Rongeurs

216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur les traite à la doxycycline pour forcer la surexpression de la télomérase dans le rein, ce qui provoque une protéinurie élevée, le traitement étant interrompu avant l'insuffisance rénale mortelle qu'entraînerait sa poursuite. Les souris sont ensuite mises à mort par dislocation cervicale ou sans réveil, à divers délais, pour prélever les reins. Il affirme que seuls les modèles animaux permettent d'étudier la régénération d'un organe "dans son ensemble".

Objectifs

L'épithélium rénal assure des fonctions structurales et métaboliques cruciales qui permettent de filtrer le plasma sanguin afin d'éliminer les déchets de l'organisme dans les urines. L'ultrafiltration rénale dépend de l'intégrité de cellules épithéliales du glomérule rénal nommées podocytes. Ces cellules hautement spécialisées sont lésées chez 90% des patients souffrant de maladies chroniques rénales et leur faible capacité de régénération conduit à terme au développement d'insuffisance rénale terminale. Toutefois, des résultats récents montrent qu’une induction forte et transitoire de l’expression de la télomérase dans le rein de souris adulte stimule des cellules progénitrices dans le rein et provoque une régénération efficace des podocytes. Ces données ont été obtenues grâce à l’analyse de souris transgéniques permettant de surexprimer la télomérase de manière contrôlée dans l’organisme adulte. Dans ce projet, nous allons utiliser ce modèle de régénération forcée des podocytes afin de caractériser les cellules progénitrices rénales et définir la trajectoire moléculaire de ces cellules lors du processus de régénération. La complétion du projet présenté ici permettra d’éclaircir les mécanismes responsables du renouvellement de l’épithélium rénal, et fournira des connaissances cruciales pour le développement de stratégies thérapeutiques permettant de traiter les patients atteints de maladies rénales.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par ce PEA permettront de caractériser les les cellules progénitrices des podocytes. Suite à ce travail, nous pourrons déterminer si et comment ces cellules sont perturbées dans des modèles de maladie rénale chronique et lors du vieillissement ce qui permettra à terme de tester des approches thérapeutiques innovantes visant à stimuler ou à restaurer la fonction de ces cellules en conditions pathologiques.

Procédures

Les animaux vont être traités à la doxycycline dans l'eau de boisson. Cette eau de boisson est additionnée de sucre afin d'atténuer le goût amer de la doxycycline et de favoriser l'hydratation des animaux. Ce traitement durera 10 à 20 jours (les jours de traitement à la doxycycline sont numérotés de D0 à D20). Le traitement à la doxycycline sera interrompu dès que l’analyse des urines des animaux montre une protéinurie de 10 mg/mL. Ces souris seront alors soumises à une période de récupération (au cours de cette période, les jours sont numérotés de R1 à R20) dont la durée varie en fonction des groupes d'animaux : sacrifice le jour de l’arrêt de la doxycycline (R0), sacrifice 5 jours après arrêt de la doxycycline (R5), sacrifice 8 jours après arrêt de la doxycycline (R8), sacrifice 11 jours après arrêt de la doxycycline (R11), sacrifice 14 jours après arrêt de la doxycycline (R14), sacrifice 17 jours après arrêt de la doxycycline (R17), sacrifice 20 jours après arrêt de la doxycycline (R20).

Impact sur les animaux

Modèle murin employé : souris double transgéniques permettant de surexprimer de manière conditionnelle la télomérase chez la souris adulte. L'expression de la télomérase dans ces souris doubles transgéniques est induite par administration de doxycycline dans l'eau de boisson des animaux. Ces souris sont inductibles et ne présentent pas de phénotype dommageable tant que l’expression du transgène n’est pas induite. Le phénotype engendré par l’induction de la surexpression de la télomérase dans les reins est caractérisé par une protéinurie élevée observable environ 10-20 jours après le début du traitement à la doxycycline. Si la surexpression de la télomérase est maintenue, les animaux développent une insuffisance rénale causant la mort dès 70 jours de traitement. Ici, la surexpression de la télomérase sera interrompue dès que les animaux présentent une protéinurie élevée, environ 10-20 jours après le début du traitement à la doxycycline : un temps suffisant pour stimuler les cellules souches rénales, mais pour lequel les animaux ne montrent pas d'insuffisance rénale pouvant entrainer la mort de l'animal. Nous utiliserons comme animaux témoins, des souris issues des mêmes portées que les souris expérimentales mais qui ne sont pas doubles transgéniques (souris simples transgéniques).

Devenir

Les 48 animaux destinés aux analyses par scRNA-seq seront sacrifiés selon la procédure sans réveil n°2. Les autres animaux de la procédure n°1 seront tous sacrifiés par dislocation cervicale à l’issue de cette procédure expérimentale.

Remplacement

Suite à ce projet, des analyses moléculaires complémentaires seront mises en place sur des cellules en culture in vitro. Cependant, bien que les techniques de culture cellulaire aient fortement évoluées, les études in vitro ne permettent pas d’étudier des processus biologiques complexes. Seuls les modèles animaux permettent d’aborder des questions relatives au fonctionnement d’un organe dans son ensemble. En effet, le processus de régénération des organes est un mécanisme qui résulte d’interactions fines entre plusieurs types cellulaires au sein de l’organe, ainsi qu’entre différentes zones de l’organe. Aussi, par définition, notre objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Aussi, la taille des effectifs a été défini grâce à l'emploi du logiciel G*Power: les groupes sont comparés 2 à 2 (souris expérimentales vs témoins) - Test family t tests - Statistical test Means: difference between two independent means (two groups) - Type of power analysis A priori: Compute required sample size, given alpha, power, and effect size. Dans notre cas, la grandeur de l'effet observé a été calculé sur la base de la pénétrance du phénotype chez les souris expérimentales. Pour un seuil à 0.05, et une puissance de 80%, la taille prédictive des groupes est de 24 (2 x 12 animaux par groupe). Ainsi, pour réaliser ce projet, nous utiliserons un maximum de 216 animaux.

