Rongeurs

2 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par ponction intracardiaque sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour, pendant seize jours au maximum, des composés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, pour déterminer la dose maximale tolérée d'inhibiteurs de kinases. Le porteur annonce comme seul effet indésirable attendu une perte de poids, et prévoit la mise à mort de tout animal atteignant un point limite. Il conclut que le recours à la souris est "indispensable" parce que les tests in vitro ne prédisent pas la toxicité d'un organisme vivant.

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine : maladies inflammatoires, pathologies affectant le système nerveux périphérique et central, et cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à cribler des molécules organiques de masse moléculaire très faible (fragments) qui n’ont la plupart du temps qu’une faible affinité pour la cible compte tenu de leur taille. Le criblage va se faire contre une cible thérapeutique choisie dans le cadre d’une pathologie particulière. Il va s’agir ensuite de combiner différents fragments identifiés et/ou de les faire évoluer en se basant sur la structure tridimensionnelle de la protéine cible considérée pour obtenir un candidat médicament de forte affinité et spécificité pour la cible étudiée. Ce projet se situera dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Les études sur les modèles de cellules en culture et la pharmacocinétique in vivo des composés à tester auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations sur la toxicité du composé test. Après avoir selectionné les molécules in vitro à travers des cribles biologiques pertinents, il est nécessaire d'évaluer la dose maximale tolérée in vivo. En effet, le développement de tout nouveau composé thérapeutique nécessite l'évaluation du rapport bénéfice/risque entre les doses thérapeutiques efficaces, et les effets secondaires et les niveaux de toxicité potentiels, suceptibles de diminuer ou annuler les effets curatifs de nouvelles molécules. L'importance d'évaluer les propriétés toxiques des molécules candidates ne peut donc pas être sous évaluée. L'objectif du projet est de déterminer la gamme optimale de doses de la molécule ne générant pas d'effets indésirables chez la souris, ainsi que ses paramètres posologiques (dose et fréquence d’administration).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d'identifier la plage de dose utilisable d'une nouvelle molécule thérapeutique ciblée, c’est à dire ne générant aucun effet indésirable chez la souris. Ceci permettra d’optimiser sa posologie pour l’évaluation de son activité biologique sur des modèles murins de pathologies humaines, mais également d'ajuster la dose initiale utilisée lors des essais cliniques. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dûs au traitement, pour le traitement de maladies à forts besoins médicaux non satisfaits (maladies neurodégénératives, inflammatoires et cancer) et ainsi améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux se verront administrer des composés test quotidiennement ou biquotidiennement pendant 16 jours maximum. Les administrations seront faites par injection du produit par voie orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale et une ponction intracardiaque sera réalisée. Les animaux seront pesés quotidiennement.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu suite à l'administration d'une nouvelle molécule est une perte de poids.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Si ces tests sont nécessaires et permettent d'identifier les meilleures molécules candidates, ils ne permettent malheureusement pas de prédire la toxicité in vivo. Ces approches expérimentales ne constituent donc pas des méthodes alternatives ou substitutives à la complexité d’un organisme vivant. L'effet de l’administration du composé test in vivo résulte de l'interaction entre de nombreux mécanismes physiologiques qui ne peuvent être reproduits in vitro. Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été determiné de manière statistique afin d'obtenir des résultats analysables avec un test statistique. La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet passe également par l'optimisation de l'utilisation des groupes contrôles : dans la mesure du possible des études pourront être définies pour tester plusieurs molécules en parallèles afin de limiter l’utilisation d’animaux dans les groupes contrôles.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté au raffinement et à l'anticipation des points limites au cours du projet. Le suivi quotidien individuel des animaux par le biais de leur observation et pesées quotidiennes permettra de minimiser au mieux les nuisances induites par l’étude. Dans le cas de l’atteinte de l’un des points limites définis dans le projet l’animal sera euthanasié. En cas d'approche de ces critères des croquettes mouillées seront mises à disposition des animaux pour éviter d'atteindre les points limites.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques : oncologie, maladies inflammatoires et pathologie du système nerveux. La majorité des modèles animaux développés pour ces pathologies sont des modèles de souris génétiquement modifiées, souris transgéniques pour les pathologies inflammatoires et système nerveux, souris immunodéficientes pour les modèles en oncologie. Afin de tester l'activité biologique in vivo des molécules développées il est donc nécessaire d'avoir recours à ces modèles murins. Dans ce projet il n'y aura pas d'induction de pathologie, cependant ces études de détermination de la dose maximale tolérée serviront pour la suite de l’évaluation préclinique du médicament (notamment pour les études d’efficacité). Il est donc prévu d’utiliser la même souche pour ce projet et pour les études d’évaluation de l’efficacité afin d’éviter l’apparition d’une toxicité innatendue liée à la différence de souche lors de l’étude d’efficacité. Les animaux seront adultes, soit 8 à 10 semaines lors du début de l’étude, afin d’avoir un système immunitaire, hormonal et métabolique mature dans le but d’obtenir la réponse recherchée sans biais.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue et le cerveau prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issus d'une lignée trisomique dont le porteur reconnaît le phénotype "dommageable", petite taille dans 80 % des cas et dermites à staphylocoque exigeant des antibiotiques chez la moitié d'entre eux, ils reçoivent pendant seize jours une molécule par voie intrapéritonéale puis passent le test de la piscine de Morris. Ce test d'apprentissage impose des séances de nage répétées, les animaux en difficulté ou épuisés étant retirés de l'étude. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à l'animal pour étudier les déficits cognitifs et propose comme candidat un médicament déjà utilisé contre l'alcoolisme.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 est la première cause de retard mental d’origine génétique. Le SD est lié à la présence d’une copie supplémentaire du chromosome 21 et touche 1 naissance sur 700. Il se caractérise par des déficiences intellectuelles : les personnes atteintes de SD ont des difficultés d’apprentissage et de mémorisation qui sont liées à des défauts dans le développement et le fonctionnement du cerveau. Cette anomalie chromosomique conduit à une surexpression des gènes du chromosome 21 humain, perturbant de nombreux systèmes physiologiques, morphologiques et biochimiques. Ces dérégulations se font de manière directe via l’augmentation de la production de protéines, ou indirecte à travers une multitude d’interactions de ces protéines sur l’ensemble du génome. Nous avons démontré le rôle du surdosage d'une protéine dans le modèle de rat SD, comme l'un des principaux moteurs du dysfonctionnement cognitif. Afin de mieux comprendre la conséquence du surdosage de cette protéine sur le fonctionnement cérébral dans notre modèle de rat SD et de développer une stratégie thérapeutique, notre projet est de tester une molécule qui est un médicament utilisé en clinique dans le traitement de l'alcoolisme, qui peut inhiber cette protéine dans un environnement cellulaire, et d’évaluer les capacités cognitives de notre modèle de rat SD.

