo-neurones, sont cruciaux pour l’apprentissage et la mémoire. Au cours du vieillissement, certains individus présentent un déficit de mémoire beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables alors que d’autres individus sont dits résilients car ils conservent une bonne mémoire au cours du vieillissement. La compréhension de ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles de mémoire liés à l'âge. L’une des explications pourrait être la capacité des nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer totalement (individus résilients) ou partiellement (individus vulnérables) dans le réseau de neurones au cours des processus de mémoire. L’objectif de ce projet est de regarder si l’intégration totale ou partielle de ces nouveaux neurones est à l’origine de déficits mnésiques.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'Union européènne. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémoire, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences interindividuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle des nouveaux neurones dans la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

7 gestes techniques seront réalisés : *Composition corporelle : Après une acclimatation de 30 minutes dans la zone d’analyse, les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention en plastique durant le temps de l’examen qui dure 3 min (180 rats). *Réactivité au stress : les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention pendant 30 min pour induire un stress. Immédiatement après, le bout de la queue (~0.3cm) est incisé à l’aide d’une lame de scalpel, la queue est massée et un volume de sang d’~200μl est prélevé. L’opération est renouvelée 30, 60 et 120 minutes plus tard. Les animaux sont remis dans leur cage après le second prélèvement (à 30 min) et sont replacés dans les tubes (2x2min) pour les deux derniers prélèvements afin d'éviter qu’ils ne se retournent. 180 rats sont concernés à 3, 8, 12 et 18 mois. *Injections intra-hippocampiques : Geste réalisé sous anesthésie gazeuse durant toute la chirurgie (~40 min), consistant en une incision du scalp, une craniotomie pour l’injection de virus et la suture de la peau. La totalité des animaux est concernée. *Injections sous-cutanées : Elles sont réalisées sur animal vigile. Les animaux reçoivent au total 4 injections (contention + injection : 4x2min=8 min) sur 4 jours consécutifs (4x8min=32min) (180 rats). *Labyrinthe aquatique : les rats nagent dans une piscine et apprennent à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Lors de l’habituation, ils passent 2x60s dans la piscine sans la plateforme. Lors de l’apprentissage, ils font chaque jour 4 essais consécutifs, pendant 6 jours. Pour chaque essai, les animaux passent 90s maximum dans l’eau (temps maximum passé dans l’eau au cours d’une session = 4 x 90s = 360s). Au fil des jours, les animaux apprennent et le temps passé dans l’eau diminue. Les groupes Apprentissage et Plateforme visible sont concernés (207 rats). *Injection d’anesthésie : Dans la partie I, les animaux sous anesthésie gazeuse sont euthanasiés (induction 5min + maintien 3-4min jusqu’à confirmation euthanasie) par injection intrapéritonéale d’une dose létale d’Exagon. (180 rats). Dans la partie II, les animaux vigiles reçoivent une injection intrapéritonéale d’un mélange d’analgésique/anesthésique (2min) (120 rats)*Perfusion intracardiaque : Après obtention d’une anesthésie profonde, une perfusion intracardiaque d’une solution enrichie en sucrose est réalisée (3min). Tous les animaux de la partie II sont concernés (120 rats).

Impact sur les animaux

Comme tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux (stéréotaxie, incision de la queue), Il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adaptées. Tout d’abord concernant la contention dans l’appareil à Résonnance Magnétique Nucléaire (RMN), celle-ci sera la plus légère possible et de durée relativement courte (3min) de manière à induire le moins de stress possible. S’agissant de la contention afin d’étudier la réactivité de l’axe corticotrope en réponse à un stress, nous savons que cela sera forcément générateur de stress puisqu’il est nécessaire à l’étude. Ensuite, même si cela est relativement rare, il est possible que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales (stéréotaxie, incision de la queue) s’infectent ou deviennent douloureux. De même dans les 2 jours suivants la chirurgie stéréotaxique, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie) ou présentent des signes de douleur. Enfin, au sujet de l’isolement certes les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant 14 jours mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

A l’issue de ces expériences, les animaux seront mis à mort et les cerveaux récupérés en vue de leur analyse.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’intégration des nouveaux neurones dans le cerveau, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, variations anatomiques inter-individuelles, des expériences d’électrophysiologie), ainsi que des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus). Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocement que prévu.