Raffinement

L’évolution de la dysfonction de la filtration rénale sera surveillée étroitement dès le début de la procédure. Aussi, dans le but de limiter l'impact de l’expression forte de la télomérase sur l’état général des animaux, et conformément à la réglementation éthique en vigueur qui impose de mettre en place les mesures permettant d’augmenter autant que possible le bien-être des animaux de laboratoire, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par la procédure expérimentale décrite dans ce projet grâce à l’utilisation d’une grille de score. Cette grille de score est systématiquement ouverte dès le début de la surexpression de la télomérase, et celle-ci est complétée 2 fois par semaine jusqu'à la fin du protocole expérimental. Si un problème est détecté sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permet de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).

Choix des espèces

La réalisation du projet présenté permettra d’acquérir des connaissances fondamentales sur la régulation des processus biologiques impliqués dans l'homéostasie et la régénération des tissus chez le mammifère adulte. Ainsi, la souris apparaît comme un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car elle présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’Homme. De plus, nous proposons dans le cadre de ce projet d’utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées déjà disponibles au sein de notre animalerie. Les souris représentent un modèle de choix du fait des nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiées déjà générées dans les différents laboratoires permettant de répondre à la question scientifique posée dans le présent projet. Pour ce PEA, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, d’après nos résultats préliminaires, c’est dans cette classe d’âge que la régénération des podocytes est la plus efficace chez les souris i-TERTci.

192 jeunes rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès la naissance, le porteur leur fait ingérer par la bouche des bactéries, puis mesure leur comportement alimentaire lors d'isolements répétés et d'un test à deux bouteilles opposant eau et solution sucrée, avant de les décapiter sous anesthésie pour prélever cerveau et sang. Il décrit un protocole sans douleur mais reconnaît le stress lié à l'isolement des ratons. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico assez complexe n'existe et que le rat Fischer est "nécessaire" à la continuité du projet.

Objectifs

Ce projet repose sur la constatation qu’un enfant présente plus de risque de développer une obésité si sa mère était en surpoids ou présentait une obésité avant ou pendant la période périnatale. Etant donné que l’obésité modifie la composition du microbiote en faisant augmenter la présence de bactéries néfastes pour le métabolisme, la question est de savoir si le comportement alimentaire de l’enfant né par voie basse et allaité peut être influencé par le transfert du microbiote maternel. Selon cette hypothèse, le microbiote maternel modifierait, par l’intermédiaire de métabolites bactériens, le neurodéveloppement du petit dans les structures cérébrales liées au comportement alimentaire. Les deux premières parties du projet ont abouti aux résultats suivants : 1. Les ratons à qui l’on a fait ingurgiter par têtage dès la naissance un mélange de microbiotes vaginaux, laitier et fécaux provenant de rates obèses s’alimentent plus que des ratons ayant ingurgité un microbiote de mères non obèses (ingéré laitier doublé, par exemple) et développent une préférence pour les aliments gras et/ou sucrés jusqu’au stade jeune adulte. 2. L’analyse des microbiotes des mères et des ratons a mis en évidence la présence d’espèces bactériennes dont les abondances/absences étaient corrélées avec des caractéristiques du comportement alimentaire des petits. L’expérimentation décrite dans cette demande vise à déterminer si les supplémentations en 2 des espèces bactériennes identifiées, et supposées favorables (car abondantes chez les rates non obèses), peuvent effectivement modifier le comportement alimentaire des ratons en le modérant. Celui-ci sera examiné à 3 temps de leur croissance : pendant la lactation, à l’adolescence et au stade jeune adulte.

Bénéfices attendus

Si l’obésité est un des grands problèmes de santé des pays industrialisés, l’obésité des enfants est doublement préoccupante, car un enfant en surpoids a toutes les chances de souffrir de ce problème et/ou de diabète de type 2 dans sa vie d’adulte. Les traitements classiques –régimes, restriction alimentaire, activité physique etc- restent généralement en échec, car trop difficiles à poursuivre dans la durée. De nouvelles sources thérapeutiques doivent donc être envisagées. L’influence du microbiote dans les problèmes métaboliques est désormais bien reconnue. La question du projet validé par l’ANR était de savoir si le microbiote maternel, transmis lors de la naissance et de la lactation, pouvait influer sur le comportement alimentaire des petits. L’objectif était d’identifier des espèces bactériennes favorables ou néfastes, dans la perspective plus lointaine de modifier et corriger le microbiote défavorable. Nous avons mis en évidence, dans une première partie, des espèces bactériennes plus abondantes dans le microbiote des ratons résistant à l’obésité et nous allons ici déterminer leur impact sur le comportement alimentaire de jeunes rats. Si les bactéries étudiées dans cette expérimentation se révélaient bénéfiques en induisant une baisse de la prise alimentaire, cela pourrait contribuer à la mise en place de nouveaux traitements par supplémentation bactérienne

Procédures

Hormis la récupération de féces dans les pots de pesée des ratons, il n’y a pas de prélèvement sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Ce protocole n’engendrera aucune douleur, mais des isolements seront nécessaires, en raison de la mesure de l’ingéré alimentaire en différents points. Dès la naissance, les ratons nouveaux nés recevront par têtage de petits volumes (25µl) de liquide (eau salée) contenant ou non les bactéries étudiées. Cet acte est réalisé avec le plus grand soin possible par des intervenants expérimentés. La goutte de liquide est déposée sur la cavité orale des ratons, sans forcer l’introduction. A J15, les ratons seront isolés de leur mère pendant 2 heures, puis remis à têter pendant 1 heure. A J34, 8 ratons dans chaque isolateur seront placés dans des cages individuelles pendant 1 heure, le temps de consommer un aliment appétent (céréales chocolatées) puis remis dans leurs cages d’origine, et ce pendant 10 jours, puis ils seront euthanasiés le 11ème jour. A J62 les ratons restants seront placés dans des cages individuelles pour l’habituation à un test 2 bouteilles, l’une contenant de l’eau et l’autre une solution sucrée. La consommation de ces boissons sera mesurée pendant 3 jours et les ratons seront euthanasiés. Le stress dû à l’isolement sera donc limité autant que possible.

Devenir

Les animaux seront décapités après anesthésie profonde à l’isoflurane afin de récupérer le sang du tronc et le cerveau. Des analyses de peptides liés à l’alimentation seront effectuées.