Bénéfices attendus

La création et la caractérisation d’un modèle de rat portant la même mutation que l'humain, a permis de comprendre que la conséquence du surdosage d'une protéine est l'un des principaux moteurs du dysfonctionnement cognitif chez les patients trisomiques. Il n’existe à ce jour aucun traitement qui permet de restaurer les performances cognitives chez les patients. Toute molécule capable d’inhiber ou de réduire le surdosage de cette protéine sera potentiellement donc d’un grand bénéfice pour les patients.

Procédures

Nous allons réaliser les interventions suivantes : -Administration de composés par voie intra-péritonéale (moins d'une minute par rat) une fois par jour pendant 16 jours -test d'apprentissage dans la piscine de Morris : La durée du test est sur 7 jours : les 2 premiers jours 4 essais de 90s espacés d'1h sont réalisés chaque jour. Les 4 jours suivants, 2 essais de 90s, espacés de 2h, par jour. Le dernier jour, un seul essai de 90s. -Un prélèvement sanguin à la veine temporale superficielle (2 minutes par rat).

Impact sur les animaux

Le phénotype du notre modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, les anomalies suivantes ont été observées : -Animaux de petite taille (80% des cas) -Dermites à Staphylococcus aureus nécessitant des traitements antibiotiques locaux (50%) voire des traitements antibiotiques généraux (20%). Concernant le SD, aucun phénotype délétère n’est observé chez ces rats dans leur environnement. Lors de l’injection par voie intrapéritonéale, une surveillance du site d'injection sera effectuée et un soin local pourra être appliqué en cas de lésion ou d'infection du site. Lors du test d'apprentissage (Piscine de Morris), les animaux présentant des problèmes de nage ou d'épuisement seront retirés de l'étude. Après les prélèvements sanguins, une surveillance de l'état des animaux, en s'assurant notamment qu'il n'y a pas de saignement au niveau de la zone de prélèvement.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puis les cerveaux seront prélevés en vue d'analyses post-mortem (structures cérébrales).

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle pas d’alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. En effet, l’étude de déficits cognitifs nécessite un modèle vivant et suffisamment proche de l’Homme pour pouvoir être transposé à l’espèce humaine. Par ailleurs, il n’existe pas encore de modèle de cerveau in vitro ou autre permettant de réaliser de la recherche fondamentale dans ce domaine.

Réduction

Dans cette étude, nous comparerons trois groupes de rats: un groupe de rats contrôle négatif (sauvages + véhicule) ; un groupe de rats contrôle positif (mutant trisomique + véhicule) et le groupe d’intérêt (mutant trisomique + molécule à tester). Chaque groupe sera composé de 20 rats. En ce qui concerne le sexe, comme nous n’attendons pas à avoir un effet sexe, les 2 sexes seront utilisés (on veillera à avoir des groupes de mêmes proportions). Nous avons évalué le nombre de rats nécessaire pour pouvoir valider de façon statistique (test de Mann et Whitney) l’hypothèse que l’effet du traitement entre les groupes n’est pas nul. En fonction de ces paramètres, 20 rats par groupe seront nécessaires pour notre étude.

Raffinement

Du fait de leurs phénotypes dommageables, ces animaux font l’objet d’une attention particulière afin de pouvoir détecter le plus précocement possible tous problèmes pouvant altérer leur bien-être. Les animaux seront ainsi suivis quotidiennement tout au long de leur vie. Si un animal présente des signes de douleur ou de mal être, il sera présenté au vétérinaire puis, si un traitement est envisageable, il sera mis en place (on utilisera des anti-inflammatoires). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas par cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable, l’animal sera mis à mort. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par 2 et disposeront d’un bâton à ronger comme enrichissement.

