Rongeurs
Etude de l’efficacité d’un composé anti-obésité en développement chez la souris rendue obèse par une alimentation riche en graisse en thermoneutralité
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime à 60 % de graisses puis hébergées seules à thermoneutralité, elles reçoivent chaque jour un composé par voie orale et subissent pesées, mises à jeun, prélèvements sanguins et test de tolérance au glucose, avant ponction cardiaque sous anesthésie et dislocation cervicale. Le porteur mène cette étude pour un laboratoire pharmaceutique client afin de confirmer qu'un composé réduit le poids et la prise alimentaire. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et le métabolisme.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'un de ces composés induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant démarrage du traitement. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre de proposer une solution thérapeutique pour les personnes atteintes d'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de part leur phénotype - un hébergement individuel sur toute l'étude - une administration orale quotidienne à partir de D-11 - une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - une mise à jeûn de 4h + un prélèvement sanguin à la queue à D-6 et D57 - une prise alimentaire et une pesée trois fois par semaine à partir de D1 - une analyse de leur composition corporelle à D29 - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) à D57 [Mise à jeun pendant 16h, Prélèvements sanguins (2 goutte) 0, 15, 30, 60 et 120min aprés administration du glucose]. De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance.
Impact sur les animaux
La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Les animaux seront pesés régulièrement afin d'administrer le bon volume de véhicule ou de traitement. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 16h), une analyse de la composition corporelle et une mise à jeun de 4h avant euthanasie sont prévus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète de ce composé.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisément l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de briquettes en bois. Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés avant la dislocation cervicale. Les animaux de la procédure 1 seront euthanasiés par surdose d’anesthésique puis par dislocation cervicale. L'autre partie des animaux seront anesthésiés, puis, une fois la ponction cardiaque réalisée, une dislocation cervicale sera réalisée avant tout prélèvement post mortem. Dans cette deuxième procédure, la ponction cardiaque n'est pas une méthode de mise à mort règlementaire. Toutefois, l'étude nécessite un volume important de sang pour des analyses ultérieures. Après la ponction cardiaque réalisée sous anesthésie, une deuxième méthode de mise à mort de l'animal (celle-ci règlementaire) par dislocation cervicale sera réalisée avant les prélèvements d'organes post mortem pour des analyses ultérieures. Enfin, en cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique sera administré. Si aucune amélioration n'est constatée passé un certain délai, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Etude de la signalisation insulinique cérébrale dans un modèle animal diabétique : le rat Goto Kakizaki
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Diabétiques de la lignée Goto-Kakizaki ou témoins Wistar, ils subissent une chirurgie stéréotaxique unique pour injecter de l'insuline ou son véhicule dans un ventricule cérébral, restent quinze minutes sous isoflurane puis sont mis à mort aussitôt. Le porteur décrit une craniotomie sous anesthésie locale et analgésie, et affirme n'attendre "pas" de souffrance liée à la procédure. Il présente le rat GK comme un modèle de diabète de type 2 "impossible" à remplacer par des systèmes in vitro ou in silico pour étudier la réponse à l'insuline.
Objectifs
Le diabète de type 2 est une pathologie due à l'altération du métabolisme glucidique et dont la prévalence mondiale augmente de façon alarmante. Il est caractérisé par une hyperglycémie chronique due à un défaut de sécrétion d'insuline par les cellule beta du pancréas et à une résistance à l'action de cette hormone au niveau de ses tissus cibles périphériques : le muscle, le foie et le tissu adipeux. L'objectif de notre projet est d'élucider, dans un modèle animal de diabète de type 2 le rat GK , si la résistance à l’insuline est aussi présente dans le cerveau. Pour cela nous allons étudier dans cet organe les mécanismes moléculaires de la signalisation de l'insuline suite à une administration d'insuline ou de sérum physiologique ( véhicule) par injection stéreotaxique dans le ventricule latéral du cerveau. Pour cette étude, qui portera sur les animaux des deux sexes, 40 rats diabétiques GK et 40 rats Wistar sains seront nécessaires.
Bénéfices attendus
Le diabète est associé à de nombreuses comorbidités, dont des troubles neurocognitifs tels que la maladie d’Alzheimer. Dans la littérature, une altération de la signalisation insulinique dans le cerveau est proposée comme un mécanisme participant au développement des maladies neurodégénératives. Ainsi, en recherchant dans ce projet si le rat diabétique GK possède une insulinorésistance en central comme en périphérie, il serait intéressant d’agir sur ce mécanisme en thérapeutique d’autant plus qu’il n’existe toujours pas de traitement curatif pour le diabète et les maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux vont subir une chirurgie unique par stéréotaxie afin d' injecter dans le ventricule latéral une solution d'insuline ou de son véhicule . Cette opération dure 20 minutes. A la fin de l'injection, une petite goutte de sang de 10 microL, obtenue à l'extrémité de la queue en piquant avec une petite aiguille 26G, est prélevée pour contrôler la glycémie.
Impact sur les animaux
Les animaux sont anesthésiés à l'isoflurane, la tête est fixée sur un cadre stéréotaxique, le crâne est desinfecté et rasé , une incision longitudinale de la peau du crâne est effectuée à l’aide d’un ciseau fin. L’os du crâne est perforé à l’aide d’une fraise. Le volume injecté grâce à une seringue hamilton munie d'une aiguille 26G est de 5 μL à un débit de 1 μL/minute pendant 5 minutes. Il n'est pas attendu de souffrance dans le cadre de la procédure chirurgicale, nous procédons à une injection en sous cutané d'anesthésique local composée de lidocaïne (2%) diluée à 0.5% (à la dose de 7mg/kg) associée à un analgésique la Buprénorphine à la dose de 0,01mg/kg 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la procédure, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Nous surveillons les paramètres vitaux, la respiration, le pouls et la température corporelle.
Devenir
Il n'y a qu'une seule procédure dans ce projet. Après l'injection stéréotaxique dans le cerveau, les 80 rats restent sous anesthésie à l'isoflurane pendant les 15 minutes nécessaires à l'action de l'insuline puis sont immédiatement mis à mort.
Remplacement
L’étude de la réponse à l’administration de l'insuline ne peut être réalisée que sur animaux vivants et l’avantage du rat GK réside dans le fait que c’est un modèle de DT2 sans manipulation génétique et mimant la chronologie d’évolution du diabète humain. Ainsi, sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant au mieux la différence entre les groupes .En fonction de la procédure expérimentale, des variables étudiées et du nombre d’effectifs, nous utiliserons principalement des tests paramétriques, et si nécessaire des tests non paramétriques.
Raffinement
Pendant la procédure la respiration, l'obstruction des voies respiratoires, le pouls et la température corporelle seront surveillés. Afin de raffiner la procédure et réduire au mieux l’apparition éventuelle de douleur, nous prendrons toutes les précautions nécessaires (Une injection en sous cutané d'anesthésique local composée de lidocaïne (2%) diluée à 0.5% (à la dose de 7mg/kg) associée à un analgésique la Buprénorphine à la dose de 0,01mg/kg, sera effectuée 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la procédure, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Le choix du protocole expérimental impliquant les 8 groupes d'animaux, nous permet d'assurer une fiabilité à cette étude.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes mâles et femelles de 4 mois, ce qui nous garantit aussi une stabilisation du diabète chez les GK.
Etude du rôle du métabolisme et du transport du lactate dans le micro-environnement tumoral du glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
3 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 3 120 individus étant classés en sévère. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques pour implanter virus et cellules de glioblastome, une résection tumorale, des cycles d'injections de témozolomide et de tamoxifène, ainsi que deux irradiations et des prélèvements sanguins réguliers. Le porteur indique que la tumeur cérébrale, la chirurgie et les traitements peuvent provoquer douleurs, perte de poids, désorientation et déséquilibre, la mise à mort intervenant à l'atteinte d'un point limite. Il reconnaît disposer de co-cultures et d'organoïdes mais les juge "simplistes" et affirme qu'un modèle in vivo est "nécessaire" pour le microenvironnement tumoral.