Remplacement

Ce projet vise à déterminer l’effet de la supplémentation de 2 bactéries sur le comportement alimentaire du jeune. Ces bactéries ingérées sont susceptibles de générer des métabolites pouvant agir sur les structures cérébrales liées à l’alimentation, par voie nerveuse ou circulatoire. L’utilisation d’animaux est donc obligatoire, car il n’y a aucun modèle in vitro ou in silico suffisamment complexe qui existe et puisse être utilisé dans cet objectif.

Réduction

Le nombre d’animaux a été fixé au strict nécessaire, par un calcul statistique de puissance (n=8 par temps, traitement et sexe) .

Raffinement

Il n’y a pas douleur particulière liée à la réalisation de ce protocole. Les ratons seront conservés avec leur mère pendant la durée de la lactation. Lors de l’isolement pour la mesure de l’ingéré laitier, ils seront isolés par portée entière, dans une cage contenant de la litière de la cage d’origine, et du sopalin déchiqueté par la mère. L’ingéré alimentaire est mesuré de plusieurs façons, mais chaque fois sur des ratons différents qui sont euthanasiés après ces mesures. Par conséquent, l’isolement nécessaire pour la mesure sera le plus bref possible et n’interviendra qu’une seule fois dans la vie de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et pesés deux fois par semaine. Tout signe indiquant un mal-être est surveillé (prostration, perte de 10% de poids par rapport à la mesure précédente, dos vouté, pelage dégradé, blessure). Bien que peu probable, un incident d’expérimentation peut survenir. Dans le cas d’un animal en détresse, une surveillance de 24 h sera effectuée, et si l’état de l’animal reste non satisfaisant, il sera exclu de l’expérience et euthanasié.

Choix des espèces

C’est le comportement alimentaire du jeune qui nous intéresse, et nous utliserons donc des ratons âgés de 15 à 70 jours, des deux sexes. Le rat Fischer est un bon modèle pour les études nutrionnelles et métaboliques ; ce modèle a été utlisé dans la première partie de l’expérimentation, et il est nécessaire pour la continuité et la cohérence du projet.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit chez elles une insuffisance rénale chronique, soit par une chirurgie des deux reins en deux temps, soit par un régime enrichi en adénine toxique pour le rein, avant de les immuniser et de leur infliger jusqu'à huit prélèvements sanguins. À la fin, toutes sont mises à mort sous anesthésie pour prélever ganglions, rate et sang. Il affirme que la complexité des mécanismes immunitaires et l'emploi d'une lignée génétiquement modifiée rendent les modèles in vitro insuffisants.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique (IRC) se définit par une diminution de la capacité de filtration des reins, et est une maladie extrémement fréquente (de causes multiples) touchant près de 10% de la population générale. Parmis les complications associées à l'IRC, on observe un profond défaut de réponse immunitaire humorale (capacité à générer des anticorps contre une cible) : cela se traduit par une augmentation de la mortalité infectieuse (100 à 1000x supérieure à celle d'une population non IRC du même âge), et à un défaut de réponse post vaccinale (par exemple, moins de 50% des patients ont une réponse anticorps satisfaisante après 2 doses de vaccin mRNA anti SARS-CoV-2). Cependant, les mécanismes responsables de ce défaut de réponse immunitaire humorale associée à l'IRC restent à ce jour non compris. Dans ce projet, nous souhaitons 1/ Valider dans un 2nd modèle les observations réalisées dans un 1er modèle murin d'IRC dans lequel nous avons identifié certains éléments de dysfonctions de l'immunité humorale. 2/ Determiner à quelle branche du système immunitaire (adaptatif et/ou inné) est du ce défaut de réponse immunitaire humorale.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but d'augmenter la compréhension des mécanismes physiopathologiques responsables du défaut de réponse immunitaire humoral lié à l'IRC, et donc par la suite de dévelloper des thérapeutiques permettant de diminuer le risque infectieux de ces patients et d'améliorer leur réponse vaccinale.

Procédures

Nous induirons l'IRC chez les animaux de 2 manières différentes (procédure 1: chirugie au niveau des 2 reins réalisée en 2 étapes à une semaine d'intervalle sous anesthésie générale et prise en charge de la douleur en pré et post-opératoire / Dans la deuxième procédure, le modèle d'IRC, modèle déjà utilisé dans une précédente étude, est mis place par un régime alimentaire enrichi en adénine pendant 6 semaines pour induire une toxicité rénale. Ces 2 modèles permettent d'induire une maladie rénale de stade modéré). Ces animaux seront ensuite immunisés par une injection sous cutanée réalisée sous anesthésie générale gazeuse (1min). Des prélévements sanguins seront réalisés (1min) sous anesthésie gazeuse, avec une alternance des techniques et des lieux de prélévement afin de limiter leur impact sur l'animal (8 prélévements au total pour la procédure 1 et 6 prélévements au total pour la procédure 2). Enfin, dans la procédure 2, les animaux recevront une injection intraveineuse (1min) après anesthésie générale gazeuse. La durée totale de la procédure 1 est basée sur 2 temps différents après l'immunisation soit 112 jours pour le lot 1 et 54jours pour le lot 2. La durée totale de la procédure 2 est de 45jours

Impact sur les animaux

Concernant le modèle chirurgical, dans de précédentes études, la mortalité était de moins de 5%. La mortalité est généralement liée à l'induction d'une maladie rénale chronique trop sévère et arrive généralement dans les 24-48h après la néphrectomie totale (2° chirurgie). De plus, il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant une souffrance ou une anxiété des animaux. Néanmoins, l’état général des animaux sera évalué le soir de la chirurgie, matin et soir pednant les 2 jours suivants puis 5 jours par semaine afin d’identifier l’apparition de troubles du comportement pouvant traduire une douleur ou une angoisse. Concernant le modèle adénine, la mortalité est exceptionnelle. Le régime entraine une perte de poids modérée, et les animaux seront donc suivis cliniquement et pesés 3x par semaines pendant l'ensemble de la procédure. Enfin, bien que les injections intraveineuses et sous cutanées ne soient pas connues pour entrainer d'effet indésirables particuliers, les animaux seront suivis de manière rapprochés et différents points limites ont été fixés qui si ils sont dépassés, entraineront la mise à mort de l'animal concerné.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale selon le protocole afin de permettre le prélévements de différents organes (ganglions, rate, sang) pour permettre des analyses complémentaires dans le but d'identifier et de comtabiliser les différentes cellules du système immunitaire.