Choix des espèces

Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez cette espèce. De plus, les régions homologues du chromosome 21 humain sont retrouvées sur 2 chromosomes chez le rat contre 3 chez la souris. L’obtention d’un modèle de trisomie complète est donc plus simple à obtenir chez le rat. Le rat constitue ainsi un modèle de choix pour générer des modèles de maladies humaines pour le syndrome de down. Les rats seront adultes, agés de 15 à 16 semaines environ au début des tests. l'ensemble des tests sera réalisé sur une période de 3 semaines.

2 330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections vaccinales par voies sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique, un marquage aux oreilles sous anesthésie, puis jusqu'à trente prélèvements sanguins et vaginaux étalés sur douze mois, pour tester vingt-cinq combinaisons d'ARN messager et d'immunostimulants contre le VIH. Le porteur indique que les prélèvements répétés peuvent provoquer des lésions irréversibles, oculaires ou de fibrose tissulaire, et que la mise à mort sert à prélever ganglions et rate. Il présente ce travail comme une étape "préliminaire" avant des modèles "plus pertinents" comme le lapin et le primate non humain, et affirme qu'un "organisme entier" doté d'un système immunitaire complet reste "nécessaire".

Objectifs

Malgré des années d'études et un large panel de thérapies contre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), les scientifiques peinent à contrôler la propagation et l’échappement du virus. De nouvelles stratégies d’immunothérapies actives et passives voient le jour, comme avec l’utilisation d’anticorps ou la vaccination. La crise sanitaire liée au COVID-19 a mis en avant les vaccins à base d’acide ribonucléique messager (ARNm) et a largement démontré son efficacité comparée aux vaccins conventionnels. Sa facilité de production et d’optimisation permet à cette technologie de s’appliquer à diverses pathologies dont le VIH. Notre laboratoire souhaite combiner des ARNm spécifiques avec des médicaments (immunostimulant) capables de renforcer la réponse immunitaire. 5 ARNm et 5 médicaments ont déjà été validés ces dernières années au laboratoire dans des modèles n'utilisant pas d'animaux. Cependant, l'efficacité réelle de ces médicaments / combinaisons ne peut être observé que chez un organisme entier, possédant un système immunitaire complet et mature. Nous souhaitons donc tester nos différentes combinaisons (25 combinaisons au total) dans des modèles souris afin d'évaluer la valeur ajoutée de nos combinaisons sur le développement d'une forte réponse immunitaire et surtout au long terme. Afin d'obtenir des résultats concluants, nous passerons par plusieurs étapes pour évaluer : l'efficacité et la sécurité de nos médicaments et combinaisons, la dose optimale à injecter, la meilleure voie d'administration et le maintien de la réponse à cours, moyen et long terme.

Bénéfices attendus

Le développement d'une nouvelle prophylaxie par combinaison d'un vaccin ARNm avec un médicament immunostimulant permettrait d'améliorer la réponse spécifique dirigée contre le VIH capable : - D'être maintenue au long terme - D'activer les centres germinatifs (essentiels pour l'induction d'une réponse à large spectre et neutralisante) - D'induire une réponse au niveau des muqueuses (essentielles dans la réduction des risques de transmission du VIH).

Procédures

Lors de cette étude, nous injecterons des combinaisons de médicaments par différentes voies d'administration (sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique). Chaque type d'administration dure moins de 30 secondes à 1 minute . Ces médicaments seront injectés à minima 1 fois, et au maximum 3 fois afin d'évaluer la réponse immunitaire à court (3 mois), moyen (6 mois) et long terme (12 mois). Afin d'identifier nos animaux, nous effectuerons des marquages aux oreilles sous anesthésie gazeuse qui est un acte qui dure quelques secondes au début de chaque étape. Nous effectuerons également de multiples prélèvements sanguins et vaginaux. Ces prélèvements seront fait toutes les 2 semaines (3-6 prélèvements à minima pour les études à court terme, jusqu'à 30 prélèvements étalés sur 12 mois pour les études à long terme). Cette acte dure 1 minute maximum par souris.

Impact sur les animaux

Un inconfort léger est attendu lors du marquage au oreille pour une durée de quelques minutes. Un inconfort léger est attendu lors de l'administration des vaccins (pour les 2 voies : intramusculaire, sous-cutanée) pour une durée de quelques minutes. L'administration par voie intradermique est un geste plus douloureux, induisant un inconfort modéré. Un suivi post-injection sera réalisé pour mettre en évidence une fièvre chez l'animal. Les prélèvements peuvent entrainer un inconfort modéré, notamment à cause de la contention qui peut entrainer un stress et les prélèvements répétés pouvant induire des lésions irréversibles (lésions oculaires, fibrose tissulaire, ...). Pour pallier à cet inconfort, nous effectuerons tous nos prélèvements sous anesthésie gazeuse et nous alternerons les sites de prélèvement afin de minimiser le risque de lésion irréversible.