Objectifs
Le glioblastome (GB) est la tumeur cérébrale la plus commune et agressive chez l’adulte. Les patients atteints de GB subissent généralement une résection chirurgicale pour éliminer autant que possible la tumeur cérébrale. Après la chirurgie, dans le but d’éliminer les cellules cancéreuses restantes, une radiothérapie et une chimiothérapie sont administrées aux patients. Malheureusement, ce traitement standard actuel n'empêche pas la tumeur de récidiver. Même après élimination de la majorité de la masse tumorale, quelques cellules restantes se multiplient et se régénèrent dans une autre partie du cerveau où la chirurgie n'est plus possible. Le métabolisme cellulaire, qui permet de fournir de l’énergie aux cellules, a un impact significatif dans la progression du cancer, ainsi que dans la résistance thérapeutique des tumeurs. Cibler le métabolisme représente donc une stratégie pour éliminer les cellules cancéreuses. Notre objectif est de comprendre les échanges métaboliques entre les cellules du GB et les cellules du micro-environnement. En utilisant des modèles animaux dont certains types cellulaires (neurones, cellules immunitaires) sont dépourvus de gènes impliqués dans le métabolisme, nous étudierons l’impact du métabolisme des cellules du micro-environnement dans la croissance et l’invasion tumorale. Nous appliquerons également le protocole standard utilisé pour les patients atteints de GB (résection, rayonnements ionisants et chimiothérapie) pour évaluer le bénéfice de combiner le traitement actuel avec l’inhibition du métabolisme dans le micro-environnement tumoral.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra i) de mieux comprendre le rôle du métabolisme dans le micro-environnement tumoral et son impact sur la progression tumorale et l’invasion ; ii) de caractériser les échanges métaboliques entre les cellules du glioblastome et leur micro-environnement ; iii) d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, notre étude pourra offrir la possibilité de mettre en place, couplée au traitement actuel standard utilisé pour traiter le glioblastome, de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant le métabolisme des cellules tumorales, mais également celui des cellules du micro-environnement, afin de freiner la progression tumorale et l’invasion des tumeurs de glioblastome dans des zones où la chirurgie n’est plus possible, et par conséquent d’améliorer la survie des patients.
Procédures
- Les animaux seront soumis à des chirurgies stéréotaxiques pour implanter des virus. Les chirurgies stéréotaxiques sont des procédures qui durent environ 25 minutes et seront réalisées une fois. - Les animaux seront soumis à des chirurgies stéréotaxiques pour implanter des cellules de glioblastome. Les chirurgies stéréotaxiques sont des procédures qui durent environ 25 minutes et seront réalisées une fois. - Les animaux seront soumis à une résection tumorale. Cette chirurgie dure 30 minutes et sera réalisé une fois. - Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales de Témozolomide chaque jour pendant 5 jours, après 2 jours de repos un nouveau cycle de 5 jours de traitement sera réalisé. Les cycles de traitement seront répétés sur une durée de 28 jours. L'injection dure moins d'1 minute par souris. - Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales de Tamoxifène chaque jour pendant 5 jours. L'injection dure moins d'1 minute par souris. - Les souris seront soumises à des rayonnements ionisants 2 fois à 4 jours d'intervalle. Cela dure 5 minutes par souris. - Les souris seront soumises à des prises de sang chaque 15 jours. Cela dure 5 minutes par souris.
Impact sur les animaux
L'irradiation et le Témozolomide peuvent induire des symptômes ressemblant à l'anxiété, des troubles de la mémoire spatiale et d'apprentissage chez la souris. Une perte de poids peut être observé après irradiations. Une perte de la pigmentation peut également être observé après l’irradiation, les poils des souris C57BL/6 peuvent devenir gris après l’irradiation. Une irritation au point d’injection peut être observé après le traitement de TMZ par IP. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgie à l’issue des stéréotaxies (injection des cellules de glioblastome, résection tumorale et injection des virus). Le développement de tumeurs cérébrales, l’injection du virus ainsi que la résection peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, déséquilibre).
Devenir
Suite à la génération des mignées de souris KO, les animaux seront utilisés pour l'implantation de cellules de glioblastome pour analyser leur survie et la tumorigenèse. Tous les animaux seront mis à mort dès l'atteinte d'un point limite.
Remplacement
Nous avons isolé des cellules de glioblastome de type souche à partir de tumeurs de différents patients. Nous avons obtenu des données robustes en utilisant ces modèles in vitro pour supporter l’hypothèse que le lactate a un rôle clé dans la prolifération et l’invasion des cellules de glioblastome. Nous souhaitons maintenant connaître son rôle dans le micro environnement. Nous avons établi des cultures de neurones corticaux de souris et nous les avons mises en co-culture avec des cellules de glioblastome isolées de patients, pour étudier le rôle des neurones dans la prolifération et l’invasion des cellules de glioblastome. Ce modèle de co-culture nous a permis de voir que les neurones favorisaient la prolifération cellulaire et l’invasion des cellules de glioblastome. Cependant, ce modèle est très simpliste et ne reflète pas la complexité du cerveau et de son micro environnement. Bien que des modèles d’organoïdes soient développés, ces modèles ne sont également pas parfaits. En effet, les composants immunitaires dans les cultures organoïdes qui ne peuvent être maintenus que pendant une courte période. Le manque de cellules endothéliales et de système vasculaire tumoral est également un problème majeur qui limite l'utilité des organoïdes des tumeurs cérébrales, car le système microvasculaire est un composant majeur de l'environnement tumoral, ce qui peut affecter la croissance des cellules tumorales et l'effet immunitaire antitumoral. Il est donc nécessaire que nous passions maintenant à un modèle in vivo, pour étudier le rôle du lactate dans le micro environnement tumoral du glioblastome.
Réduction
Une manip pilote avec un petit groupe d'animaux est tout d'abord réalisé pour définir les meilleures conditions d’implantation (coordonnées stéréotaxiques) pour l’injection des virus. Nous avons mis en place des stratégies pour réduire le nombre de souris en utilisant le même groupe de souris pour obtenir plusieurs résultats. Par exemple, l'imagerie bioluminescente est une méthode non invasive qui nous permet suivre la progression de la tumeur dans le temps tandis que les mêmes souris peuvent être maintenues pour générer les courbes de survie ou bien pour les analyses immunohistochimiques. Le même groupe de souris sera utilisé pour évaluer la survie et pour les prélèvements sanguins pour analyser les métabolites présents dans le sang.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d’un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre d’explorer, de jouer et de ronger. Ces cages offrent aux animaux un espace important pour se redresser. Les chirugies (implantation des cellules, virus et résection) se déroulent sur animaux anesthésiés. Les animaux sont placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Des analgésiques sont donnés avant la chirurgie. L'incision de la peau de la tête se fait suite à une anesthésie locale. Les animaux ont du gel ophtalmique avant la chirurgie afin de réduire la sécheresse oculaire. Une injection de saline est réalisée pour éviter une déshydratation de l’animal. En cas de perte de poids par rapport au poids initial, du nursing sera mis place. Postopération (résection), un analgésique est administré 2 fois par jours pendant les 72h suivant l’opération. Du geldiet est déposé dans le fond de la cage pour prévenir de la perte de poids. Pour le suivi de la croissance tumorale, les souris seront anesthésiées pour mesurer la bioluminescence. Du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux pour éviter un dessèchement de la cornée. Les souris sont réchauffées grâce à une plaque chauffante à 37°C placée dans l’imageur. Lors de la session d’IR, du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux pour éviter un dessèchement de la cornée. Une injection de saline est réalisée en sous-cutané pour éviter une déshydratation de l’animal. Du geldiet est mis dans le fond de la cage pour palier au possible perte de poids suite aux IR. Une irritation au point d’injection peut être observé après les injections IP (TMZ, Tamoxifène) répétées. Les souris sont massées au niveau du point d’injection. Suite à la prise de sang, une injection de saline est réalisée. Les animaux sont surveillés quotidiennement pour détecter l’apparition d’éventuels effets secondaires. Des points limites sont définis.