Remplacement

Le but de cette étude est de préciser les mécanismes par lesquels l’insuffisance rénale chronique affecte la réponse humorale. La complexité des mécanismes immunologiques en jeu, ainsi que la complexité de l’état d’IRC ne peuvent être appréhendés par des modèles in vitro seuls. De plus, ce projet necessite l'emploi d'une lignée génétiquement modifiée permettant de disséquer l'effet de l'IRC sur l'immunité adaptative et innée, ne permettant pas d'être approchée par des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupes expérimentaux dans chaque procédure expérimentale a été calculé a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Ainsi, le nombre d'animaux controle à pu être diminué de moitié dans la procédure 1 compte tenu de l'homogénéité des résultats chez ces animaux. On prévoit cependant la possibilité de répéter une fois les procédures en cas de problème experimental.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées sur tapis chauffant (37°C), en condition d'asepsie, sous anesthésie générale médicamenteuse ou gazeuse. Une protection oculaire sera effectuée. L'antalgie sera assurée dans un délai suffisant en pré-opératoire (30min avant la chirurgie) puis pendant 48h matin et soir. Il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant souffrance ou anxiété. Une surveillance rapprochée sera mise en place 2 fois/jour pendant 48h en post-opératoire puis 1 fois par jour 5 jours/semaine et le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole. En post opératoire immédiat, de l'eau gélifiée et de l'alimentation seront mis dans les cages à disposition des souris pour faciliter leur alimentation/hydratation. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie générale pour permettre un prélèvement de sang total nécessaire aux dosages immunologiques. Des points limites suffisamment précoces ont été mis en place afin d'anticiper toute douleur liée aux protocoles et permettre d'internevir en cas de necessité. Le régime alimentaire enrichi en adénine est bien toléré par les souris. Les animaux seront placés 5/cage afin de garder leurs interactions sociales.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des souris de 8-10semaines, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme. Enfin, et du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire humorale.

135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plus lourde est l'implantation chirurgicale de capteurs télémétriques dans l'abdomen, dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer décès sous anesthésie, infection ou arrêt cardiaque, l'hébergement en cage individuelle affectant en outre le bien-être social des souris. Elles sont ensuite exposées de façon répétée à des champs radiofréquences puis mises à mort pour analyser les organes de la thermorégulation. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est possible tant que la cible moléculaire n'est pas identifiée.

Objectifs

Les champs radiofréquences (RF) deviennent de plus en plus ubiquitaires. Au-delà des interrogations soulevées par le public, cela justifie de rechercher s’il existe un risque même faible, de telles expositions à faible niveau, répétées ou continues. A faible intensité, il a été montré par plusieurs équipes qu’une exposition chronique ou répétitive à des RF de faible niveau à 900MHz - 1 à 30 V/m - peut produire des réponses chez la souris semblables à celles provoquées par le froid. L’objectif de notre projet est de préciser l’effet des champs RF dans ces réponses en étudiant les mécanismes biologiques impliqués chez les souris exposées de façon répétée aux champs radiofréquences (RF) et en identifiant les cibles moléculaires responsables des changements observés. Ce projet vise à vérifier quels récepteurs thermiques sont à l'origine des comportements manifestés par les animaux exposés. Plus spécifiquement les questions abordées dans ce projet sont: 1) Est-ce que le phénomène de vasoconstriction observé chez les animaux exposés se produit dans la même plage de température lorsque la température ambiante augmente et lorsqu'elle diminue ? 2) Est-ce que cet effet se produit aussi chez des souris privées d’un gène pour un récepteur thermique (souris mutantes) ? 3) Dans quelle gamme de fréquences cet effet est-il observable ? Dans ce projet, 135 souris adultes seront utilisées, 108 mâles et 27 femelles.

Bénéfices attendus

L’identification de la cible moléculaire d’interaction du champ RF permettra d’envisager d’une part les possibles conséquences sanitaires des effets des RF sur la régulation thermique chez les animaux, d’une part l’éventuelle extrapolabilité ou non à l’homme des effets observés.

Procédures

Une implantation intra-péritonéale de capteurs télémétriques sera effectuée sur 119 souris, 92 mâles dont 14 mutées sur le gène TRPM8 et 27 femelles dont 14 mutées sur le gène TRPM8. La durée d'intervention est d'environ une demi-heure. Les souris doivent être hébergées isolément en cage individuelle en post-opératoire (4 jours, 119 souris), ou sur 2 jours pour les mesures de température par caméra infra-rouge (16 souris).

Impact sur les animaux

L’acte le plus sévère sur une partie des animaux est la chirurgie d’implantation de capteurs télémétriques. Les effets indésirables attendus sont une mauvaise réaction à l’anesthésie (décès), et dans les 3 à 4 jours post-opératoires une agressivité des congénères, une infection de la plaie, sous-cutanée ou du péritoine, un possible lâchage de suture nécessitant une reprise chirurgicale. Un arrêt cardiaque post-chirurgical ou une rupture de suture dans les 24h ont quelquefois été observés dans nos expérimentations antérieures. L’exposition au champ RF ne produit a priori pas d’effet indésirable attendu. La fragilité post-opératoire nécessite 3 à 4 jours d'hébergement en cage individuelle et les mesures de température par caméra infra-rouge sur 48h nécessitent également un hébergement en cage individuelle. Cet isolement en cage individuelle supérieur à 24h a un retentissement sur le bien-être social des souris.

Devenir

A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort pour étudier les modifications tissulaires et moléculaires des organes impliqués dans la régulation thermique.

Remplacement

Les premiers objectifs de cette étude visent à préciser les cibles moléculaires ou tissulaires des effets observés sur la régulation thermique lors d’expositions répétées à des champs RF. Ceci permettra lorsqu’elles auront été identifiées d’envisager des études in vitro pour explorer les paramètres efficaces de ces effets. D’ici là, la réaction de régulation thermique étant un effet systémique global, cet effet ne peut pas être observé par des méthodes in vitro tant que la cible d’interaction moléculaire ou cellulaire n’est pas clairement identifiée, et il n’existe pas de modèle tissulaire partiel qui éviterait de rechercher cet effet in vivo.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires à une bonne compréhension des mécanismes mis en jeu, des études in vitro et une modélisation en dynamique moléculaire sont envisagées dans ce projet. Ces travaux devraient permettre de cibler plus rapidement les paramètres efficaces de l’effet étudié et ainsi limiter le nombre d’expérimentations in vivo effectuées à cette fin. De plus, plusieurs expérimentations sont conditionnées aux résultats antérieurs, et ne seront donc pas effectuées lorsqu’elles n’ont pas d’utilité. A la fin de la période d’exposition, les animaux seront mis à mort. Pour optimiser l’utilisation des animaux et limiter ou éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, de nombreux échantillons de tissus seront prélevés pour réaliser des analyses biochimiques et immunohistochimiques.