Raffinement

Hébergement : Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés par 2 en cages collectives (grande taille) enrichies (sizzle pad : lanières de papier kraft vierge) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité et réactivité, aspect général et aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur sacrifice. Ils seront stabulés dans une animalerie avec une température maintenue constante, une hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera illimité et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Gestion de la douleur : La chirurgie se fait sous anesthésie et analgésie. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si un animal présente des signes de douleur, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. En cas de signes d’infection de la plaie chirurgicale (rougeur, oedème, écoulement, saignement), nous la désinfecterons et administrerons un analgésique. Nous utilisons des grilles d’évaluation de la douleur permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’au sacrifice des animaux. Plus le score est élevé plus le bien-être de l’animal est menacé et des points limite ont été définis. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera euthanasié par inhalation de gaz carbonique.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la néo-neurogenèse hippocampique est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des chirurgies stéréotaxiques. Ensuite, comme indiqué dans le paragraphe 3.3.2, les différentes études seront réalisées 5 à 15 mois après les injections intra-cérébrales. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : 8 mois :1) adulte : 8 mois ; 2) milieu de vie : 12 mois ; 3) fin de vie : 18 mois. Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale du rôle des néo-neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de déficits mnésiques.

110 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent pendant trois semaines un régime contenant de la viande, puis passent jusqu'à 72 heures seuls en cage à métabolisme pour le recueil de leurs urines et fèces, une phase que le porteur reconnaît comme génératrice de stress. Les animaux sont tués pour prélever leur côlon et y mesurer l'oxydation et l'inflammation. Le porteur teste des antioxydants censés contrer l'effet cancérigène du fer héminique de la viande rouge, et affirme qu'aucune étude in vitro ne rend compte d'un "organisme entier".

Objectifs

Les études épidémiologiques réalisées chez l’Homme montrent une association entre la consommation importante de viande rouge et de charcuteries et le développement du cancer colorectal. Les études réalisées chez le rat ou la souris confirment cette association et montrent que le fer héminique (le rouge de la viande), contenu en grande quantité dans ces aliments pourrait être responsable de leur effet néfaste. Le fer héminique est un agent pro-oxydant qui provoque l’oxydation, dans la lumière intestinale, de composés du régime alimentaire, comme les lipides, aboutissant à la formation de composés toxiques. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d'extraits végétaux antioxydants, ajoutés directement dans la viande (volet 2), ou bien indirectement dans la ration des bovins (volet 1), sur leur capacité à contrecarrer l’effet délétère du fer héminique de la viande. Les antioxydants ajoutés directement dans la viande (volet 2) seront choisis pour leur capacité antioxydante intrinsèque mais aussi pour leur capacité à moduler une voie importante impliquée dans le dialogue entre différents types cellulaires au niveau colique (études in vitro sur lignée cellulaire en amont de ce projet). Les antioxydants ajoutés dans la ration des bovins seront choisis pour répondre à un triple objectif : avoir non seulement un effet antioxydant, destiné à contrecarrer l’effet du fer héminique chez le consommateur de viande (volet 1), un effet de réduction d’émission de méthane lors de la digestion des bovins (étude sur digesteurs artificiels en amont de ce projet), mais aussi une absence de modification ou une amélioration de la qualité organoleptique (évaluation gustative par un jury de testeurs humains). La viande issue de ces bovins (8 bovins, 2/lots, 1 lot témoin/élevage, 3 lots/rations enrichie en antioxydant) sera testée en l’ajoutant à la ration des rats dans le volet 1. Dans ce projet, nous proposons deux volets où 110 rats Fisher F344 mâles seront nourris avec un régime contenant de la viande pendant 3 semaines. Leur urine et leur fèces seront récupérées lors d’un passage de 2 jours et demi en cage à métabolisme et leur côlon post mortem sera prélevé à la fin de l’expérimentation. Ces échantillons permettront des mesures des produits d’oxydation des lipides et de l’inflammation et permettront des analyses pour la compréhension mécanistique au niveau du tissu colique.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans chacun de ces 2 volets permettront l’identification de molécules prometteuses afin d’élaborer des stratégies de prévention nutritionnelles visant à limiter l’effet de la viande rouge sur le risque de cancer colorectal. La première stratégie (volet 1) constitue un levier de prévention nutritionnelle dès la production du bétail qui outre la limitation du risque de cancer colorectal devra provoquer une diminution des émissions de gaz à effet de serre par le bétail tout en maintenant une bonne qualité organoleptique des viandes. La seconde stratégie (volet 2) devra permettre de proposer un levier de prévention nutritionnelle du risque de cancer colorectal défini sur la base d’une étude mécanistique innovante.

