Rongeurs
Identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans les leucémies aiguës myéloïdes dans l’espèce Mus musculus
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une irradiation, des injections, des prélèvements de sang hebdomadaires, des prélèvements de moelle osseuse et, pour certaines, une plaie provoquée par brûlure, afin de tester des cibles contre une leucémie agressive, dont des sécrétions de la grenouille utilisée dans le rituel du kambo. Le porteur prévoit la mise à mort quand les cellules leucémiques atteignent 80 % du sang ou dès l'apparition de signes de souffrance. Il affirme que le développement de la leucémie exige un "micro-environnement médullaire" impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Le projet vise à identifier des nouvelles thérapies pour le traitement de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), un cancer agressif des cellules du sang. Ce projet se base sur deux hypothèses. Selon la première hypothèse, la protéine ACLY, impliquée dans le cycle de synthèse des acides gras, jouerait en rôle clef dans le développement de la leucémie. Elle constituerait donc une importante cible thérapeutique. Cette hypothèse sera adressée en vérifiant si la leucémie disparaît après avoir invalidé la protéine ACLY. Selon la deuxième hypothèse, les protéines contenues dans les sécrétions de la grenouille tropicale Phyllomedusa bicolor (utilisées dans le rituel du kambo) pourraient être utilisées comme approche thérapeutique dans les LAM. Cette hypothèse se base sur observations cliniques, car un patient atteint de LAM a été guéri après avoir fait le rituel du kambo. Ces hypothèses seront abordées grâce à trois lignées différentes de souris: - Des souris qui développent une leucémie similaire à celle développée par les patients atteints de LAM - Des souris qui permettent d’invalider la protéine ACLY dans les leucémies - Des souris qui permettent la survie et l’expansion des cellules leucémiques de patients, cellules qui sont trop fragiles pour être maintenues in vitro, pour y mener des tests thérapeutiques
Bénéfices attendus
1. Bénéfices à court terme: ce projet fera progresser le connaissance scientifique car il permet d’identifier de nouveaux mécanismes qui expliquent pourquoi et comment la leucémie aiguë myéloïde survient et se développe. La connaissance de ces mécanismes sera utile non seulement pour comprendre les mécanismes de leucémogenèse mais aussi potentiellement pour d’autres cancers du sang et/ou des cancers solides. 2. Bénéfices à long terme: grâce à ce projet nous espérons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer le pronostic de leucémie aiguë myéloïdes, de prévenir la résistance aux médicaments et les rechutes et donc prolonger donc la vie des patients atteints de LAM.
Procédures
P1 - analyse de la leucémie après invalidation de la protéine ACLY: exposition à l’antibiotique doxycycline (eau de boisson, tous les jours de jour 1 à jour 168) Injection intra-péritonéale de tamoxifen, 5 jours consécutifs, de jour 1 à jour 5, prélèvements sanguins hebdomadaires (ponction veineuse submandibulaire sur souris vigile avec une lancette), effectués pour 24 semaines à partir de 15 jours après l’exposition à la doxycycline. P2 - analyse de la progression de la leucémie après invalidation d’ACLY dans des cohortes des souris receveuses: une injection intra-péritonéale d’anesthétique une irradiation sub-létale (durée d’une minute) tout de suite après l’anesthésie 6 heures après l’irradiation, une injection intraveineuse des cellules leucémiques murines Prélèvements sanguins hebdomadaires, effectués pour 36 semaines à partir de 7 jours après l’injection des cellules leucémiques. P3 - analyse de l’invalidation d’ACLY sur la survie des cellules saines de la moelle osseuse: injection intra-péritonéale de tamoxifen, 5 jours consécutifs, de jour 1 à jour 5. P4 -effet de l’application des sécrétions de grenouille sur le dévelopement de la leucémie. exposition à l’antibiotique doxycycline (eau de boisson, tous les jours de jour 1 à jour 198) prélèvements sanguin hebdomadaires, effectués pour 28 semaines à partir de 15 jours après l’exposition à la doxycycline une injection intra-péritonéale de l’anesthétique quand la leucémie apparaît dans le sang (à patrir de la semaine 8) Injection intra-péritonéale de l’analgésique, tout de suite après l’anesthésie 30 minutes après analgésie, induction d’une plaie par brûlure par application pendant 1 seconde d'une tige de laiton de 2mm de diamètre chauffée à 100°C sur la peau du dos de la souris. une application cutanée des peptides bioactifs sur plaies cutanées, faite tout de suite après l’induction de la plaie par brûlure. 8h et 16h après la brulure, injection intra-péritonéale de l’analgésique. P5 - greffe des cellules leucémiques des patients, injection intra-péritonéale de busulfan 24 h après, injection intraveineuse des cellules leucémique humaines, prélèvements sanguin hebdomadaires sur souris vigiles, effectués pour 52 semaines à partir de 15 jours après les injections des cellules leucémiques, prélèvement de la moelle osseuse sur souris anesthésiée (4 prélèvements totaux qui se font en alternant les pattes avec une fréquence de 3 semaines entre les prélèvements
Impact sur les animaux
1. Effets indésirables directement liées aux actes expérimentaux: 1. Nuisances modérées liées aux injections intra-péritonéales et intraveineuse. Ces nuisances sont attendues durer quelques secondes, ce qui est le temps requis pour effectuer les injections. 2. Nuissances sévères à la réalisation d’une plaie par brulure. L’administration de l’analgésique avant la réalisation de la paie diminuera fortement la douleur. On attend donc seulement une nuisance modérée liée à cette intervention. 3. Nuissances modérées aux prélèvements de la moelle osseuse en intra-tibiale. L’administration de l’anesthésie avant la réalisation des prélèvements limitera au maximum ces nuances. Elles vont également être limitées par leur nombre (4 maximum) et l’alternance des deux pattes. 4. Modérées nuisances liées aux prélèvements sanguins hebdomadaires. Ces nuisances sont attendues pour durer quelques secondes, ce qui est le temps requis pour effectuer le prélèvement, car le saignement s’arrête par compression dès que le prélèvement est terminé. Nuissances modérées liées à l’irradiation sub-létale (2.5 Gy). Ces nuisances sont attendues pour durer 1 minute, ce qui correspond au temps nécessaire pour effectuer l’irradiation. 2. Effets indésirables issues des produits injectés: effets indésirables modérées liés à l’injection des cellules leucémiques (réduction de l’activité, position anormale du nez et des oreilles, poil hérissé, yeux plissés ou bridés). Ils vont être prévenus au maximum grâce à une analyse du taux d’infiltration leucémique à travers le prélèvement sanguin, qui doit conduire à la mise à mort anticipée de la souris en cas d'infiltration forte
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront mises à mort avec dislocation cervicale car la moelle osseuse et la rate doivent être prélevées et analysées pour déterminer le taux d’infiltration leucémique.
