Rongeurs

Toute souris qui perd 20 % de son poids initial est mise à mort, et le médicament testé "peut également provoquer une perte de poids importante", indique le porteur. 1 280 souris sevrées vers quatre semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour mesurer, entre autres, la fonte de leur masse grasse. Nourries d'un régime riche en graisses ou en sucres, ou issues de lignées prédisposées à l'obésité ou au diabète, elles reçoivent des injections dans le ventre, sous une contention répétée trois fois par semaine que le porteur dit source d'un "stress modéré", et une prise de sang tous les trois mois. Le but est de vérifier qu'un médicament qui fait disparaître une "protéine d'intérêt" freine la prise de poids, sans que le porteur nomme la protéine ni le médicament.

Objectifs

En 2020, 8,5 millions de personnes souffrent d’obésité, dont 1 million de personnes en obésité massive soit 17% de la population nationale. De plus, l’obésité, chez les plus jeunes, montre des chiffres inquiétants, puisque l’on observe la plus forte progression des cas d’obésité chez les 18-24 ans. En effet, cette tranche d’âge est passée de 5,4% en 2012 à 9,2% en 2020. Chez les enfants, les observations sont elles aussi alarmantes puisque 34% des enfants de 2-7 ans et 21% des adolescents de 8-17 ans sont en situation de surpoids ou d’obésité. La situation actuelle est inquiétante pour l’avenir car cette augmentation de l’obésité chez les plus jeunes va conduire à une augmentation des pathologies liées à l’obésité telles que les maladies cardio-vasculaires, le diabète et les cancers. L’obésité reste aujourd’hui un problème de santé public important. La finalité du projet et son bien-fondé visent à comprendre le rôle et la fonction de notre protéine d’intérêt dans l’obésité et ses pathologies associées, afin de proposer une nouvelle thérapie pour leur prise en charge. Ce projet repose sur des observations que le laboratoire a obtenu sur cellules ainsi que sur des publications internationales. L’essence même de la question posée implique l’utilisation d’un organisme vivant tel que la souris, afin d’illustrer au plus proche de l’homme sa compléxité métabolique, sans solutions alternatives satisfaisantes.

Bénéfices attendus

Ce projet, à court terme, permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents au développement de l’obésité et des syndromes métaboliques associés. En étudiant, plus particulièrement le rôle et la fonction de notre protéine d’intérêt tout au long de la prise de poids. L’utilisation de souris non modifiées génétiquement mâles et femelles, permettra de modéliser au plus proche de l’humain le métabolisme lors d’un régime riche en lipides ou en sucres. Ces souris seront traitées avec un médicament permettant la disparition de cette protéine. Ceci nous permettra de voir si l’élimination de cette protéine induit une diminution de la prise de poids de nos souris et in fine de prévenir/traiter l’obésité et ses syndrômes métaboliques associés chez le rongeur. De plus, les souris prédisposées génétiquement à une prise de poids accélérée (obésité) ou à un développement de diabète de type 2 permettront de valider l’impact de la dégradation de notre protéine d’intérêt sur un syndrome métabolique établi génétiquement. A la fin du projet, l’objectif est de transférer une nouvelle thérapie vers la clinique afin de mieux répondre aux problématiques de santé publique que constituent que l’obésité et les pathologies associées comme le diabète de type 2.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune procédure chirurgicale au cours de notre projet. On sera toutefois ammené à effectuer un prélévement sanguin tous les 3 mois afin de tester leur glycémie (80uL total de sang prélevé, 1min par souris contention comprise). Les animaux seront soumis à des injections de médicaments dans le bas du ventre (5secondes par souris, contention comprise). Pour pouvoir effectuer ces injections les animaux seront contentionnés de façon adéquat par le personnel.

Impact sur les animaux

Lors du traitement des animaux par un personnel qualifié, l’injection intra-péritonéale à répétition peut entrainer l’apparition occasionnelle d’hématomes sous-cutanés. Pour ces injections nous privilégierons le côté droit de l’animal. Lors de ces injections, il y aura une contention de l’animal (trois fois par semaine) ce qui peut conduire à un stress modéré pour les animaux. La drogue injectée peut également provoquer une perte de poids importante chez les animaux qu’il faudra surveiller attentivement grâce à des pesées tri-hebdomadaires.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en respectant les règles de bien-être animal. Cela afin d’étudier au niveau moléculaire et anatomiques (diminution de la masse graisseuse, etc ) les effets de notre traitement.