Choix des espèces
Des souris immuno compétentes recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine murine. Ce modèle nous permet d’étudier le rôle du micro-environnement dans le développement tumoral. Des souris immunodéprimées recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine humaine. Ces souris permettent d'implanter des cellules humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. Le laboratoire a une grande expérience d'implantation de cellules de glioblastome dans ces modèles et nous avons l'habitude du développement du glioblastome dans ces souris. Les tumeurs se développent de manière très reproductible dans ces modèles, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences. De plus, ces modèles sont idéaux d'un point de vue préclinique, car nous reproduisons grâce aux cellules de type souche des caractéristiques complexes observées chez les patients humains. Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines pour les injections de cellules tumorales pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés. Les KO seront induits 2 semaines avant l'implantation des cellules de glioblastome, nous utiliserons donc des souris de 5 à 7 semaines pour l'injection de tamoxifène. Les KO Mct2 dans les neurones seront induits 2 semaines avant l'implantation des cellules de glioblastome, nous utiliserons des souris de 5 à 7 semaines pour l'implantation des virus. Le délai de 2 semaines entre ces 2 procédures (injection de tamoxifène ou de virus) et l'implantation des cellules de glioblastome, a été choisi pour permettre de laisser le temps au KO de se faire dans les cellules, et aux souris de récupérer de ces procédures avant la chirurgie.
Comprendre le rôle du CD36 intestinal dans l’apparition des maladies métaboliques et de l’inflammation associée : utilisation de « faux lipides » bio-sourcés et dérivés d’acides gras naturels.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée va du sans réveil au modéré, 128 individus étant menés sans réveil. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer le récepteur CD36 intestinal, elles reçoivent par gavage des agonistes et de l'huile après une mise à jeun de douze heures, avant prélèvement sanguin sous anesthésie et mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur cherche à établir le rôle du CD36 intestinal dans l'obésité et présente ce récepteur comme une éventuelle cible thérapeutique. Il affirme le remplacement "impossible" au motif que l'étude met en jeu plusieurs organes.
Objectifs
L’obésité est associée à une inflammation de faible intensité ainsi qu’aux maladies cardiovasculaires et au diabète. L’obésité peut notamment s’expliquer par une consommation excessive de lipides. L’intestin et plus précisément le récepteur CD36 intestinal pourrait jouer un rôle central dans le développement de l’obésité et de l’inflammation associée. Une consommation excessive de lipides pourrait, via le dysfonctionnement de CD36, altérer les paramètres postprandiaux associés à l’obésité. Ces données ont été obtenues chez des souris totalement déficientes en CD36. La contribution physiologique spécifique de CD36 intestinal n’a donc pas été prouvée. De plus, les voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation de CD36 n’ont pas encore complètement été identifiées. Ce projet a donc un objectif double : 1) Évaluer la contribution effective du CD36 intestinal dans les perturbations physiologiques associées au développement de l'obésité. 2) Comprendre le fonctionnement du récepteur CD36 au niveau intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires induites par son activation. Pour ce projet, nous utiliserons des souris wild-type et génétiquement modifiées, n’exprimant pas le récepteur CD36 spécifiquement au niveau intestinal, et des souris contrôles correspondantes, exprimant le récepteur CD36 au niveau intestinal. Nous utiliserons des molécules ciblant CD36. Ce sont des molécules dérivées d’acides gras naturels et ayant la caractéristique d’activer spécifiquement le récepteur CD36. Nous disposons de deux agonistes différents pour réaliser ces expériences (nommé A et B pour des raisons de confidentialité). Si nos hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait être une cible thérapeutique pour limiter l’obésité.
Bénéfices attendus
Si les hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait in fine être une cible thérapeutique et/ou nutritionnelle dans le traitement des pathologies liées à un excès de lipides, comme l’obésité, le diabète de type 2 ou encore les maladies cardiovasculaires. L’identification des voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation du récepteur CD36 permettrait de mieux comprendre le fonctionnement de ce récepteur, ses impacts physiologiques et donc de faciliter une potentielle utilisation de ce récepteur comme une cible thérapeutique. De plus, si les agonistes montrent des effets bénéfiques sur les paramètres postprandiaux alors ils pourraient eux aussi être très utilisés comme éventuelle molécules thérapeutiques pour optimiser l’absorption intestinale des lipides, réduire l’hypertriglycéridémie postprandiale, réduire l’endotoxémie postprandiale et donc l’inflammation au sens large. Ces agonistes pourraient donc, via le récepteur CD36, permettre de lutter contre l’épidémie inquiétante d’obésité et des maladies associées.
Procédures
L’administration des agonistes et de l’huile se fait par voie orale (gavage). Chaque souris est gavée une ou deux fois. C’est un geste légèrement invasif mais indolore qui ne dure pas plus de 4 ou 5 secondes. La souris est de suite reposée dans sa cage de vie. Les souris sont ensuite anesthésiées pour prélèvement sanguin( 30 secondes maximum), puis euthanasiées par dislocation cervicale, sous anesthésie, pour réaliser des prélèvements de tissus d’intérêt.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 12 heures ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Celui-ci est diminué par le fait que pendant cette période les souris sont laissées dans leur cage avec un enrichissement supplémentaire de leur mileu de vie (frisons en carton, petits abris en carton ou en plastique).
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure. Pour la procédure 1 nous avons besoin de récupérer du sang et des tissus pour réaliser des dosages plasmatiques et des mesures d’expression protéique/génique tissulaire. Pour la procédure 2, nous travaillons sur des segments isolés d’intestin, nous avons donc besoin de prélever l’intestin et donc d’euthanasier les souris au cours de la procédure.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques, sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.
Développement chez la souris d’une nouvelle méthode contraceptive non hormonale
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Pour tester une contraception sans hormone, des femelles reçoivent dans le vagin un ovule chargé de lyral, une molécule odorante censée perturber l'orientation des spermatozoïdes, avant d'être mises à l'accouplement. 640 souris Swiss CD1, choisies parce que leurs portées dépassent souvent dix souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une même femelle pouvant recevoir l'ovule jusqu'à trois fois, tenue dans la paume une trentaine de secondes. Le lyral étant allergisant, les souris sont observées chaque jour pendant deux à trois semaines, et celles qui feraient une réaction allergique seraient retirées de l'expérience et mises à mort par dislocation cervicale ou au CO2. Après chaque accouplement, les adultes retournent dans le pool pour d'autres accouplements et les souriceaux nés sont mis à mort immédiatement, sans que le résumé dise ce que deviennent les adultes à la fin du projet.
Objectifs
La contraception bénéficie de nombreuses méthodes. La pilule à base d'hormones qui est l'une des méthodes les plus utilisées dans notre société souffre à tort ou à raison d'une suspicion quant aux effets négatifs que l'usage répété d'hormone pourrait engendrer. Les travaux de recherche sur les récepteurs olfactifs (OR) capables de reconnaître des molécules odorantes, ont montré qu'un certain nombre d'entre eux étaient présents à la surface des spermatozoïdes de plusieurs mammifères dont l'homme et la souris. Par ailleurs il a été montré que le bourgeonal, l’un des ligands de hOR 17-4, OR exprimé à la surface des spermatozoïdes humains modifiait in vitro le chimiotactisme de ceux-ci. En parallèle, il a été montré que le récepteur olfactif MOR23 était présent à la surface des spermatozoïdes de souris et que le lyral modifiait lui aussi in vitro le leur chimiotactisme Suite à ces travaux, nous avons cherché à savoir si in vivo l'addition de lyral dans le vagin des souris modifierait leur chimiotactisme. Pour cela, nous avons émis l’hypothèse qu’une surcharge de lyral dans le vagin de souris serait de nature à perturber la reconnaissance d’un ligand naturel à découvrir et limiterait la fécondation de l'œuf. Dans une série d’expériences préliminaires nous avons de fait observé que l’introduction de lyral liquide à 0.04% (40 microlitres, 10-5 M) dans le vagin de souris perturbait la procréation : Ainsi, la copulation de 31 couples de souris SWISS CD1, n’a donné naissance qu’à 176 souriceaux (13 femelles n’ayant eu aucune progéniture) alors que tous les couples témoins (n=31) ont été productifs et amené à la naissance de 372 souriceaux (résultats non publiés). A partir de ces résultats, statistiquement significatif (test de Fischer), nous avons émis l'hypothèse qu'une molécule odorante introduite dans le vagin par un ovule pourrait être la source du développement d'une nouvelle méthode contraceptive non hormonale. Le présent projet a pour but de tester cette possibilité, ainsi le mode de l'utilisation via un ovule.