Remplacement
Les objectives du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement de la leucémie nécessite la présence d’un micro-environnement médullaire qui joue un rôle clef dans le développement de la leucémie et le maintien des cellules souches leucémiques. L’évaluation de l’activité thérapeutique du Kambo nécessite également d’être faite in vivo car l’activité pharmaco-dynamique et la pharmaco-cinétique des peptides contenus dans les sécrétions de la grenouille jouent certainement un rôle clefs dans leur effet thérapeutique et elles ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons: - mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris - effectuer une étude statistique qui permettra de determiner le nombre des souris à utiliser pour obtenir l’information scientifique en évitant la répétition de l’expérience. Cela permettra de réduire au minimum l’utilisation des animaux optimiser le matériel issu des greffes pour production multiple (congélation des cellules, conservation du materiel génétique etc..) pour analyses rétrospectives et éviter la répétition de l’expérience). quantifier la viabilité cellulaire des échantillons humains avant toute injection pour limiter les échecs de greffe
Raffinement
Pour réduire au maximum la douleur associée à la leucémie, la mise à mort sera pratiquée lorsque les cellules leucémique dans le sang représenteront 80% des cellules circulantes, c’est à dire quand la leucémie peut commencer à générer une légère souffrance aux animaux. Si des signes cliniques de souffrance se déclarent avant ce point limite, l’animal sera mis à mort. La manifestation de signe évoquant une douleur chez l’animal sera surveillée grâce à un suivi de 5 jours par semaine (de lundi au vendredi). Nous veillerons à optimiser, enrichir l’hébergement (nous mettrons de la nourriture dans la cage si nous constatons une difficulté de déplacement et accès à la nourriture et/ou à l'eau). Pour réduire la souffrance liée à la réalisation d’une plaie par brulure, l’analgésie sera administrée 3 fois (30 minutes avant de la réalisation de la plaie, 8 heures et 16 heures après). La plaie sera suivie 5 jours par semaine afin de surveiller tout risque d’infection (jusqu’à cicatrisation de la plaie). Si mise en évidence d’une infection cutanée, la plaie sera désinfectée 2 fois par jour avec une solution de Vétadine à 10% jusqu’à disparition des signes d’infection. Pour réduire au maximum les nuissance liées aux injections et au prélèvement de sang, nous ferons une surveillance 5 jours par semaine. Si des signes cliniques de souffrance animal apparaissent la souris sera mise à mort. Pour réduire les nuisances liées au prélèvement intra-tibial de la moelle osseuse les souris seront anesthésiées avant le prélèvement. D’autre part, nous limiterons ces prélèvements à un total de 4 (c’est à dire 4 prélèvements totaux qui se font en alternant le site de prélèvement entre le tibia gauche et le tibia droit avec une fréquence de 3 semaines entre prélèvements). Nous allons aussi réaliser un suivi du comportement des souris 5 jours par semaine après réalisation de ces prélèvements afin de vérifier que ces prélèvements n’auront pas d’impact sur le déplacement des souris. Si nous constatons des souris incapables de se déplacer, elles seront immédiatement mises à mort par dislocation cervicale
Choix des espèces
L’objective de ce projet est d’identifier de nouveaux traitement pour la LAM, une maladie qui rechute très fréquemment. Au cours des dernières années, la communauté scientifique a générée des lignées génétiquement modifiées en utilisant l’espèce Mus musculus. Ces lignées miment la maladie humaine et permettent donc d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de tester leur efficacité thérapeutique afin d’aboutir à des nouveaux traitements pour les patients atteints de cette maladie. Les souris génétiquement modifiées que nous allons utiliser proviendront de notre élevage. Elles seront utilisées entre 8 semaines et 36 semaines (âge auquel les souris auront toutes développées la leucémie). Les souris que nous allons utiliser comme receveuses de cellules leucémiques murines seront fournies par un fournisseur agrée à l’âge de 7 semaines. Elles seront utilisées à 8 semaines, âge auquel ces souris tolèrent bien la greffe). Elles seront utilisées jusqu’au l’âge de 17-25 semaines, car 8-16 semaines seront nécessaires afin que les souris développent la leucémie après avoir été greffées. Les souris immunodéficientes que nous allons utiliser comme receveuses de cellules leucémiques humaines proviendront de notre élevage. Ces souris seront utilisées entre 8 et 15 semaines car cette fenêtre d’âge permet d’avoir un taux idéal de greffe, en permettant de réaliser la procédure d’injection dans de bonnes conditions. Ces souris seront utilisées jusqu’à 52 semaines après la greffe car, comme décrit dans la littérature scientifique, certaines cellules humaines peuvent greffer après un longue période de temps, qui peux atteindre 52 semaines.
Modèle de suivi de l’expression de l’aSynucléine par bioluminescence chez la souris_1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau avec injection d'un virus faisant surexprimer une protéine liée à la maladie de Parkinson, puis des séances d'imagerie sous anesthésie et des tests comportementaux que le porteur qualifie de "non invasifs" sans les détailler. Les animaux sont tués pour analyse du tissu cérébral. Le porteur affirme avoir besoin d'un "modèle intégré" que la culture cellulaire ne remplace pas, et présente le suivi par bioluminescence comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Certains sont basés sur l'injection intracérébrale de virus permettant la surexpression d’alpha-synucléine (protéine abondante dans le cerveau et dont l’agrégation provoque une dégénérescence de certains neurones) mutée (A53T) ou d’injection de fibrilles synthétiques d’alpha-synucléine, formes toxiques de la synucléine, qui serait une des causes de la mort des neurones dopaminergiques et des problèmes moteurs conséquents. L’accumulation d’alpha-synucléine n’est étudiée que post-mortem chez l’animal.Les objectifs sont doubles : 1/ Tout d’abord la création d’un modèle de surexpression de l’alpha-synucléine mutée couplée à la production de la NanoLuc, protéine traçable in vivo au cours du temps et qui permettra le suivi de l’évolution du syndrome pathologique. Pour cette approche in vivo, nous comparerons la souche C57Bl6 et son équivalent albinos pour s'affranchir de la pigmentation de la peau. 2/ En plus de cette évolution pour ce modèle, nous souhaitons aussi améliorer l'infection et la transduction des virus dans les neurones dans le cerveau chez la souris, en affinant la méthode d’injection intracérébrale (grâce à l'utilisation de fibroine, comme protéine facilitante).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus, sont : La création d’un modèle de surexpression de l’alpha-synucléine mutée couplée à la production d’une protéine traçable in vivo au cours du temps, ce qui permettra le suivi de l’évolution du syndrome pathologique à différents temps et sans sacrifier les animaux, ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés dans nos recherches. L’amélioration de l'infection et de la transduction des virus dans les neurones dans le cerveau chez la souris, en affinant la méthode d’injection intracérébrale.
Procédures
Chirurgie stéréotaxique : 30 minutes par animal, une seule fois dans l'étude, sous anesthésie gazeuse et couverture analgésique. Imagerie in vivo : 10 minutes sous anesthésie gazeuse. Deux sessions de comportement classique non invasif, durée 2H à 10 semaines et 20 semaines postchirurgie. Nuisances dues au transport entre les deux animalerie pour les souris qui suivront l'imagerie in vivo.
Impact sur les animaux
Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie stéréotaxique, mais bien cadrés par l’utilisation d’analgésiques adaptés et d’un suivi régulier des animaux.
Devenir
Les animaux (sauf ceux qui sont transférés pour l'imagerie) sont mis à mort à la fin de chaque étude afin de réaliser une étude histologique et biochimique du tissu cérébral.
Remplacement
Nous souhaitons améliorer un modèle du laboratoire, en optimisant la transduction virale et ainsi l’expression des formes pathologiques de synucléine. Nous avons besoin d’un modèle intégré ce qui n’est pas le cas avec des alternatives comme la culture cellulaire. En amont de nos expériences in vivo, le matériel biologique virus, fibroine..etc est testé en culture cellualire afin de valider leur efficacité, de déterminer les concentrations nécessaires et de valider un protocole expérimental correct.
Réduction
Nous utilisons des tests comportementaux qui sont non invasifs et permettent un suivi au long cours sur un même animal. Le développement de modèles avec un suivi en bioluminescence qui est non invasif pour les animaux, permet des études longitudinales et ainsi une diminution du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés soit par la peau du dos soit dans des tubes, afin de ne pas les manipuler par la queue. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'aseptie pendant la période opératoire. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.
Choix des espèces
Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement decrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte qui est compris entre 8 et 12 semaines.
Evaluation d’un agent de contraste dans l’amélioration de la fertilité féminine
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mâles sont vasectomisés par une chirurgie de trente minutes puis gardés huit mois, les femelles reçoivent des stimulations hormonales, un agent de contraste par voie vaginale et une insémination, pour comprendre comment ce produit améliore la fertilité. Le porteur indique que l'agent de contraste iodé peut provoquer chez les femelles une réaction allergique avec difficulté respiratoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne permet d'obtenir des gamètes fécondables et que l'étude de la fertilité ne peut se passer d'animaux reproduisant les atteintes humaines.
Objectifs
L'infertilité touche près de 15% des couples en age de concevoir. Les causes de cette infertilité peuvent être multiples et touchent aussi bien les hommes que les femmes. L'une des causes féminines est l'imperméabilité des trompes de Fallope, ce qui aura pour conséquence d'empecher le passage des spermatozoides vers l'oviducte et donc la fécondation ovocytaire. Afin de tester cette hypothèse, les femmes subissent une hystérosalpyngographie qui consiste en l'injection d'un agent de contraste monitoré sous rayons X et qui permet de visualiser l'utérus et les oviductes. Cet examen médical peut se faire à l'aide d'agents de contraste soit huileux (oil-soluble contrast media dénommé ci-après OSCM), soit soluble dans l'eau (water-soluble contrast media, ci-après WSCM). Une amélioration du taux de grossesse a été montrée lorsque les patientes sont traitées avec le OSCM (39.7%) vs le WSCM (29,1%). Cette amélioration est visible jusqu'à 6 mois après l'hystérosalpyngographie. Le but de notre projet est donc de comprendre dans un modèle murin à quel niveau un OSCM agit : épithélium utérin/oviductal, implantation embryonnaire, physiologie spermatique et améliore ainsi la fertilité. La souris étant un mammifère hyperfertile, il faudra donc dans un premier temps générer un modèle sous-fertile puis analyser si un traitement avec un OSCM rétablit une fertilité normale.
Bénéfices attendus
A court terme, cela permettra de comprendre comment un OSCM améliore la fertilité et sur quel type cellulaire il agit. A plus long terme, une fois la cible déterminée, de nouvelles molécules pro-fertilisantes pourront être developpées et proposées aux patients.