Remplacement

Dans le laboratoire, nous avons déjà réalisé in vitro, sur des cellules pré-adipocytaire, les expériences permettant de montrer la nécessité de notre protéine d’intérêt dans la différenciation adipocytaire et son impact sur le métabolisme. Cependant les cellules pré-adipocytaires ne permettent pas d’appréhender la complexité métabolique d’un organisme entier, c’est pourquoi, il est important de réaliser ces procédures expérimentales sur l’animal. Notre objectif in fine, étant de présenter en clinique une nouvelle thérapie contre l’obésité et ses pathologies associées tel que le diabète, l’utilisation des animaux et notamment les souris est indispensable au déroulement de notre projet.

Réduction

Nos resultats expérimentaux obtenus sur des cellules nous permettent d’anticiper certains résultats et ainsi diminuer le nombre de conditions expérimentales sur animal vivant. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en prenant en compte les tests statistiques. Sur cette base, nous avons estimé à 1280 animaux, le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble de notre projet

Raffinement

L’hébergement se fera à raison de 5 animaux par cage, sur un fonds de litière et enrichissement en briques de peuplier ou carrés de cellulose pour favoriser la confection de nids. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les membres du personnel et à heures fixes afin de limiter le stress. Ils seront pesés trois fois par semaine. Tout animal présentant des difficultés à se nourrir ou à s’abreuver sera assisté par le dépôt dans la cage d’un gel lui évitant d’aller chercher en hauteur nourriture ou boisson. Une perte de masse corporelle constituera un indicateur de toxicité et sera considérée comme un point limite conduisant à l’euthanasie de l’animal lorsqu’elle sera égale ou supérieure à 20% du poids initial. Les injections IP seront réalisées par du personnel formé en préviliégiant le coté droit de l’animal . Une attention particulière sera portée aux points suivants afin de limiter la souffrance et la détresse des animaux : - Une absence d’hydratation ou de prise de nourriture afin d’anticiper une perte de poids excédant 20 % du poids initial - Une gêne dans la locomotion - D’autres signes de douleur tels que l’isolement des autres animaux, les yeux fermés ou creux, le dos voûté - Un saignement ou autre perte de liquide physiologique - Un changement du rythme respiratoire - Tout autre comportement anormal de l’animal tel que la prostration ou la vocalise lors de la préhension

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, disposant d’un système génétique et métabolique proche de l’homme. De plus, de nombreux modèles génétiquements modifiés pour les études de l’obésité ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. L’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci sur un organisme entier. Nous choisirons des souris jeunes sevrées (c’est-à-dire environ 4 semaines de vie). Pour notre projet, il est important d’avoir de jeunes souris afin de suivre au plus tôt le développement de la pathologie (obésité/diabéte) mais aussi d’observer au mieux le temps de l’apparition des symdromes métaboliques associées à l’obésité.

Huit heures par jour pendant seize semaines, 160 souris sont placées en hypoxie intermittente, une privation d'oxygène répétée censée reproduire l'apnée du sommeil. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois séries d'injections d'insuline, de glucagon, d'adrénaline ou de dexaméthasone, des gouttes de sang prélevées à la queue et trois ECG et échographies cardiaques sous anesthésie générale. Le porteur décrit des effets "sans conséquence majeure", une ventilation et un hématocrite en hausse, alors que le projet doit établir si ce stress hypoxique dérègle le système sympathique et le métabolisme du foie. Toutes sont tuées au bout des seize semaines pour prélever leurs organes, que d'autres chercheurs du laboratoire pourront se partager.

Objectifs

Le projet vise à répondre à deux questions scientifiques, à savoir : -L’hypoxie intermittente (induite pas l’apnée obstructive du sommeil AOS) provoque-t-elle des dérèglements de l’activation sur système sympathique ? -Si oui, ces dérèglements sont-ils responsables des troubles métaboliques hépatique associés à ce stress hypoxique et plus largement à cette pathologie (AOS) ?