Bénéfices attendus
Les conséquences et bénéfices attendus sont à deux niveaux le premier dans le cadre de la pratique médicale, le second sur le plan de la recherche fondamentale. 1) Si le lyral introduit dans le vagin à l’aide d’un ovule diminue nettement la procréation, comme observé précédemment chez les souris ayant reçu du lyral liquide il est prévu de faire des essais cliniques d'utilisation d'ovules chargés d'un odorant reconnu par les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes humains, dans le but de développer une nouvelle méthode contraceptive sans hormone. 2) Sur le plan de la recherche fondamentale, une forte limitation de la taille des progénies confirmerait les résultats de nos expériences précédentes selon lesquels les OR exprimés à la surface des spermatozoïdes ont un rôle biologique dans la fécondation de l'oeuf, ce qui n’a jamais été démontré. Cela ouvrirait la voie à la recherche de ligand(s) particuliers impliqués dans le chimiotactisme naturel des spermatozoïdes et dans la reproduction. Cela conduirait aussi à la recherche des cellules émettrices de ce ligand et plus encore permettrait d’envisager de nouvelles explications et hypothèses de travail relatifs à la stérilité de certains couples.
Procédures
L'expérimentation se limite à l'introduction d'un ovule de la taille d'un petit grain de blé dans le vagin de souris avant leur mise en accouplement. L'introduction sera réalisée manuellement et délicatement alors que la souris sera maintenue dans la paume de l'expérimentateur pendant un temps n'excédant pas 30 secondes pour limiter le stress. Le geste sera répété à une semaine d'intervalle ou plus, en cas de non copulation. La même souris femelle pouvant être utilisée jusqu’à 3 fois, si nécessaire.
Impact sur les animaux
Les expériences préliminaires que nous avons faites et qui consistaient en l'introduction directe de lyral dans l'espace vaginal de souris n'ont pas mis en évidence d'effets indésirables à court ou moyen terme chez les souris. La même dose sera utilisée dans cette expérience. L’introduction de la molécule via un ovule sera également sans effet. Aussi toutes les souris recevant un ovule (placebo ou test) seront quotidiennement observées pour noter tout changement dans leur comportement ou l'apparition de quelques symptômes qu'ils soient. Etant donné le caractère allergisant du lyral, une attention particulière sera donnée à l’apparition de démangeaisons et de conjonctivites pendant 2 à 3 semaines après introduction des ovules. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne de leur comportement afin de détecter toute gêne éventuelle, ou phénomène de nature allergisant (dermatites, conjonctivites). Si de tels problèmes étaient observés, risquant d’entrainer une douleur chez l’animal, l’expérience sera stoppée et celui-ci sera euthanasié.
Devenir
Après chaque accouplement, les souris seront remises dans le pool et utilisées pour d'autres accouplements. Les souriceaux seront immédiatement mise à mort.
Remplacement
Il est impossible de remplacer ces expérimentations chez la souris, préliminaires à des essais cliniques chez l'homme, par des tests in vitro dans la mesure où la question posée est celle de savoir si un ovule libérant dans le vagin une molécule odorante se fixant à la surface des spermatozoïdes pourrait empêcher la procréation en perturbant leur chimiotactisme en direction de l'œuf. A l’évidence, des expériences reposant sur fécondation in vitro ne permettrait pas de tester cette hypothèse.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au strict minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques pertinentes et scientifiquement irréprochables afin de valider les données obtenues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une structure agréée qui tient compte de l'éthique animale. Les accouplements seront hébergés dans une armoire ventilée afin d'éviter les conséquences olfactives de l'utilisation de la molécule odorante sur les autres animaux présents dans la pièce d'hébergement. Le reste du temps l'hébergement se fera en groupes sociaux et les animaux bénéficieront d’un environnement calme et d'une alimentation abondante. Une surveillance journalière des animaux sera réalisée pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Si des souris présentaient une réaction de nature allergisante, elles seraient immédiatement retirées de l'expérience et euthanasiées par dislocation cervicale ou par inhalation de CO2 à l'aide d'une chambre d'euthanasie. Par ailleurs, rappelons que les ovules fournis par NextPharma sont de qualité pharmaceutique, fabriqués avec des produits autorisés par la pharmacopée et ainsi sans danger par elles-mêmes.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce animale pour laquelle on a clairement identifié les récepteurs olfactifs exprimés à la surface des spermatozoïdes. Par ailleurs nous avons choisi la souris Swiss CD1 car elle est très prolifique. Les portées sont régulièrement supérieures à 10 souriceaux, ce qui facilite la recherche d'un effet négatif sur la procréation. Les souris seront utilisées dès qu'elles sont en âge de se reproduire. Les mâles sont sexuellement matures dès l'âge de 8 semaines et les femelles dès l'âge de 6 semaines.
Diabète gestationnel et épigénétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras obésogène, toutes subissant des tests métaboliques hebdomadaires avec injections intrapéritonéales et prélèvements sanguins répétés à la queue, un bolus d'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie. Le porteur cherche à établir que le diabète gestationnel modifie par voie épigénétique l'expression des gènes hypothalamiques de la descendance, prédisposant à l'obésité. Il affirme que ces mécanismes multi-organes ne peuvent être reproduits qu'avec la souris, jugée "indispensable" faute d'échantillons humains.
Objectifs
Notre corps est optimisé pour stocker tout apport énergétique qui dépasse les besoins de l'organisme. En effet, l’évolution a permis aux humains de traverser des périodes de famine. Cependant, ce mode de fonctionnement n’est pas compatible avec notre style de vie sédentaire d'aujourd'hui. Il en résulte l'émergence de la pandémie d'obésité et de diabète, qui survient de plus en plus fréquemment dès l'enfance et l'adolescence. Bien que des études de génétique humaine à grande échelle aient été menées avec succès, l'héritabilité de traits aussi complexes reste difficile à déterminer. De plus en plus d’études scientifiques suggèrent que la suralimentation dans des conditions telles que le diabète gestationnel (DG), peut entrainer un métabolisme altéré à travers les générations. Ces mécanismes impliquent des changements héréditaires dans l'expression des gènes qui se produisent plutôt par le biais d'une régulation épigénétique altérée. Les études chez l’animal suggèrent que le stress nutritionnel affecte le développement de l'hypothalamus et prédispose la descendance à l'obésité. En effet, l'hypothalamus orchestre un ensemble complexe de processus pour réguler l'apport et la dépense énergétiques. Par conséquent, l'hyperphagie et la réduction de la satiété représentent des caractéristiques précoces chez les enfants sujets à l'obésité. Cependant, une analyse complète du profil épigénétique de l'hypothalamus dans le contexte du DG fait largement défaut jusqu'à présent. Ainsi, nous cherchons à mettre en évidence que le DG a un impact sur l'expression des gènes hypothalamiques par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène tout au long de la vie.
Bénéfices attendus
Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète à part entière est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Nous supposons que le DG a un impact sur l'expression des gènes de l'hypothalamus par le biais d'une régulation épigénétique au cours du développement intra-utérin et postnatal précoce, prédisposant la descendance à un phénotype obésogène qui dure toute la vie. Les données récentes du laboratoire avec lequel nous collaborons pour ce projet suggèrent l'existence d'un nouveau code épigénétique qui pourrait jouer un rôle majeur dans la différenciation cellulaire et le développement de maladies. Ainsi, nous sommes convaincus que ce projet permettra de mieux comprendre l'impact de la suralimentation sur la prédisposition au diabète.