Raffinement

Ce projet sera réalisé dans des chambres réverbérantes, où les animaux seront hébergés pendant l’exposition. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier, des tubes colorés et des bâtons en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les protocoles expérimentaux limiteront fortement l’intensité et la durée de l’inconfort ou de l’angoisse des souris qui seront utilisées par l’utilisation d’antalgiques pré et post-opératoires, et permettront de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaires, pour obtenir des résultats concluants. Des procédures d’anesthésie et de mise à mort éviteront toute douleur ou angoisse prolongées. Une surveillance régulière permet également de détecter toute souffrance aigue et d’anticiper l’aggravation de l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans la recherche fondamentale et bien documentée dans la bibliographie. Ce qui permet des comparaisons de nos résultats avec ceux obtenus précédemment concernant les effets thermiques des champs RF dans la litérature scientifique. L’équipe possède une expertise en toxicologie expérimentale, ainsi que dans le domaine des effets des champs RF et de la régulation thermique. L’équipe dispose ainsi des compétences et de l’équipement nécessaires à l’exposition des souris aux RF et à l’évaluation des effets précités.

1 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections répétées de tamoxifène, une chirurgie crânienne avec deux craniotomies pour injecter un virus dans les deux hippocampes, l'implantation d'une lentille miniature puis des tests comportementaux sur cinq semaines, avant décapitation ou perfusion intracardiaque. Le porteur vise à comprendre le rôle des récepteurs astrocytaires mGluR5 dans la mémoire de la souris adulte, les retombées pour des maladies comme Alzheimer restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme que l'étude in vivo est "indispensable" et qu'aucune technique sans animaux ne peut se substituer à la souris.

Objectifs

De nombreuses études indiquent que l’astrocyte joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule gliale détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) et en retour régule la communication neurone-neurone via la libération de gliotransmetteurs. Nous avons précédemment montré que l’astrocyte était capable de réguler l’efficacité de la transmission synaptique chez l’animal juvénile, notamment grâce à l’activation du récepteur astrocytaire glutamatergique mGluR5. Cependant, afin d’aller plus loin dans la compréhension du transfert d’information dans l’hippocampe, une région cérébrale jouant un rôle clef dans la mémoire, il est donc nécessaire de déterminer si ce processus est toujours présent à l’âge adulte. Les objectifs de ce projet sont donc de déterminer la contribution des récepteurs mGluR5 astrocytaires dans la transmission synaptique, ainsi que dans les processus de mémoire chez la souris adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

-Injections intra-péritonéales de tamoxifène : Ces injections seront réalisées sur animal vigile. Les animaux recevront au total soit 5 ou 8 injections sur 5 ou 8 jours consécutifs. Chaque injection durera moins d’une minute. En fonction du protocole choisi, 120 ou 860 animaux seront concernés. -Chirurgie pour injections intra-hippocampiques : les animaux seront anesthésiés sous isoflurane durant toute la chirurgie (soit environ 1h par animal). Elle consiste en une incision de la peau au niveau du crâne, puis deux craniotomies permettant la descente de l’électrode d’injection au niveau des deux hippocampes. Les animaux subiront donc au total 2 injections (5min chacune). 400 ou la totalité des animaux seront concernés en fonction du protocole choisi. -Implantation du système nVista INSCOPIX : Les animaux seront anesthésiés sous isoflurane pendant 1h30 environ. Les craniotomies déjà effectuées pour les injections virales seront réutilisées pour l’implantation de la lentille intégrée. Un animal sera implanté une seule fois. Le système sera laissé en place le temps de réaliser les tests comportementaux (soit 5 semaines après la chirurgie). Au total, 160 animaux sont concernés. -Anesthésie pour perfusion : Les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale unique d’un mélange kétamine/xylazine (

Impact sur les animaux

Suite aux différentes procédures, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares. Pour prévenir ces phénomènes, du méloxicam (5 mg/kg) sera injecté en préemptif par voie sous-cutanée. Si nécessaire, l’injection sera renouvelée 24 heures après la chirurgie pour calmer la douleur. La plaie chirurgicale sera observée quotidiennement afin de déceler les traces d’infection au niveau du site opératoire (rougeur, enflure, écoulement, saignement). Si la plaie présente un de ces signes, nous appliquerons du Picri-Baume® (spray désinfectant et cicatrisant à base de cire d’abeille) quotidiennement, jusqu’à complète cicatrisation et pendant 7 jours maximum. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2. Les animaux seront observés quotidiennement et la douleur sera évaluée jusqu’à J2 après chirurgie selon la grille d’évaluation, organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement non provoqué, changements de poids corporel, la locomotion ou encore l’aspect de la plaie. Si l’animal présente des signes de douleur, nous injecterons immédiatement en sous-cutané du Méloxicam (5 mg/kg) pour calmer la douleur (score entre 5 et 9). Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo et sur tranches aigües de cerveau est donc indispensable. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au cours de la chirurgie, pipette utilisée pour injecter le virus bouchée, injection dans la mauvaise structure cérébrale, problème au moment de la dissection, problème rencontré au moment de l’expérience d’électrophysiologie). Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous poolerons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dispositions d’hébergement : Pour chacune des études, les animaux seront placés dans des cages enrichies (carrés de cellulose lab’nest et sizzle nest), au nombre de 4-5 par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière effectué chaque semaine. Dispositions visant à réduire la douleur : Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, nous administrerons immédiatement en sous-cutané de méloxicam (5 mg/kg) pour calmer la douleur (score entre 5 et 9). Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort par inhalation de CO2.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Ce modèle permet de produire des tranches aiguës de cerveau afin de réaliser des études d’électrophysiologie et d’imagerie. Les souris C57BL6/J seront réceptionnées à l’âge de 6 semaines afin d’être âgés de 7 semaines minimum au moment des injections intra cérébrales. Ensuite, les diverses études seront réalisées 5 à 9 semaines après les injections intra cérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 12 à 16 semaines.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié suit un régime riche en fibres, toutes reçoivent une injection de substance cancérigène sous la peau, et une partie est enfermée sous cloche sans eau ni nourriture pendant une à quatre heures pour mesurer le dihydrogène produit. Le porteur indique que les animaux peuvent développer des nécroses au point d'injection et une tumeur, et sont tués aux points limites pour prélèvement. Il affirme que le rôle du microbiote et l'immunosurveillance des cancers ne peuvent s'étudier qu'in vivo, sans alternative à ce jour.