Devenir

A la fin de chaque procédure, nos animaux seront mis à mort après anesthésie gazeuse. Cette mise à mort est nécessaire afin de récupérer des organes clés impliqués dans le développement et le maintien d'une bonne réponse immunitaire (comme l'analyse des cellules retrouvées dans le ganglion lymphatique, la rate, ...). Ces analyses sont primordiales dans la compréhension des voies induites par nos candidats vaccins. Les résultats obtenus nous permettront d'adapter notre stratégie thérapeutique/prophylactique afin d'optimiser nos vaccins eux-mêmes ou encore d'optimiser les schémas d'injection.

Remplacement

Les études vaccinales nécessitent d’effectuer des analyses préliminaires sur le modèle murin avant de passer sur des modèles plus pertinents tels que le lapin et le primate non humain. Des études préliminaires d’efficacité et de toxicité ont été effectuées sur des modèles in vitro pertinent. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas de mimer la complexité d’une réponse immunitaire humorale et cellulaire, impliquant généralement une multitude de cellules et d’organes. Dans ce sens, un modèle vivant, dynamique et doté d’un système immunitaire complet favorisera la compréhension des mécanismes sous-jacent liés à l’efficacité vaccinale dirigée contre le virus de l’immunodéficience humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux indiqué pour chaque étape représente un essai pour lequel toutes les combinaisons se révèleraient efficaces. Le nombre d’animaux maximum à utiliser dépendra donc du nombre de candidats vaccins ayant été validé lors de la première étape. En fonction de ces succès, nous adapterons nos expériences afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux à utiliser, notamment par les groupes contrôles négatifs, identiques pour chaque candidats vaccins. Le nombre d’animaux choisi par groupe permet de lisser la variabilité entre individu existant dans les études immunologiques et nécessitant a minima 7 souris pour les groupes essais. Nous évaluerons et déterminerons les groupes d'intérêt afin de minimiser au maximum le nombre de souris utilisé au cours de toutes les étapes.

Raffinement

Pour veiller au bien-être de l’animal, les conditions d’élevage, d’hébergement (en collectivité), des soins et des méthodes utilisées pour chaque étape de l’expérimentation seront optimisées pour minimiser douleurs, souffrance et angoisse, tel que l’enrichissement du milieu (copeau de bois, coton, dôme de cellulose et/ou tube rouge transparent). Un suivi quotidien des animaux sera effectué, cela permettra d’augmenter la surveillance en cas d’altération du comportement et d’identifier rapidement si un animal a atteint un des points limites définis ; auquel cas il sera profondément anesthésié puis mis à mort. Dans le cas où nous observons une fièvre ou une douleur, nous mettrons en place un traitement par analgésique ou anti-pyrétique et surveillerons l'animal sur les 48h.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris présentant un système immunitaire complet et reflétant au mieux les réponses que nous pouvons retrouver chez d'autres animaux dont l'homme. Cette faculté est primordiale pour l’analyse de candidat vaccin, notamment dirigé contre le VIH qui nécessite une réponse variée afin de contrôler le virus. Les souris seront âgées de plus de 7 semaines pour s’assurer que le système immunitaire est mature. Des souris plus âgées pourraient biaiser nos analyses due au dysfonctionnement causé par la vieillesse des souris.

33 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse histologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une craniotomie puis une injection stéréotaxique dans le thalamus, avant deux semaines de surveillance, pour valider la diffusion d'un virus thérapeutique. Le porteur prévoit une couverture analgésique et une mise à mort en cas de perte de 20 % du poids. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative expérimentale à ce modèle murin.

Objectifs

Le but du projet est de définir la propagation d'un virus à visée thérapeutique ainsi que son intégration dans les cellules cibles du système nerveux central. Pour cela, nous allons procéder à trois étapes. La première consistera à valider les coordonnées d'injection d'un colorant dans une zone du cerveau de Souris, le Thalamus. Cela nous permettra de nous assurer de la validité et de la reproductibilité du geste technique. Une fois cette étape validée, nous procéderons à l'injection du virus de type adénovirus. Celui-ci s'incorporera dans les cellules du tissu cible et déclenchera l'expression d'une protéine fluorescente que nous pourrons ensuite analyser par histologie. Nous ciblons dans cette étude le thalamus qui n'a jusqu'à présent jamais été ciblé dans notre institut, mais nous maitrisons cette voie d'injection pour d'autres structures. Par ailleurs, ce virus a déjà fait l'objet d'injections dans d'autres structures mais son intégration n'était pas satisfaisante étant donné les populations de cellules atteintes qui ne correspondaient pas au type cellulaire efficace pour permettre l'expression du code génétique véhiculé par ce virus. Finalement, si ces étapes sont validées, nous utiliserons le virus candidat médicament dans une dernière étude afin de valider l'expression du matériel génétique apporté par le virus.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de poursuivre le développement d'un virus candidat médicament dont le but est de traiter les pathologies d'origine génétique du système nerveux central, dans les populations neuronales. Nous prévoyons en effet ensuite d'appliquer le vecteur thérapeutique sur des lignées de souris porteuses d'une mutation génétique, modèles d'une pathologie humaine (Syndrome de l'X fragile). Ce projet consiste donc à une des étapes indispensables du développement d'un candidat médicament.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés durant environ 60 minutes avec une mélange injecté par voie intra-péritonéale. Pour éviter toute douleur durant l'injection cérébrale, un injection sous-cutané d'antalgique sera aussi pratiquée (le geste dure quelques secondes et la couverture antalgique plusieurs heures).