Procédures
168 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids. Par ailleurs, tous les animaux (336) seront soumis à des tests métaboliques (1 test/semaine). Le test de tolérance au glucose nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Parrallèlement, 4x 40μL de sang sont prélevés (durée 1min) à l'aide d'un capillaire pour mesurer l'insulinémie par le même site de prélèvement. Le test de sensibilité à l'insuline nécessite 1 injection IP ( durée 10 sec) et des prélèvements de 6 gouttes de sang (2μl - durée 5sec.) à la veine de la queue à des temps post-injection précis. Le traitement hormonal nécessite 2 injection IP ( durée 10 sec)
Impact sur les animaux
Une diète riche en gras pour créer une environement obésogène, le traitement hormonal pour favoriser la reproduction et le test de tolérance au glucose peuvent créer un inconfort chez les souris. La sensibilité à l'insuline nécessite l'injection d'un bolus d'insuline qui peut entrainer une hypoglycémie chez la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leur tissus seront prélevés pour determiner le profil épigénétique.
Remplacement
La nature transitoire du diabète gestationnel (la maladie n'existe que pendant la grossesse), la rareté des échantillons de tissus humain post mortem, la cause du décès... etc rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. De plus, la disponibilité des échantillons humains est limitée au sang, au cordon ombilical. Pour ces raisons, les modèles animaux constituent une alternative indispensable pour étudier ces mécanismes.
Réduction
Nous utiliserons un total de 336 animaux. Le nombre d’animaux testé dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.
Raffinement
Les différentes expériences seront réalisées par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les volumes de sang prélevés seront réduits au minimum nécessaire pour les analyses biochimiques et les volumes injectés seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire. Le recours aux analgésiques et anesthésiques sera systématique pour éviter toute souffrance ou douleur chez l'animal.
Choix des espèces
L'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, pancréas (ilots de Langerhans) , muscles, tissus adipeux, intestin, cerveau) . Ces mécanismes complexes ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris. Le modèle murin ne peut donc pas être remplacé dans notre cas. De plus, la nature transitoire du DG et la rareté des échantillons de tissus en dehors du sang et du cordon ombilical rendent l'étude de ce phénomène très difficile chez l'homme. Les animaux seront soumis à une diète riche en gras dès l'âge de 5 semaines, âge idéal pour permettre une prise de poids suffisante.
Traitements ciblant EZH2 dans l’initiation et le développement de la leucémie aiguë promyélocytaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever la moelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 170 individus étant classés en sévère. Elles reçoivent une irradiation sublétale aux rayons X, une greffe de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis des traitements par acide rétinoïque et épidrogues, avec des prélèvements sanguins sous anesthésie. Le porteur indique que la leucémie et les traitements peuvent entraîner perte de poids et dégradation de l'état, et fixe un point limite à 20 % de cellules leucémiques circulantes. Il reconnaît avoir déjà montré in vitro l'effet de l'association testée, mais affirme que le microenvironnement médullaire rend le modèle murin "nécessaire".
Objectifs
Une proportion rare de leucémies aiguës promyélocytaires (APL) présente un réarrangement chromosomique entraînant la juxtaposition des gènes RARA (récepteur de l’acide rétinoïque alpha) et PLZF (Promyelocytic leukaemia zinc finger protein), avec production d’une oncoprotéine hybride à l’origine du développement de la maladie. Dans ce cas particulier de fusion PLZF-RARA, le traitement conventionnel par l’acide rétinoïque (ATRA, qui permet une rémission dans les autres types d’APL) se heurte à une résistance des cellules leucémiques et une rechute chez les patients. Nos travaux précédents ont mis en évidence dans une lignée de leucémie myéloïde aiguë une nouvelle interaction au mécanisme original entre PLZF et EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2), un facteur responsable de la réduction d'activité de nombreux gènes. Or, l'implication d'EZH2 dans le développement d'hémopathies malignes a été mise en évidence dans de nombreuses études et EZH2 est une cible thérapeutique pour laquelle des inhibiteurs sont actuellement en développement. Nous souhaiterions donc nous intéresser au rôle de cette interaction entre PLZF et EZH2 dans l'initiation et le développement de l'APL exprimant la fusion PLZF-RARA. Nous avons obtenu des résultats préliminaires in vitro encourageants, montrant que l'inhibition d'EZH2 était associée à une moindre capacité de prolifération dans une lignée cellulaire exprimant PLZF-RARA. Nous souhaitons donc tester maintenant l’effet d'inhibiteurs d'EZH2 (épidrogues) sur le développement tumoral d'APL PLZF-RARA traitées à l'acide rétinoïque (ATRA, traitement conventionnel des APL), afin de déterminer si l'association d'une épidrogue au traitement conventionnel permet de contourner la résistance et de réduire la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet qu'il révèle de nouvelles pistes pour déterminer si l'association de différentes épidrogues au traitement classique par l'acide rétinoïque permet de contourner les résistances et de réduire la progression tumorale des APL.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles le prélèvement, effectué en 10 à 20 secondes, est réalisé. Les animaux receveurs de greffe subiront une irradiation sub-léthale réalisée via une exposition des animaux aux rayons X d'environ 2 minutes. La greffe de cellules leucémiques qui s'ensuit par injection intraveineuse est réalisée sous anesthésie gazeuse. L'anesthésie dure 2 à 3 minutes au cours desquelles l'injection des cellules, effectuée en quelques secondes, est réalisée. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par des injections intrapéritonéales nécessitant chacune quelques secondes d'intervention sur l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous anesthésie gazeuse (prélèvement soit unique, soit hebdomadaire selon la procédure). Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation sub-léthale et une greffe de cellules leucémiques par injection intraveineuse sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront soumis à des traitements ATRA et épidrogues (durée 1 à 2 semaines, injection 3 fois par semaine ou tous les 2 jours selon la greffe), par injections intrapéritonéales. Le développement de la maladie et les traitements étant susceptibles d’entraîner une perte de poids et une dégradation de leur état, les animaux seront soumis à une observation quotidienne et à des évaluations à l'aide de la grille de score, permettant de prévenir les effets délétères et gérer la douleur. Nous serons vigilants sur l’altération du bon fonctionnement des cellules sanguines de l'animal qui pourrait survenir du fait du développement de la leucémie, et notamment une possible baisse de l’hématocrite. C'est pourquoi nous réaliserons un suivi précoce et prédictif grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire de notre laboratoire, en quantifiant la proportion de cellules leucémiques dans le sang. Cette mesure nous permet, grâce à notre expérience de ce modèle, de fixer un point limite de 20% de cellules leucémiques circulantes afin de rester en-deçà de l'apparition d'une formule sanguine anormale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures, afin de prélever les moelles qui seront regreffées et utilisées pour réaliser les analyses moléculaires et cellulaires.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre les processus de régulation de l’hématopoïèse pathologique, l'hématopoîèse étant définie comme le processus de production de toutes les cellules sanguines dans la moelle osseuse. Cette régulation implique des mécanismes intrinsèques aux cellules, mais aussi une communication cellulaire avec des facteurs microenvironnementaux de la moelle osseuse (facteurs extrinsèques). Ces deux types de mécanismes sont entièrement imbriqués du fait d’un dialogue permanent entre les cellules hématopoïétiques et leur microenvironnement. Il est donc nécessaire de replacer la cellule dans son contexte et d’avoir recours aux modèles murins. Cependant, nous avons pu récemment utiliser des modèles in vitro pour montrer les effets bénéfiques de l’association d'une épidrogue avec l’acide rétinoïque sur les cellules leucémiques. Nous souhaitons donc tester l'hypothèse d'un bénéfice de cette association in vivo, aux doses recommandées dans la littérature.
