Rongeurs
Etude du rôle des NETs dans la progression tumorale du cancer de la peau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans le derme qui provoque un cancer de la peau, avec troubles de la locomotion et signes de douleur suivis pendant 40 jours au moyen d'une grille de points limites détaillée incluant nécrose, ulcération et perte de poids, avant le prélèvement des tumeurs. Le porteur étudie le rôle des NETs, des structures libérées par certains globules blancs, dans la progression tumorale. Il indique avoir d'abord travaillé sur des cultures in vitro.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact des voies de signalisation responsables du recrutement des neutrophiles et de la formation des Neutrophil Extracellular Traps (NETs) dans la progression tumorale des carcinomes squameux (CS) de la peau in vivo. En effet, nos résultats obtenus in vitro montrent que les neutrophiles et NETs entrainent la progression des CS via i) un effet direct sur la prolifération des cellules tumorales ; i) l’activation des fibroblastes et ainsi la mise en place d’un environnement riche en matrice extracellulaire ; ii) l’inhibition des lymphocytes T cytotoxiques. En effet, cet environnement est indispensable au développement tumoral et à l’invasion des CS. Nous voulons maintenant confirmer nos résultats chez la souris en utilisant un modèle d’injection de cellules tumorales de souris (cellules SCC38) dans le derme des souris. En effet nous nous attendons à une diminution de la progression tumorale après inhibition du recrutement des neutrophiles et NETs et de leurs sous-effecteurs.
Bénéfices attendus
Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de CS. Cette étude permettra notamment de mettre en évidence les neutrophiles et les NETs comme cibles thérapeutiques permettant de contrecarrer la progression des CS.
Procédures
Nous implanterons 500 000 cellules de la lignée SCC38 dans le derme de souris FVB/n femelles rasées placées sur un tapis chauffant, sans incision sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintient au masque à 2.5% isoflurane d’environ 5 minutes, temps nécessaire au rasage des souris et l’injection des cellules dans les souris). Pour cela une seringue à insuline (29 G) sera utilisée pour injecter les cellules tumorales dans le derme des souris, au niveau du dos, dans un volume de 50 uL de PBS (communément utilisé pour l’injection intradermique). L’administration des inhibiteurs/anticorps et de leur véhicule commencera 7 jours après implantation des cellules tumorales et jusqu’à la fin de l’expérience. L’administration des inhibiteurs/anticorps se fera IP dans un volume de 200uL (via une seringue à insuline, 29G). Une rotation des points d’injection IP sera effectuée.
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des problèmes de déplacements et des signes de douleurs. Le bien-être animal sera évalué de manière objective grâce à des fiches d’évaluation adaptées à cette procédure (cf. annexe 1). Le suivi des animaux sera effectué 2 fois par semaine jusqu’a la mise a mort des animaux, au maximum 40 jours après implantation des cellules tumorales SCC38 ou lorsqu’un point limite sera atteint. Ce projet a été construit en respectant la règle des 3R.
Devenir
Les animaux seront a mis a mort par dislocation cervicale puis les tumeurs primaires seront prélevés pour analyse ex vivo. Les critères d’analyses des échantillons utilisés seront l’évaluation i) de la taille des papillomes/carcinomes ; ii) de la présence de neutrophiles/NETs/lymphocytes/fibrose dans les papillomes/carcinomes ; iii) de la fibrose tumorale. De plus, nous ne considérons pas comme un échec qu’un traitement n’aboutissent pas à un changement du nombre/taille des papillomes/carcinomes puisque la compréhension de ce critère nécessite l’analyse histologique/biochimique des échantillons à la fin de l’expérience.
Remplacement
Remplacer : Nos recherches ont décrit les cultures in vitro comme une méthode de remplacement pour l’étude du développement tumoral métastatique. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur les capacités tumorales des SCC38. Ces cultures ne récapitulent pas la complexité de l’organe (notamment les relations entre les cellules tumorales, les neutrophiles, les fibroblastes et les lymphocytes CD8), nous avons donc recours aux animaux.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur le volume tumoral avec un nombre de souris minimum. Les tests statistiques nous permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires pour comparer les valeurs moyennes des groupes expérimentaux ont été réalisés via le logiciel BiostaTGV (recommandé par l’INSERM) avec les estimations suivantes : Moyenne du premier lot : 1000 (1cm3) Moyenne du deuxième lot : 700 (0.7 cm3) Ecart type commun omega : 310 Risque de première espèce alpha : 0.05 Puissance 1 – beta = 0.95 Les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. De plus, les résultats déjà publiés avec ce modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Toutes ces données nous ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des problèmes de déplacements et des signes de douleurs. L’implantation des cellules tumorales, les souris se fera sur un tapis chauffant, sans incision sous anesthésie générale (induction à 5% isoflurane pendant une minute, et maintien au masque à 2.5% isoflurane d’environ 5 minutes, temps nécessaire au rasage des souris et l’injection des cellules dans les souris). Afin d’évaluer le bien-être animal au mieux et de manière objective, nous avons établi des fiches d’évaluation du bien-être animal adaptées à cette procédure (cf. annexe 1). Ces fiches contiennent des points limites qui correspondent à un score maximum qui prend en compte plusieurs paramètres. L’état des animaux sera évalué 2 fois par semaine et un score sera donné aux paramètres suivants. Prostration=point limite Manque de toilettage=1 Mauvais état de la peau=1 Plaie=3 Dos vouté=3 Ventre creux=point limite Plaie majeure=point limite Difficulté respiratoire=point limite Tremblement=1 Piloérection=point limite Convulsion=point limite decubitus=point limite Ataxie=point limite Paralysie=point limite Vocalisations=1 Agressivité=3 Saignement muqueuse=1 Prolapsus mineur=1 Prolapsus majeur=3 Maigreur=3 Perte de poids inferieur 5%=1, Perte de poids inferieur 10%=2 (un sirop de framboise 1% sera donne) Perte de poids inferieur 15%=3 (de la nourriture gélifiée sera donne) Perte de poids de 15%=point limite Nécrose=point limite Ulcération=point limite Tumeur de 0.75cm3 =2, tumeur de plus de 1cm3=point limite Rougeur site IP=1 (antiseptique quotidien jusqu’à disparition) Gonflement site IP=1 (antiseptique quotidien jusqu’à disparition) Peau tanne site IP=1 (antiseptique quotidien jusqu’à disparition) Suintement site IP=2 (antiseptique quotidien + antibiothérapie per os quotidien jusqu’à disparition) Un score de 9, évalué selon les différents critères de la grille de score, correspond à un point limite et entrainera la mise a mort immédiate de l’animal. De plus, les résultats obtenus avec ce même modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie et justifient les procédures proposées.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans le développement des CS. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. En outre, les modèles de tumeur primaire chez la souris sont couramment utilisés par la communauté scientifique, et nous ont déjà permis de dévoiler ; 1) le rôle des fibroblastes dans l’invasion tumorale 2) le rôle des NETs dans le réveil des cellules tumorales ; 3) le rôle des NETs dans la résistance aux chimiothérapies. De plus, le modèle d’implantation des SCC38 dans le derme de la souris a déjà été utilisé pour étudier le développement des CS. Les injections de cellules tumorales SCC38 seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines ce qui représenten l’âge adulte chez la souris. En effet, nous nous intéressons au développement des cancers de la peau chez l’adulte et non chez l’enfant. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront au maximum 40 jours après injection des cellules tumorales (ou lorsque le point limite sera atteint).
Evaluation de l’efficacité de la rifampicine dans un modèle de pneumonie à Acinetobacter baumannii chez la souris – Recherche de la plus petite dose optimale de rifampicine.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont d'abord rendues immunodéprimées par deux injections, puis infectées par une bactérie hospitalière résistante, Acinetobacter baumannii, par voie intranasale sous anesthésie, avant une mise à mort 24 heures après l'infection pour compter les bactéries dans les poumons et la rate. Le porteur cherche la plus petite dose efficace de rifampicine. Il affirme que le recours aux animaux est une étape obligatoire et réglementaire du développement de médicaments.
Objectifs
L’objectif du projet est de définir la plus petite dose et fréquence d’administration d’un antibiotique (ici la rifampicine) capable d’induire une diminution bactérienne dans les poumons des souris infectées par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes (CRAb). En effet les carbapénèmes constituaient la dernière ligne de traitement antibiotique efficace contre ce pathogène fréquemment associé aux infections nosocomiales (acquises en milieu hospitalier), telles que les pneumonies sévères acquises sous ventilation chez les patients de réanimation ou immunodéprimés. Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude réalisée par le laboratoire ayant donnée de bons résultats avec la rifampicine dans ce modèle d’infection.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une étude déjà réalisée par notre équipe ou les souris infectées et traitées par de la rifampicine à 25 mg/kg administrée 4 fois par jour a montré une réduction bactérienne pulmonaire de plus de 4 Log 24h après l’infection par une souche d’Acinetobacter baumannii résistante aux carbapénèmes. Après plus d’investigations, il s’est avéré que la rifampicine administrée était surdosée par rapport à la clinique. Le but de cette étude est d’évaluer la plus petite dose et fréquence de rifampicine seule ou en association avec un carbapénème permettant une diminution de la charge bactérienne dans le poumon qui se rapproche au maximum de la clinique. Cette combinaison pourrait représenter une nouvelle ligne thérapeutique contre les infections à A. baumannii résistant aux carbapénèmes.