Procédures
Chirurgie sur les males pour la vasectomisation (30 minutes par souris, une chirurgie par souris). Injection intra-péritoneale pour les stimulations hormonales, les anesthésies et les analgésies (2 à 4 par souris femelle). Injection avec l'agent de contraste par voie vaginale (1 par souris femelle). Insémination intra-utérine ou tranfert d'embryon (1 par souris femelle)
Impact sur les animaux
La stimulation hormonale et l'insémination des souris femelles nécessitera leur préhension, de même que l'anesthésie et l'analgésie des souris males et femelles. Les males ayant une vasectomie pourront perdre du poids. Les souris femelles traitées au lipiodol pourraient faire une réaction allergique (difficulté respiratoire, rougeur) due à la présence d'iode dans le produit de contraste.
Devenir
Les males vasectomisés sont maintenus en vie pendant 8 mois puis euthanasiés. Nous ne pouvons réutilier les femelles traitées au lipiodol car nous ne connaissons pas la durée d'action du composé.
Remplacement
L'étude de la fertilité nécessite l'utilisation d'animaux reproduisant les phénotypes observés chez l'homme. Il est donc compliqué de les remplacer. Il n'existe aucun système de culture in vitro permettant d'obtenir des gamètes matures et fécondables (femelle) ou fécondantes (male).
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte (ANOVA, test de Tukey's). Lorsque les gamètes sont utilisées en fécondation in vitro, la stimulation hormonale des souris permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, cela permet de réduire le nombre de souris femelles. Plusieurs fécondation in vitro ou insémimation intra-utérine seront réalisées avec les spermatozoides d'un seul male, ce qui permet de réduire le nombre de males utilisés dans l'étude. Les males vasectomisés serviront tout au long du projet.
Raffinement
Les souris seront placées en conditions de température régulée, ad libitum. Afin de limiter l'angoisse et le stress, les souris sont hébergées à plusieurs par cage. Pour qu'elles puissent interargir avec leur environnement, faire leur nid et se cacher, des rouleaux et du papier sont ajoutés lors du change. Les animaux seront maintenus le moins de temps possible afin d'injecter les hormones nécessaires à la stimulation ovarienne, le traitement au lipiodol ou les anesthésiants/analgésiants. Le sacrifice des animaux sera effectué dans une pièce différente de celle de l'hébergement. Suite aux inséminations, les femelles seront placées individuellement avec un male vasectomisé pendant 24h puis rassemblées à raison de 2 souris par cage. Les males ne pouvant être rassemblés entre eux, ils seront replacés avec une femelle afin qu'ils ne restent pas isolés.
Choix des espèces
L'étude des mécanismes de la spermatogenèse et de l'ovogenèse, ainsi que de l'infertilité nécessite l'utilisation d'animaux car 1/ ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. Il n'existe pas de système de culture cellulaire permettant d'obtenir des gamètes viables. 2/ La fécondation nécessite l'obtention de gamètes matures, qui ne peuvent être obtenus que sur des animaux 3/ l'étude des phénotypes d'infertilité humaine nécessite des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients Il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. En effet, aucun modèle alternatif ne permet encore de reproduire en globalité, la complexité de la gamétogenèse et les impacts sur la fertilité en général et la fécondation en particulier. Il n'existe pas de modèle utérin in vitro assurant toute la complexité d'interaction entre la muqueuse utérine et l'embryon. Les souris males seront utilisés à maturité sexuelle soit 8-9 semaines. Les souris femelles seront utilisées à maturité sexuelle soit à partir de 6 semaines et pas au delà de 12 semaines car elles répondent alors moins bien à la stimulation hormonale.
Efficacité et toxicité après administration buccale et nasale de biothérapies anti-hémophiliques A et B chez des souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
2 400 souris hémophiles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent des facteurs de coagulation par le nez ou par un patch collé sur la langue, puis subissent un prélèvement sanguin terminal ou une section de la queue pour mesurer le temps de saignement, sans être réveillées. Le porteur indique que leur maladie prédispose à des hémorragies parfois mortelles en cas de bagarre, d'où une surveillance quotidienne, week-ends compris. Il affirme que la souris hémophile est, après le chien, le seul modèle permettant de mesurer l'activité de ces médicaments et que son statut hémophile est "indispensable".
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique grave caractérisée par un déficit en agents de la coagulation, appelés facteurs de coagulation, sans lesquels la coagulation (formation du caillot de sang permettant de tarir l’hémorragie lors d’un traumatisme) est impossible. Un déficit en facteur numéro VIII aboutit à l’hémophilie de type A et un déficit en facteur numéro IX aboutit à l’hémophilie de type B. Le traitement actuel de cette maladie, qui consiste en l’administration régulière au long cours des facteurs de coagulation par voie intraveineuse, est efficace pour prévenir ou traiter l’apparition d’un saignement mais altèrent fortement la qualité de vie des patients. Le développement de voies d’administration, autres qu’intraveineuse, pour le traitement de l’hémophilie, permettrait donc d’améliorer la qualité de vie des patients. En pratique courante, il existe des médicaments qui peuvent être administrés au travers des muqueuses de la bouche ou du nez. Le nez a déjà montré son efficacité pour le passage de médicaments et de vaccins en dehors de l’hémophilie. La bouche présente elle l’avantage d’éviter le tube digestif (pas de dégradation du médicament, ni de réaction de défense de l’organisme) et d’avoir une muqueuse très fine facilitant la traversée des médicaments. Parmi les éléments impliqués dans la biodisponibilité muqueuse, un récepteur semble jouer un rôle majeur dans la capture des médicaments, qui s’appelle le FcRn. Ce récepteur joue ainsi un rôle de transporteur permettant le passage d’actifs à travers la barrière muqueuse. L’objectif de ce projet est ainsi de comparer deux voies d’administration muqueuses (voie nasale et voie buccale) de facteurs anti-hémophiliques dans un modèle de souris (souris sauvages ou modifiés génétiquement). Ce modèle permettra d’identifier les paramètres d’efficacité et de toxicité associé à ces deux nouvelles voies d’administrations non invasives. Cinq médicaments seront testés : les facteurs VIII et IX non modifiés, 2 dérivés du facteur IX et 1 dérivé du facteur VIII, modifiés pour améliorer leur disponibilité dans le sang leur liaison au récepteur FcRn. Après chaque traitement, des études de coagulation seront effectuées, nécessitant 2400 souris sur une durée de 5 ans afin d’atteindre une puissance statistique nécessaire à l’interprétation des données.
Bénéfices attendus
Le développement de voies d’administration non invasives pour les facteurs anti-hémophiliques pour le traitement de l’hémophilie A et B seraient bénéfiques pour les patients : - Améliorer l’adhésion au traitement - Améliorer l’observance (la prise régulière des médicaments à visée préventive) - Améliorer la qualité de vie en réduisant les contraintes liées aux injections répétées - Eviter des réactions de défenses de l’organisme en évitant le tube digestif (comprimé) et la circulation sanguine (administration par voie intraveineuse)
Procédures
Pour la procédure 1, seulement un poiçon d'oreille sera réalisée pour pouvoir bien contrôler la qualité génétique de la lignée, Ce geste de quelques secondes sera réalisée par un zootechnicien entrainé et une légère compression (quelques secondes) sera réalisée si besoin. Pour les procédures 2 à 5, l’administration des médicaments se fera sur des animaux anesthésiés pour pouvoir évaluer l’efficacité de deux nouvelles voies d’administrations au travers de la muqueuse, la voie nasale (gouttes nasales) et la voie buccale (application d’un patch). Le patch, composé de sucres et des facteurs de coagulation, mesure 6mmx2mm et est placé sur la face ventrale de la langue. Il est mucoadhésif, biocompatible et se dégrade dans la salive en environ 20 min. Seulement une voie d’administration sera testée pour chaque souris. Il s’agit d’un inconfort de niveau léger et de très courte durée (temps d’administration inférieur à 1min dans les 2 cas (nasale et buccale) et prélèvement au maximum 24 heures après l’administration). De plus, cette administration sera exécutée après une anesthésie générale gazeuse. Il y aura 2 tests d’efficacités, un prélèvement sanguin et une section de la queue pour observer la coagulation, un seul réalisé pour chaque souris. Dans les deux cas, les gestes seront réalisés sous anesthésie générale et suivi d’une mise à mort alors que la souris sera toujours sous anesthésie générale. Ces tests seront réalisés au maximum 24 heures après l’administration nasale ou buccale. Durant le projet, tout sera mis en œuvre pour répondre au mieux aux critères de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).