Réduction
Bien que le recours aux modèles murins soit rendu nécessaire par l’existence reconnue de mécanismes de régulation des cellules hématopoïétiques par le microenvironnement, nous limiterons au maximum le nombre d'animaux. Pour cela, nous nous baserons sur les résultats obtenus in vitro afin d'optimiser les combinaisons de drogues à tester et nous utiliserons les techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Notre projet nécessitera 200 souris NSG, permettant d'évaluer l'action potentiellement bénéfique d'une association d'épidrogues au traitement conventionnel par l'ATRA. Le nombre d’animaux a été optimisé grâce à notre expérience du modèle : nous avons ajusté le nombre d'animaux au minimum requis pour l'obtention du nombre de cellules suffisantes pour réaliser les analyses moléculaires, et permettant également d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable.
Raffinement
Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment la détermination de la quantité de cellules leucémiques dans le sang par des mesures en cytométrie d'un rapporteur permettant de distinguer l'origine des cellules (celllules leucémiques PLZF-RARA ou cellules sanguines des souris NSG). Les prélèvements sont réalisés sous anesthésie gazeuse par du personnel compétent. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage.
Choix des espèces
L’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés. Ceci restreint l’étude des mécanismes moléculaires de l’hématopoïèse à ces derniers, parmi lesquels le poisson zèbre et la souris sont les modèles génétiques les mieux caractérisés. L’apport historique et la disponibilité des modèles souris dans l’étude du système hématopoïétique, notamment pathologique, et notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes, agées de 7 à 10 semaines, âge où le système hématopoïétique et son microenvironnement sont définitivement matures, et qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe des cellules leucémiques.
Exploration de stratégies thérapeutiques pour restaurer la fonction synaptique et les comportements cognitifs dans un modèle de souris du syndrome de l’X fragile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation reproduisant le syndrome de l'X fragile, elles reçoivent un traitement pharmacologique quotidien par gavage ou injection intrapéritonéale, et pour certaines une chirurgie d'implantation cérébrale suivie de cinq semaines en cage individuelle. Le porteur indique que les injections, la contention, les tests comportementaux, la chirurgie et l'isolement social provoquent douleurs et stress, et mentionne deux tests d'évaluation des déficits cognitifs sans préciser lesquels. Il affirme qu'aucune alternative in silico ou en culture cellulaire ne convient et que l'animal doit rester "intact" pour étudier la mémoire.
Objectifs
Le syndrome de l'X fragile (SXF) est la forme la plus fréquente de déficience intellectuelle héréditaire (Prévalence 1:4000 chez les hommes et 1:7000 chez les femmes) et cette maladie reste malheureusement sans traitement efficace à ce jour. La majorité des patients atteints présentent une déficience intellectuelle associée à des troubles de l'apprentissage, de l'attention, et dans un quart des cas à des troubles du spectre autistique. Ce syndrome résulte de mutations du gène FMR1 (Fragile X Mental Retardation 1) qui entraine soit l’absence d’expression de la protéine correspondante, FMRP, ou bien l’expression d’une forme non fonctionnelle de celle-ci. La modification de cette protéine chez la souris conduit à des effets similaires à ceux observés dans les cerveaux de patients atteints de SXF. Deux mécanismes ont déjà été montrés comme dérégulés chez ces souris génétiquement modifiés et comme étant à l’origine des anomalies de communication entre neurones observées chez ces animaux. Ces mécanismes représentent donc des cibles très intéressantes pouvant être utilisées à des fins thérapeutiques. Les travaux que nous souhaitons mener sur ce model vise à cibler ces mécanismes dans la perspective de développer des solutions thérapeutiques innovantes pour les patients atteints du syndrome de l'X fragile. Pour cela, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées et des agents pharmacologiques actifs sur les mécanismes d’intérêt. Nous évaluerons leurs efficacités pour restaurer la communication neuronale par des taches comportementales et des mesures d’activité neuronale in vitro et in vivo.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d’évaluer l'efficacité de traitements pharmacologiques afin de corriger les défauts physiologiques et les comportements identifiés sur le modèle murin de syndrome de l’X Fragile. La validation d’un ou plusieurs de ces traitements permettra de proposer des pistes de traitements pour les patients atteints du syndrome de l'X fragile (SXF) .
Procédures
Dans ce projet, les 540 animaux recevront un traitement pharmacologique quotidien soit par voie orale pour une durée variable en fonction de la molécule, soit par injection dans le péritoine pour une durée de 8 jours maximum - 140 de ces animaux recevront juste un traitement pharmaceutique -260 animaux recevront un traitement pharmaceutique et subiront deux tests comportementaux afin d’évaluer les défauts cognitifs. Ces 2 tests nécessitent que les animaux soient isolés respectivement 15 et 8 jours afin de limiter les interactions stressantes pouvant influencer sur les performances de mémoire. -140 animaux recevront un traitement pharmaceutique et subiront une chirurgie implantatoire afin d’enregistrer l’activité neuronale lors d’un test comportemental de mémoire. Les animaux seront hébergés en cage individuel pour une durée de 5 semaines suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. L’ensemble des animaux seront sacrifiés en présence d’analgésique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont : Des douleurs avec les piqûres en injection dans le péritoine Du stress physique lié à des contentions et aux tests de comportement Des douleurs, et stress liés aux lésions des chirurgies, Du stress lié au restriction de comportement social suite à l'isolement des animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux est sacrifié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'electrophysiologie in vitro ou des études histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonction cérébrale complexe étant à la base du codage de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques et de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitifs et sensoriels sont traités exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre d’animaux, il sera réalisé différents tests comportementaux successifs et de gravité croissante sur les mêmes cohortes. Pour les expériences comportements, nous utiliserons 20 souris / traitement. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient être le résultat d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux. Pour les enregistrements d’activité neuronale in vitro et in vivo au cours du comportement, le nombre de 10 souris / traitement nous permettra d’enregistrer un nombre de neurones conséquent afin de pouvoir collecter un ensemble important de données.
Raffinement
Pour les expériences in vitro, les souris seront maintenues en groupes sociaux tout le long de la procédure. Pour les expériences in vivo, les animaux seront placés en cage individuelle pour des périodes de 8 à 10 jours lors de chaque tache comportementale. Les animaux subissant une chirurgie implantatoire seront placés en cage individuelles pour une période de 4 à 5 semaines. Lorsque l’animal est placé en cage individuelle, la cage est enrichie avec un tunnel et une maison en papier mâché pour favoriser les comportements d'exploration et d'empêcher le stress Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues aux congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin », qui renseigne les soins prodigués et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. La chirurgie implantatoire est réalisée sous anesthésie gazeuse avec un contrôle de la respiration et de l’absence de reflex tout le long du protocole. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique, en sous cutané en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, nous réalisons une injection d'une double dose d'analgésique, et d'un euthanasiant. L'absence de reflexe est vérifié afin de contrôler la profondeur de l'anesthésie.
Choix des espèces
Les modèles murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions normale et pathologique, la souris partage environ 99% de ses gènes avec l'homme. L’homologue murin du gène FMR1 humain a été manipulé pour générer des modèles animaux présentant des phénotypes similaires à ceux observés chez les patients X-fragiles notamment au niveau de la morphologie neuronale et de l’apprentissage, ce qui en font des modèles de choix pour l’étude de la pathologie. Les données de la littérature démontrent clairement que les mutations du gène FMR1 sont responsables du syndrome de l’X fragile chez l’homme et que ces mêmes mutations chez la souris ont des effets moléculaires, morpho-fonctionnels et comportementaux similaires à ceux observés chez les patients X fragiles. Nos modèles souris X fragiles sont donc d’excellents modèles précliniques pour évaluer le potentiel thérapeutique de traitements pharmacologiques ciblant les défauts relevés chez nos souris. Les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines et jusqu’à 4 mois d’âge.
Etude de l’engramme d’une mémoire de type post-traumatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 480 individus étant classés en sévère. Elles subissent un conditionnement par deux chocs électriques aux pattes censé induire une mémoire de type post-traumatique, complété par des injections intrapéritonéales, avant analyse du cerveau. Le porteur décrit un modèle comportemental de mémoire traumatique développé par l'équipe, sans détailler les autres tests employés au-delà de ce conditionnement. Il affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la mémorisation et qu'une espèce "suffisamment proche" de l'humain est requise pour extrapoler les résultats.