Procédures
L’infection se fera par voie intranasale par l’injection de 50µL à l’aide d’une pipette et sous une petite anesthésie volatile (isoflurane 2%). L’administration des antibiotiques et d’un immunosuppresseur (endoxan) se fera par voie intrapéritonéale (ip). Les souris recevront deux injections d’endoxan en ip à J-4 et J-1 avant infection afin d’obtenir une neutropénie significative mais non létale.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle d’infection, aucune atteinte systémique liée à l’infection n’est attendue (vérifié dans d’autres études réalisées par le laboratoire). Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté. En effet, l’appréhension et l’entrainement liés au geste technique d’injection intra-nasales ont déjà été réalisés sur d’autres expériences et sont maintenant bien maitrisés. Avant l’infection, les souris seront immunodéprimées avec un protocole bien défini (150 mg/kg de endoxan à J-4 et 100 mg/kg à J-1). Ce protocole a déjà été utilisé dans plusieurs études et n’a montré aucun effet indésirable sur les animaux. Les concentrations d’antibiotiques utilisées seront en accord avec les données de la littérature sur ce sujet. Aucune toxicité n’est rapportée. Du fait des temps d’administration des antibiotiques (toutes les 8h pour la rifampicine et toutes les 2h pour le méropénème), la surveillance sera accrue sur la totalité de l’étude (24h). Si l’animal présente des souffrances extrêmes (convulsions, détresse respiratoire, animal amorphe et non réactif aux stimuli), alors une mise à mort prématurée sera mise en place.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort 24h post infection afin de dénombrer la charge bactérienne présente dans les poumons et dans la rate.
Remplacement
La rifampicine est un antibiotique antibactérien de la famille des rifamycines, antituberculeux, antilépreux, dont le mode d'action est la formation d'un complexe stable avec la RNA polymérase des bactéries. Utilisé en clinique, son spectre antibactérien est large et comprend les staphylocoques, les streptocoques et les bactéries à croissance intracellulaire telles que les mycobactéries. Dernièrement, des études in vitro et in vivo ont démontré une activité intéressante chez Acinetobacter baumannii multi résistants (en fonction des résistances). La mesure de l’efficacité de la rifampicine ne peut se faire sans avoir recours au modèle animal ce d’autant que certains échecs de traitement ne peuvent être anticipés autrement. Pour l’heure, le recours à des animaux est une étape obligatoire et règlementaire dans le développement de molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (8 souris par groupe) qui permettront de répondre aux hypothèses énoncées et permettre une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne dans les poumons par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)).
Raffinement
4. D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, et risquerait même de faire flamber l’infection. Les injections intra-nasales seront réalisées par du personnel compétent et expérimenté et sous anesthésie volatile (isoflurane 2%). Un programme d’enrichissement de l’environnement sera mis en place pour prévenir les comportements anormaux et problèmes de santé lié au stress de l’animal. Les animaux seront hébergés à 8 par cage. De plus, une surveillance accrue (toutes les 8h pour la phase 1 et toutes les 2h pour la phase 2) sera réalisée tout au long de l’étude. 5.
Choix des espèces
Les souris Balb/c représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne. D’autre part, il s’agit de l’espèce utilisée pour la mise au point du modèle d’infection pulmonaire à Acinetobacter baumannii dans d’autres projets. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 20-22g (même poids que pour les précédentes études).
M. tuberculosis et le modèle murin: essais d’efficacité́ de médicaments contre une épreuve virulente induite par des bacilles de la tuberculose chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol, puis reçoivent des composés par gavage cinq jours par semaine pendant quatre à huit semaines, avec une perte de poids pouvant conduire à la mort et une mise à mort à 20 % du poids perdu, avant le prélèvement des poumons et de la rate. Le porteur situe le projet dans un consortium européen et revendique un "besoin" de générer un maximum de données. Il affirme que les essais précliniques reposent sur le recours à l'"organisme entier".
Objectifs
Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la sélection in vivo de molécules comme traitement ou encore vaccins avant leur passage en essais cliniques. Le projet européen, dans lequel nous sommes partenaires, est engagé dans le développement de nouvelles molécules anti-tuberculeuses. Ce projet, qui ne compte pas moins de 30 partenaires de 13 pays différents, a pour ambition d’accélérer les processus qui conduiront à la sélection de nouveaux composés et nouvelles combinaisons efficaces comme traitement contre la tuberculose avant leur entrée en phase clinique. Les nouvelles molécules sont synthétisées par des groupes pharmaceutiques partenaires, sont testées par une partie du consortium en charge des expériences in vitro et les plus prometteuses (seule ou en combinaison) passent ensuite à l’étape in vivo pour évaluer leur véritable potentiel sur un organisme vivant. Nous intervenons, avec d’autres groupes, d’autres modèles, à ce niveau-là. Notre participation à ce projet permettra de générer in vivo des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques chez le modèle murin pour un nombre limité de molécules savamment sélectionnées ; données qui, analysées et intégrées à l’ensemble de celles générées par le consortium, participeront donc à l’optimisation et au développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux, à valider ou non leur passage en phase clinique.
Bénéfices attendus
Les données générées par nos expériences combinées à celles des divers partenaires rendront compte de l’efficacité de nouveaux composés contre l’agent pathogène de la tuberculose, dont certains, telle est l’ambition de ce projet, pourront passer en phase clinique. A cela, l’apport de nouvelles technologies, l’apport de nombreuses données inédites pour caractériser la tuberculose et son évolution in vivo (imagerie, biomarqueurs…) seront un support essentiel pour le développent de meilleures armes pour lutter contre cette maladie qui demeure un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial.
Procédures
1. L'infection des souris par des souches virulentes de bacilles tuberculeux est effectuée par une exposition à un aérosol. Une seule exposition d’une vingtaine de minutes en début d’expérience. 2. Lors du traitement, les composés sont administrés par gavage 5 jours par semaine pendant 4 à 8 semaines. Il y a 1 gavage par jour par souris. Le nombre de gavages total par souris au cours de l’expérience variera selon qu’une souris soit un contrôle du niveau d’infection ou bien reçoive un traitement de 8 semaines, ou encore permette d’obtenir des données pharmacodynamiques à des stades intermédiaires, par conséquent de 0 à 40 gavages. Le geste technique en lui-même ne prend que quelques secondes. 3. Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués au niveau de la queue pour l'étude de la biodisponibilité́ des composés. Un faible volume de sang (~ 30 µl) sera prélevé au niveau d’une incision faite sur la veine caudale. L’animal, vigile, est pour cela placé dans un dispositif l’immobilisant et ne laissant dépasser que la queue. Une pression est ensuite effectuée au niveau de l’incision avec une compresse imbibée d’alcool pour stopper le saignement. Il y aura au maximum 2 prélèvements – à plusieurs heures d’intervalle – pour chaque souris sélectionnée pour l’étude pharmacologique. Il s’agit d’un acte rapide qui doit prendre 1 à 2 min. 4. Pour l’analyse de biomarqueurs, des prélèvements de sang seront effectués par ponction cardiaque sur animaux anesthésiés avant leur mise à mort prévue pour le prélèvement des organes. Sont concernés l’ensemble des animaux de l’expérience (maximum 120). Une fois les animaux anesthésiés, le geste technique ne prend que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Sur la base de nos expériences, l’apparition de signes cliniques (déambulation perturbée due à un début de parésie et piloérection) plusieurs semaines après une infection avec des bacilles tuberculeux est précurseur d’une perte de poids qui a terme peut conduite à la mort des animaux. Habituellement à partir de leur apparition, un suivi strict du poids d’abord 2 fois par semaine puis à fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué. Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considérée comme point limite et les animaux concernés seront mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Dans le cas présent, et du fait d’un besoin de générer un maximum de données relatives aux expérimentations, les animaux identifiés par un marquage aux oreilles seront pesés une fois par semaine avec pour premier point celui correspondant au jour de l’infection. A noter que la probabilité de voir l’apparition de signes cliniques sera fortement diminuée pour les groupes d’animaux traités avec une molécule anti-tuberculeuse. Une attention particulière sera portée sur le groupe témoin non-traité avec toujours pour point limite la perte de 20 % du poids.
Devenir
Tous les animaux au cours de la procédure doivent être mis à mort pour prélever les organes cibles (poumons et rate) pour déterminer les charges bactériennes.
Remplacement
Cet important projet comprend de nombreuses études in vitro pour évaluer, entre autres, l’efficacité́ bactéricide des composés (exemple : via l’infection de lignée cellulaire). Néanmoins elles permettront de ne répondre qu’à une partie de la problématique. Ces modèles ne permettent pas d’identifier et donc de caractériser, de façon biologiquement pertinente, tout ce qui concourt, par exemple, à la colonisation du poumon et à l’établissement plus ou moins durable des bactéries. En d’autres termes le recours aux souris, chez qui le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons plus ou moins importants selon la virulence de la souche, permet de reproduire les processus rendant compte de ce qui sous-tend les premières phases du parasitisme – colonisation, persistance ...- des différentes populations des bacilles tuberculeux et rend compte de manière plus approfondie des phénotypes complexes d’une interaction hôte-pathogène. Les essais pré-cliniques de nouveaux médicaments antituberculeux reposent entièrement sur la combinaison des méthodologies in vitro avec ces approches in vivo (comprendre la réponse d’un organisme vivant « entier » à un traitement) avant un éventuel passage en phase clinique.