Impact sur les animaux
Un inconfort léger après administration nasale ou buccale est attendu pour une durée de quelques minutes. Puis les animaux seront tous mis à mort au maximum dans les 24h après l'administration des facteurs de la coagulation pour prélever le sang et pouvoir doser les facteurs de coagulation qui sont passés de la muqueuse à la circulation sanguine. Concernant le test de coagulation par section de la queue, il sera intégralement réalisé sous anesthésie générale avec mise à mort en fin d’expérimentation donc aucun effet indésirable n'est attendu. En raison du phénotype dommageable (l’hémophilie prédispose à des saignements), même si ces souris présentent très peu de signes cliniques tels qu’observés chez l’homme (hémorragies internes spontanées), en cas d’agressivité et de combats dans la cage, une hémorragie peut survenir et elle peut être mortelle. Une surveillance quotidienne de ces lignées est donc prévue (weekends et jours fériés inclus). En cas d’hémorragie, les souris seront mises à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure : - pour la procédure 1 : après 6 mois de reproduction les souris seront mise à mort pour le remplacement des géniteurs. - pour les procédures 2 et 3 : le prélèvement sanguin est terminal car un important volume de plasma (partie du sang contenant les facteurs de coagulation) est nécessaire. Les souris seront mises à mort en fin de prélèvement alors qu’elles sont encore sous anesthésie générale. - pour les procédures 4 et 5 : l’efficacité clinique des facteurs anti hémophiliques, c’est-à-dire leur capacité à arrêter un saignement, ne peut se démontrer qu’à l’aide d’un test de coagulation réalisé en conditions réelles de blessures. Ce test de référence est la section d’un petit morceau de queue et une observation du temps de saignement (au maximum pendant 10minutes) chez une souris sous anesthésie générale. Les souris ne seront pas réveillées à l’issu du test, et elles seront mises à mort. - pour toute les procédures de 1 à 5, si un point limite est atteint, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Des analyses préliminaires sur modèle murin sont nécessaires avant de commencer les essais cliniques chez l’homme. Premièrement, des études préliminaires de toxicité de ces médicaments sur les muqueuses ont été effectuées in vitro, mais bien que satisfaisante, la toxicité n’a pas été étudié in vivo et donc le recours à l’homme n’est pas possible. Deuxièmement, le recours à l’animal vivant est justifié car il n’existe pas d’autres modèle permettant l’analyse des effets doses et effets temps après que des médicaments aient été administrés par voie nasale ou buccale. De la même façon, seul un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire est nécessaire pour des études sur la coagulation sanguine (test de saignement). Enfin, des études chez l’homme ne peuvent pas être réalisées car cela mettrait le pronostic vital de patients hémophiles en jeu et le volume sanguin requis serait trop important dans un délai trop court.
Réduction
Dans la procédure 1, le nombre minimal de reproducteurs a été sélectionné. Dans les procédures 2 à 5, le groupe contrôle est commun à l’analyse des facteurs VIII et IX ce qui réduit le nombre d’animaux. Dans les procédures 4 et 5, seulement 2 temps d’analyse seront étudiés car les résultats des procédures 2 et 3 seront utilisés pour réduire le nombre d’animaux utilisés. De plus, des souris mâles et femelles seront utilisées de façon indifférente car aucune différence n’est attendue entre espèces pour les paramètres étudiés. Ainsi, toutes les naissances d’animaux seront concernées par les procédures, sans mise à mort sélective d’un des deux sexes. Ainsi, le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué au sein des 5 procédures.
Raffinement
Pour veiller au bien-être de l’animal, les conditions d’élevage, d’hébergement, des soins et des méthodes utilisées pour chaque étape de l’expérimentation seront optimisées pour minimiser douleurs, souffrance et angoisse, tel que l’enrichissement du milieu (copeau de bois, coton et dôme de cellulose). Un suivi quotidien des animaux sera effectué, cela permettra d’augmenter la surveillance (contrôle à 1h et antalgique dans l’eau de boisson) en cas d’altération du comportement (présence d’une courbure du dos) et d’identifier rapidement si un animal a atteint un des points limites définis ; auquel cas il sera profondément anesthésié puis mis à mort. L’administration par voie buccale ou nasale (inconfort de niveau léger et de très courte durée) sera exécutée sous contention légère après anesthésie gazeuse. Le prélèvement sanguin et le test in vivo de coagulation par section de la queue seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie (anti-douleur).
Choix des espèces
La souris hémophile est la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de la coagulation. En effet, le dosage de l’activité coagulante des facteurs anti-hémophiliques humains ne peut être effectué qu’en l’absence des protéines analogues du modèle. Le statut hémophile est donc indispensable. C’est pourquoi l’utilisation de souris pour cette étude se justifie car uniquement deux modèles d’animaux hémophiles sont disponibles : le chien et la souris. Les deux modèles murins hémophiles (hémophilie A et hémophilie B) servant de base à tout protocole préclinique concernant l’activité coagulante des facteurs sont très bien caractérisées. Ils permettent de mettre en évidence la capacité coagulante des molécules générées après l’administration de molécules thérapeutiques. L’absence des facteurs anti-hémophiliques murins proches de nos facteurs anti-hémophiliques humains est un prérequis pour la mesure de l’activité du produit. En plus d'être un modèle pertinent en hématologie et en immunologie, la souris est un animal de petite taille, facilement manipulable et génétiquement bien caractérisé. Ce protocole sera effectué sur des souris sevrées depuis 3-4 semaines (le sevrage se fait entre 3 et 4 semaines de vie selon la taille des souriceaux). Ces souris (entre 6 et 12 semaines) seront pesées quotidiennement à partir de la 3ème semaine de sevrage pour vérifier qu’elles ont le poids idéal (soit au moins 20-25g), pour recevoir un maximum de 10µl de matériels à tester par voie nasale et un patch de 10mm². En effet, ces jeunes individus présentent des parois vasculaires plus propices à une bonne efficacité des molécules à tester nous permettant de nous rapprocher des conditions chez l’homme. Ainsi, les modèles animaux seront bien représentatifs du profil hémorragique observé dans l’hémophilie. Des individus plus âgés ont un profil de coagulation différent des individus plus jeunes. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact avec la souris, et à l'observation des signes cliniques fondamentaux, coagulation inclus.
Implication thérapeutique du blocage des CB1R et de l’inhibition des récepteurs SGLT2 sur la prise en charge de la néphropathie diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques, elles reçoivent pendant vingt-huit jours deux médicaments par gavage, avec incision de la veine de la queue pour mesurer la glycémie et échocardiographie sous anesthésie, pour tester une association contre la néphropathie diabétique. Le porteur indique que le diabète expose les animaux à un risque de déshydratation et d'hypothermie, pris en charge par du sérum et un tapis chauffant. Il juge "indispensable" de travailler sur un "organisme vivant en entier" et présente l'effet bénéfique de l'association au conditionnel.
Objectifs
L'insuffisance rénale chronique (IRC) touche des millions de patients dans le monde et malgré les efforts de recherches, peu d'options thérapeutiques sont disponibles. Actuellement, la prise en charge des patients souffrant de néphropathie diabétique (ND) consiste essentiellement en l’amélioration du contrôle glycémique, la réduction du risque cardiovasculaire, un meilleur contrôle de la pression artérielle, l'inhibition du système rénine-angiotensine (SRA) et plus récemment, l’inhibition du cotransporteur sodium-glucose de type 2 (SGLT2). Les patients présentant une ND sont de plus en plus fréquemment soumis à un double traitement composé d’un bloqueur du SRA associé à un inhibiteur SGLT2. Toutefois, bien que cette approche soit efficace, la progression de la ND n’est freinée que dans 39% des cas. Cela démontre que les traitements actuels ne sont pas optimums et que les efforts de recherche doivent s’intensifier afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce contexte, le récepteur aux cannabinoïde-1 (CB1R) est actuellement une cible potentielle très prometteuse pour la prise en charge de la ND mais là encore, les données pré-cliniques montrent une protection partielle uniquement. Ainsi, l'idée d'utiliser une approche pharmacologique permettant de combiner le blocage de CB1R et l’inhibition de SGLT2 au cours de la ND pourrait être une stratégie thérapeutique prometteuse. L’objectif principal de ce projet sera donc de déterminer si cette approche poly-pharmacologique est viable. Ainsi, nous étudierons les effets combinés du bloqueur CB1R INV202 et l’inhibiteur SGLT2 Empaglifozine dans deux modèles de souris diabétique de type 2 présentant les principaux symptômes retrouvés au cours de la pathologie humaine dont la perte de fonction glomérulaire, le développement de fibrose ou encore la présence d'une forte inflammation. L’objectif secondaire sera de déterminer si cette approche pharmacologique entraîne une amélioration de la fonction cardiaque particulièrement impactée par la présence d’un diabète non ou mal contrôlé. Cet aspect se fera de manière non-invasive via la technique d’échocardiographie.