Objectifs
Si les caractéristiques cliniques de l’état de stress post-traumatique (ESPT) sont bien décrites, les bases neurobiologiques de cette pathologie sont encore méconnues. L’un des trait cardinaux de cette pathologie, se développant à la suite d’un stress intense, est une altération de la mémoire associant à la fois une amnésie et une hypermnésie. Cette mémoire est définie comme maladaptative, en opposition à une mémoire émotionnelle normale qui est considérée comme adaptative. Le but de ce projet est de définir en quoi ces deux types de mémoire diffèrent. Pour ce faire, nous étudierons le réseau cérébral recruté dans ces deux types de mémoires à la fois lors de l’encodage de l’événement et lors de son rappel.
Bénéfices attendus
En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.
Procédures
Les animaux sont soumis à des procédures comportementales entainant un stress chez l'animal permettant de mimer une mémoire de type post-traumatique ainsi qu'à des injections intra-péritonéales.
Impact sur les animaux
Une telle investigation implique l’utilisation d’un modèle permettant de distinguer et de comparer après un épisode de stress le développement d’une forme de mémoire émotionnelle normale et d’une mémoire de type traumatique. Le modèle de mémoire traumatique développé au sein de l’équipe permet précisément une telle comparaison. Ce modèle de conditionnement implique des effets stressants chez les animaux liés l'application de deux chocs élèctriques légers au niveau des pattes. Cette nuisance entraine une classe de sévérité sévère.
Devenir
Toutes les souris des procédures 1 et 2 seront mises à mort après les procédures comportementales afin d'analyser l'activité du cerveau.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.
Réduction
Concernant la réduction, l’effectif de 528 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit, en cage collective, sauf dans la semaine qui précède l'étude comportementale où elles seront placées en cage individuelle . Dans toutes les cages l'environnement sera enrichi ( bio-tunel et carrés de cellulose) . Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine et pesées 1 fois par semaine par un personnel qualifié . Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être (perte de poids, poils hérissés, prostration…), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h.
Choix des espèces
La souris adulte (8 à 12 semaines): -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris adulte : pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet d'accéder au niveau cellulaire grace à des procédures histologiques simples et d'immunohistochimie
Etude des voies de signalisation du post-conditionnement ischémique dans un modèle d’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue et le cœur prélevé, dans des procédures classées en gravité sévère. Elles subissent une chirurgie cardiaque d'environ quatre-vingts minutes sous anesthésie générale profonde qui induit un infarctus du myocarde, certaines recevant une injection intraveineuse de molécules pendant l'opération, avant mise à mort dans les vingt-quatre heures. Le porteur justifie le prélèvement du cœur par les mesures de taille d'infarctus et l'analyse du tissu cardiaque, et prévoit un suivi post-opératoire renforcé au réveil. Il indique avoir écarté les modèles in vitro, jugés "inadaptés" pour ces voies de signalisation, et conclut que le recours à la souris est "nécessaire".
Objectifs
Les lésions tissulaires engendrées par un infarctus peuvent être réduites par la mise en place de procédure de cardioprotection, appelée « post-conditionnement ischémique ». Cependant, les mécanismes d’action de cette cardioprotection restent encore peu connu. Des données de la littérature suggèrent l’implication de plusieurs voies de signalisation bien spécifiques. Le but de ce projet est de comprendre les modulations de ces voies de signalisation aux différent moment clefs d’un infarctus.
Bénéfices attendus
L'infarctus du myocarde est encore aujourd'hui l'une des principales causes de décès dans le monde. L’étude de son fonctionnement, mais surtout des phénomènes dits « cardioprotecteurs » pouvant aboutir à la protection du tissu cardiaque, est donc une priorité et une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu est donc un enjeu de santé majeur. L’intérêt de ce projet, à terme, est de pouvoir développer des outils pharmacologiques capables de mimer ces phénomènes et donc de réduire les lésions cardiaques post-infarctus et les dysfonctionnements fonctionnels et métaboliques associés.
Procédures
L’expérimentation consiste en une chirurgie cardiaque sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée (durée : environ 80mn). Pour certains groupes expérimentaux, une injection intraveineuse de molécule tests non toxiques est prévue pendant la chirurgie. Un prélèvement sanguin puis la mise à mort interviennent au plus tard 24h plus tard sous anesthésie générale profonde et analgésie (durée : environ 20mn).
Impact sur les animaux
L'expérimentation consiste à induire un infarctus du myocarde chez l'animal, impliquant un acte chirurgical, sous anesthésie générale, nécessitant une prise en charge de la douleur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort dans chaque procédure car les mesures effectuées nécessitent le prélèvement du cœur (pour les mesures de tailles d’infarctus ou les analyses du tissu cardiaque)
Remplacement
Des données préliminaires obtenues in vitro ne correspondent pas du tout à ce qui est connu in vivo dans la littérature, nous laissant penser que les modèles in vitro classiquement utilisés sont inadaptés pour l’étude des voies de signalisations dans ce contexte particulier d’infarctus. Par ailleurs, Il est question dans cette étude de mesurer un effet global (et donc une réponse intégrée) sur tous les types cellulaires composant le tissu cardiaque. Le recours à l’animal est donc nécessaire. Néanmoins, afin de limiter l'utilisation des animaux, la mise au point analyses et la caractérisation des doses efficaces des molécules d’intérêt seront tout d'abord réalisé sur une lignée cellulaire (ex vivo). Suite à celle-ci, une phase test sera réalisée pour vérifier l'absence de toxicité aigüe et la réalité de l'efficacité de l'injection de ces molécules d’intérêt chez les animaux.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d'animaux, les différents temps choisis pour l’infarctus seront basés sur une précédente étude mise en place au laboratoire. Les effectifs ont été calculés au plus juste (tests statistiques) pour permettre l’exploitation des résultats Les différentes étapes se succèdent, permettant de réajuster si besoin à chaque étape en fonction des résultats de l’étape précédente (en réduisant les effectifs prévus initialement, en abandonnant la réalisation d’un groupe expérimental qui s’avèrerait finalement superflus ou en arrêtant le projet en cas de résultats non concluants. Enfin, des données obtenues lors de précédents projets seront utilisés pour éviter d’avoir à réaliser certains groupes dans ce projet.
Raffinement
Pour réduire au maximum la souffrance et la douleur imputables à la chirurgie, celle-ci est effectuée sous anesthésie profonde et couverture analgésique adaptée. Une attention particulière est apportée aux soins post-opératoire des animaux. Un suivi renforcé dans les heures suivant le réveil est assuré à l'aide d'une fiche d'observation éprouvée, spécifique à cette chirurgie, consistant en la détermination d'un score des symptômes bien déterminés, dans le but d'intervenir de manière rapide et efficace, le cas échéant, en concertation avec le chef de projet et le vétérinaire référent. Le fait de réaliser les prélèvement au plus tard 24h après la chirurgie, permet de s’affranchir des complications éventuelles à long terme d’un infarctus du myocarde.
Choix des espèces
Le modèle murin d’infarctus, parfaitement maîtrisé au laboratoire, permet de reproduire et d'étudier au mieux l'infarctus du myocarde, a été largement éprouvé dans la littérature, et est particulièrement adapté à l'étude des voies de signalisations. C'est par ailleurs ce modèle qui a été utilisé lors de la précédente étude, sur laquelle nous nous sommes appuyés pour choisir les temps clefs d'ischémie-reperfusion. Le recours au même modèle permettra ainsi de mettre en corrélation les résultats obtenus. L'expérimentation portera sur des animaux de 8 à 14 semaines, afin de comparer les résultats avec ceux obtenus dans le laboratoire, en particulier ceux du précédent projet.