Procédures

Tous les prélèvements in vivo, sur rat vigile, se feront sans contention de l'animal (animal posé sur le bras ou maintenu dans la main). Les fèces à l’anus seront prélevées 1 fois à J21 pour des analyses du microbiote. Une crotte sera prélevée par rat. Ce prélèvement dure environ 1 à 3 min par rat. Pour les prélèvements des fèces et urines de 24 h séparées, les rats seront hébergés en cage à métabolisme maximum 48h en continues. Les prélèvements sont en fait des recueils dans des réceptacles sous la cage à métabolisme. Nous recueillons toutes la production de 24h en féces et en urine séparément, 2 fois, au bout de 24 et 48h. Les rats n’ont pas besoin d’être manipulés. Les rats seront également manipulés sans contention pour les identifié par tatouage à l'oreille (pince Aramis spécifique aux rongeurs avec une aiguille type insuline, encre spécifique pour rongeurs, un point par rat).

Impact sur les animaux

Le projet comporte un passage en cage à métabolisme pendant au maximum 72h ce qui peut générer du stress pour les animaux qui sont hébergés seuls.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin que le côlon soit prélevé pour analyses.

Remplacement

Les études sur digesteurs artificiels mimant le rumen des bovins ont permis de choisir les extraits végétaux antioxydants qui réduiront le plus les émissions de méthane par les bovins (amont du volet 1). Des études in vitro sur des cellules permettront de choisir les antioxydants les plus à même d’avoir un effet intéressant sur le dialogue entre les différents types cellulaires du côlon (volet 2). Ces études en amont de ce projet permettent de limiter le nombre d’animaux en testant beaucoup de molécules in vitro puis de ne tester que les plus pertinentes chez l'animal. Cependant, aucune étude in vitro ne permet d'évaluer les répercussions de ces composés antioxydants, sur la physiologie et le métabolisme d'un organisme entier. L'utilisation d'animaux permet d’examiner des atteintes dans les voies intestinales et coliques (inflammation, atteinte tissulaire). Seule une approche in vivo permet de prendre en compte la complexité de l'épithélium colique sur la physiologie intestinale et le rôle des antioxydants dans l'inflammation et l'apparition de dommages à l'ADN dans l'épithélium ainsi que les modifications possibles du microbiote intestinal.

Réduction

Dans l'objectif de réduire au strict minimum l'utilisation d'animaux de laboratoire, le nombre d'animaux a été limité au maximum à 10 animaux par lot. Pour ces études nutritionnelles de 22 jours, notre expérience et nos publications montrent qu'un nombre minimal de 10 animaux par lot est nécessaire pour une modulation des marqueurs biologiques analysés. Par exemple, un nombre de 10 animaux par lot suffit à obtenir des résultats significatifs sur un marqueur urinaire tel que le DHN-MA (composé issue de la dégradation physiologique d'un acide gras lors de l'oxydation des lipides). Afin d'obtenir des résultats interprétables et statistiquement fiables, et d'être dans des conditions expérimentales équivalentes, nous prévoyons d'utiliser le même nombre d'animaux dans ce projet, soit 10 rats par lot

Raffinement

Les conditions d'expérimentation font l'objet d'une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis et surveillés quotidiennement ou deux fois par jour lorsqu’ils passeront 48h dans une cage à métabolisme (animal isolé). La surveillance sera réalisée à l'aide d'une fiche de suivi sanitaire où sont listées et scorées différentes observations spécifiques au rat F344 utilisé dans cette étude. Cela concerne globalement le comportement alimentaire/social et l’état général. Si l'état sanitaire des animaux se révèle modérément modifié (exemple de score 2 : poils non toilettés, prise de poids modéré, …), la surveillance sera augmentée en conséquence (action préétablie à suivre). Si les observations montrent un état général ou un comportement classé sévère (exemple de score 3 : baisse de la prise de poids ou comportement non curieux) ou très sévère (exemple de score 4 = point limite : baisse du poids à 15% par rapport à la dernière mesure), alors le vétérinaire référent sera sollicité pour vérifier que l’action préétablie suffise (score 3) ou l’animal sera euthanasié et autopsié (score 4).