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront une injection stéréotaxique. Celle-ci se réalise sous anesthésie par voie intra-péritonéale et dure environ 1 heure. Durant ce geste, une craniotomie est réalisée suivie d'une injection dans le cerveau. Trente minutes avant l'injection du virus, les animaux recevront une injection de buprénorphine (10 secondes). La zone est ensuite nettoyée et suturée. Les animaux seront ensuite surveillés durant deux semaines puis mis à mort.

Devenir

Tous les animaux doivent être analysés au niveau histologique, ce qui nécessite leur mise à mort.

Remplacement

ce projet s'inscrit dans la mise en place d'un candidat médicament chez l'Homme dont le modèle d'étude principal est une lignée de souris génétiquement modifiées. Il n'existe actuellement pas d'alternative expérimentale.

Réduction

Les effectifs dans les groupes expérimentaux sont réduits mais suffisants pour les analyses histologique ou génétiques planifiées. Il n'est pas possible de les réduire sans impacter la robustesse de l'analyse finale.

Raffinement

Les injections seront effectuées sous anesthésie (Kétamine/Xylazine) avec une couverture antalgique (Buprénorphine)), les animaux maintenus à température à l'aide d'un matelas chauffant et une surveillance étroite post-injection du site d'injection et de l'état des animaux sera réalisée pour réagir à tout signe de souffrance. Un suivi de poids sera mis en place pour les protocoles étalés sur 2 semaines afin de mettre en évidence une baisse de l'état général des animaux le cas échéant. En cas d'une baisse de 20% du poids initial sur une semaine, les animaux seraient euthanasiés immédiatement pour éviter toute souffrance.Des points limites ont été mis en place pour éviter toute souffrance aux animaux.

Choix des espèces

La souris constitue le meilleur modèle d'étude car il existe une lignée Fmr1 KO qui est un bon modèle d'étude de la pathologie ciblée (syndrome de l'X fragile) Les animaux seront agés de 5-6 semaines, correspondant au stade cible pour l'étude de la pathologie dans le projet utilisant les animaux génétiquement modifiés.

974 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection du parasite du paludisme puis subissent des prélèvements sanguins quotidiens pendant sept à dix jours, pour évaluer l'effet d'une mutation sur la résistance à la sulfadoxine. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hyperparasitémie, une anémie et un neuropaludisme, et précise qu'aucun analgésique ne sera administré pour ne pas fausser les résultats. Il affirme que les tests in vitro se sont révélés non reproductibles et qualifie le modèle murin d'"indispensable".

Objectifs

La combinaison sulfadoxine/pyriméthamine est le traitement prophylactique recommandé pour la prévention du paludisme chez la femme enceinte et l’enfant de moins de 5 ans. Cependant, la résistance à cette combinaison thérapeutique est due à l’émergence de mutations sur les gènes dhfr et dhps de Plasmodium falciparum. La mutation I431V de DHPS chez P. falciparum fut identifiée pour la première fois au Nigéria en 2006 et des quintuples mutants de DHPS furent décrits en Afrique Centrale. Cette nouvelle mutation semble être une mutation émergente dans ces pays. A ce jour il n’existe aucune donnée phénotypique de ce génotype. Les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciparum n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. La forte homologie entre les enzymes DHPS de P. falciparum et de P. berghei fait du parasite murin un bon modèle d’études du niveau de résistance à la sulfadoxine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir les premières données phénotypiques dues à la nouvelle mutation I431V de DHPS décrite en Afrique Centrale. L’évaluation de l’effet de cette mutation sur la résistance à la sulfadoxine est primordiale et indispensable pour prédire de l’efficacité du traitement préventif intermittent par sulfadoxine/pyriméthamine utilisé chez les femmes enceintes et les enfants de moins de 5 ans. Ce travail sera une première étape qui permettra d’évaluer la nécessité de la mise en place d’études à grande échelle sur le terrain afin d’actualiser les recommandations mondiales.

Procédures

Injection par voie intra-péritonéale (1 injection, durée estimée 10 secondes). Induction d'une maladie expérimentale : paludisme pendant 7 à 10 jours. Prélèvement sanguin quotidien pendant 7 à 10 jours (durée estimée 10 secondes).

Impact sur les animaux

La souris peut développer une hyperparasitémie accompagnée d’anémie et/ou un neuropaludisme. La surveillance et le suivi quotidiens de la parasitémie permettront de s’affranchir de ces risques.

Devenir

Procédure 1 : Souris et rat euthanasiés au CO2 pour réalisation d'exsanguination. Procédures 2 et 3 : Mise à mort par dislocation cervicale avant apparition des signes de gravité du paludisme (hyperparasitémie et/ou neuropaludisme).