Bénéfices attendus

L'activation du système sympathique dans la pathologie de l'AOS commence d'être décrite en clinique par des observations cardiaques (ECG). Par ailleurs, cette activation a sans doute des répercussions sur le plan métabolique que nous allons tenter de comprendre. Si une activation de la voie sympathique s'avère dans notre modèle d'exposition à l'HI avec des désordres métaboliques associés, nous allons pouvoir envisager des traitements d'inactivation de cette voie (Béta bloquant ou autre) avec des répercussions importantes. Au final, l'idée est de développer une nouvelle thérapie pour lutter contre les déréglements métaboliques associés au SAOS.

Procédures

Les animaux seront soumis à de l'hypoxie intermittente 8 heure par jour, pendant 16 semaines de 8h à 16h. Ils suivront des tests de stimulations à différentes drogues connues afin d'évaluer leur sensibilité à celles-ci (3 tests à la 2ème, 8ème et 16ème semaine d'exposition à l'hypoxie). Ils auront des mesures de glycémie par microprélèvements (goutte de sang prélevée à la queue, 3 tests). Il suivront 3 ECG et 3 echographies cardiaques non invasifs, réalisés sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le modèle d'exposition à l'hypoxie intermittente est bien connu au laboratoire et les effets secondaires sur les animaux sont bien décrits (augmentation de la ventilation et augmentation de l'hématocrite sans conséquence majeure). Les traitements utilisés sont déjà connus dans la litérature et au laboratoire, il ne devrait pas y avoir de problème. Les injections de glucagon devraient augmenter la glycémie des animaux (mais sans excés). Les injection d'insuline devraient provoquer une baisse de la glycémie. Si celle-ci devient inférieure à 40mg/dl les animaux recevront une injection de glucose à 10% (2mg/kg). Les injections d'adrénaline, d'isoprénaline, de noradrénaline et de dexaméthazone sont attendues pour augementer légèrement la fréquence cardiaque.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue des 16 semaines d'hypoxie afin de prélever différents organes. Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.

Remplacement

Nous avons pris en compte la règle des 3 R car ces expérimentations seront réalisées avec le souci de remplacer l'expérimentation animale. Seulement à ce jour aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle animal pour analyser les dérèglements des systèmes intégrés comme l'activation du système sympathique .

Réduction

Nous réduisons le nombre d'expérience en multipliant les tests à partir d'un seul animal graçe a des analyses non invasives (ECG+Echographie) à différents temps (avant le sacrifice teminal). Nous utilisons également le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Cette étude est menée avec un grand souci de raffinement d'autant que ces analyses sont très sensibles aux moindres perturbations des animaux (stress etc). Ainsi nous veillerons à respecter scrupuleusement les cycles jours/nuit et limiterons fortement les allers et venues dans l'animalerie ainsi que le bruit pour ne pas déranger les animaux. Les animaux suivront également des habituations de manipulation par les expérimentateurs afin de limiter fortement le stress des animaux durant les analyses. Les animaux seront anesthésiés durant les ECG et les échographies.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l'Homme, notamment dans le cadre d'études systémiques, premettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques avant d'entreprendre des études cliniques. Enfin la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparativité des études scientifiques. Le modèle d'exposition des souris à l'hypoxie intermittente étant déjà bien caractérisé et publié dans la litérature. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte ou adulte afin de mimer au mieux la pathologie clinique qui survient à l'age adulte. Age de 16 semaines à l'entrée dans l'étude.

1890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles de dystrophies musculaires, elles reçoivent des injections répétées et des gavages plusieurs fois par semaine, ainsi que des vecteurs de thérapie génique, avant une évaluation de la force musculaire sous anesthésie terminale. Le porteur soutient que les traitements, "tous de nature bénéfique", ne justifient pas de points limites, tout en décrivant des modèles sévères au phénotype avancé. Il affirme que l'effet ne peut être obtenu que dans un organisme "entier" et qualifie ces expériences d'"absolument indispensables".