Réduction
Au sein de ce projet, une équipe de statisticiens spécialisés dans les études pré-cliniques a pour rôle de concevoir avec les expérimentateurs les designs expérimentaux en trouvant le meilleur équilibre entre les capacités (techniques et d’hébergement) des différentes équipes et la pertinence des données à générer pour répondre au mieux aux problématiques posées. Et ce, avec toujours en tête, la réduction au minimum du nombre d’animaux nécessaire. Exemples : .pour le groupe témoin traité avec une molécule dont l’efficacité est connue et très bien documentée, seul un nombre limité d’animaux seront mis à mort et uniquement en un seul point de cinétique. La charge bactérienne alors estimée en UFC par rapport à celle avant traitement donneront une tendance sur l’efficacité de la réponse qui sera comparée aux multitudes de données pour ce composé déjà existantes et qui permettront d’établir la cinétique sans avoir eu à utiliser des animaux pour des points de cinétique intermédiaires. .pour une étude avec un nouveau composé et donc avec peu voire pas de donnée de disponible, plus d’animaux seront nécessaires pour décrire la réponse au traitement au cours du temps. Néanmoins, nous ne cesserons d’optimiser au minimum le nombre d’animaux requis. Il peut être envisagé d’avoir 5 animaux pour seulement 1 ou 2 points clefs de la cinétique, comme 4 semaines et 8 semaines – dans le cas d’un traitement de 8 semaines – et ainsi obtenir des données statistiquement robustes sur ces points charnières. Ensuite sur des points intermédiaires comme à 1 semaine, 3 semaines ou 5 semaines après le début de traitement, ne mettre à mort « que » 2 animaux serait suffisant pour estimer la cinétique de la réponse. A nouveau, tout ceci repose sur l’étroite collaboration mise en place avec ces spécialistes de la modélisation informatique d’essais pré-cliniques qui analyseront l’ensemble des résultats du consortium. La procédure expérimentale ne cessera d’être optimisée, notamment en termes de nombre de points d’observation / nombre d’animaux par points au cours du traitement ou encore sur la durée entre l’ingestion des composés et le prélèvement de sang périphérique, avec toujours cette considération à minimiser les contraintes de manipulations et réduire au minimum le nombre d’animaux pour l’obtention de données utiles. A noter qu’il a été délibérément choisi que ce soient les mêmes animaux qui serviront à l’obtention des données pharmacocinétiques et des données pharmacodynamiques.
Raffinement
Des observations régulières des animaux sont effectuées tout au long de l’expérience : d’une part lors de la pesée hebdomadaire depuis l’infection jusqu’au début du traitement puis au cours des administrations quotidiennes des composés. De manière plus précise, nous serons sensibles à l’apparition du moindre signe clinique telles la parésie et la piloérection qui sont précurseurs, sur la base de nos expériences, d’une perte de poids. Dès apparition de ces signes cliniques, un suivi strict du poids à une fréquence plus importante selon la cinétique de la perte de poids est effectué (de 2 fois par semaine à tous les jours jusqu’à 2 fois par jour, l’animal étant mis à mort en fin de journée s’il est estimé que le point limite sera atteint avant la pesée du lendemain matin). Dans le cas d’une parésie importante, qui pourrait rendre l’accès à la nourriture difficile, des aliments et du diet gel seront déposés dans le fond de la cage pour en faciliter l’accessibilité. La perte de 20 % du poids sera considéré comme point limite et l’animal concerné sera mis à mort (le poids référence étant le poids le plus élevé atteint par l’animal juste avant que ne débute la perte de poids). Il est à noter également que les animaux ne sont jamais privés de nourriture et de boisson. Pendant la durée de l’expérience, ils restent dans leur environnement habituel.
Choix des espèces
Le modèle souris continue de jouer un rôle essentiel dans la recherche in vivo de nouveaux traitements anti-tuberculeux. Le développement de la maladie est assez proche de l’homme de par notamment les réponses immunitaires à l’infection tuberculeuse ou encore la formation de granulomes au niveau des poumons. Pour ce projet nous utiliserons des souris commerciales immunocompétentes C57BL/6 et BALB/c pour lesquelles de nombreuses données bibliographiques d’études pré-cliniques existent. Nous serons également amenés à utiliser un modèle de souris dont l’intérêt est grandissant depuis quelques années : la souris C3HeB/FeJ dite « Kramnik ». Il s’agit d’un modèle plus susceptible à l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis pouvant induire des lésions nécrotiques et reflétant au final plus fidèlement la stratification et la pathogénèse de la tuberculose chez l’homme. Nos travaux sont effectués sur des animaux adultes car nous avons besoin d’organisme mature en particulier sur le plan immunitaire.
Etude du dysfonctionnement des cellules Natural Killer en contexte tumoral dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales qui provoque une pousse tumorale, avec baisse des interactions sociales et de la mobilité dans les dernières 24 heures, avant le prélèvement de plusieurs organes pour analyser les cellules Natural Killer. Le porteur relie le projet à un financement de la Ligue contre le Cancer. Il affirme que la complexité du système immunitaire rend impossible son étude in vitro.
Objectifs
Les cellules NK (Natural Killer) sont primordiales dans la défense anti-tumorale. En effet, celles-ci appartiennent à la première ligne de défense du corps contre les agents pathogènes et les cellules cancéreuses en ayant les capacités de les éliminer suite à leur reconnaissance. Cependant, lorsqu'elles sont trop sollicitées, celles-ci s'épuisent et n'arrivent plus à éliminer les cellules tumorales ce qui explique l'échappement tumoral. Ce projet vise à générer et étudier une population de cellules NK dites "épuisées" dans le but d'identifier des cibles thérapeutiques pouvant bloquer ce phénomène impliqué dans l'échappement tumoral. Nous avons identifié de multiples altérations chez ces cellules NK épuisées mais les conditions de génération de cette population ainsi que la chronologie des dysfonctions sont inconnues. Le but de ce projet, intégré à un projet financé par la Ligue contre le Cancer (équipe labelisée) est de mieux comprendre les conditions de génération de cette population afin de pouvoir éventuellement interférer avec elles pour empêcher ou restaurer une fonctionnalité des cellules NK normale dans un modèle tumoral chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les causes de l'épuisement des cellules NK en contexte tumoral. Nous espérons que ces données conduiront à l'élaboration de nouvelles thérapies., que ce soit des thérapies cellulaires (permettant le transfert des cellules NK insensible à l'épuisement) ou médicamenteuse (composés ciblant des voies de signalisation impliquées dans l'établissement de l'épuisement).
Procédures
Des injections intra-veineuses (dans la veine caudale des souris) seront réalisées une seule fois chez les animaux. La durée de ce geste est compris entre 10 et 30 seconde à partir du moment où l'animal est prêt.
Impact sur les animaux
La pousse tumorale s'accompagne d'effets indésirables pour les animaux. Ceci se caractérise par une baisse des intéractions sociales. Dans certains cas, une réduction de la mobilité des animaux est observée. Ceux-ci n'apparaissent qu'au cours des dernières 24h précédent la mise à mort des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dans le but d'analyser les cellules NK présentes dans les organes (rate, moelle, foie, poumons...).
Remplacement
Le système immunitaire est biologiquement très complexe, faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude par des tests in vitro exclusivement. La principale problématique étant que l'on ne connait pas l'ensemble des paramètres du système.
Réduction
L'utilisation de techniques de pointe (séquençages total ou à l'échelle d'une unique cellule) permet d'analyser un grand nombre de paramètres sur chaque animal et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. De plus, l'utilisation de méthodes statistiques permettent de réduire au strict minimum le nombre d'animaux nécessaire pour le déroulé de ce projet.
Raffinement
Les animaux serront suivis de manière journalière à partir du septième jour post-injection. De plus, le modèle étant parfaitement maitrisé, nous connaissons les jours auxquel les animaux atteindront les points limites et nous augmentons la fréquence de surveillance des animaux (2 fois par jour) sur les 3 jours précédents les jours connus pour atteindre des points limites. Enfin, des croquettes hydratées ainsi que de l'eau gélifiée seront placées au fond de la cage les jours précédents de mise à mort afin d'améliorer le confort des animaux. Des points limites adaptés à notre modèle ont été définis de façon à éviter toute souffrance inutile des souris.
Choix des espèces
Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu, un atout déterminant dans notre projet. Enfin, des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées pour les expérimentations. A cet âge, les souris ont un système immunitaire mature.
Evaluation de la capacité de microorganismes à prévenir des infections de type grippal dans un modèle souris.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
478 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, presque toutes tuées à l'issue et quatre gardées pour l'entraînement du personnel. Elles reçoivent une infection grippale, jusqu'à 26 gavages de microorganismes, des prélèvements de sang et de fèces et des séances d'imagerie sous anesthésie, avant le prélèvement des poumons et du tube digestif. Le porteur teste des probiotiques censés réduire les symptômes grippaux et évoque un objectif commercial. Il affirme que les interactions virus-hôte ne peuvent pas être reconstituées en culture cellulaire.