Objectifs

Il a été montré qu’un régime riche en fibre (High Fiber Diet - HFD) permet de moduler positivement la composition de la flore intestinale, ainsi que ses fonctions, impactant sur le métabolisme et l'immunité de l’hôte. Ceci conduit à l’activation de certains lymphocytes au niveau intestinal. Dans un modèle murin de mélanome, un pré-conditionnement à l’aide d’un régime HFD permet de prévenir la pousse tumorale. Au sein des tumeurs résiduelles, nous retrouvons ces lymphocytes avec des fonctions augmentées.Ceci suggèrent qu’un régime riche en fibre, en modulant le microbiote intestinal et ses métabolites, active l’immunité locale et systémique de l’hôte, permettant une immunosurveillance accrue des cancers. Afin de pleinement démontrer le rôle de la nutrition dans la prévention des cancers, nous proposons ici d’évaluer les capacités préventives des cancers d’un régime HFD, dans un modèle de cancer chimio-induit, qui se développe « naturellement » suite à l'exposition à un carcinogène. Cette démonstration au plus proche de la situation clinique des patients renforcera nos observations et sera rapidement transférable en clinique humaine, ainsi que dans la population générale.

Bénéfices attendus

Le modèle de mélanome utilisé jusqu'à présent est très artificiel, car il consiste en l'injection directe de cellules cancéreuses. En conditions physiologiques, un cancer apparait progressivement, suite à une exposition à un carcinogène. Ce projet permettra de mettre en évidence l'effet préventif du régime riche en fibres (High Fiber Diet – HFD) sur l'apparition de cancer, dans des conditions physiologiques normales, suite à une exposition à un carcinogène. L'ajout d'un anticorps bloquant les lymhocytes chez les animaux n'ayant pas développé de tumeur sera une preuve de concept de l'implication de l'immunosurveillance dans la prévention de l'apparition de tumeurs. La mesure de dihydrogène sera un argument supplémentaire pour expliquer cette immunosurveillance accrue suite au régime HFD.

Procédures

La moitié des animaux (92) suivra un régime High Fiber Diet (HFD) durant la totalité de la procédure, pendant que l'autre moitié aura un régime standard. Après 3 semaines de pré-conditionnement, chacune des 192 souris recevra une injection sous-cutanée de carcinogène, et leurs fécès seront prélevés une fois par mois. Durant les neufs mois suivant l'injection du cancérigène, maximum 20% des animaux (40) développeront une tumeur, puis de nouveau 20% (40) après l'injection de l'anticorps bloquant les lymphcytes. 24 animaux, n'ayant pas développé de tumeur, seront mis sous cloche pour mesurer le dihydrogène qu'ils produisent (2 séquences de 3 mesures d'1 à 4h par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances au bien-être animal apportées par ces expérimentations seront visibles par des caractères physiques (manque de toilettage, poil ébouriffé, écoulement nasal/oculaire posture prostrée), comportementaux, (mobilité réduite, vocalisations), ainsi que par la perte de poids. Les animaux pourront aussi déveloper des nécroses au site d'injection du carcinogène et seront manipulés pour les collectes de fécès. Dans la cloche pour la mesure de dihydrogène, les animaux n'auront pas d'accès à l'abreuvement et à l'alimentation pour la durée de la mesure.

Devenir

Les animaux en fin d'expérimentation seront euthanasiés après avoir atteint les points limites, pour des prélèvements.

Remplacement

Le rôle du microbiote intestinal ne peut être étudié qu’in vivo. En effet les interactions hôte/microbes et notamment système immunitaire de l’hôte/microbes et les réponses anti-tumorales induites nécessitent une étude dans un organisme vivant. Il n’existe donc pas d’alternative à ce jour.

Réduction

Afin de tenir compte de la variabilité inter individuelle dans la réponse à l'agent carcinogène d'une part (20% des animaux exposés développent une tumeur) et au régime HFD d'autre part, ainsi que des aléas dus au maintien des animaux durant toute la durée de la croissance tumorale, deux groupes de 96 souris seront constitués, afin de s'assurer 18 à 20 animauxdéveloppant une tumeur dans le groupe contrôle in fine. Ainsi malgré la variabilité, ce nombre d’animaux par groupe apportera une fiabilité au niveau statistique.

Raffinement

Afin d'assurer le bien être des animaux, les souris seront hébergées par cage de 6, avec environnement enrichi. Le régime alimentaire n'est associé à aucune contrainte. L'injection de l'agent carcinogène n'induit qu'une légère souffrance des animaux. Toutefois, les animaux seront quotidiennement surveillés la première semaine suivant l'injection du carcinogène, puis 1 fois par semaine au minimum jusqu'à J70. Au delà, et ce jusuqu'au jour 250, les animaux seront cliniquement suivi au minimum 3 fois par semaine. Les animaux seront sacrifiés dès lors que la tumeur nécrose ou atteind la taille définie comme point limite. En plus des points limites liés à la tumeur, les animaux seront suivis pour évaluer l’apparition de stress/douleur liés à l’expérience selon les critères de base (poil hérissé, faible activité, perte de poids).

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus pertinent pour mener ce genre d’étude. La manipulation de leur flore est acquis. De plus, les modèles tumoraux et d’immunothérapie, ainsi que les outils pour étudier les réponses immunes induites sont parfaitement développer pour ce modèle animal. Tous nos résultats précédents obtenus dans le cadre de cette thématique scientifique l'ont été avec ces mêmes souris. Les souris seront utilisées à partir de 6 semaines d’âge (livrées à 5 semaines + 1 semaine d'acclimatation). A ce stade, les souris sont sevrées, et le système immunitaire est pleinement mature et permet donc son étude.