Objectifs

L'objectif de ce projet s’inscrit dans l’évaluation d’approches de thérapie génique médiées par des vecteurs viraux pour les dystrophies musculaires, pour lesquelles il n’existe, à l’heure actuelle, aucun traitement. Ces maladies sont caractérisées par des cycles de dégénérescence/régénération du muscle entrainant une perte des fibres musculaires au profit de tissu fibrotique ou adipeux. Ce processus dégénératif provient de défauts génétiques et conduit à des conséquences délétères sur la fonction motrice, la qualité et la durée de vie des patients. Il peut impacter les capacités de réversion du phénotype myopathologique. En raison de la progressivité du processus dégénératif, le diagnostic et le traitement se réalisent alors que la dégénération est engagée déjà depuis des années chez les patients. Il semble que ceci soit à l’origine de la faible efficacité des approches de thérapie génique observée dans les essais cliniques dans les dystrophies musculaires où la restauration fonctionnelle dépasse rarement 15%. De plus, les essais cliniques soulignent la possibilité d’apparition d’effets adverses liés aux doses utilisées. Il apparait donc nécessaire d’adjoindre au transfert de gène des traitements agissant sur le mécanisme physiopathologique dystrophique afin d’obtenir un effet thérapeutique probant et une meilleure sécurité. Le but est d’évaluer l’effet de traitements thérapeutiques agissant sur les différentes composantes du processus dystrophique en combinaison avec un produit de thérapie génique pour évaluer leur synergie sur les modèles murins des pathologies incluses dans le projet à un stade précoce et avancé de la maladie. Les résultats obtenus devraient permettre une meilleure efficacité de la thérapie génique et une réduction des possibilités de toxicité par une diminution des doses à administrer chez les patients. Les animaux utilisés sont des souris modèles et leurs contrôles normaux. Le nombre nécessaire est de 1890 animaux. Les traitements associés peuvent être de petites molécules qui seront administrées soit par gavage, soit par administration intrapéritonéale, sur une durée variable. Ils peuvent également être réalisés par transfert de gène. Dans ce cas, ils seront co-administrés avec le traitement de thérapie génique. Un suivi de biomarqueurs sériques permettra de suivre l’effet au cours du temps. L’évaluation de l’effet thérapeutique sera réalisée par des études de la fonction du muscle, et après sacrifice par des études moléculaires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices devant découler de ce projet concernent le domaine de la santé humaine. Ils visent à valider l’effet thérapeutique de combinaisons associant soit une petite molécule, soit une modulation génique, à un traitement de thérapie génique d’intérêt pour un groupe de maladie humaine sur un modèle murin de la maladie. L’observation d’un effet thérapeutique permettra d’envisager un essai clinique qui, s’il est probant, devrait permettre de stopper l’évolution de la pathologie chez les patients atteints de dystrophie et donc de valider une thérapie pour des maladies qui n’en n’ont pas à ce jour. La combinaison de traitement permettra d’augmenter la correction chez les patients et d’améliorer la sécurité de produits de thérapie génique par la réduction des doses requises.

Procédures

Toutes les molécules pharmacologiques seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Elles seront administrées soit par voie orale, soit par injection intra péritonéale (durée injection moins de 1 minute), sur animaux vigiles. L’administration par voie orale se fait par gavage à l’aide d’une canule souple en plastique à bout arrondi afin de ne pas blesser l’animal (durée : entre 30 secondes et 1 minute). Les traitements adjoints administrés par AAV et le traitement de thérapie génique se font par injection intraveineuse en une seule fois, soit sur animaux vigile avec injection dans la veine caudale (durée : moins de 1 minute en injection rapide et entre 3 à 10 minutes pour les injections lentes), soit sur animaux anesthésiés au sinus (durée : moins de 1 minute). Dans ce cas l’anesthésie est une anesthésie gazeuse de courte durée. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée. (Durée de l’intervention : moins de 10 minutes entre l’anesthésie et le réveil de l’animal. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. En fin de protocole, les animaux sont soumis à une évaluation fonctionnelle sur muscle semi-isolé sur animaux analgésiés et anesthésiés. L’analgésique est injecté 30 minutes avant l’anesthésie qui est une anesthésie par voie intra-péritonéale profonde sans réveil de l’animal. L’évaluation fonctionnelle dure en moyenne 30-45 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : - Piqûres intrapéritonéales d’un volume maximum de 100µl pour l’administration de molécules (5 fois par semaine sur animaux vigiles) ou d’anesthésique une seule fois en fin de protocole. Pour réduire les nuisances, les animaux seront traités 30 minutes avant la procédure avec un analgésique. - Gavage pour administration de molécules (maximum 200µl, 5 fois par semaine) - Intraveineuse caudale ou au sinus pour injection AAV (soit en bolus de 100µl/20g, soit en IV lente 500µl/20g, une fois au cours du protocole) * Possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies (utilisation de gel pour réduire cette nuisance). En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils sont porteurs d’une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères (SGCA et SGCG) au stade avancé de la pathologie. Cependant, même dans ce cas, les nuisances possibles n’ont pas d’impact sur la survie et ne sont pas de nature à nécessiter la mise en place de points limites. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés par dislocation cervicale.