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que le rat Fisher F344 était un bon modèle pour étudier la modulation de la cancérogenèse colorectale associée à la consommation d’un régime riche en viande rouge. Les mâles sont privilégiés pour analyser le développement des pathologies à l’âge adulte afin d’éviter les effets hormonaux liés aux cycles de la femelle (observés sur l’inflammation et la cancérogenèse). Les études se feront sur des rats adultes. Ils seront âgés de 5 à 6 semaines à leur arrivée et leurs organes seront matures en particuliers ceux de l'appareil digestif. L'ensemble des études précédentes ont été menées sur des rats adultes du même âge dont la fonction digestive est totalement fonctionnelle. Afin de rester en accord avec les résultats précédents, il est important de rester au même stade de développement.

1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent par gavage quotidien des composés perturbateurs de la thyroïde, et leur descendance subit un test auditif par clic mécanique dès l'âge de dix jours ainsi qu'un test de retournement sur le dos. Les animaux sont ensuite tués pour prélever sang, foie, thyroïde et cerveau. Le porteur présente le projet comme un effort de mise au point de méthodes sans animaux, tout en affirmant que des données in vivo chez le rat restent "nécessaires" pour valider ces méthodes.

Objectifs

Les études conduites chez le rat, en parallèle d’essais sur cultures d’hépatocytes et de thyrocytes, auront pour objectifs d’augmenter la connaissance des mécanismes d’action notamment quantitativement de perturbateurs thyroïdiens, directs ou médiés par le foie, sur le neurodéveloppement. Le projet sera utilisé pour étudier précisément le mode d’action de produits déjà étudiés et référencés, connus dans la littérature, agissant comme perturbateurs thyroïdiens. Plusieurs types d’études seront conduites dans le cadre de ce projet. Ces études seront conduites chez la femelle gestante pour étudier l’effet toxique des produits sur la femelle et sur sa descendance. Ainsi trois types de procédures expérimentales sont détaillées : 1. Etudes préliminaires pour la validation des choix des doses et de choix de dose de toxicité du développement chez le rongeur gestant et juvénile. 2. Etudes définitives pour l’étude du développement neuronal et de la fonction de la thyroïde chez les rats femelles et leurs descendances exposés à des composés ayant une action de perturbation thyroïdienne lorsqu’ils sont administrés à une dose élevée unique à la mère pendant la période de gestation et de lactation (validation qualitative des évènements clefs impliqués dans le mode d’action de ces perturbateurs). 3. Etudes d’évaluation du développement neuronal et de la fonction de la thyroïde chez les rats femelles et leurs descendances lorsque les composés sont administrés à des doses croissantes pendant la période de gestation et de lactation (validation quantitative des seuils de dérégulations des évènements clefs impliqués dans le mode d’action de ces perturbateurs).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples : tout d'abord une meilleure connaissance phénotypique et moléculaire d’une altération du neurodéveloppement médié par une baisse d’hormones thyroïdiennes. D'autre part, une démonstration d’un effet dose et d’un effet seuil. Enfin, le but ultime du projet : la création d'un modèle mathématique capable de prédire à partir des résultats d'essais in vitro notamment sur hépatocytes la quantité de baisse d'hormones thyroïdiennes chez le rat et d'en déduire des possibles effets sur le développement cérébral.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures incluant: Un gavage journalier sur femelles adultes vigiles, se faisant en 15 secondes environ, tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l'âge des animaux. Afin d’évaluer si le développement des petits est normal: les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours pour tester le développement du système auditif, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus seront modérés car aux doses testées des 2 produits de référence connus, peu d’effets cliniques sont attendus. Les femelles gestantes sont hébergées individuellement pendant la gestation (14 jours), ce qui peut induire un stress léger. Afin d’évaluer si le développement est normal: pour le système auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner. La nuisance engendrée est un stress léger car les tests sont peu invasifs et non douloureux. Les produits sont administrés une fois par jour par gavage aux mères (procédure inférieure à 15 sec). Cette procédure à l’aide de sonde souple n’est pas douloureuse mais peut induire un stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à morts afin de prélever du sang et des organes (foie, thyroïde et cerveau) qui seront utilisés pour de multiples analyses (dosage d'hormones, évaluation histopathologique et moléculaire notamment).