Modèles de cancerologie expérimentale par cellules de carcinome colique pour l’évaluation de nouvelles thérapeutiques par imagerie in vivo
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit un cancer colorectal par chirurgie ou par injection, puis elles subissent jusqu'à deux imageries par semaine pendant neuf semaines sous anesthésie, jusqu'à cinq traitements hebdomadaires pendant six semaines et des prélèvements sanguins en sous-mandibulaire sur animal vigile. Le porteur indique que les tumeurs sous-cutanées, coliques et péritonéales peuvent provoquer des difficultés de locomotion, des diarrhées et des occlusions intestinales. Il affirme que l'étude des tumeurs et métastases ne peut pas être modélisée in vitro et qu'aucune autre méthode n'apporterait un niveau d'information équivalent.
Objectifs
Le cancer colorectal représente un défi majeur de santé publique en raison de sa gravité et de l’augmentation croissante des cas nouvellement diagnostiqués en France et à travers le monde. Malgré des avancées significatives en termes de survie grâce aux chimiothérapies à base d’anticorps thérapeutiques, certains patients ne répondent pas ou peu aux traitements. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies afin d’améliorer l’efficacité antitumorale et de lutter contre les phénomènes de résistance.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’étudier par imagerie in vivo des modèles de cancer colorectal à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments.
Procédures
Induction de cancer colorectal : 1 acte par animal soit par chirurgie (15min max d’intervention sous anesthésie générale) soit sans chirurgie : injection intrapéritonéale (quelques secondes), injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie générale), injection par endoscopie (5-10min sous anesthésie générale) Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 9 semaines sous anesthésie générale. Traitements : au maximum 5 traitements par semaine pendant 6 semaines par voie orale, intrapéritonéale ou intraveineuse Prélevement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire volume maximal de 130μL( en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours) pour une souris de 25g .
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus pour les animaux sont liés au développement de foyers tumoraux au niveau sous-cutané ainsi qu’au niveau du colon et des viscères. Une difficulté de locomotion peut éventuellement s'installer lorsque la tumeur sous cutanée évolue et des diarrhées ou occlusions intestinales peuvent apparaître lors de l’évolution des tumeurs du colon ou des métastases péritonéales. La définition de points limites, le suivi quotidien, les pesées ainsi que la grille de scoring nous permettront d’anticiper toute douleur ou souffrance qui seraient induites. Nous n’attendons pas de douleur ou d’intolérance liées aux composés tests.
Devenir
Toutes les souris seront mise à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.
Remplacement
L'étude de tumeurs ou métastases résulte de l’interaction de nombreux types cellulaires et ne peut pas être modélisée in vitro. Aucune autre méthode expérimentale ne serait en mesure d’apporter un niveau équivalent d’information que la procédure expérimentale impliquant l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Les groupes témoins seront regroupés lorsque cela sera possible. La mise en oeuvre de l'imagerie (bioluminescence et échographie) permettra de suivre le même animal au cours du temps ce qui permet de réduire significativement leur nombre.
Raffinement
Les méthodes d'imagerie mises en oeuvre sont non invasives et les actes réalisés sous anesthésie ce qui limite la douleur et le stress infligé au cours de l’expérimentation. Par ailleurs, les souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des cages disposant d’un environnement enrichi et en accord avec les directives européennes. L'induction des modèles tumoraux sera réalisée sous anesthésie générale. Durant les actes de chirurgie, la douleur sera également prise en charge par l'utilisation d'antalgiques (paracétamol) la veille et 24h post opératoire et par l’administration d'anti inflammatoire (tolfédine) le jour et 24h post opératoire. Des grilles de scoring avec les points limites prédictifs seront mis en place et le personnel examinera les animaux quotidiennement afin d'anticiper la souffrance de l'animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale.
Interactions métaboliques entre glioblastome et neurones “GLIONEUROMET” 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
144 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Porteuses d'un glioblastome, elles reçoivent une perfusion de substrats marqués au carbone 13 destinée à mesurer les échanges métaboliques, avant prélèvement du cerveau pour analyse par spectroscopie. Le porteur indique que le modèle tumoral peut entraîner perte de poids, hérissement du poil, baisse d'activité et prostration, et formule l'hypothèse que des cannabinoïdes réduiraient le lien métabolique entre cellules tumorales et neurones. Il reconnaît l'existence de co-cultures glioblastome-neurones mais affirme qu'un "organisme entier" est requis pour son approche translationnelle.
Objectifs
Le glioblastome est une tumeur cérébrale qui touche les astrocytes (les cellules de soutien du cerveau). Cette maladie est rare ; cependant son mauvais pronostic représente un problème de santé publique majeur. En effet, après traitement, le risque de récidive est très élevé. Les cellules tumorales migrent et envahissent les tissus avoisinants et forment des foyers tumoraux secondaires. Le lien métabolique entre les astrocytes et les neurones est très fort. L’hypothèse du projet est que la relation métabolique entre les cellules du glioblastome (astrocytes devenus tumoraux) et les neurones pourrait être impliquée dans l’invasion tumorale : les neurones pourraient aider au développement tumoral en stimulant les cellules du glioblastome. L’objectif global de ce projet est de décrypter les principales voies du métabolisme reliant les cellules du glioblastome et les neurones. L’inhibition de ce lien métabolique pourrait représenter une piste thérapeutique de choix. Les cannabinoïdes pourraient inhiber ce lien entre cellules du glioblastomes et neurones et donc inhiber l'invasion tumorale.
Bénéfices attendus
En dépit des traitements thérapeutiques, les cellules tumorales du glioblastome (cellules dérivées des astrocytes, cellules de soutien du cerveau) migrent et envahissent les tissus avoisinants pour former des foyers tumoraux secondaires, associés à un mauvais pronostic. Il existe un lien métabolique très fort entre les astrocytes et les neurones ; dans le cadre du glioblastome, les neurones pourraient aider au développement tumoral en stimulant les cellules du glioblastome. Le projet vise à évaluer les effets d’une diminution du lien entre cellules tumorales et neurones, sur l’invasion tumorale. Le bénéfice attendu est une réduction de la capacité invasive des cellules tumorales. La réduction de ce lien entre cellules tumorales et neurones par les cannabinoïdes pourrait représenter une stratégie thérapeutique complémentaire pour contrer les récidives de l'invasion tumorale, après le traitement.
Procédures
Perfusion de substrats marqués au carbone 13 pour permettre la mesure des échanges métaboliqies. 1 fois / 1 heure. Prélèvement du cerveau sur animaux préalablement mis à mort.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé est un modèle de glioblastome et un certain nombre d’événements indésirables pourrait survenir au cours des expérimentations : une perte de poids, un hérissement du poil, une diminution de l’activité, une prostration.
Devenir
Le cerveau des animaux doit être prélevés pour être analysé par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire.
Remplacement
Des modèles de co-culture (glioblastomes / neurones) existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester les effets de la modulation du métabolisme énergétique entre les cellules du glyoblastome et les neurones dans les capacités invasives et métastatiques des cellules tumorales, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par l’utilisation de l'imagerie et la spectroscopie par résonance magnétique qui sont des techniques d’investigation non invasives et permet donc une réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude. De plus un seul hémisphère cérébral est touché ainsi, chaque animal peut être son propre témoin. Ceci permet de réduire fortement le nombre d’animaux nécessaire pour distinguer de façon statistiquement significative deux populations.
Raffinement
Les nuisances sur le bien-être animal seront minimisées par la mise en place de diverses procédures : utilisation d'analgésiques en cas de douleurs obervées, pesées régulières des animaux pour détecter toute perte de poids. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l’animal à s’alimenter, son comportement et sa vivacité, l’état du pelage seront évalués. Un échange quotidien entre le zootechnicien et l’expérimentateur permettront une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.
Choix des espèces
La souris est utilisée depuis plusieurs années pour les études du métabolisme dans notre laboratoire, ainsi nous disposons déjà de nombreux groupes témoins permettant les comparaisons et limitant ainsi de refaire tous les témoins. De plus, l'utilisation de l'espèce souris permet d'utiliser des animaux génétiquement modifiés adapté à l’implantation de xenogreffes (cellules tumorales P3). La capacité de ces souris à ne pas initier de rejet permettra aussi de diminuer le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 3 et 6 mois), le métabolisme cérébral étant différent à des stades plus précoces.