Remplacement

Afin de valider l’effet thérapeutique in vivo au préalable à une application chez l’homme, nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris), car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne nous permet d’étudier les symptômes de perte de la locomotion typiques des dystrophies musculaires. De plus, afin d’estimer l’efficacité de nos approches expérimentales, il est nécessaire d’administrer les vecteurs dans un organisme entier capable de répondre physiologiquement aux traitements administrés. Ceci ne peut être obtenu in vitro et justifie notre recours à des animaux.

Réduction

Un effort de réduction a été réalisé en amont de ce projet. En effet, les molécules pharmacologiques utilisées dans ce projet ont toutes déjà démontré leur efficacité sur la souris mdx, modèle de la myopathie de Duchenne. Nous savons donc qu’elles ont un effet bénéfique, reste à savoir maintenant si, combinées à la thérapie génique, elles pourront augmenter la correction et permettre une réduction des doses de vecteurs. La dose administrée a déjà été validée chez la souris. Au cours des 5 années du projet, nous avons prévu d’utiliser un total de 1890 souris pour faire l'ensemble des expériences in vivo. Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes. Tous les modèles sont sur le même fond génétique., nous pouvons donc utiliser les mêmes souris contrôles pour tous les modèles. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les différentes conditions seront testées en premier lieu sur les modèles les plus sévères. Pour les conditions ne montrant pas d’effet positif, les traitements ne seront pas testés sur les modèles les moins sévères, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Le raffinement du projet inclus la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Le souci de raffinement est une préoccupation permanente tout au long de la vie des animaux et pendant les différentes étapes des protocoles expérimentaux. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris reçoivent un traitement analgésique, et si cette douleur persiste, les animaux sont sacrifiés pour éviter toute souffrance. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi, ils sont observés quotidiennement pendant les jours ouvrés. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures de sacrifice appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés dans ce projet sont des souris modèles de la pathologie étudiée. Dans cette étude, les animaux seront utilisés à partir de leur sevrage jusqu’à un stade tardif de la pathologie (variable selon les modèles mais entre 6 mois et 1 an) afin de refléter au mieux la maladie humaine puisqu’il s’agit de pathologies progressives. Les signes cliniques peuvent apparaitre dès l’enfance, mais également à l’âge adulte pour certaines dystrophies. Après le sevrage, les animaux présentent une taille de muscle et des conditions physiques suffisantes pour évaluer la fonction musculaire et présentent déjà des signes histologiques pour les modèles les plus sévères. Des animaux plus âgés (entre 6 mois et 12 mois) seront également utilisés, afin d’évaluer l’effet thérapeutique sur des animaux où le phénotype dystrophique est installé, ce qui permettra d’évaluer la réversion du phénotype au stade tardif. En effet, il est indispensable de savoir si le traitement est efficace lorsque la maladie est installée afin de pouvoir proposer un traitement à des patients qui sont à un stade avancé de la maladie.

20 souris Hairless vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une plaie de 6 mm est pratiquée sur chaque flanc puis traitée avec deux formulations en gel tous les deux jours jusqu'à cicatrisation, les animaux étant maintenus isolés en cage individuelle. Le porteur reconnaît une douleur possible durant les 24 heures suivant l'induction des plaies et un stress lié à la privation d'interactions sociales. Il affirme que ni culture cellulaire ni explant cutané ne reproduisent la complexité de la cicatrisation, qui ne peut être appréhendée qu'in vivo.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer les effets de 2 formulations sous forme de gel, administrées par application cutanée locale (voie topique) à 2 doses, sur le processus de cicatrisation sur un modèle de plaies cutanées induites par excision cutanée complète chez la souris Hairless Skh-1.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité sur la cicatrisation de 2 formulations en cours de développement, formulations ayant montré des effets bénéfiques sur la prolifération cellulaire in vitro. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le processus cicatriciel des ces formulations in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 formulations testées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction des plaies cutanées. Sous anesthésie générale, une plaie cutanée de 6 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectuée sur les flancs gauche et droit de chacune des 20 souris nécessaires à la réalisation de ce projet. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 5 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les plaies cutanées seront traitées immédiatement après leur induction puis tous les 2 jours jusqu’à cicatrisation complète. Les plaies cutanées seront protégées par un pansement de couverture changé tous les 2 jours sous anesthésie gazeuse et seront observées et scorées lors de chaque change effectué. Un suivi quotidien des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.