Remplacement

Le projet s’inscrit totalement dans le R de Remplacement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet a justement pour objectif la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) pour remplacer les études utilisant des animaux par des méthodes de culture cellulaire (ici hépatocytes et thyrocytes, 2D et 3D) combinées à des méthodes informatiques (in silico). Elles permettront de prédire l’effet sur les hormones thyroïdiennes en fonction de l’impact des produits sur les enzymes hépatiques mesurées in vitro et sans recourir à l’animal. Pour valider ces nouvelles méthodes et cette extrapolation entre méthodes in vitro et méthodes in vivo, des données sont nécessaires in vitro mais aussi in vivo chez le rat que concernent cette demande d’autorisation de projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire et suffisant pour répondre de manière robuste aux questions posées. Les études seront conduites de manière séquentielle avec un nombre d’animaux croissants. Ainsi la première étude se fait avec un nombre d’animaux par groupe réduit (4) pour valider le choix des doses et les techniques moléculaires innovantes. Par la suite le nombre d’animaux est augmenté pour avoir une puissance statistique suffisante concernant les paramètres étudiés. Ce projet participe à l'effort de mise en place et de validation de méthodes alternatives pour réduire globalement le nombre d’animaux utilisés en Toxicologie. En effet, l’objectif est de promouvoir les produits au profil le plus favorable et le moins risqué dans les phases avancés (celles qui nécessitent toujours l’utilisation d’animaux d’un point de vue réglementaire), en testant d’abord les produits à travers ces nouvelles méthodes alternatives. De ce fait, un nombre plus restreint de produits resteront à être testés chez l’animal et avec de plus grandes chances de donner des résultats favorables, ce qui réduirait de facto le nombre d’études nécessaires et donc d’animaux.

Raffinement

Les paramètres étudiés sont beaucoup plus nombreux que ceux classiquement testés dans les lignes directrices de l’OCDE, notamment en incluant des biomarqueurs moléculaires au niveau cérébral, comme des spatial OMICs, ce qui permet d’obtenir un plus grand nombre d’informations pour le projet. Ces études sont réalisées avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo- thyroïdien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal. Dans ces études les animaux sont hébergés dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance ou leur bien-être. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal.

Choix des espèces

Le rat est le modèle de référence en toxicologie. On s'appuie sur des données scientifiques publiées chez le rat. Les mécanismes de développement du système neurologique du rongeur sont souvent similaires à ceux de l’homme et, ainsi, les données générées chez le rongeur peuvent être extrapolées à l’homme. Ces études seront conduites chez la femelle gestante et allaitante et sa descendance. En effet, la fenêtre d’exposition encadrant la naissance jusqu’à la fin de la lactation a été montrée comme étant la plus sensible aux traitements pouvant impacter le neurodéveloppement.

Une partie des 134 souris de ce projet porte la mutation d'un gène que l'équipe soupçonne d'être en cause dans le syndrome de Hermansky-Pudlak, une maladie rare qui associe albinisme et tendance aux hémorragies, et risque de saigner longtemps à chaque prise de sang. Mutantes et témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour deux prises de sang sans anesthésie, à 6 et 8 semaines, un groupe étant aussi étudié à 7 mois sans que les actes prévus à cet âge soient décrits. Le porteur juge la souris "indispensable et nécessaire" pour étudier ce gène "à l'échelle de l'organisme entier". Toutes doivent ensuite être transférées dans le laboratoire d'un collaborateur pour compléter l'étude immunologique, sans que le porteur précise ce qu'elles y subiront ni leur sort final.