Objectifs
Les virus influenza A sont responsables de milliers d’infections chaque année et constituent de ce fait un problème de santé publique. Le modèle d'infection grippale par le virus influenza que nous utilisons chez la souris reproduit très bien ces mécanismes inflammatoires et son emploi permet d'étudier en détail la réponse immunitaire développée en réponse à l'infection. Dans ce modèle infectieux, le virus grippal induit une pathologie marquée. Ce modèle pathologique permet de tester des stratégies antivirales (drogues, probiotiques, vaccins) en développement afin de valider leurs effets contre ce type de virus. En outre, des virus modifiés permettent le suivi de la réplication virale in vivo grâce à un système d’imagerie intra-vitale. L’imagerie intra-vitale consiste à observer des processus biologiques et à quantifier des signaux lumineux provenant de l’animal vivant sans devoir l’euthanasier, de façon non-invasive. Ce système permet de visualiser in vivo l’importance de la réplication virale la réponse de l’hôte. L'emploi du modèle souris pour étudier les mécanismes pathologiques liés aux virus influenza est extrêmement puissant car il permet de comprendre la dynamique de l'inflammation pulmonaire et de suivre l'afflux de cellules immunitaires au niveau des voies respiratoires. Il permet ainsi de caractériser finement des éléments clés de la réponse de l'hôte qui peuvent être de futures cibles thérapeutiques. Par ailleurs, certaines souches de microorganismes ont été étudiées pour leurs effets positifs sur ces infections virales En effet, il a été démontré que les produits contenant des probiotiques ont un effet immunomodulateur et un effet protecteur contre les infections virales respiratoires chez les souris et l’Homme Plusieurs études, incluant des essais cliniques chez l’homme, démontrent que certains microorganismes peuvent réduire les symptômes pseudo-grippaux (fièvre, écoulement nasal, incidence de la toux et durée de la prescription d'antibiotiques). Ainsi leur emploi comme agents préventifs et thérapeutiques dans les infections respiratoires communes constitue une piste sérieuse pour la réduction de la sévérité de ces infections dans la population générale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus à court terme : Certains microorganismes sont déjà inclus dans des produits destinés à la consommation humaine. Si des effets bénéfiques sont confirmés par ces essais, les microorganismes testés au cours du projet pourraient également être inclus dans des études cliniques humaines ciblant les pathologies grippales. Il pourrait amener à un positionnement nouveau pour ce produit et bénéficier à la population générale en terme de bien-être (réduction de symptômes grippaux). Par ailleurs, des bénéfices en termes de connaissance sur l’interaction hôte-microorganisme, et plus particulièrement l’interaction microbiote intestinal/santé pulmonaire devraient pouvoir être obtenus en cours de projet. Il s’agit pour notre équipe de l’intérêt principal. Par quelle(s) voie(s) les microorganismes utilisés peuvent-ils stimuler les réactions de défense de l’hôte ? Dans cet objectif d’acquisition de connaissances sur le mode d’action de microorganismes et le rôle du microbiote intestinal dans des pathologies respiratoires, nous inclurons également un groupe test avec de l’acetate. L’acetate est un acide gras à chaine courte (AGCC) produit et consommé par le microbiote intestinal. Il peut notamment être consommé par certaines espèces bactériennes pour produire un autre AGCC, le butyrate, doté de propriétés anti-inflammatoires. Dans la littérature, une administration d’acetate à des souris dans un modèle comprenant une infection grippale suivie d’une infection bactérienne a permis d’amoindrir les effets de ces agents pathogènes. Nous voudrions voir si une protection peut être conférée dans le cas d’une infection grippale seule. Cela pourrait orienter les futures sélections de souches bactériennes, en retenant des bactéries capables de produire des quantités importantes d’acetate. A plus long terme : Pour les microorganismes nouveaux, n’étant actuellement pas commercialisés, leur mise à disposition sur le marché sera forcément plus longue mais constituent un objectif également à la fois commercial et de bien-être (réduction de symptômes grippaux).
Procédures
Prélèvement de feces : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 prélèvement = maximum 10 minutes dans un pot transparent, 4 prélèvements prévus pour chaque animal sur la durée de la procédure Gavage : sur animal vigile, 478 animaux concernés, 1 gavage = 5-10 secondes avec insertion d’une sonde de gavage dans l’œsophage et injection de 200µl de liquide, 26 gavages prévus pour chaque animal (1 par jour) Contention pour le gavage, sur animal vigile, 478 animaux concernés, 1 contention = 10 secondes où l’animal est immobilisé par une main de personnel compétent / empêche mouvement pour permettre gavage, 26 contentions prévues pourr chaque animal (1 par jour)? Administration intra-nasale : sur animal anesthésié, 474 animaux concernés, 1 administration = 20 secondes, 1 seule par animal pendant la procédure Anesthésie générale pour administration intra-nasale : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 anesthésie = 1 piqûre en voie intra-péritonéale avec injection de 150µl, 1 seule par animal pendant la procédure Anesthésie gazeuse générale pour imagerie : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 anesthésie = faire respirer du gaz isoflurane dans une boite hermétique jusqu’à endormissement puis déplacement des animaux dans l’imageur, prise de clichés et remise en cage pour réveil, durée totale = 5 minutes, 3 sessions d’imagerie Prélèvement de sang : sur animal vigile, 474 animaux concernés, 1 prélèvement = une incision à la veine submandibulaire pour recueillir environ 300µl de sang, durée totale = 30 secondes, 1 seule fois par animal pendant la procédure
Impact sur les animaux
L’aspect dommageable de ce protocole réside dans l’infection virale elle-même. Le virus utilisé génére des symptômes très légers à très sévères, en fonction de la dose utilisée lors de l’infection. Dans le cadre de ce projet, aucune mortalité consécutive à l’infection n’est attendue car nous souhaitons utiliser des doses faibles de virus qui ne génèrent pas de symptômes trop importants. Le suivi quotidien est néanmoins indispensable afin d’effectuer un contrôle des signes cliniques. Les dommages principaux liés à l’infection peuvent se manifester par une perte de poids, une détresse respiratoire (sifflement respiratoire, bronchoconstriction) ou une hypothermie. Des signes cliniques peuvent également être relevés : pelage hérissé, posture voûtée, yeux clos ou mi-clos.
Devenir
A l’exception des animaux destinés à l’entrainement pour la contention et les gavages, les autres animaux subiront un prélèvement d’organes post-mortem (poumons, tractus digestif) incompatible avec une survie.
Remplacement
Les rongeurs sont couramment utilisés pour les études des interactions virus-hôte. De telles expériences ne peuvent être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes. De plus, les paramètres respiratoires : fréquences respiratoires, volumes respiratoires, bronchoconstrictions; ainsi que les paramètres sanguins : pression partielle en oxygène, hypoxie; malgré de gros progrès réalisés dans le développement d'organoïdes respiratoires, ne peuvent encore aujourd'hui être quantifiés que sur l'animal.
Réduction
Comment mentionné dans les objectifs, certains microorganismes sont issus d’un programme de criblage in vitro au préalable. A partir d’une collection contenant plusieurs dizaines de souches de microorganismes, des essais in vitro sont effectués. Ils ont pour but d’identifier des microorganismes potentiellement intéressants. Ainsi seuls des microorganismes les plus prometteurs sont envisagés pour un test in vivo. Alternativement, d’autres microorganismes ont déjà fait preuve d’une efficacité contre une autre pathologie et sont étudiés dans ce projet en repositionnement. Ce sont des candidats avec de bonne chances de succès, également. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Dans notre cas, des données acquises les années précédentes nous ont permis de calculer les tailles de groupes suivants avec des paramètres classiques (risques α=0,05 et 1-β=0,9) : Pour les pertes de poids, nous avons mesuré un écart-type de 5.33 et nous aimerions distinguer des groupes différents par 5% de perte de poids. Les tables indiquent dans ce cas 25 animaux nécessaires. Pour les analyses en plethysmographie, nous avons un écart-type de 0.8 sur l’indicateur PenH et nous aimerions distinguer des groupes différents par 0.6 unités de cet indicateur. Les tables indiquent dans ce cas 38 animaux nécessaires. Nous pensons qu’un compromis de 30 animaux par groupe reste raisonnable : il nous permettra de mettre en évidence des différences de poids et nous donnera de bonnes opportunités de voir une différence en détresse respiratoire également. Nous effectuerons des ANOVA non paramétriques (Kruskal-Wallis) suivies de test de Dunnet. D’autres types de tests pourront également être menés, notamment pour les analyses de microbiotes où des procédures dédiées existent.
Raffinement
Tout au long des procédures expérimentales, les animaux sont observés et pesés quotidiennement. A partir du moment où la phase infectieuse débute, la température des animaux est également prise chaque jour, et un score clinique individuel est établi. Toutes ces mesures représentent une surveillance accrue nécessaire à cette phase. Par ailleurs, les animaux sont hébergés à plusieurs (4 ou 5) afin de ne pas exposer ces animaux sociaux à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux sont séparés ne représentent qu’un temps très faible (5-10minutes, environ une fois par semaine) et ne sont pas considérées comme dommageables. Des anesthésies sont prévues lors des phases qui pourraient être stressantes pour l’animal (administrations intra-nasales). L’anesthésie est également requise pour l’imagerie, afin que l’animal ne bouge pas. Nous veillons toujours à ce que les durées d’anesthésie soient limitées au minimum nécessaire (quelques minutes pour l’imagerie, 30 minutes maximum pour l’administration intra nasale). Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à dechiqueter et permettant la création de nids, bâtons à ronger et maisonnettes en carton (sans encre). Le matériel que nous utilisons (sonde rectale pour la prise de température, sonde de gavage) est évidemment adapté à nos animaux. Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin (diamètre externe voisin du millimètre), à bords arrondis et de taille adaptée (4cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. Des points limites sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux. Enfin, toutes les personnes manipulant les animaux sont formées et compétentes pour ce type d’expérimentation.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence très largement utilisé dans le cadre de l'étude de la réponse développée en réponse aux infections respiratoires virales. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d'un système immunitaire mature.
TP chez le rat mâle ou femelle : Formation spéciale à l’expérimentation animale – niveau praticien
- Formation professionnelle
290 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Ils servent de support à des étudiants qui s'entraînent aux injections intrapéritonéales, intramusculaires, intraveineuses et au gavage sur animaux vigiles, un même rat pouvant être réutilisé entre la formation et l'évaluation, avant d'être tué puis disséqué. Le porteur justifie l'usage du rat par une formation réglementaire à l'expérimentation animale de niveau praticien. Il affirme la "nécessité" de manipuler des animaux vigiles pour maîtriser ces gestes.
Objectifs
Ce projet s'inscrit dans la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau praticien), que nous proposons à des étudiants de Licence Professionnelle ou de Bachelor Universitaire de Technologie. Ce projet consiste à former des étudiants d'un point de vue pratique sur les procédures faiblement invasives chez le rat (procédures régulièrement utilisées en expérimentation animale), puis de contrôler leurs connaissances pratiques afin de valider la formation réglementaire. Ce TP permettra à certains étudiants de pratiquer ces procédures pour la première fois de façon individuelle. Notre expérience nous montre qu'il est préférable dans une formation réglementaire de niveau praticien que les étudiants aient l’occasion de manipuler des animaux vigiles et d'acquir de l’autonomie. Le rat est une des espèces les plus utilisées en expérimentation animale. Dans la formation de la licence professionnelle ou du Bachelor Universitaire de Technologie, les étudiants réalisent un TP sur la souris leur permettant d’acquérir les gestes de base sur cette espèce. Ainsi dans un souci de réduction des animaux utilisés, nous avons fait le choix de n’inclure que des rats dans le TP dédié à notre formation praticien.