Remplacement

Pour étudier la résistance des parasites aux différents antipaludiques, des tests in vitro peuvent être réalisés. Cependant, les expérimentations in vitro sur des isolats de P. falciaprum menées au laboratoire n’ont pas permis de déterminer de manière fiable et reproductible la concentration inhibitrice à 50% (CI50) de la sulfadoxine. Ces variabilités techniques majeures sont décrites dans la littérature. Un modèle murin in vivo est donc indispensable pour obtenir des données phénotypiques des différents génotypes de DHPS.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée (test de Student). Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Dans un objectif de réduction, des rats seront utilisés à certaines étapes de la procédure 1 afin de recueillir la quantité de parasites nécessaire à l’expérimentation.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est aussi un facteur de variabilité expérimentale. Les animaux seront hébergés en cage de 2 rats ou de 5 souris, conformément aux recommandations de l'établissement utilisateur. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement de l’habitat. Aucun traitement analgésique ne pourra être administré sous peine d'interférer avec les paramètres étudiés. Nous effectuerons une surveillance quotidienne des souris (état général, prise de nourriture, toilette, mouvements), afin de détecter le plus précocement les signes de souffrance. L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des hôtes intermédiaires de Plasmodium berghei et constitue un modèle animal reconnu Des souris âgées de 6 semaines et des rats âgés de 9 semaines seront utilisés puisqu’ils auront terminé leur croissance.

Âgés de deux jours, des souriceaux sont anesthésiés par refroidissement sur la glace, reçoivent dans le cerveau une injection de vecteur viral ou de solution saline, puis retrouvent leur mère au réveil. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'expérience pour prélever leur cerveau. Le porteur attend des pertes lors des injections et des rejets de portée par les mères, et injecte des souriceaux dont le génotype reste inconnu à ce stade, pour tester une thérapie génique sur une lignée porteuse d'une mutation à l'origine d'une forme familiale sévère de SLA. Le comportement moteur doit révéler l'effet du traitement, avec un minimum de 18 souris pour "le test comportemental", sans que le résumé précise lequel.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent un phénotype moteur associé à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de leur stabilité à long terme dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est de réaliser des injections avec des AAV dans un modèle de souris SLA, afin de valider leur effet thérapeutique. Dans un second temps, le comportement moteur des animaux sera analysé afin de valider l'effet de la thérapie génique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous apportera une meilleure compréhension de la SLA et des traitements possibles. Le modèle de souris SLA permettra de tester des approches thérapeutiques permettant de reverser les symptômes de ces souris et d’améliorer leur survie. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. La prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements améliorant leur qualité de vie et une thérapie pluridisciplinaire prodiguées par des professionnels de santé. La compréhension de la physiopathologie de la maladie est donc indispensable à la conception d’un traitement adapté à chaque forme de SLA. Cette étude chez un modèle de souris SLA est un prérequis pour tester ces traitements chez l’Homme ensuite.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec un vecteur AAV ou une solution véhicule (NaCl) chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal (état d'inconscience) et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin d'effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable. De plus, on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant tel que la souris.

Réduction

Les effectifs ont été mis en place suite aux prérequis statistiques et aux résulats de notre étude pilote, permettant tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable, en prenant en compte la variabilité interindividuelle. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de minimum de 18 souris pour le test comportemental est nécessaire. Notre étude pilote nous a montré qu’un taux de 70% de réussite au niveau du site d’injection était obtenu après les injections intracérébrales. Nous avons ainsi défini le nombre d’animaux nécessaires en prenant en compte ces paramètres ainsi que le fait que le génotype sera inconnu au moment de l’injection, les pertes des animaux lors des chirurgies ainsi que le potentiel rejet des mères après les injections. En fonction de la normalité des données (répartition en cloche) les tests statistiques paramétriques ou non paramétriques seront utilisés afin de comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Lors des chirurgies les mères seront isolées de leur portée. Les souriceaux seront injectés et après le réveil ils seront réintroduits dans leur cage initiale. Ils seront marqués avec leur propre urine afin de masquer toutes odeurs liées à la procédure chirurgicales. Cela évitera un rejet de la mère. Les mères seront réintroduites dans leurs cages une fois la portée injectée et réveillée. Les cages ne seront pas changées lors de la période post-opératoire (48h minimum). Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Cette couverture possédant une sonde thermique elle nous permettra de réaliser un retour progressif à 37°de la température corporelle du souriceau. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure. Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, à un stade précoce du développement cérébral, pour permettre une expression optimale du matériel génétique.

4 200 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et environ 200 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un candidat médicament par différentes voies, parfois sous chirurgie, puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des ponctions de liquide céphalorachidien, pour mesurer la pharmacocinétique de molécules en développement. Le porteur indique que les effets indésirables des produits ne sont pas prévisibles au départ et seront gérés au cas par cas. Il affirme que les méthodes in vitro ou in silico n'existent pas ou ne suffisent pas, sans autre justification.

Objectifs

Chaque étude de ce projet a pour objectif principal d’étudier le devenir d’une molécule, candidat-médicament, chez la souris, lorsque cette espèce est utilisée au cours du développement préclinique de cette molécule (pharmacocinétique). Pour cela, au cours de chaque étude, des prélèvements sanguins répétés et/ou un prélèvement de liquide céphalorachidien (LCR) sont réalisés chez l’animal vigile ou transitoirement anesthésié après l’administration par différentes voies du candidat-médicament comparé ou non à une autre molécule. Ces prélèvements sont utilisés pour mesurer dans le temps la concentration du candidat médicament administré et éventuellement la concentration de différents autres marqueurs biologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée (souris) grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.