828 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans les canaux mammaires ou sous la peau, des séances d'imagerie sous anesthésie et, pour certaines, une ablation des ovaires et des traitements hormonaux, sur une durée pouvant atteindre un an. Le porteur affirme que les tumeurs resteront le plus souvent petites et peu douloureuses, les animaux étant tués pour récolter ces tumeurs. Il indique recourir à des cultures en trois dimensions mais juge la vérification in vivo obligatoire, la réponse de ces cultures aux hormones étant "contestée".

Objectifs

Établir des lignées cellulaires de cancer du sein à partir de tumeurs de patientes. Créer des lignées cellulaires de cancer du sein à partir de tissu mammaire normal. Caractériser l'effet d'oncogènes sur la différenciation de lignées de cancer du sein. Tester la réponse de ces lignées aux traitements pour le cancer du sein. Abréviations: PDX: xénogreffe dérivée de tumeur de patiente ("Patient Derived Xenograft"). GDX: xénogreffe dérivée de cellules normales converties en cellules tumorales ("Genetically Defined Xenograft"). SARM: androgène sans effet virilisant ("Selective Androgen Receptor Modulator").

Bénéfices attendus

Les lignées créées permettront de comprendre la réponse aux traitements hormonaux du cancer du sein. Nous avons montré qui les androgènes sans effet virilisant, dites SARMs, inhibent la croissance des tumeurs résistantes aux traitements avec les anti-estrogènes habituels. Les SARMs ont le double avantage d'être très bien acceptés par les femmes, contrairement aux traitements classiques qui sont abandonnés par la moitié des femmes. Le problème est que nous ne comprenons pas pourquoi certaines tumeurs du sein sont inhibées et d'autres sont stimulées par les androgènes. Le bénéfice attendu donc est de pouvoir mieux choisir quelles patientes devraient recevoir les SARMs. Jusqu'à présent il était presqu'impossible d'établir des lignées cellulaires de tumeurs du sein hormonosensibles. Nous avons montré que la culture 3D, dite organoïde, combinée avec l'injection intracanalaire permet de créer des lignées hormonosensibles à partir de tumeurs de patientes, et nous avons montré que la même approche permet de créer des tumeurs hormonosensibles à partir de cellules mammaires normales en ajoutant des oncogènes mammaires. Ces derniers permettent de disséquer les mécanismes de régulation de la croissance par les stéroïdes parce que on peut modifier les gènes qu'on utilise pour créer les tumeurs. Un deuxième avantage de l'injection intracanalaire est que ça met les cellules au site d'origine des tumeurs du sein. Elle permet donc de suivre la progression des tumeurs dès la première étape de formation de la tumeur.

Procédures

Nous injecterons des cellules tumorales dans les mamelons ou sous la peau. La procédure durera environ 10 min par animal. Si nous injectons les cellules dans le mamelon, une crème analgésique sera mise sur la peau autour du mamelon pour prévenir la douleur immédiatement après l’injection. Les cellules tumorales émettront une lumière dite bioluminescence qui permettra de quantifier la croissance de la tumeur. Les souris seront anesthésiées pour scanner la bioluminescence. La durée d’un scan sera d'environ 15 min. Les souris seront scannées une semaine après l'injection des cellules, puis une fois par mois pour suivre la croissance des tumeurs si nous voulons simplement établir une lignée tumorale. Dans ce cas l’expérience pourrait durer 1 an si la tumeur poussait très lentement. Si les cellules tumorales ont besoin de l’estrogène pour survivre, la souris pourrait recevoir de l’estrogène dans le biberon pendant tout ce temps. Pour évaluer la réponse aux traitements les souris seront scannées tous les 7-14 jours. Si un traitement antitumorale est mis dans le biberon, la durée sera

Impact sur les animaux

Dans la majorité des cas les tumeurs seront tellement petites qu'elles ne seront détectables que par bioluminescence, ou par des analyses au laboratoire après la mort de l’animal (microscopie fluorescente et histologie). L'impact sur le bien-être des souris sera limité essentiellement aux procédures et donc aux injections et à la chirurgie pour enlever les ovaires. Les injections dans les canaux galactophores seront faites avec une aiguille tellement fine que la blessure sera à peine visible à l'oeil nu. Pour éviter la douleur après la chirurgie pour enlever les ovaires les souris recevront un traitement analgésique (la buprénorphine) 20 minutes avant l'intervention et pendant les jours suivant l'intervention si nécessaire. Même quand les tumeurs seront palpables, elles auront peu d'effet sur le bien-être des animaux (les tumeurs équivalentes chez les femmes ne sont pas douloureuses). Les tumeurs ne feront presque jamais d'ulcères cutanées. Les traitements prévus sont des traitements hormonaux (androgènes, anti-androgènes, estrogènes, anti-estrogènes et produits similaires). Comparés à la chimiothérapie il s'agit de traitements doux qui ont certes des effets physiologiques, par exemple sur la croissance des canaux galactophores, mais n'induisent pas les effets secondaires qu'on craint avec la chimio (diarrhées, anémies, pertes de poids). Les pellets d'estrogène peuvent provoquer la rétention urinaire s'ils sont utilisés pendant plus de 3 mois donc nous limiterons la durée du traitement à 3 mois dans ces cas. L'estrogène dans les biberons n'a pas cet effet donc les biberons seront utilisés s'il faut donner de l'estrogène pendant des périodes prolongées.

Devenir

Mise à mort pour récolter les tumeurs.

Remplacement

Plusieurs nouvelles approches de cultures cellulaires dites "organoïdes" viennent d'être inventées. Les milieux utilisés pour la culture organoïde maintiennent le caractère des cellules tumorales mieux que les milieux de culture classique. Au lieu de pousser sur une boîte en plastique, les cellules flottent dans un gel où elles forment des petits amas sans toucher le plastique. A l’échelle d’une cellule, le plastique est plus rigide que l’os, ce qui change complètement le comportement des cellules. Pour les tumeurs du sein l’avantage de la culture organoïde est que les cellules tumorales continuent à produire les protéines pour détecter les stéroïdes. On s’attend donc à ce que les réponses aux médicaments en culture organoïde prédisent mieux les réponses dans les patientes. Autant que possible nous utilisons ces approches pour tester l'efficacité des médicaments mais la réponse des organoïdes aux stéroïdes est actuellement contestée et nous sommes obligés de vérifier au moins les résultats importants in vivo. Par ailleurs, les cultures organoïdes sont rarement pérennes et il faut donc maintenir un stock des cellules dans les souris pour éviter de les perdre.