Bénéfices attendus
Ce TP permettra une validation pratique de la formation à l’expérimentation animale niveau praticien dispensée dans notre établissement. En effet, la réalisation de ce TP (partie apprentissage et partie évaluation) est incluse dans le dossier de validation de notre formation praticien. Etant donné que cette formation à l'expérimentation animale niveau praticien donne aux étudiants, l'ayant validée, la possibilité de travailler avec des animaux de laboratoire dès leur sortie de formation, il nous semble nécessaire de leur donner des bases pratiques et de les évaluer pour s'assurer qu'ils sont bien capables de travailler avec des animaux dans les meilleures conditions pour le bien-être de ces derniers. En outre, le retour des employeurs sur notre formation praticien est très positif, car ils trouvent que nos étudiants sont rapidement autonomes après une prise de poste et que leur maîtrise des gestes techniques leur permetttent d'assurer un travail respectueux de l'animal.
Procédures
Les animaux seront répartis en 3 lots qui seront soumis à des protocoles différents faisant appel à la réalisation de procédures faiblement invasives : - Lot 1 : une administration intrapéritonéale (IP)/un prélèvement sanguin (TP formation) et une administration intramusculaire (IM) (TP évalutation). Les rats recevront par voie IP du sérum physiologique, un produit neutre. Le prélèvement sanguin par voie intraveineuse (IV) dans la veine de la queue sera réalisé sur animal vigile à l'aide d'un tube de contention adapté à son poids. Le volume prélevé sera faible (
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ces TP sont faiblement invasives. Les produits adminsitrés sont neutres (sérum physiologiques, eau distillée). Les administrations de produits se feront sous le strict contrôle de l’équipe enseignante, y compris lors de l’évaluation pratique. Ainsi les seules nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation mais, afin de diminuer ce stress, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation par l'équipe technique.
Devenir
A la fin des protocoles, les animaux seront mis à mort. Ils seront ensuite réutilisés pour les TP de dissection réalisés en 1ère année dans notre formation.
Remplacement
Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau praticien), il est nécessaire que les étudiants pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives (IM, IP, IV et VO) sur animal vigile pour les maîtriser et ceci en complément des autres supports utilisés (vidéos, démonstrations...).
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des étudiants. L'administration par voie orale sera réalisée une fois par rat et par un étudiant, l'injection par voie IP et le prélèvement de sang par voie IV seront réalisés une seule fois par rat et par un étudiant et enfin l'injection IM sera réalisée par 2 étudiants alternativement sur le même rat (une IM par cuisse). Un enseignant réalisera une démonstration de chaque procédure en utilisant 3 rats. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, l'ensemble des rats sera réutilisé pour le contrôle pratique, mais au minimum 4 jours après la formation pratique pour un meilleur confort de l'animal. Au total, 58 rats maximum seront utilisés par an pour 20 étudiants, soit un total de 290 rats pour 5 ans. Ce chiffre sera bien entendu revu à la baisse si le nombre d'inscrits à la formation est inférieur à 20. Enfin, certains animaux pourront provenir d'un précédent protocole classé hors champ, dans lequel les rats femelles auront eu 2 frottis vaginaux, ou d'un TP de pharmacologie dans lequel, les rats mâles et femelles auront reçu une administration IP unique d'une molécule pharmacologique à action rapide (anxiolytique, antidépresseur, véhicule des molécules...), suivi de tests comportementaux simples. Ceci permettra de réduire encore le nombre d'animaux que nous faisons nâitre dans notre établissement pour ce TP formation praticien.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés, par groupe socialement harmonieux, en présence de deux éléments d'enrichissement (tunnel en plastique et bâton de bois à ronger ou noix). Les animaux auront été habitués à la préhension / contention avec le personnel de l’animalerie, afin qu'ils soient moins stressés lors des procédures réalisées par les étudiants. Avant toute intervention sur l'animal, les étudiants auront visionné les différentes procédures à exécuter sur des vidéos et/ou images et également en démonstration par les enseignants. La pratique des étudiants sur l'animal ne sera réalisée que sous contrôle rigoureux des enseignants. Une attention particulière sera portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. De plus, les rats seront récompensés à la fin de chaque manipulation à l'aide d'un aliment appétent sucré (type pop corn, biscuit sec...), ce qui permettra de diminuer leur stress tout en sensibilisant les étudiants à l'importance du renforcement positif. Enfin une même procédure ne sera pas réalisée deux fois sur un même animal. Ainsi lors du contrôle, la procédure effectuée sur chaque rat sera différente de celle réalisée pendant la formation pratique. A noter qu'avant les séances de TP, les étudiants auront suivis plusieurs enseignements théoriques de la formation à l'expérimentation animale et seront donc particulièrement sensibilisés au respect des procédures.
Choix des espèces
Cette formation à l'expérimentation animale (niveau praticien) aura pour spécialisation d'espèces animales : les rongeurs rats et souris. Dans le cadre du programme de la Licence Professionnelle et du Bachelor Universitaire de Technologie, un TP est réalisé chez la souris, pendant lequel les étudiants réalisent certaines procédures faiblement invasives (IP, SC). Dans la LP et dans le BUT, les étudiants réaliseront également un TP sur le rat, dans lequel ils pourront réaliser une IP et/ou une VO, mais pas de façon systématique en individuel. Cet unique TP ne permettant pas de former suffisamment à l'utilisation du rat en expérimentation animale nous avons choisi de conserver notre TP de formation à l'expérimentation animale sur le rat, afin de former nos étudiants à d'autres procédures faiblement invasives (IM, prélèvement sanguin) mais également de consolider leur apprentissage de l'IP et de la VO (procédures les plus utilisées en expérimentation animale). Les animaux seront âgés de 8-12 semaines et pèseront entre 250 et 350 g en fonction du sexe, poids qui permettront une contention aisée pour des étudiants qui se forment à l'expérimentation animale.
Evaluation sur la douleur de l’effet d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation aigüe microcristalline.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
181 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent deux à trois injections intra-articulaires provoquant une arthrite microcristalline, un modèle de la crise de goutte, avec gonflement et douleur de la patte, suivies de mesures quotidiennes de la douleur par le test de Von Frey sur neuf jours. Le porteur revendique l'originalité d'évaluer la douleur, rarement étudiée dans ces modèles. Il affirme qu'aucun procédé in vitro ou in silico ne permet cette évaluation.
Objectifs
Les dépôts de cristaux d’urate de sodium, de pyrophosphate de calcium ou de phosphate de calcium au sein des articulations sont fréquents, touchent plus de 17.5% des personnes âgées de plus de 75 ans. Ils peuvent être responsables d’inflammation articulaire aiguë récidivante. Cette inflammation est contrée par la colchicine ; mais celle-ci, utilisée par voie orale et systémique expose à des effets secondaires parfois mortels, en particulier chez des patients avec insuffisance rénale. Ainsi, il existe un réel besoin de traitement local efficace, et rapidement actif sur la douleur, qui est intense au cours d’un accès goutteux. L’efficacité de la colchicine dépend de sa concentration locale. Nous développons un nouveau procédé médicamenteux, avec une molécule que nous encapsulons pour former des microparticules, permettant d’obtenir de fortes concentrations locales avec de faibles concentrations systémiques, devant améliorer l’efficacité locale. Les modèles expérimentaux d’arthrite sont utilisés depuis longtemps pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie. Les études pré-cliniques sont menées principalement pour évaluer la capacité de nouveaux traitements à inhiber l’inflammation et la destruction des articulations, et non à inhiber les paramètres de la douleur. La douleur est très rarement étudiée dans les modèles animaux d’arthrite, or c’est d’un intérêt clinique majeur pour les patients. Un élément novateur est que les modèles animaux d’arthrite microcristalline n’ont jamais fait l’objet de ce type d’évaluation. Ainsi, l’intérêt du projet est aussi d’établir un nouveau modèle d’évaluation. Finalement notre objectif est de démontrer : - L’intérêt d’une nouvelle formulation, innovante, utilisant une nouvelle technologie de délivrance de médicament. - D’établir l’effet sur la douleur de cette formulation, de la comparer et l’associer à un antalgique local. - De démontrer l’intérêt d’évaluer la douleur dans un modèle d’inflammation microcristalline.
Bénéfices attendus
La douleur dégrade très fortement la qualité de vie des patients atteints de maladie goutteuse. Dans cette maladie très inflammatoire qui altère progressivement les articulations, la douleur peut être associée à une inflammation en cours (douleur inflammatoire) ou peut survenir durant la phase chronique de la maladie, en dehors des poussées. La douleur est ressentie de façon variable par les patients au cours de la maladie (3). Les médicaments anti-inflammatoires sont efficaces sur l’inflammation et la douleur à condition d’être tolérée. On se heurte la plupart du temps à un seuil d’efficacité faute de pouvoir atteindre une concentration synoviale suffisante. L’utilisation d’un anesthésique local (M2), simultanément à une préparation délivrant M1 de façon continue, serait un progrès significatif dans la prise en charge des malades. Ce projet serait donc susceptible d’apporter la preuve de l’efficacité d’une telle approche sur la goutte et permettrait d’envisager un nouveau traitement efficace sur la douleur pour ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 ou 3 injections intra-articulaires (en fonction des groupes) d'une durée de 1 à 2 min sous anesthésie gazeuse ainsi qu'à un prélèvement de sang conservateur d'une durée de 3 min. Ils seront manipulés tous les jours pendant 9 jours pour les mesures de douleur et de score clinique, cette évaluation dure envrion 30 min par rat. Les rats seront également soumis à un prélèvement sanguin terminal d'une durée d'environ 3 min, réalisé sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
L'arthrite microcristalline provoquera un gonflement et une douleur transistoire de la patte postérieure injectée. La manipulation des rats pour les tests de douleur peut provoquer un incofort passager. L'isolement des rats pour le test de Von Frey peut être responsable d'un léger stress temporaire.