Procédures

Les souris seront généralement soumises à une ou des administrations du candidat-médicament en vigile (quelques secondes à 1-2 min), sous anesthésie (1 à 5 min) ou au cours d’une chirurgie (10 à 30 min). L’administration du candidat-médicament nécessitant une chirurgie ne sera réalisée qu’une seule fois. Les autres voies pourront être utilisées plusieurs fois en suivant les recommandations éthiques. Puis, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins répétés et/ou de LCR (Liquide Céphalo Rachidien). Concernant les prélèvements, les volumes prélevés, la fréquence de prélèvement et les temps de récupération suivent les recommandations éthiques. En général, la durée du prélèvement sanguin (contention et prélèvement) n’excède pas 2 min.

Impact sur les animaux

Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Dans ce projet, les administrations nécessitant une chirurgie est composée d'un protocole chirurgical et analgésique maitrisé ainsi que d'un suivi post-opératoire adapté, ce qui permet de limiter au maximum l'impact négatif sur l'animal. Après récupération, les animaux seront maintenus en groupe sociaux pour améliorer leur bien-être et la qualité des données recueillies.

Devenir

Les animaux seront généralement mis à mort à la suite de l’étude pour la réalisation de prélèvements terminaux (sang, tissus). En l’absence de prélèvements terminaux, certains animaux pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée, si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés et après l’avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet pratiqué sur l'animal ne peut être remplacé par d'autres méthodes expérimentales car ces méthodes de substitution (in vitro ou in silico) n'existent pas ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique qui sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu par : - le recours à des procédures les moins invasives possibles - le suivi d’éventuel signes cliniques - la recherche des points limites - le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire - la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse .

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour la réalisation d’étude de pharmacocinétique permettant d’étudier le devenir du produit testé lorsque ces rongeurs sont utilisés au cours du développement préclinique de ce produit. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

585 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules ou sont suivies dix à douze mois pour laisser survenir une leucémie qui se manifeste par des tumeurs palpables, pour analyser quatre facteurs de la leucémogenèse B. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les déplacements et prévoit une mise à mort avant que la tumeur ne dépasse une taille définie. Il affirme que ces processus ne peuvent être étudiés dans des lignées cellulaires et conclut que la génétique connue de la souris "impose" son choix.

Objectifs

Les cellules B jouent un rôle crucial dans notre système immunitaire grâce notamment à leur capacité à produire des anticorps. Dans certains contextes encore mal compris, de rares cellules B peuvent devenir cancéreuses. Ce processus pathologique peut survenir à différents stades du développement des cellules B. En général, la leucémie touche des cellules B aux stades précoces ou immatures de leur développement, alors que les lymphomes ou myélome ciblent des cellules B plus matures. Malgré d’intenses efforts et d’importantes avancées, les mécanismes et les facteurs qui déclenchent le processus tumoral à des stades déterminés du développement des cellules B et favorisent l’expansion des rares cellules cancéreuses initiales, ou au contraire leur blocage, restent obscurs. Ceci est en grande partie dû à l’absence de modèles animaux appropriés qui miment la situation chez l’Humain. Notre projet est à visée biomédicale et a pour objectif d’analyser le rôle de 4 facteurs, connus pour jouer un rôle important dans le développement des cellules B, dans la survenue de la leucémie. Ces 4 facteurs seront étudiés dans un modèle de leucémie chez la souris. Nos travaux relèvent de la recherche publique et sont réalisés au sein d'une unité mixte de recherche.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de comprendre le rôle de 4 facteurs dans la prolifération tumorale, ou au contraire dans son inhibition, au cours de la leucémie B. A court et moyen termes, la réalisation du projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes en jeu lors de la prolifération tumorale. Mais au-delà de cet aspect fondamental, le projet a des implications pour la santé humaine dans la mesure où la leucémie B reste un problème de santé majeur, en particulier en raison des problèmes récurrents de rémission observés chez les patients, chez qui les conséquences sont souvent fatales. Cette étude devrait donc apporter une contribution originale et importante aux efforts déployés par différentes équipes pour la compréhension des mécanismes de la leucémogenèse en particulier et des différents cancers touchant les cellules B en général (lymphome, myélome, etc). A plus long terme, les résultats obtenus devraient ouvrir la voie à des approches thérapeutiques, notamment par des criblages pharmacologiques et des essais d’immunothérapie, ciblant les facteurs qui se révéleront les plus prometteurs.

Procédures

Dans une procédure, les souris subiront une injection de cellules et d’un suivi de la survenue de la leucémie. A la fin de la procédure, les souris seront mises à mort et certains de leurs organes prélevés pour analyse. Dans une deuxième procédure, aucune intervention n’est prévue. Les souris seront suivies pendant 10-12 mois pour vérifier la survenue de la leucémie, qui se manifeste par l’apparition de tumeurs d’abord palpables à la main lors des examens réguliers, puis visibles à l’œil nu. A la fin de la procédure, les souris seront euthanasiées et certains de leurs organes prélevés pour analyse.