Objectifs

L’étude des maladies rares d’origine génétique permet aujourd’hui de décrire les gènes, des protéines et des mécanismes biologiques fondamentaux pour la compréhension du vivant et celle de maladie plus fréquente. Nous avons identifié chez des patients atteints du syndrome de Hermansky-Pudlak (SHP) qui est une maladie multisystémique caractérisé par un albinisme oculo-cutané et un terrain hémorragique. Une mutation d'un gène qui pourrait être à l’origine du déficit immunitaire global ainsi que d’anomalies sanguines principalement thrombopénie (déficit des plaquettes) avec des dysfonctionnements de la fonction plaquettaire. Notre projet et l’étude de la modification de ce gène impliqué dans la pathologie complexe observée chez les patients, grâce au modèle de souris portant la mutation de notre gène d'intêret. Plus précisément, nous souhaiterions étudier les paramètres hématologiques et particulièrement les plaquettes et leur physiologie. Pour cela des prélèvements de sang seront réalisés chez des souris contrôles et mutantes, afin d’être analysés. Au total 134 souris seront nécessaires pour valider notre question biologique et obtenir des résultats statistiquement valides.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet et l'étude de systeme immunitaire et la fonction plaquettaire dans le cadre d'une maladie rare le syndrome de Hermansky-Pudlak , nous souhaiterons comprendre les mecanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur la thrombopenie (deficite plaquettaire)

Procédures

Les souris seront soumises à 2 prelevements sanguins (vigiles) à l'age de 6 et 8 semaines. Nous avons également un groupe de 7 mois.

Impact sur les animaux

Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction plaquettaire et de la thrombopénie, un risque de saignement prolongé au moment de la prise de sang pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes.

Devenir

Tous les animaux seront transferés dans le laboratoire de notre collaborateur pour completer l'étude immunologique.

Remplacement

Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et est étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal (souris) reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en gardant s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Etant donné le manque de donnée concernant cette nouvelle lignée, l’analyse de puissance sera revue en fonction des données générées. En effet, en fonction du phénotype observé, on pourrait être amené à réduire le nombre d'animaux tout en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Un maximum de 134 souris sera nécessaire. Le test statistique utilisés sera student-test (comparaison des mutants Vs contrôles). Comme on s'attend à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, nous utiliserons pour chaque série l'un des 2 sexes (selon la production), ce qui éviterait de dédoubler les effectifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation et son euthanasie. Les animaux seront observés toutes les semaines avec une grille de suivi du bien-être, en plus du suivi quotidien habituel. Afin d’éviter toute perte de sang excessive (hémorragie), le site de ponction sera comprimé avec un hémostatique local afin d’atteindre l’hémostase.

Choix des espèces

Le modèle souris est très pertinent et est necessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intêret à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystemique ; de plus, le modèle de souris est très étudié et largement utlisé pour analyser la fonction plaquettaire. Les animaux seront étudiées à l'âge de 6 et 8 semaines à fin d'étudier les 2 stades avant l'age adulte et à l'age adulte. Nous avons également un groupe de souirs de 7 mois afin comparer l'effet de l’âge dans ce groupe.

Un dispositif de contention fixé sur le crâne lors d'une chirurgie d'une heure au plus permet ensuite de faire tourner 110 rates pour enregistrer leurs mouvements oculaires. 242 rates Long Evans vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 140 enfermées 6 heures par jour, cinq jours de suite, pendant une ou quatre semaines, dans des enceintes où elles respirent du styrène ou des isomères du xylène, et 80 témoins à l'air filtré, puis toutes tuées par perfusion intracardiaque pour l'histologie de l'oreille interne. Aux concentrations élevées, le porteur prévoit un effet dépresseur sur le système nerveux central et des effets narcotiques, qui ne devraient pas persister plus d'une heure après la sortie des enceintes. L'étude doit confirmer une toxicité pour l'équilibre suggérée in vitro sur des cultures d'organes issus de rats nouveau-nés. Le porteur annonce aussi deux tests comportementaux de l'équilibre, passés trois fois par 110 rates, sans les nommer.

Objectifs

Cette étude qui consiste à comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux localisés au niveau de l’oreille interne apportera pour la première fois des données sur la dangerosité éventuelle des solvants sur l’équilibre au niveau périphérique. Par ailleurs, cette étude permettra de valider des données obtenues in vitro suggérant un potentiel effet toxique de certains solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre et permettra de proposer ce test comme test de criblage.Cette étude qui consiste à comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux localisés au niveau de l’oreille interne apportera pour la première fois des données sur la dangerosité éventuelle des solvants sur l’équilibre au niveau périphérique. Par ailleurs, cette étude permettra de valider des données obtenues in vitro suggérant un potentiel effet toxique de certains solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre et permettra de proposer ce test comme test de criblage.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de valider des résultats obtenus précédemment avec un test in vitro obtenu à partir de cultures d’organes récepteurs de l’équilibre de rats nouveau-nés et exposées aux mêmes solvants. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro alors ce test pourra être proposé comme test de criblage afin d’identifier les produits industriels rencontrés par les salariés lors d’exposition professionnelles et susceptibles perturber l’équilibre. Par ailleurs, cette étude permettra de comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux situés dans l’oreille interne et apportera des informations nouvelles sur la toxicité potentielle des solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre, sujet non traité dans la littérature jusqu’alors.