Devenir
Tous les animaux (181 rats) seront euthanasiés à l'issue de la procédure. Ceci permettra d'effectuer le prélèvement des pattes postérieures nécessaire à l'étude histologique complémentaire.
Remplacement
Les expériences in vivo dans ce projet sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance de la drogue par un procédé nouveau utilisant des microparticules dans des conditions inflammatoires, d’autre par car l’originalité principale ici consiste à évaluer l’effet antalgique du procédé que nous étudions.
Réduction
Le nombre de rats nécessaires (181) est défini pour obtenir des données statistiquement exploitables. La taille des groupes a été définie grâce à un calcul de puissance. Nous avons tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale ainsi que de la variabilité inter-individuelle pouvant être observé lors des évaluations cliniques. Sur les animaux seront prélevés le sang et les pattes afin d’obtenir un maximum d’information complémentaires sur l'impact de arthrite microcristalline et son traitement au niveau de l'articulation et limiter ainsi la répétition d'expériences.
Raffinement
Les rats sont maintenus en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Ils sont hébergés dans des cages en plastique munies d’une grille, à raison de 4 animaux par cage maximum. L’enrichissement par des tunnels sera effectué pour améliorer leur bien-être. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C.Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale. Toutes les injections intra-articulaires et les prélèvements de sang se font sous anesthésie gazeuse. Dès les premiers signes cliniques (gonflement de la patte injectée), des aliments sous forme de granulés seront placés directement dans la cage pour faciliter la prise de nourriture des rats.
Choix des espèces
Le rat a été choisi car c’est le plus petit animal chez qui il est fiable d’injecter des volumes bien définis, de l’ordre de 50 µl (moins devient problématique à préparer et à injecter) dans un site anatomique aussi précis qu’une articulation. Des rats de 250 à 300g seront utilisés, soit environ 6 à 7 semaines. Pour l’évaluation de la douleur posturale, des animaux plus gros ont tendance à s’appuyer avec leur corps et non leurs pattes sur le capteur et on perd donc l’information voulue.
Importance du microbiote intestinal dans la production d’anticorps spécifiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, gardées vivantes à l'issue. Elles reçoivent trois à cinq gavages d'antibiotiques et quatre prélèvements sanguins sur 21 jours pour éliminer leur microbiote intestinal, avec un risque de déshydratation et de perte de poids. Le porteur indique qu'après vérification les souris rejoindront un programme de "maintien des compétences" du personnel. Il affirme que l'effet du microbiote sur la production d'anticorps ne peut pas être étudié hors d'un animal vivant.
Objectifs
L'objectif de notre étude est d'identifier l'origine de l'allergie, notre hypothèse est que le microbiote est l’élément déclencheur de la production d'anticorps dits "non protecteurs" qui pourraient jouer un rôle dans certaines pathologies, comme ici, l'allergie. Le but de cette étude est d'éliminer le microbiote grâce à des antibiotiques. Des dosages seront réalisés pour vérifier l'absence d'anticorps spécifiques et la durée de leur absence.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de choisir le meilleur protocole d'élimination du microbiote et de déterminer la durée de l'absence d'anticorps spécifiques. Nous souhaitons grâce à cette étude identifier le bon moment pour effectuer une transplantation du microbiote enrichi en protéines dites "protectrices", cela fera l'objet d'une seconde demande.
Procédures
Les souris vigiles subiront deux types d'intervention dans cette étude de 21 jours : 3 à 5 gavages d'une solution d'antibiotiques et 4 prélèvements sanguins à la veine mandibulaire. Les souris subiront également d'autres procédures non invasives : elles seront pesées 3 fois par semaine et leur niveau d'hydratation (léger pincement de la peau au niveau des omoplates) sera évalué 3 fois par semaine également.
Impact sur les animaux
Il y a risque de déshydratation des souris dans les groupes où les antibiotiques sont dans l'eau de boisson. L'administration d'antibiotiques peut également engendrer une perte de poids chez les souris.
Devenir
A la fin de ce protocole, les souris auront retrouvé un microbiote normal. Après vérification de leur état, ces souris pourront être inclues dans un programme de maintien des compétences du personnel (pas plus de 2 gestes par semaine, maximum 3 répétitions).
Remplacement
Nous souhaitons voir l'impact du microbiote sur la production d'anticorps spécifiques, cela ne peut pas être réalisé hors d'un animal.
Réduction
Le nombre de souris a été déterminé pour être nécessaire et suffisant pour répondre à notre hypothèse. Des groupes de 10 souris seront utiles pour identifier une différence entre les groupes tests, le groupe contrôle sera composé de 6 souris, nombre nécessaire et suffisant pour mettre en évidence une différence avec les groupes tests.
Raffinement
Les gestes effectués sur les souris (gavages et prélèvements sanguins) seront effectués par du personnel entrainé et tout sera mis en oeuvre pour assurer le bien-être des animaux. Les souris seront par groupe de 6 ou 10 dans des cages adaptées et leur bien-être sera évalué tous les jours. La température et l'hygrométrie ambiantes seront également suivies quotidiennement et maintenues respectivement entre 20 et 24°C et entre 35 et 75%. Leur milieu sera enrichi avec des objets en plastique rouge transparent et avec des bâtons de coton pour créer leur nid. Selon la bibliographie, il est possible que les animaux perdent du poids et se déshydratent, surtout dans les groupes où le cocktail d'antibiotiques est mis dans l'eau de boisson. L'eau de boisson devient moins appétente et les souris boivent moins, c'est pourquoi, il est conseillé d'ajouter des arômes de fruits dans l'eau de boisson. Le poids des souris sera vérifié 3 fois par semaine. En cas de perte de poids supérieure à 15% entre deux mesures, la souris sera sortie de l'étude, remise en cage avec une eau de boisson dépourvue d'antibiotiques. La bonne hydratation des souris sera également vérifiée. Si la souris semble faible, si sa fourrure est terne ou si sa peau met du temps à se remettre en place ou colle lorsqu'on la pince doucement entre les omoplates, la souris sera immédiatement sortie de l’étude. Un pack d’hydrogel sera mis à sa disposition dans une nouvelle cage, lui évitant ainsi l'effort d'aller boire au biberon qui se trouve en hauteur. Son poids sera suivi 3 fois par semaine et si son état ne s'améliore pas la souris sera mise à mort. Si son état s'améliore, la souris ne sera pas réintroduite dans cette étude mais pourra servir au maintien des compétences de notre personnel (programme détaillé en paragraphe 4.2.1).
Choix des espèces
Souris femelles adultes, agées de 6 semaines
Etude du potentiel thérapeutique de peptides ciblant les oligomères d’Aβ dans le modèle murin APP/PS1 de la maladie d’Alzheimer EU 1/3
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des peptides par voie intranasale tous les deux jours pendant six mois, puis passent trois tests de mémoire nommés, mémoire de travail spatiale, association d'un contexte à une émotion et reconnaissance d'objet, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur revendique le caractère "indispensable" de ces animaux pour comprendre la maladie. Il indique avoir d'abord testé les composés sur des modèles cellulaires.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l'accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d'augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l'évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l'accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l'efficacité de ces composés à bloquer la formation, l'accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L'ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d'Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d'Alzheimer, afin d'étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d'Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.
Impact sur les animaux
L'application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d'habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l'administration intranasale de composés comme l'induction d'une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu'une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l'animal sera sorti immédiatement de l'étude et mis à mort après induction d'une anesthésie profonde.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d'intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l'intégrité de leurs cellules nerveuses.
Remplacement
Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d'utiliser d'autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l'étude et/ou mort de l’animal).
Raffinement
Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l'étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l'avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.
Effet de la consommation d’aliments sucrés à l’adolescence et ses conséquences à l’âge adulte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Adolescentes, elles sont exposées à des solutions sucrées puis soumises à des tests comportementaux censés révéler des profils dépressifs ou anxieux, certaines subissant en amont une chirurgie cérébrale pour stimuler ou inhiber des structures du cerveau, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur décrit ces tests comme sans douleur mais ne précise pas lesquels. Il affirme qu'un syndrome dépressif ne peut pas être modélisé in vitro.
Objectifs
Nos sociétés abondantes en aliments très palatables, car riches en sucre et en graisse, favorisent la prévalence de mauvaises habitudes alimentaires dès l’enfance ou l’adolescence. Ces comportements précoces peuvent affecter durablement les choix alimentaires adultes. Il a été montré que l’adolescence est une fenêtre critique de vulnérabilité au cours du développement cérébral, caractérisée par des comportements spécifiques et une sensibilité accrue aux récompenses. Des données chez le rat indiquent qu’une surconsommation de sucre pendant l’adolescence altère durablement la sensibilité et la motivation à consommer des aliments palatables (dont la qualité gustative et la texture sont agréables au palais) à l’âge adulte, et fait émerger un profil comportemental spécifique rappelant la dépression, pouvant être reversé par un antidépresseur. De même, il a été mis en évidence qu'une alimentation hautement palatable à l'adolescence pouvait altérer la maturation des circuits cérébraux du plaisir alimentaire, encore en cours de développement, modifiant ainsi durablement l’impact hédonique des aliments et impactant le comportement alimentaire à l'âge adulte. Des processus neurobiologiques affectant la perception sensorielle plaisante ou non des aliments ont ainsi pu être mis en évidence et il apparaît qu'une modification du plaisir alimentaire et de la sensibilité des systèmes de récompense pourrait être l’un des déterminants clés des dérèglements du comportement alimentaire. Ce projet consiste à vérifier chez la souris des données obtenues chez le rat afin de pouvoir aborder les substrats neurobiologiques de façon beaucoup plus précises. En effet, l'existence chez la souris (et non chez le rat) de lignées de souris génétiquement modifiées rend possible l'activation de sous-population de neurones SPECIFIQUES dans des structures SPECIFIQUES. Ces données pourront nous permettre de comprendre en quoi l’adolescence est une fenêtre critique de vulnérabilité des effets à long terme de la surconsommation de récompenses sur le fonctionnement cérébral, et par là-même sur les désordres comportementaux. Ces données seront particulièrement pertinentes au regard des épidémies d'obésité et de dépression des sociétés modernes où le sucre est largement surconsommé par les populations jeunes.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester l’hypothèse selon laquelle une expérience précoce avec des aliments hautement palatables altérerait la maturation des circuits cérébraux du plaisir alimentaire encore en cours de développement et modifierait durablement l’impact hédonique des aliments. La souris est un modèle permettant d'obtenir facilement des animaux génétiquement modifiés, facilitant ainsi l'étude et l'implication de certains processus neuronaux. Si ce modèle permet de retrouver des résultats comportementaux similaires à ceux obtenus chez le rat , nous pourrons alors utiliser des souris modifiées génétiquement afin de tester l'implication du système de récompense via une approche neurobiologique. Plus précisemment nous étudierons les processus impliqués dans le système de récompense par l'utilisation d'outils viraux permettant l'activation ou l'inactivation de certaines voies neuronales d'intérêt.