Réduction

L'injection dans les canaux galactophores est beaucoup plus efficace que l'injection sous la peau pour les tumeurs du sein hormonosensibles. Nous avons donc besoin de moins d'animaux pour obtenir le même nombre de tumeurs. Nous avons déterminé via des tests statistiques (test t de Student avec une puissance de 80% et une valeur p de 0.05) qu'un lot de 10 souris par groupe était nécessaire pour avoir des données statistiquement exploitables à la fin de l'étude.

Raffinement

Afin d'être moins invasif, nous marquerons les cellules tumorales avec des protéines qui émettent la lumière. Ceci permettra de suivre la croissance des tumeurs quand leur taille sera nettement inférieure aux tailles habituelles. Par conséquent il sera souvent possible d’arrêter l'expérience avant que les tumeurs ne soient palpables ou visibles à l'oeil nu. Afin d'éviter la douleur, les souris seront anesthésiées pendant les interventions potentiellement douloureuses. Afin de protéger les animaux contre les infections, nous utiliserons des cages stériles. Plus globalement en matière de raffinement, le bien-être des animaux sera pris en compte dès leur naissance jusqu’à leur mort. Pour réduire la souffrance et l’angoisse, les animaux seront hébergés collectivement, cinq souris par cage, avec accès en permanence à l'eau et à la nourriture. Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement du milieu (nids de « woodwool »). Les souris seront manipulées par du personnel formé et qualifié. L'estimation de la souffrance sera réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés seront basés directement sur les conseils des autorités françaises et européennes.

Choix des espèces

Il faut utiliser des animaux immunodéficients pour éviter le rejet des cellules humaines. De nombreuses études ont montré que les souris immunodéficientes dites "NSG" permettent de greffer les cellules humaines. Les canaux galactophores de souris maintiennent le caractère hormonosensible des tumeurs du sein humaines. Souris adultes (il n’y a pas assez de canaux galactophores pour faire les injections avant 6 semaines).

98 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, des formes altérées d'une protéine liée à la maladie de Parkinson, pour comparer leur pouvoir pathogène. Le porteur indique que cette inoculation conduit irrémédiablement à une paralysie mortelle, les animaux étant tués dès l'apparition d'une démarche saccadée et d'une perte d'équilibre. Il affirme que le projet ne peut être mené qu'in vivo, faute de méthode alternative.

Objectifs

L’alpha-synucléine est une protéine présente sous une forme anormale dans les lésions cérébrales des patients atteints de la maladie de Parkinson, la démence à corps de Lewy ou l’atrophie multisystématisée. Nous avons développé une méthode permettant d’amplifier in vitro les altérations de l’alpha-synucléine à partir d’un cerveau (substrat) provenant de souris conventionnelles C57Bl/6 après amorçage de la réaction par une petite quantité de matériel cérébral de souris modifiées génétiquement (M83) et présentant des altérations de l’alpha-synucléine humaine. Notre projet vise à évaluer dans quelle mesure la présence d'autres protéines humaines anormales dans le cerveau utilisé comme substrat peut modifier les altérations de l’alpha-synucléine lors de la réaction in vitro. Ces autres protéines humaines examinées sont celles impliquées dans la maladie d’Alzheimer (β-amyloïde et tau) et dans le diabète de type 2 (peptide amyloïde des ilots pancréatiques). Les caractéristiques de l’alpha-synucléine ainsi altérée in vitro sont évaluées dans notre projet par les caractéristiques de la maladie et des lésions cérébrales observées suite à son inoculation dans le cerveau de souris modifiées génétiquement (M83).

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des nouvelles connaissances sur les relations entre des protéines qui sont altérées dans la maladie d’Alzheimer ou le diabète de type 2 et l’alpha-synucléine, qui est altérée dans la maladie de Parkinson. Il est en effet établi que l’altération des premières protéines entraîne une fréquence accrue et une aggravation des maladies humaines associées à l’alpha-synucléine altérée, mais les mécanismes en cause restent encore très mal compris. Ce projet envisage de répondre à la question de savoir dans quelle mesure ceci peut être lié à des altérations différentes de l’alpha-synucléine elle-même, du fait de la présence dans le cerveau d’autres protéines altérées. On parle de co-morbidités.

Procédures

Les produits d’amplification obtenus in vitro sont caractérisés par leur pathogénicité après inoculation dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 98 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation de différentes formes altérées d’alpha-synucléine présentes dans les différents produits d’amplification étudiés est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les 7 lots expérimentaux sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, pour chaque produit d’amplification examiné. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée de survie, de la distribution des lésions cérébrales et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. L’analyse statistique de la distribution de l’alpha-synucléine nécessite en particulier un minimum de 6 souris au stade clinique de la maladie. Un lot de 14 souris nous permet ainsi de bénéficier au stade clinique d’au moins 6 cerveaux, pour les analyses biochimiques de l’alpha-synucléine et d'au moins 6 cerveaux pour l’analyse des lésions cérébrales. Les autres prélèvements (intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire dans ce modèle de souris sur les marqueurs de la maladie dans les tissus périphériques.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Grâce à ce projet fondé sur l’inoculation de différentes sources d’alpha-synucléine anormale nous souhaitons affiner la caractérisation clinique comme possible critère de différenciation, une possibilité décrite dans la littérature scientifique, par exemple lors d’un test de suspension par la queue.

Choix des espèces

Plusieurs études récentes ont montré que les souris (M83) utilisées dans ce projet permettaient la caractérisation de différentes formes anormales d’alpha-synucléine, après leur inoculation dans le cerveau de ces souris, sur la base du délai d’incubation de la maladie, de l’extension des lésions dans le cerveau et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6 à 8 semaines. Compte-tenu de l’importance de la mesure de la durée d’incubation de la maladie ces souris sont entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à son apparition, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.