Bénéfices attendus
Le diabète représente un véritable enjeu de santé publique ; cette pathologie étant classée parmi les urgences sanitaires du XXIème siècle du fait de l’évolution rapide du nombre de patients. En effet, selon les derniers chiffres de l’atlas de la Fédération Internationale du Diabète, le nombre d’adultes souffrant de diabète dans le monde est passé de 151 millions en 2000 à 463 millions en 2019. Sur le long terme, le diabète est la cause de nombreuses complications dont la néphropathie conduisant à l’insuffisance rénale chronique. À ce jour, malgré des efforts et des recherches considérables, peu d'options thérapeutiques restent disponibles pour les cliniciens pour traiter ou ralentir l’apparition de la néphropathie. Actuellement les traitements disponibles freinent le développement de la pathologie dans 39% des cas et une approche poly-pharmacologique semble appropriée en ce qui concerne le blocage des récepteurs CB1 et les inhibiteurs SGLT2. Ces derniers semblent exercés des effets bénéfiques différents mais complémentaires sur la néphropathie diabétique et leur combinaison devrait permettre d’obtenir une protection plus importante vis-à-vis de cette pathologie.
Procédures
Pour chaque test de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local et la quantité de sang total prélevée à un moment donné sera d’environ de 2 à 2,5 μL afin de pouvoir réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement n’aura lieu qu’une fois, après 9 semaines de régime afin de sélectionner les souris diabétiques. Les souris seront anesthésiées puis rasées sur le ventre afin de procéder à une échocardiographie avant et après traitement pharmacologique. L’ensemble de la mesure se fait en 45 minutes maximum. Pendant les 28 jours de traitements, les drogues seront administrées par voie orale via gavage.
Impact sur les animaux
Tout au long de ce projet, l’état général des animaux diabétiques sera surveillé de façon régulière car bien que le diabète ne soit pas un point limite, les pathologies qu’il génère peuvent être une source de dérèglements internes. Ainsi les risques de déshydratations sont importants et les animaux présentant ces signes recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Pour prévenir les risques d’hypothermie suite au développement d’hyperglycémie, les cages seront maintenues sur un tapis chauffant à circulation d’eau chaude. Le personnel maitrise très bien les gestes techniques nécessaire au bon déroulement du prélèvement de sang caudal servant à la mesure de la glycémie ainsi que la mise en œuvre des gavages orogastriques, et les animaux seront observés plusieurs fois dans la journée (en cas de fausse route l'animal montre des signes de souffrance assez rapidement). Tous les animaux de l’étude seront suivis par un personnel compétent selon les modalités mise en place par la structure chargée du Bien-être Animal du Centre de zootechnie.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
Le diabète de type 2 est une pathologie multifactorielle entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier les conséquences métaboliques et les pathologies associées, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Dans ce projet, nous allons utiliser des souris diabétiques. Les procédures prévues dans ce projet ne provoqueront pas de contraintes indues. Toutefois, le diabète pouvant conduire à un risque accru de déshydratation et d’hypothermie, nous opérerons un suivi quotidien des animaux afin de détecter tout dommage imprévu et ainsi intervenir pour soulager/abréger toute souffrance. Ainsi, les cages seront posées sur des tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie et en cas de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée de sérum physiologique ainsi que de l’eau gélifiée supplémentée en nutriments. Enfin, les souris diabétiques sont susceptibles de développer une polyurie marquée, nécessitant un changement de litière plus fréquent. Les analyses étant basées sur le degré d’hyperglycémie et d’albuminurie développé par les animaux, ces derniers seront répartis dans les groupes placebo, INV202, Empaglifozine ou INV202+Empaglifozinee de manière à ce que ces 2 paramètres soit similaire dans les 4 groupes. Dans le cas où un test non paramétrique serait nécessaire, nous utiliserons le test non paramétrique de Mann-Withney. Le minimum d’animaux par groupe pour atteindre la significativité de différence de traitement est de 15-20. Toutefois, ce nombre pourra être réduit dès que la significativité sera atteinte.
Raffinement
Depuis leur arrivée du fournisseur jusqu’à 5 semaines de régime hyper-protéiné, les souris seront hébergées en groupe afin d’éviter l'isolement. De plus, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher. Lors des 4 dernières semaines, les souris seront hébergées individuellement afin de permettre l’évaluation quotidienne de la prise alimentaire. A nouveau, les souris auront accès à enrichissement de milieu dans toutes les cages avec du papier absorbant pour nicher et un tunnel en plastique pour se cacher.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’Homme. C’est pourquoi, le choix des modèles est important. Ainsi, il apparait logique de choisir un modèle de vertébré dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris. Leur métabolisme au sens large présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. A 9 semaines, les animaux seront soumis à un régime riche en protéines pour une durée de 9 semaines dont les 4 dernières correspondront aux interventions pharmacologiques. Cette intervention commencera donc lorsque les animaux auront 14 semaines et se terminera à l’âge 18 semaines. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique telles que le diabète de type 2 et ses conséquences sur la fonction rénale normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte. Pour une raison de coût financier, les animaux seront commandés à l’âge de 4-5 semaines et seront hébergés dans notre animalerie en attendant d’avoir 9 semaines d’âge.
Etude de l’efficacité de composés anti-obésités en développement chez la souris diabétique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Rendues obèses par un régime gras et hébergées seules, elles reçoivent chaque jour un composé par gavage, des pesées, des prélèvements de sang à la queue et un test de tolérance au glucose précédé de plusieurs heures de jeûne. Le porteur précise que l'étude est menée pour le compte d'un "client" en vue d'un dossier d'autorisation de mise sur le marché, et que le diabète sévère et le traitement peuvent entraîner une perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier l'effet d'un composé sur le poids et le métabolisme.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Dans ce contexte, notre client souhaite évaluer l'effet des nouveaux composés sur les symptômes liés à l'obésité chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). Dans ce contexte, notre entreprise mènera, au nom de notre client, une étude in vivo visant à évaluer les effets des composés clients sur la prise alimentaire, le poids corporel et le métabolisme du glucose chez les souris obèses (induites par une alimentation enrichie en graisses). L’étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement de composés d'intérêt thérapeutique, destinés à l’amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré que ces composés induisent une perte de poids corporel associée à une diminution de prise alimentaire chez des souris obèses. L’objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l’impact à plus long terme de ces composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris soumises à une alimentation enrichie en graisses (HFD; 60% de l'énergie fournie par les lipides).
Bénéfices attendus
Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de part leur phénotype - un hébergement individuel sur toute l'étude - une administration orale quotidienne à partir de D-11 - une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - un prélèvement sanguin à la queue à D-3 et D29 - une prise alimentaire et une pesée trois fois par semaine à partir de D1 - une mise à jeûn de 4h - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) à D28 [Mise à jeun pendant 8h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 30min avant et à 0, 5, 20 et 60min aprés administration du glucose] De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance.
Impact sur les animaux
La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h), une mise à jeûn de 4h avant euthanasie sont prévus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance au glucose (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés (Procédure 1 : Euthasol en surdose/Procédure 2 : mélange de kétamine/xylazine) avant la dislocation cervicale.
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Modèles murins pour comprendre les fonctions de p53 dans la moëlle osseuse.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
174 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des prélèvements sanguins tous les deux mois pendant un an après inactivation d'un gène dans leur moelle osseuse, pour étudier le rôle de la protéine p53 dans la production des cellules du sang. Le porteur indique que cette inactivation peut provoquer une insuffisance médullaire ou une leucémie, avec un point limite déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il qualifie la souris de "modèle incontournable" et juge son usage "indispensable", les retombées thérapeutiques n'étant évoquées qu'au conditionnel.
Objectifs
La moëlle osseuse est un tissu situé au centre des os où tous les différents types de cellules du sang sont produites : Les globules rouges (qui transportent l’oxygène), les globules blancs (qui protègent des infections) et les plaquettes (qui s’accumulent lors d’une blessure pour arrêter une hémorragie). Ces cellules sanguines ont une durée de vie allant de quelques jours à quelques mois et doivent être continuellement renouvelées tout au long de la vie. Le processus de renouvellement des cellules sanguines est appelé hématopoïèse. Ce processus est finement régulé. Un défaut d’hématopoïèse peut être à l’origine d’une anémie causée par un défaut de production des globules rouges et de transport d’oxygène ou d’une thrombopénie causée par un défaut de production des plaquettes responsable de défauts de cicatrisation et d’hémorragies. A l’inverse une trop grande production de plaquettes peut créer des caillots de sang qui vont obstruer la circulation sanguine.
Bénéfices attendus
Les données du projet permettront peut-être aussi d’identifier une nouvelle stratégie thérapeutique dans les syndromes d’insuffisance médullaire associés à une hyperactivation de p53.