Procédures

Chirurgie crânienne: 110 rates sont équipées d’un dispositif de contention sur le crâne, pour enregistrer le mouvement oculaire (nystagmus post-rotatoire) après stimulation du système vestibulaire par mise en rotation de l’animal. Cette intervention chirurgicale est réalisée sous anesthésie gazeuse et n’excède pas une heure par animal. Elle est réalisée 1 seule fois. Mesures du nystagmus post-rotatoire : Ces mesures sont effectuées sur les 110 rates ayant subi une chirurgie. Elles sont réalisées avant exposition par inhalation au solvant ou à l’air filtré (T0), après une semaine d’exposition (T1) et après 4 semaines de récupération (T2). Ces mesures nécessitent une mise en contention. Cette procédure ne dure pas plus de à 10 minutes par rate. Tests comportementaux : A T0, T1 et T2, 110 rates sont soumises à 2 tests comportementaux permettant une mesure de la fonction vestibulaire. Moins de 10 minutes sont requises pour effectuer ces tests. Une fois effectués, les rates sont soumises aux mesures des produits de distorsion acoustique. Mesure des produits de distorsion acoustique : 110 rates sont soumises à une anesthésie médicamenteuse légère pour enregistrer les produits de distorsion acoustique après avoir placé une sonde au niveau de l’oreille. Ces mesures sont effectuées à T0, T1 et T2. Quinze minutes par rate sont nécessaires. Exposition par inhalation au solvant ou à l’air filtré dans des enceintes d’inhalation : Les rates sont disposées dans des enceintes 6 heures/jour pendant 5 jours consécutifs durant 1 semaine voire 4 semaines (4 x 5 jours) et sont exposées soit aux solvants (140 rates) soit à de l’air filtré (80 rates). Prélèvement sanguin à la veine caudale : 56 rates sont soumises à un prélèvement sanguin à la veine caudale sous anesthésie gazeuse. Le prélèvement est réalisé 1 seule fois à l’issue de l’exposition au solvant ou à l’air filtré. La procédure ne dure pas plus de 5 minutes par animal. Au terme des expérimentations, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque pour réaliser l’histologie de l’oreille interne.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études expérimentales (rat, cobaye) mais aussi par des études épidémiologiques en entreprise. A l’inverse, les effets de ces substances sur le vestibule, qui partage de nombreuses similitudes avec la cochlée, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture d’explants vestibulaires, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. L’étude in vivo se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène (ortho, méta et para) par voie inhalatoire 6 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 5 jours (ou 4 semaines à raison de 5 jours par semaine). L’évaluation de la toxicité se fera par le biais de mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui devront permettre une comparaison fiable et objective des effets cochléotoxiques et vestibulotoxiques. Ces techniques auront été préalablement validées et calibrées à l’aide d’une molécule, l’iminodipropionitrile, reconnue être à la fois cochléo-et vestibulotoxique. Cette pré-étude a fait l’objet d’une demande d’autorisation de projet. Les méthodes utilisées dans le cadre de cette étude évaluent les fonctionnements physiologiques de ces deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être testées que sur des organismes vivants. Ces tests sont des mesures de produits de distorsion acoustique pour l'audition et la mesure du nystagmus post-rotatoire ainsi que des tests comportementaux pour l'équilibre. Des analyses histologiques seront également réalisées. D’autre part, pour évaluer la toxicité de ces agents chimiques, il est nécessaire que ces derniers soient métabolisés par des organismes vivants.

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures du nystagmus-post rotatoire ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure du nystagmus-post rotatoire et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie, surface des cages). Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de respecter leur rythme. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage. Seuls les animaux ayant subi une intervention chirurgicale, afin de les équiper d’un dispositif de contention, seront hébergés seuls pendant une semaine afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Selon les procédures du projet, les animaux seront habitués à leur nouvel environnement et à être manipulés. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignés à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle sélectionné dans les lignes directrices de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les cytochromes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.