Procédures
Les animaux seront exposés à des solutions sucrées durant leur adolescence (pour une durée allant de 2 à 8 semaines) avant de suivre divers tests comportementaux permettant de caractériser l'apparition de phénotypes dépressifs ou anxieux, tels que retrouvés chez l'homme. La durée des tests varie entre 5 et 30 min par jour, certains n'étant réalisé qu'une seule et unique fois. Pour certains tests, une procédure chirurgicale, n'excédant pas 1h,devra être mise en place en amont afin de pouvoir stimuler ou inhiber des structures cérébrales spécifiques, impliquées dans le traitement des récompenses.
Impact sur les animaux
L'exposition aux solutions sucrées et les différents tests comportementaux sont sans douleur sur l'animal et n'engendre pas de nuisances ou d'effets néfastes. Les procédures chirurgicales peuvent être source de douleurs post-opératoires pour lesquels des traitements anatalgiques et un suivi post-opératoire sont mis en place.
Devenir
A la fin des expérimentations tous les animaux seront euthanasiés et perfusés afin de pouvoir effectuer des mesures histologiques sur cerveaux.
Remplacement
Il n'est pas possible de modéliser ou d'utiliser des modèles in vitro permettant de reproduire certaines pathologies humaines. Les nombreuses similitudes entre les humains et les animaux en termes de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que certaines caractéristiques neuronales et hormonales permettent de justifier l’utilisation du modèle animal rongeur comme outil dans de nombreuses études. En effet, il est impossible de modéliser ces pathologies et ces caractéristiques, et par là-même d’étudier un syndrôme dépressif, chez un modèle in vitro. Le modèle animal, et plus particulièrement le modèle rongeur, est pour cela le modèle le plus adapté.
Réduction
Afin d'obtenir des résultats statistiquement fiable, et réduire au maximum le nombre d'animaux nécessaires, nous avons pu déterminer selon notre expérience qu'un effectif de 16 animaux par groupes (16 animaux contrôle, 16 animaux exposés au sucrose) est nécessaire pour la partie comportementale et pour nos analyses statistiques (le plus couramment ANOVAs à 1, 2 ou 3 facteurs) afin de s'abstenir de la variabilité interindividuelle. Un effectif de 20 animaux par groupe est nécessaire pour la partie neurobiologique afin de tenir compte du pourcentage d'animaux pour lesquels les injections intracérébrales ne seraient pas correctes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives (2 souris par cage) dans un milieu enrichi (carrés de cellulose et papier ouaté) et dans des conditions optimales de température et d'humidité. La surveillance des animaux est réalisée de façon quotidienne. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction de points limites strictes. Des mesures compensatoires sont mises en oeuvre en amont afin de palier à tout problème de santé éventuel. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le reponsable du projet sera averti et prendra la décision si nécessaire d'euthanasie de l'animal, ceci dans les délais les plus brefs.
Choix des espèces
Notre projet de recherche implique une expérimentation chez la souris génétiquement modifiée qui constitue pour les neurobiologistes un support indispensable à l'étude de l'organisation et du fonctionnement du système nerveux central en situation normale mais également, et surtout, en situations expérimentales ou pathologiques. L'ensemble de nos travaux considère l'animal in vivo, et met à profit différents protocoles comportementaux développés et codifiés depuis de nombreuses années chez ces espèces, et irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau de souris est proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus dans ces conditions permettent de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre de surconsommation de récompenses. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 26 jours, ce qui correspond à l'entrée dans la phase d'adolescence
Effets de l’exposition au dioxyde de carbone sur les accidents de désaturation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles sont placées dans un caisson hyperbare simulant une plongée, un protocole que le porteur reconnaît comme sévère et qui provoque des accidents de désaturation, avec convulsions, déficits moteurs et décès par arrêt cardio-respiratoire pour une partie d'entre elles. Le porteur prévoit qu'un tiers des animaux meurent et un tiers gardent des séquelles neurologiques. L'objectif est d'étudier l'effet du CO2 avant la plongée, une recherche liée aux plongeurs militaires.
Objectifs
3.3.2.1 Objectifs du projet Les accidents de désaturation (ADD) représentent la première cause d’accidents de plongée et sont responsables d’une morbidité non négligeable. Ils peuvent conduire à la paralysie, voire à la mort, avec un risque de séquelles neurologiques à long terme. Ces accidents sont liés à la formation de bulles, essentiellement composées d’azote, qui proviennent de la ventilation d’air comprimé pendant la plongée. La charge tissulaire en azote dans l’organisme, et la formation de bulles qui en découle, sont proportionnelles à la durée et à la profondeur de la plongée réalisée. Cette formation de bulles est favorisée en présence de noyaux gazeux micro et nanométriques, initialement présents à la pression atmosphérique. La variabilité inter individuelle de la formation de bulles post décompression semble être directement liée à la vitesse de désaturation mais également à la quantité initiale de noyaux gazeux présents dans l’organisme. Ces noyaux gazeux sont également directement influencés par les gaz dissous tissulaires comme l’oxygène, l’azote ou le CO2. Le CO2 étant un gaz très diffusible, il pourrait contribuer significativement à l’activation du processus bullaire, surtout lorsque sa concentration augmente dans le sang. La présence de bulles engendre des destructions cellulaires mais aussi une activation plaquettaire, de l’inflammation et une vasoconstriction, aboutissant à la mort tissulaire. Les bulles circulantes se comportent comme des agents capables de léser le système nerveux central. Les affections au niveau de la moelle épinière et du cerveau, sont les plus fréquentes et les plus graves. La réaction inflammatoire liée à l'augmentation du CO2 a surtout été étudiée concernant les phénomènes environnementaux. L’augmentation du CO2 favorise, la formation de peroxynitrite délétères. Les macrophages en phagocytant ces cellules, libèrent des cytokines pro-inflammatoires. Le CO2 inhalé lors de l’exposition hyperbare favorise les accidents ostéo-articulaires. Par ailleurs le niveau de dépressurisation (altitude simulée) nécessaire pour engendrer la formation de bulles est plus faible lors de l'exposition des animaux au CO2. Enfin l'exposition chronique au CO2 favorise les accidents de décompression d’altitude. Fort est de constater une absence de données sur l’influence du CO2 avant la plongée.
Bénéfices attendus
Si notre hypothèse se confirme, les procédures de plongée chez l’homme pourraient être modifiées. Par exemple en pratiquant une hyperventilation pré-plongée afin d’éliminer le CO2 et de diminuer ainsi les risques d’accidents de décompression.
Procédures
Les animaux traités et contrôles seront soumis à un protocole simulant une plongée sèche dans un caisson hyperbare. L’évaluation des différents protocoles se fera sur un modèle animal d’accident de désaturation qui peut paraitre sévère, en comparaison de l’Homme, mais les fréquences cardiaques et ventilatoires élevées des petits animaux limitent fortement la genèse bullaire et donc le traumatisme. Les accidents de désaturation se manifestent principalement par des signes de dysfonction respiratoire (gasps), des symptômes neurologiques (convulsions, déficits moteur et/ou sensitif) ou par un état d’asthénie marquée. Les formes les plus sévères peuvent entrainer le décès de l’animal par arrêt cardio-respiratoire. Quant aux symptômes potentiellement douloureux, l’expérience de l’équipe sur ce modèle n’a pas de mauvais retour d’expérience en ce sens et les observations précédentes ont montrées qu’aucun rongeur ne présente de signe d’excitation ni ne se gratte les oreilles dans le caisson et en sortie de caisson, ni ne se lèche particulièrement sur une zone, ne laissant penser ni à un barotraumatisme de l’oreille, ni à des bends. Mais la vitesse de compression de notre protocole est très lente au début (1m/min puis 10m/min, contre 10m/min chez l’homme) ce qui doit permettre d’éviter tout risque de barotraumatisme de l’oreille. Une évaluation clinique et comportementale est effectuée après les expositions hyperbares. La durée de l’évaluation et de l’observation clinique est de l’ordre de 30 minutes. Puis les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés suivant la procédure décrite. Nous profiterons de l’anesthésie pour effectuer, avant euthanasie, un prélèvement de sang à la queue, 90 microlitres de sang total et dosage sur EPOC Siemens pour bilan standard, proteine S,, proteine 100, ionogrammme, gaz du sang. Au total, la durée de l'intervention sera de 3 heures incluant l'exposition à la pression, l'observation et les prèlevements.