Procédures
Pour assurer le suivi des animaux, des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile tous les deux mois sur une durée maximale d’un an
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiellement associés à l’inactivation de notre gène d’intérêt dans l’ensemble de l’organisme sont inconnus. Les effets indésirables possibles de son inactivation ciblée dans la moëlle osseuse sont le développement soit d’une insuffisance médullaire soit d’une leucémie.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des analyses in vitro réalisées au préalable sur des lignées cellulaires murines et humaines ont révélé que la protéine p53 inhibe l’expression de plusieurs gènes fréquemment inactivés dans les syndromes d’insuffisance médullaire. Ce mécanisme est indirect et dépend du recrutement sur l’ADN d’un complexe protéique ayant un rôle répresseur sur l’expression des gènes. Ces résultats suggèrent la possibilité de prévenir l’insuffisance médullaire en atténuant l’activité du complexe répresseur induit par la suractivation de p53. Le projet a pour but maintenant d’étudier chez la souris, organisme vivant intégré et autonome, les conséquences physiologiques d’une perte de fonction de ce complexe répresseur. L’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
Les stratégies d’accouplement sont optimisées afin d’obtenir le maximum de souris de génotype adéquat et ainsi réduire l’élevage. Pour chaque souris euthanasiée, un maximum d’organes est prélevé et les tissus sont congelés et/ ou fixés pour analyses ARN, protéines et histologiques. Dans les différentes procédures, le nombre d’animaux est suffisant pour mesurer des différences significatives.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet peuvent avoir un phénotype dommageable. Afin d’éviter toute souffrance et/ou détresse, une grille d’évaluation de l’état de l’animal sera appliquée pour définir le point limite à partir duquel l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Grâce à sa parenté biologique avec l’Humain (génome murin/humain, physiologie) et à la possibilité de modifier son génome, la souris est un modèle incontournable pour la compréhension des mécanismes qui contribuent au développement des syndromes d’insuffisance médullaire prédisposant aux cancers. Les conséquences de l’inactivation de notre gène d’intérêt in vivo sont totalement inconnues, c’est pourquoi une analyse phénotypique chez l’embryon et l’adulte sera réalisée. Les conséquences de l’inactivation de notre gène d’intérêt dans le lignage hématopoïétique sont également inconnues. Le suivi d’une éventuelle anémie ou hémopathie maligne sera réalisé chez des animaux adultes.
Développement de modèles de neuropathies périphériques liées à la chimiothérapie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des injections répétées de deux anticancéreux, le paclitaxel et la vincristine, pour reproduire les neuropathies douloureuses provoquées par la chimiothérapie chez les patients, avec mesure de l'activité nerveuse sous anesthésie. Le porteur décrit des atteintes possibles, perte de poids, baisse d'activité, agressivité et douleur, et reconnaît avoir eu du mal à trouver dans la littérature une description détaillée de ces effets. Il affirme que la réponse aux chimiothérapies ne peut se modéliser ni in vitro ni in silico et qu'aucune alternative ne remplace l'animal, avant un prélèvement terminal de peau et de nerf.
Objectifs
Dans ce projet pilote, notre objectif est de tester deux protocoles actuellement utilisés dans la chimiothérapie chez l’Homme. Les molécules d’intérêts, bien qu’efficaces dans le traitement contre le cancer, sont responsables de l’apparition de neuropathies périphériques particulièrement handicapantes, qui se manifestent chez plus de 68% des patients traités avec un anti-cancéreux. Les troubles neuropathiques perdurent même après l’arrêt du traitement. La neuropathie périphérique induite par chimiothérapie (CIPN : Chemotherapy-induced peripheral neuropathy) se manifeste par une atteinte sensorielle des membres, tels que des douleurs, picotements, engourdissements, sensations de brûlure, sensibilités à la température, etc. et sont globalement similaires d’un agent chimio thérapeutique à l’autre. Malgré la connaissance des mécanismes de toxicité de ces différents traitements, il n’y a, à l’heure actuelle, aucun médicament capable de soigner efficacement et de manière définitive la neuropathie périphérique, les traitements étant majoritairement à but palliatif. Bien que de nombreux modèles rongeurs (souris et rats) aient été développés, l’incohérence des résultats reste un problème. Ainsi, il existe autant de résultats que de protocoles expérimentaux, engendrant une véritable confusion autour de ces modèles. Ici, nous souhaitons mettre en place un modèle fiable et reproductible, qui serait une représentation pré-clinique fidèle des CIPN observés chez l’Homme, en administrant aux rats de molécules couramment utilisées dans la chimiothérapie en hôpital.
Bénéfices attendus
Une fois validé par analyse statistique, ce modèle nous donnera la possibilité d’envisager différentes approches pharmacologiques et thérapeutiques qui pourraient conduire au traitement des CIPN. La construction de ce modèle est impossible sans l’utilisation d’animaux vivants. L’organisme étant un ensemble complexe, il serait difficile de modéliser la réponse systémique aux chimiothérapies sur des modèles in-vitro ou in-silico. Ainsi, à l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de remplacer l'expérimentation animale par d'autres alternatives pour ce projet.
Procédures
Les animaux de la première procedure (Taxol), auront quatre injections en intrapéritonéale. Ainsi qu'une mesure électromyographique sous anesthésique gazeuse au jour 29. Les animaux de la second procédure (Vincristine), auront cinq injections par voie intraveineuse. Ainsi qu'une mesure électromyographique sous anesthésique gazeuse au jour 18.
Impact sur les animaux
Pour ce modèle, les nuisances possibles sont une baisse du poids, une baisse d’activité, le développement d’une agressivité et/ou de douleur, une inflammation du point d’injection. Cependant, il nous a été très difficile de trouver dans la littérature une description détaillée des effets secondaires qui ont déjà été observés à la suite du traitement par les anticancéreux
Devenir
Tous les animaux subissant des prélèvements de peau et de nerf à la fin de leur procédure, ils sont tous euthanasiés.
Remplacement
Ce projet s’articule autour d’une pathologie nerveuse liée aux effets secondaires d’un traitement anti-cancereux actuellement utilisé en médecine humaine. Les processus mis en jeu dans ce cas ne peuvent être modélisés qu’à travers l’étude de l’animal vivant. Les cultures cellulaires, de même que les modèles in-silico, ne nous fourniraient qu’une réponse limitée et ne pourraient, en l’état actuel des connaissances, remplacer le système complexe qu’est l’organisme vivant. Ainsi même si des études prélimianires sont possibles et faites (selection des molécules, étude de leur mécanisme anti-cancéreux), l’étude présentée dans ce projet ne pourrait être complètement réalisée sans le recours aux animaux.
Réduction
Nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe après analyse une statistique à l’aide d’un logiciel. Chaque molécule sera testée à 1 dose choisie suite à notre revue de la littérature et les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques permettant d'évaluer si les traitements chimiothérapiques testés peuvent induire des neuropathies. Chaque groupe sera composé de 10 animaux. Pour comparaison, nous intègrerons également 20 animaux contrôles qui seront traités avec le véhicule de chaque molécule. Cette expérience sera ensuite répétée une deuxième fois afin de confirmer ou infirmer les résultats de la première session.
Raffinement
Les animaux utilisés seront hébergés dans notre animalerie dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations : nous portons une attention particulière aux conditions d’hébergement afin que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte des tunnels en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les animaux font également l’objet d’une surveillance quotidienne, et tout signe de souffrance entraine un signalement à la structure interne du bien-être animal, pour prendre une décision rapide sur le devenir de l’animal (pouvant aller jusqu’à l’interruption des procédures) et pour raffiner notre grille de points limites pour nos futures procédures. Tous les moyens possibles sont utilisés pour améliorer le bien-être des animaux du projet. Afin de réduire la souffrance dans la mesure du possible, par la détermination de points limites prédictifs et de critères d'arrêt permettant d'interrompre les procédures .
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons pris le parti d’utiliser des rats mâles Sprague- Dawley. Cette souche est une des souches les plus utilisées dans la littérature en ce qui concerne la modélisation de cette pathologie (DOI: 10.1371/journal.pone.0221787). Les études utilisant cette souche semblent les plus robustes et les plus reproductibles. De plus, l’appareillage présent dans les locaux de Neurofit est mieux adapté aux souches de rats. Les animaux que nous utiliserons seront adultes (environ 6-8 semaines soit 250g au moment de la première injection pour les mâles et environ 200g au moment de la première injection soit pour les femelles), les CIPNs observés en clinique touchant en grande majorité les individus adultes. De plus nous souhaitons que les animaux puissent supporter au mieux les traitements entrepris dans ce projet.
Etude du potentiel thérapeutique de peptides ciblant les oligomères d’Aβ dans le modèle murin APP/PS1 de la maladie d’Alzheimer EU 3/3
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par le nez, tous les deux jours pendant six mois, des composés censés limiter les protéines anormales de la maladie d'Alzheimer, puis subissent trois tests de mémoire, spatiale, d'association entre contexte et émotion et de reconnaissance d'objet, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur indique que l'administration par le nez peut induire un stress et une détresse respiratoire. Il décrit l'utilisation de ces animaux comme "indispensable" et conclut que l'effet sur la mémoire ne peut s'étudier qu'in vivo.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l'accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d'augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l'évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l'accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l'efficacité de ces composés à bloquer la formation, l'accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L'ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d'Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d'Alzheimer, afin d'étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours, sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d'Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.