Impact sur les animaux

L’induction des plaies cutanées peut engendrer une douleur au cours des 24 heures suivant celle-ci. D’autre part, un stress dû à la limitation des interactions sociales directes pourra être induit par l’hébergement en cage individuelle transparente des souris, rendu nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci. Pour ces raisons, la procédure expérimentale a été classée en sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction des plaies cutanées puis le traitement et le suivi de celles-ci jusqu’à leur cicatrisation complète, les souris seront mises à mort. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction des plaies cutanées pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la régénération du tissu cutané.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, au moins 2 semaines selon notre connaissance du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, angiogénèse, réépithélialisation…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé par le Département Statistiques de notre client qui développe un nouveau programme informatique dans lequel sont compilées les données d’études in vitro et in vivo réalisées sur plusieurs années avec des composés de nature proche. Ce programme informatique modélise ainsi la transposition des résultats d’études in vitro aux études in vivo dans le but premier de réduire le nombre d’animaux utilisés en expérimentation, l’objectif final étant de développer une alternative à l’expérimentation animale. Selon le test de puissance statistique effectué, en prenant en compte les mêmes conditions expérimentales, il est ainsi nécessaire d’utiliser au moins 3,6 animaux avec 2 plaies cutanées par animal donc 4 animaux (soit 8 plaies cutanées) par groupe expérimental pour mettre en évidence des différences significatives.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celles-ci. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’infection des plaies cutanées ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des morceaux de papier absorbants seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des plaies cutanées représentatives des plaies à traiter chez l’Homme, et la souris Hairless est un modèle très utilisé et largement décrit dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la cicatrisation. De plus, elle présente une structure de la peau proche de celle de l’Homme permettant une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la cicatrisation (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats très intéressants.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs rénales, elles reçoivent un traitement par gavage quotidien et sont suivies par échographie puis IRM sous anesthésie, avant mise à mort pour analyse des organes. Le porteur annonce des bénéfices en termes de compréhension des mécanismes du cancer et de pistes thérapeutiques, formulés au conditionnel. Il affirme que les expériences in vitro ou in silico ne conviennent pas car "trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu" et que la souris est le seul mammifère où les gènes visés ont été mutés.

Objectifs

Les cancers du rein représentent environ 2% des tumeurs malignes chez l’être humain. Au cours des dernières décennies, l’incidence de ce cancer a progressivement augmenté. Le cancer du rein touche davantage les hommes que les femmes, il est diagnostiqué principalement entre 60 et 70 ans mais peut survenir à tout âge. Les facteurs de risque principaux sont le tabagisme et l’obésité. Le potentiel métastatique de ces cancers est important. La survie médiane à ce stade n’est que de treize mois, le défi thérapeutique est donc immense. Au cours des dix dernières années, il a été clairement établi que ces cancers sont associés à des anomalies génétiques spécifiques tant dans les formes sporadiques que dans les formes héréditaires. Actuellement, il n'existe pas modèle préclinique pour analyser correctement le developpement d'un cancer du rein. Un modèle préclinique efficace permettrait de mieux comprendre les mécanismes de progression de la maladie et d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant au développement de cellules cancéreuses. Identification potentielle de nouveaux traitements. Identification potentielle de biomarqueurs.

Procédures

Un traitement sera administré par gavage quotidien pour faire diminuer le volume tumoral. Celui ci sera effectué́ par un technicien expérimenté́ et le plus petit volume possible sera administré aux souris. Le gavage sera réalisé chez des souris adultes. Les sondes de gavages sont les dernières arrivées sur le marché́, en silicone, ultra souple et non traumatisante pour l’animal. Les tumeurs rénales seront surveillées en imagerie à intervalles réguliers (echographie une fois par mois puis une seule IRM en fin de procédure).