Impact sur les animaux
Les animaux traités et contrôles seront soumis à un protocole simulant une plongée sèche dans un caisson hyperbare. L’évaluation des différents protocoles se fera sur un modèle animal d’accident de désaturation qui peut paraitre sévère, en comparaison de l’Homme, mais les fréquences cardiaques et ventilatoires élevées des petits animaux limitent fortement la genèse bullaire et donc le traumatisme. Les accidents de désaturation se manifestent principalement par des signes de dysfonction respiratoire (gasps), des symptômes neurologiques (convulsions, déficits moteur et/ou sensitif) ou par un état d’asthénie marquée. Les formes les plus sévères peuvent entrainer le décès de l’animal par arrêt cardio-respiratoire. Quant aux symptômes potentiellement douloureux, l’expérience de l’équipe sur ce modèle n’a pas de mauvais retour d’expérience en ce sens et les observations précédentes ont montrés qu’aucun rongeur ne présente de signe d’excitation ni ne se gratte les oreilles dans le caisson et en sortie de caisson, ni ne se lèche particulièrement sur une zone, ne laissant penser ni à un barotraumatisme de l’oreille, ni à des bends. Il n’y a pas d’étude histologique sur le barotraumatisme chez le rongeur. La vitesse de compression de notre protocole est très lente au début (1m/min puis 10m/min, contre 10m/min chez l’homme) ce qui doit permettre d’éviter tout risque de barotraumatisme de l’oreille. Une évaluation clinique et comportementale est effectuée après les expositions hyperbares. Le modèle murin d’accident de décompression a déjà fait l’objet de nombreuses publications, il existe bien sûr des limites à la transposition à l’homme, mais ce modèle a déjà permis des avancées en terme de compréhension physiopathologique et d’évaluation thérapeutiques. Le métabolisme et le poids des rongeurs sont des facteurs très importants à prendre en compte nécessitant des expositions beaucoup plus sévères que chez l’homme pour observer des symptômes d’accident de décompression.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Concernant le modèle hyperbare d’ADD, seul le modèle animal vigile peut présenter l’ensemble de la symptomatologie complexe dans le cadre d’une unique expérimentation (avec utilisation de drogues) et ainsi fournir la puissance nécessaire à ce type de recherche, sans multiplier les supports biologiques. Seule l’utilisation de l’animal entier peut-être à l’origine d’une inflammation systémique consécutive à la présence de bulles circulantes. Il est toutefois possible de générer des bulles dans un seul organe isolé, mais pas de reproduire la maladie de décompression (qui comprend entre autres des réactions immuno-inflammatoires) qui succède à l’accident de désaturation. Aucun modèle physico-chimique ou mathématique actuel ne peut rendre compte de la complexité de la réponse.de désaturation chez l’homme.
Réduction
L’effectif de 110 souris nécessaire à ce projet est estimé sur la base des études précédentes réalisées sur le modèle souris d’accident de désaturation. En effet, dans les conditions expérmentales envisagées nous prévoyons qu'avec une vitesse de décompression de 10m/s , un tiers des animaux vont décéder, un autre tiers aura des séquelles neurologiques et le dernier tiers sera sain et sauf . Dans cette perspective des groupes de 20 à 30 animaux pourront être constituées, ce qui permettra une analyse statistiques suffisament performente. Les valeurs des paramètres recueillies seront exprimées en moyenne et écarts types ou mediane et range selon les cas.Les tests statistiques non paramétriques seront privilégiés en rapport du faible nombre d’animaux intra-groupes. Les comparaisons intergroupes via un test de Kruskall-Wallis adjoint à des comparaisons post hoc de Dunn devraient être opérées, et complétées si besoin est par des comparaisons deux-à-deux avec des tests de Mann-Withney ou Wilcoxon. Le seuil de risque alpha retenu est de 5%. -Manipulation 1 : - 15 souris non exposées - 15 souris exposées à 7% de CO2 Manipulation II : Le nombre de 40 animaux par groupe correspond à : - 20 plongeurs - exposition AIR avant plongée : - 30% (n=6) sans ADD exploitable en clinique. - 30% (n=6) avec ADD exploitable en clinique. - 40% (n=8) avec ADD létal exploitable en clinique seulement. Ces 40% représentent aussi une marge de progression pour mettre en évidence l’effet négatif du gaz inhalé avant la plongée. - 20 plongeurs - exposition CO2 avant plongée : Exemple de tests statistiques (Kruskal-Wallis) sur la clinique : si n=10 sans ADD, n= 9 ADD, n=1 ADD létal. p=0.035 si n=11 sans ADD, n= 7 ADD, n=2 ADD létal. p=0.037
Raffinement
Les animaux, en groupe, disposent d’une litière, de boisson et de croquettes à volonté et aussi de mini buchettes de bois pour ronger. L’application d’un feuillet opaque sur une partie de l’extérieur de la cage (en plexiglass transparent) leur permettra de se cacher et éventuellement de nidifier avec le coton mis à disposition dans la cage. Le cycle jour/nuit 12h/12h est respecté avec l’extinction des lumières à 19h. La température des pièces est régulée à 22 ± 1°C
Choix des espèces
Les modèles murins d’accident de désaturation sont bien identifiés et utilisés, notamment la souris C57bl6. Le modèle souris permet d’obtenir des réponses facilement observables sur des effectifs raisonnables. Les souris C57bl6 mâles sont privilégiées car elles permettent d'obtenir plus facilement le poids cible. De plus les plongeurs des armées concernés sont en très grande majorité des hommes. Un point cible de 25-30g doit être respecté pour observer la survenue des accidents de désaturation. Par ailleurs le modèle murin a été validé sur ce type d'expérimentation dans plusieurs publications y compris par d'autres équipes . Les animaux utilisés sont des jeunes adultes. Les souris C57bl6 mâles de 25-30g mâles sont choisies afin de répondre aux critères de susceptibilité à l’accident de désaturation. Les animaux de faible poids ne développeront peu ou pas d’ADD en rapport de ceux ayant un poids plus important.
Caractérisation de la neurostimulation transcranienne ultrasonore en photométrie par fibre.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux heures d'opération pour injecter un vecteur viral dans le cerveau, trois heures pour y implanter une canule optique : 187 souris adultes subissent ces deux chirurgies, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées par perfusion intracardiaque pour vérifier l'expression du gène injecté et la place des canules. 147 d'entre elles passent auparavant six séances de 30 minutes de stimulation par ultrasons à travers le crâne, pour régler fréquence, pression acoustique, distance et profondeur d'anesthésie d'une technique qui permettrait, selon le porteur, "théoriquement" d'activer le cerveau "de manière indolore et non invasive". Pour justifier le choix de la souris, il invoque "l'observation du comportement de l'animal vivant", alors que chaque séance se déroule sous anesthésie gazeuse et que le résumé ne décrit aucun test de comportement.
Objectifs
Ce projet porte sur la neurostimulation ultrasonore. Cette technique permet théoriquement d’activer des zones du cerveau à travers le crâne de manière indolore et non invasive, offrant donc un espoir pour de nouvelles thérapies pour certains troubles neuropsychiatriques sévères. L’objectif de ce projet sera de caractériser les paramètres physiques et expérimentaux permettant une neurostimulation fiable et optimale de plusieurs zones du cerveau qui sont connues pour jouer un rôle important dans ces troubles. Cette caractérisation sera réalisée chez la souris avec une méthode de photométrie par fibre. Celle-ci permet de visualiser l’activité neuronale par imagerie chez la souris, laquelle sera soumise à différents types d’émissions d’ondes ultrasonores. La mesure de l’activité des neurones sera permise par (1) l’expression d’un gène spécial (dont la protéine dégage de la fluorescence en fonction de l’activité des neurones) qui devra être injecté (= transfecté) dans la zone du cerveau que l’on souhaite stimuler et imager, et (2) par une canule optique implantée dans la zone cérébrale dont on veut suivre l’activité neuronale, laquelle pourra être reliée par fibre optique à l’appareil de photométrie lors des mesures et des stimulations ultrasonores transcrâniennes. Le projet comprendra 2 phases : (1) une phase de développement permettant de déterminer l’expression optimale du gène transfecté pour des zone du cerveau superficiel ou profond (40 souris maximum). (2) une phase de caractérisation des effets de neurostimulation par les ultrasons dans différentes zones cibles en fonction des différents paramètres physiques et expérimentaux suivants : fréquence (2 niveaux 0.5 et 1.5 MHz), pression acoustique (10 niveaux de 0 à 500 kPa), distance de la cible (3 niveaux : rayon de 0 – 0.5 – 1 cm), niveau d’anesthésie (3 niveaux de 0.5% – 1% – 1.5% d’isoflurane). La deuxième phase nécessitera 21 souris par zone sur les 7 zones cibles donc un total de 147 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre de caractériser les paramètres optimaux de neurostimulation par ultrasons. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutiques de cette méthode pour de nombreux troubles neuropsychiatriques (comme l’autisme, la dépression et les troubles anxieux)
Procédures
Dans la procédure 1 : Chaque animal sera soumis à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 2h), puis à une implantation intracérébrale de canule optique sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 3h), et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine). Dans la procédure 2 : Chaque animal sera soumis à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 2h), à une implantation intracérébrale de canule optique sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 3h), à 6 séances de stimulations transcrâniennes ultrasonores (6 séances de 30 minutes) et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine).
Impact sur les animaux
La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie a un impact modéré et limité dans le temps (quelques heures ou jours) sur le bien-être animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant très faibles (< 0,1 g) : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sur l’animal mobile et éveillé sans impact majeur sur le bien-être. La stimulation ultrasonore transcrânienne est une approche non invasive et indolore. L’animal sera installé sur le dispositif (permettant de calculer des coordonnées stéréotaxiques) et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipulation et associé à l’installation dans le dispositif.
Devenir
Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure Procédure 2 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure. Lors des 2 procédures, cette étape de mise à mort est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression du transgène et du placement des canules optiques.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.8 pour une taille d’effet f de Cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique (Buprecare, Metacam) avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur un matelas chauffant pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.
Choix des espèces
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.