Impact sur les animaux
L'application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d'habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l'administration intranasale de composés comme l'induction d'une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu'une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l'animal sera sorti immédiatement de l'étude et mis à mort après induction d'une anesthésie profonde.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d'intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l'intégrité de leurs cellules nerveuses.
Remplacement
Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d'utiliser d'autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l'étude et/ou mort de l’animal).
Raffinement
Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l'étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l'avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.
Rôle des hormones thyroïdiennes sur croissance de tumeurs intestinales en xénogreffes sous-cutanées et analyse de l’effet sur la chimiothérapie FOLFIRI
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues hyperthyroïdiennes par leur eau de boisson pendant dix-huit semaines, elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau puis neuf injections de chimiothérapie, pour mesurer l'effet des hormones thyroïdiennes sur l'efficacité du traitement. Le porteur indique que la chimiothérapie peut provoquer des diarrhées et du sang dans les selles, les manipulations se faisant sur animal vigile. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier que dans un "organisme complet" et juge l'animal "absolument nécessaire", les retombées pour les patients restant hypothétiques.
Objectifs
Le but du projet est de réaliser des expériences permettant d’analyser les effets des Hormones Thyroïdiennes (HT) sur la croissance de tumeurs chez la souris lorsqu’un traitement par chimiothérapie est mis en place. La chimiothérapie est l’un des traitements majeurs mis en place pour combattre le cancer. Elle vise à éliminer les cellules cancéreuses quel que soit l’endroit où elles se trouvent dans le corps. Nous savons par nos travaux antérieurs que les HT influent le développement de certains cancers, dont le cancer colorectal. Nous souhaitons étudier maintenant si ce taux d’HT influe également sur l’efficacité de la chimiothérapie. Pour cela, nous utiliserons des souris hyperthyroïdiennes (avec un niveau d’HT plus élevé que la normale) auxquelles nous grefferont des cellules cancéreuses. Une fois que les tumeurs se seront développées, ces souris recevront une chimiothérapie. Nous pourrons alors étudier l’impact des HT sur le développement des tumeurs et estimer si les HT ont un impact sur l’efficacité de la chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Des patients atteints de cancers colorectaux se retrouvent dans une situation d’hyperthyroïdie. Nous savons qu’il existe un lien entre les HT et le développent tumoral. SI cet effet est caractérisé et mieux compris, les traitements pourront être mieux adaptés pour les patients.
Procédures
Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui seront hébergées dans une pièce dédiée à ce type d'animaux afin de les protéger au maximum. Les animaux recevront d’abord un traitement pour induire une hyperthyroïdie sub-clinique dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 18 semaines. Les souris subiront ensuite une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Cela dure quelques secondes. Cette injection engendrera un développement de tumeurs. Enfin, les souris seront traitées par chimiothérapie. L’administration de ce traitement se fait par cycle de 3 injection par semaine. Il y aura 3 cycles de traitement au total, soit 9 injections par souris. Entre chaque cycle de traitement, il y aura une semaine de repos. Chaque injection dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des souris immunodéprimées qui seront hébergées dans une pièce dédiée à ce type d'animaux afin de les protéger au maximum. Les animaux recevront d’abord un traitement pour induire une hyperthyroïdie sub-clinique dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure. Cette hyperthyroïdie induit des modifications physiologiques légères, en particulier une tendance à une légère hyperthermie. Les souris subiront ensuite une greffe de cellules cancéreuses sous la peau. Cela dure quelques secondes. Cette injection engendrera un développement de tumeurs. Enfin, les souris seront traitées par chimiothérapie. L’administration de ce traitement se fait par cycle de 3 injection par semaine. Il y aura 3 cycles de traitement au total, soit 9 injections par souris. Entre chaque cycle de traitement, il y aura une semaine de repos. Chaque injection dure quelques secondes. La chimiothérapie peut provoquer des effets secondaires comme des diarrhées et du sang dans les selles. Les manipulations se feront sur animal vigile.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. En effet, le but est de mener des analyses sur plusieurs de leurs tissus (tumeurs et organes) afin d'évaluer l'impact des hormones thyroïdiennes lors d'une chimiothérapie.
Remplacement
Un travail en amont a été réalisé in vitro sur les cellules cancéreuses utilisées dans ce projet. A présent, il s'agit d'étudier l'impact des hormones thyroïdiennes et leur effet sur un traitement de chimiothérapie. Pour cela, ces cellules cancéreuses doivent être implantées dans un organisme afin de reproduire au mieux les conditions physiologiques dans lesquelles les tumeurs se développent habituellement. Il nous faut donc avoir recours à un système intégré et mature, dans notre cas le modèle souris.
Réduction
Ce nombre a été réduit au maximum tout en restant suffisant et statistiquement robuste pour apporter des réponses claires à notre projet.
Raffinement
Les souris, de par leur statut immunodéficient, seront hébergées en groupes sociaux dans des conditions sanitaires contrôlées en disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux seront commandés chez un fournisseur et à leur arrivée au laboratoire, ils bénéficieront d’une période d’acclimatation pour leur permettre de s’habituer à leur nouvel environnement. Une habituation à la manipulation sera également réalisée après cette période d’acclimatation. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, taille des tumeurs, état général) sera effectué. Des points limites (poids et état de maigreur, taille des tumeurs) ont été établis permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris comme modèle. L'animal est absolument nécessaire par son côté physiologique intégratif. Dans notre projet, l'étude de l'effet des hormones thyroïdiennes (HT) sur le développement de tumeurs cancéreuses et l’étude de l'impact de ces hormones lors d'un traitement de chimiothérapie ne peuvent se faire que dans des organismes complets. La culture sur cellules ne permet pas d'étudier la totalité des mécanismes ni d'évaluer l'efficacité d'un traitement et ses effets. Les animaux seront âgés d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur un stade adulte.
Nouvelle classe d’anticorps thérapeutiques ciblant la destruction intracellulaire de leur cible
- Recherche appliquée
- Cancers
231 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines sous la peau, des prélèvements de sang dans la queue et des injections intraveineuses hebdomadaires, pour tester des anticorps modifiés censés dégrader leur cible à l'intérieur des cellules tumorales. La croissance de la tumeur peut provoquer une perte de mobilité et de poids, et les animaux sont tués pour prélever tumeurs et organes métastasés. Le porteur affirme que les tests sur cellules ne reproduisent pas la complexité d'un "organisme entier" et conclut à la nécessité de recourir à la souris, les bénéfices pour les patients restant renvoyés au long terme.
Objectifs
Ce projet consiste à étudier l’amélioration de l’efficacité des anticorps thérapeutiques, utilisés aujourd’hui dans le traitement de certains cancers, par des modifications. Actuellement, les traitements utilisant des anticorps permettent rarement la dégradation de leur cible. Le but ultime de cette étude est de rendre ces anticorps thérapeutiques (mAb) plus efficaces en les rendant capables de dégrader leur cible à l'intérieur des cellules. Pour ce faire, ces mAb sont modifiés leur permettant d'être internalisés dans la cellule. Ainsi, une fois la cible liée à l’anticorps modifié, le complexe est adressé vers l’intérieur de la cellule et une dégradation de la cible est attendue. Les premiers résultats des tests cellulaires de dégradation de la cible, avec des anticorps utilisés actuellement en clinique pour le traitement du cancer, se sont révélés encourageants avec une dégradation plus importante de la cible grâce aux mAb modifiés. Afin de pouvoir poursuivre le développement de ces nouveaux mAb, l’étude de l’efficacité sur l’animal est nécessaire. Des modèles murins présentant des greffes de cellules cancéreuses humaines seront utilisés afin d’évaluer l’amélioration du potentiel thérapeutique des anticorps modifiés.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de l’amélioration de l’efficacité des anticorps thérapeutiques, la technologie AMFA a pour but de rendre plus efficace les traitements en permettant la dégradation des cibles surexprimées dans le cadre de cancers et d’autres maladies telles que les maladies inflammatoires. Dans cette étude, une régression significative de la taille de la tumeur voire sa disparition est attendue pour les souris traitées avec le mAb-AMFA. Aussi, la survie des animaux traités avec le mAb-AMFA devrait être supérieure. A long terme, c’est un traitement moins contraignant et plus efficace qui pourra être proposé aux patients dans le cadre d’une immunothérapie anti-cancéreuse.