Impact sur les animaux

Deux types de nuisance ou d’effets indésirables sont attendus dans le cas du protocole rapide : l’injection intraveineuse est relativement douloureuse pour les souris. L’injection se fera au niveau des queues des souris. Les souris seront d’abord mises sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). Une anesthésie locale sera en plus réalisée en appliquant une pommade sur la zone de piqure. Par ailleurs, en cas de survenue de leucémie, l’apparition de tumeurs peut gêner le mouvement des souris (voir point 3 : Raffinement). Dans le protocole standard, aucune injection n’est prévue et les nuisances ou effets indésirables sont ceux liés à l’apparition des tumeurs, i.e., mobilité réduite. Dans tous les cas, nous adopterons en plus des critères généraux d’arrêt par rapport à la souffrance (arrêt d’alimentation, amaigrissement, poil hérissé, prostration durable) un critère lié à la taille de la tumeur (< 5 mm). Avant ce point limite, les souris seront mises à mort pour analyse.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyse.

Remplacement

La nature des travaux que nous menons, et qui concernent la physio-pathologie du développement des cellules B, impose le choix de la souris dans la mesure où sa génétique est bien connue. En effet, les processus développementaux que nous étudions ne peuvent être abordés dans leur complexité physio-pathologique (développement, interactions avec d’autres molécules et cellules, vieillissement, etc) dans des lignées cellulaires ou d’autres systèmes in vitro. Néanmoins, aussi souvent que possible, dans le respect du principe de remplacement, nous utilisons des lignées cellulaires ou d’autres systèmes de culture cellulaire. Enfin, notre démarche inclut également la responsabilisation de tous les membres de l’équipe amenés à faire de l’expérimentation animale grâce notamment à des formations spécifiques et au strict respect des règles en vigueur.

Réduction

Dans toute notre démarche, de l’hébergement des souris à l’expérimentation, nous nous faisons un devoir de respecter la règle des 3R (Réduction, Remplacement, Raffinement). En étroite interaction avec les animalier(e)s, le nombre des souris est réduit au strict nécessaire permettant de réaliser nos expériences en tenant compte de la reproductibilité et de la significativité statistique. Ci-dessous, nous présentons le nombre de souris prévues dans les 2 cas de figures : 1) succès du protocole rapide, 2) échec du protocole rapide, impliquant le recours au protocole standard. A noter que les nombres totaux de souris sont donnés pour la durée globale du projet. En pratique, les expériences seront échelonnées dans le temps et conditionnées par les résultats de l’étude pilote. 1. Succès du protocole rapide : Dans un premier temps, nous procèderons à une étude pilote dans laquelle nous nous focaliserons sur un seul facteur (sur la base des données de la littérature). Nous utiliserons donc 3 lignées de souris : une pouvant développer à terme la leucémie, une correspond au facteur cible (et contrôle négatif), et une qui permettra l’étude de l’effet du facteur étudié sur la survenue de la leucémie (amplification ou inhibition) (45 souris au total). En cas de succès de l’étude pilote, l’étude défintive, réalisée une fois, sera étendue aux 4 facteurs. Dans ce cas le nombre de souris prévu (incluant tous les contrôles) est de 540 souris. 2. échec du protocole rapide : En cas d’échec de l’étude pilote, nous adopterons une procédure consistant en un suivi à long terme des lignées. Dans ce cas, le nombre total de souris est de 360 souris, dont la moitié sera hébérgée en zone stérile et l’autre moitié en quarantaine.

Raffinement

Le raffinement inclut d’un côté les conditions d’élevage et d’hébergement qui sont optimisées par les animalier(e)s (nombre de souris ne dépassant pas 5/cage, inclusion de différents objets dans les cages, nourriture au sol en cas de mobilité réduite, etc), et d’un autre côté le choix des méthodologies induisant le moins de souffrance. Notre souci premier dans ce contexte est la prévention de souffrances inutiles, incluant notamment l’observation régulière tous les 2 jours, grille de scoring (établie par la SBEA, structure du bien-être animal), respect des nouvelles règlementations mises en place, etc. Pour ce qui est de la grille de scoring, elle est basée sur 3 critères majeurs : I. Aspect (état corporel, état du pelage et de la peau, écoulement, yeux, bouche) II. Fonctions corporelles (surtout respiration) III. Comportement (interaction sociale, posture et mobilité, comportements indésirables) La grille comporte une échelle de 0 à 3 à renseigner pour chaque souris à chaque observation : 0 (normal), 1 (légère altération), 2 (altération forte), 3 (altération très forte). Le score final se décline comme suit : Score total de 0-3: Normal Score total de 4-7: Observer attentivement, envisager l'utilisation d'un antalgique Score total de 8-11: Souffrance, prévoir un mode de soulagement et observer régulièrement. Demander un 2ème avis. Considérer l'euthanasie Score total de 12-15: Souffrance sévère. Fin de la procèdure par l'euthanasie de l'animal (sachant que la procédure est impérativement arrêtée lorque le total de point atteint 12).

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle d'étude est justifié à plusieurs titres : 1) sa génétique est bien connue permettant une certaine souplesse dans le choix du fond génétique approprié aux questions posées, 2) il existe de nombreuses lignées mutantes permettant des analyses génétiques fines, 3) le fonctionnement de son système immunitaire est relativement bien connu, 4) son ontogénie est bien connue de sorte que les lymphocytes B peuvent être prélevés à des stades précis du développement, 5) il existe une grande panoplie d'anticorps spécifiques et de banques de séquences très utiles à nos travaux et projets.