Procédures
Les animaux seront injectés, une seule fois, de cellules cancéreuses dans le tissu sous-cutané. L'intervention est estimée à 1 minute par animal. Les souris seront soumises à un prélèvement de sang dans la veine caudale avant le traitement et à 15 jours après le début du traitement. L'intervention est estimée à 3 minutes (contention + prélèvement). Les souris seront aussi injectées dans la veine caudale toutes les semaines soit 4 fois. La durée de l'intervention est estimée à 5 minutes (contention + pré-chauffage de la queue + injection) par animal.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de l’étude, il peut être attendu une perte de mobilité ainsi qu’une perte de poids chez les animaux xénogreffés, à cause de la croissance tumorale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de pouvoir récupérer les tumeurs et les organes présentant des métastases pour analyse.
Remplacement
Afin de limiter au maximum l’utilisation des animaux, des études aux résultats encourageants sur cellules cancéreuses ont préalablement été menées afin de tester l’efficacité du nouveau traitement proposé. Cependant, ces expérimentations ne prennent pas en considération la complexité de la physiologie d’un organisme entier. Pour confirmer le potentiel thérapeutique de cette approche et poursuivre le développement du traitement jusqu’à son application chez le patient, il est nécessaire de tester son efficacité chez l’animal dans le but de se rapprocher le plus possible de l’Homme.
Réduction
Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible tout en gardant des résultats exploitables, une recherche bibliographique a été réalisée afin de baser les tests statistiques de manière sérieuse pour chaque mAb. Ainsi, pour l’étude pilote, le nombre de souris correspond au nombre moyen d’animaux par groupe utilisés dans des études classiques. Concernant le nombre des animaux utilisés pour les mAb, il a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistiques et tout en tenant compte des effets de taille spécifiques à chaque mAb, d’après la recherche bibliographique. Aussi, la concentration des traitements administrés a été déterminée à la suite d’une recherche bibliographique pertinente pour chaque modèle afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
En plus des conditions réglementaires du bien-être animal, les animaux seront placés par 4 par cage afin de stimuler les contacts sociaux entre eux. Aussi, les animaux seront manipulés quotidiennement dès leur arrivée pour limiter le stress des animaux lors de l’expérimentation. Aucune douleur n’est attendue à la suite de l’injection des cellules tumorales. La croissance de la tumeur dans le cadre de notre étude sera contrôlée tous les cinq jours et limitée, afin de ne pas entrainer de douleur chez l’animal. Aussi, dans le but de limiter la souffrance animale et d’après une recherche bibliographique pertinente, seule concentration de chaque anticorps sera administrée à chaque animal. Les animaux seront quotidiennement surveillés selon une fiche de suivi clinique standard. Si des signes de douleur de l’animal sont perçus, les animaux seront sortis de l’étude. Pour faciliter la réhydratation des animaux après la greffe de la tumeur, de la nourriture gélifiée sera disponible ad libitum dans la cage.
Choix des espèces
Les souris utilisées seront des BALB/c nude athymiques, des animaux immunodéprimés, pour éviter tout rejet de la greffe utilisant des cellules humaines. Ces modèles permettront d’apprécier l’efficacité unique des traitements appliqués. L’âge des souris utilisées dans cette étude est de 5 à 6 semaines, âge où les animaux sont sexuellement matures et adultes. C’est aussi à ces âges où l’on observe une meilleure prise de greffe ainsi qu’une forte homogénéité.
Cancer Colorectal : développement de nouveaux bio-marqueurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Génétiquement modifiées pour être dépourvues de trois protéines, elles reçoivent quatre injections intrapéritonéales et deux prélèvements sanguins pour produire des anticorps, avant le prélèvement de la rate. Le porteur destine ces anticorps au diagnostic du cancer colorectal. Il affirme que la production d'anticorps ne peut se faire que dans un animal vivant au système immunitaire opérationnel.
Objectifs
Le cancer colorectal (CCR) est la troisième malignité en nombre de nouveaux cas par an en Europe. Dans ce projet, nous allons clarifier le rôle de 3 protéines encore peu étudiées et dont l’expression peut être un biomarqueur pronostique pour le CCR et/ou un indicateur pour les options de traitements spécifiques. Nous avons mis en évidence une altération de l’expression de ces protéines dans des tumeurs de patients atteints de CCR en comparaison avec la muqueuse intestinale normale du même patient. Hors actuellement, il n'existe pas d’anticorps fiables reconnaissant spécifiquement ces molécules. C’est pourquoi nous souhaitons générer des anticorps monoclonaux dirigés contre ces protéines de modification de la structure cellulaire, qui pourront être utilisés comme des nouveaux outils indispensables dans la caractérisation en routine de biopsie du colon et ainsi permettront d’affiner le diagnostic et le traitement des patients atteint de CCR.
Bénéfices attendus
La production d’anticorps spécifiques pour des enzymes de modification de la structure cellulaire permettra, à court terme, de pouvoir confirmer nos résultats de recherche obtenus aux niveaux de l’expression des gènes. Ils nous permettront également de visualiser la distribution de ces enzymes dans les différents compartiments du colon et ainsi de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans le développement du cancer colorectal. A plus long terme, nous pourrons également proposer ces anticorps en clinique humaine, pour déterminer le niveau d’expression des protéines aux différents stades du cancer colorectal et dans les différents sous-types de cancer. La cartographie plus précise de cette expression permettra de proposer ces enzymes comme biomarqueurs de façon à diriger plus efficacement les stratégies de traitement.
Procédures
Chaque animal entrant dans ce projet sera soumis, vigile, aux interventions suivantes : - 4 injections intrapéritonéales d’un liquide inerte de 100µl, espacées de 2-3 semaines. Cet acte représente moins d’une minute ; - 2 prélèvements de 70-100µl de sang au niveau mandibulaire (réalisé pas un personnel de l’animalerie parfaitement formé à cette technique), 7 jours après la 2° et la 3° injection, soit deux prélèvements à 2-3 semaine d’intervalle. Cet acte représente moins d’une minute.
Impact sur les animaux
L’injection intrapéritonéale de l’antigène représente une souffrance de classe légère. Notre pratique régulière de cette procédure montre que la gêne la plus importante pour les animaux est le stress lié à la contention et à la piqure de l’aiguille. Pour le réduire au maximum, l’aiguille utilisée est une 26G que nous utilisons seulement pour injecter 2 souris, car ensuite le bout est trop émoussé. A son retour dans sa cage, la souris va y trouver une récompense sous forme de pâtée alimentaire différente des croquettes habituelles.
Devenir
Chaque animal entrant dans ce projet sera mis à mort afin de prélever sa rate, organe à partir duquel nous isolerons les lymphocytes B producteurs d’anticorps
Remplacement
La réaction immunitaire contre un antigène/protéine conduisant à la production de lymphocytes B producteurs d’anticorps n’est possible que dans un animale vivant avec un système immunitaire opérationnel, soit chez la souris pour la génération d’anticorps monoclonaux, soit chez le lapin pour celle d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Donc cette première phase de la production d’anticorps ne peut pas utiliser de méthode alternative. Le choix de la souris comme espèce de travail se justifie par le faite que l’anticorps va être généré par immunisation d’une souris déficiente pour l’antigène/protéine d’intérêt pour avoir une réponse immunitaire élevée et spécifique. De plus les clones auront l’avantage d’avoir une spécificité stricte et leur mode de production assurera une production infinie et reproductible d’anticorps de lot-à-lot.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires pour la génération d'un anticorps monoclonal spécifique dépend de l'antigène/protéine et notamment de son immunogénicité, habituellement il est de l’ordre de 4 à 8 souris. Aucune analyse empirique ne documente cela, mais ces chiffres sont basés sur l'expérience du chercheur principal, qui a généré divers anticorps monoclonaux au cours de sa carrière scientifique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés selon les standards prévus pour la règlementation, en groupes sociaux, dans un environnement adapté et enrichi (cabane, coton à dépiauter pour faire un nid). Les 4 femelles, injectées pour une même protéine, seront regroupées dans une même cage. Lors des injections de l’antigène, les souris vont trouver, à leur retour dans la cage, une récompense sous forme de pâtée alimentaire différente des croquettes habituelles. Pour que les animaux se partagent la récompense, et ne se battent pas, nous déposons autant de portions de pâtée alimentaire (de la taille d’une noisette) que d’animaux présents dans la cage et ceci de manière espacée. Une attention particulière est portée à la formation de l’expérimentateur afin de limiter la durée de la procédure expérimentale et ainsi réduire la douleur et le stress de l’animal.
Choix des espèces
Pour optimiser la réaction immunitaire contre un antigène/protéine conduisant à la production d’anticorps les souris totalement déficientes pour TTLL3, TTLL4 ou TTLL6 (des enzymes de modification de la tubuline) seront utilisées pour générer des anticorps contre ces protéines. L’utilisation d’animaux transgéniques totalement “naifs” vis-à-vis de la protéine contre laquelle nous voulons faire des anticorps augmentera l’efficacité de la réponse immunitaire puisque le système immunitaire n’aura jamais rencontré cet antigène/protéine. Les animaux seront utilisés à partir de 2 mois d'âge selon le protocole établi dans la littérature.