Impact sur les animaux

Nous n'attendons aucun effet indésirable lié au gavage. Nous serons particulièrement attentif aux fausses routes (point limite établi). La réalisation des suivis en imagerie se fera sous anesthesie générale. Nous serons particulièrement attentifs au stress induit par l'anesthésie (point limite établi).

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Dans un contexte de recherche physiopathologique sur le cancer du rein, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu.

Réduction

La taille des groupes utilisés représente le minimum nécessaire et suffisant pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés aux procédures expérimentales.

Raffinement

Enfin, nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Par ailleurs, des points-limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Nous espérons ainsi identifier de nouveaux traitements médicamenteux qui pourraient améliorer les conditions de vie des patients porteurs de ces mutations génétiques et pour lesquels aucun traitement satisfaisant n'existe.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et que de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). La souris est le seul mammifère pour lequel les protéines PIK3CA, VHL et SDHA ont été mutéee. Souris âgées d'au moins 4 semaines car il est nécessaire que leur développement soit terminé.

550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de fixation d'une pièce métallique sur le crâne, une restriction hydrique et, pour une partie, une perfusion intracardiaque terminale, afin d'enregistrer l'activité de neurones pendant des tâches olfactives. Les souris sont maintenues assoiffées, la totalité de leur eau quotidienne servant de récompense pour les faire travailler dans le dispositif, où elles doivent aussi éviter des bouffées d'air ou d'eau salée. Le porteur affirme que la souris est le seul mammifère au système olfactif proche de l'humain et qu'aucune approche in vitro ou in silico ne peut répondre à ses questions.

Objectifs

Les odeurs ont une capacité unique à nous transporter dans des moments reculés de notre passé, notamment ceux associés à des émotions fortes. Elles jouent également un rôle très important dans les choix que nous faisons au jour le jour, notamment lorsqu’il s’agit de notre alimentation. Mais qu'est-ce qui, dans le système olfactif, confère aux odeurs ces propriétés particulières ? Dans cette étude, nous étudierons les voies anatomiques et les mécanismes physiologiques par lesquels les odeurs laissent une empreinte émotionnelle si forte dans nos mémoires.

Bénéfices attendus

Cette recherche peut fournir des indications importantes sur les mécanismes neuronaux qui attachent une valence hédonique à un objet. Dans de nombreux troubles neurodégénératifs, à mesure que la maladie progresse (en particulier dans le cas de la dégénérescence du lobe frontal), les patients souffrent car ils sont moins connectés au monde qui les entoure. La valeur qu'ils attribuent à différents éléments peut être déformée, ce qui peut entraîner des changements radicaux dans leur personnalité, inquiétants pour eux et leurs proches. Si cette recherche permet de découvrir l'ensemble des connexions qui attribuent une valeur émotionnelle aux odeurs, elle peut donner un aperçu de la physiopathologie de ces troubles. Outre les maladies neurodégénératives, des études récentes ont également montré que les enfants atteints de troubles du spectre autistique (TSA) n'adaptent pas leur comportement de reniflage lorsqu'on leur présente des substances odorantes aversives ou appétissantes, alors que les enfants au développement normal le font. Cela suggère une déconnexion entre l'intégration des informations sensorielles et les processus de mémoire émotionnelle dans les TSA, et ce travail pourrait permettre de comprendre comment les odeurs se voient attribuer une signification émotionnelle qui conduit à un comportement adaptatif.

Procédures

Dans cette étude, toutes les souris (550) subiront une intervention chirurgicale. Certaines souris (490) seront fixées à la tête et soumises à une restriction hydrique, et d'autres seront perfusées par voie intracardiaque à la fin de l'étude (460).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, les souris seront placées dans un appareil comportemental dans lequel elles devront utiliser leur odorat pour trouver une récompense hydrique et éviter les petites bouffées d'air ou d'eau salée. Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir les souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. Pour les motiver à effectuer des tâches dans l'appareil, la totalité de l'apport en eau quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux.

Devenir

Sur les 490 souris soumises à une restriction hydrique, 90 seront mis à mort et 400 seront gardé en vie. Sur les 550 (y compris les 490 de la restriction hydrique) animaux qui subissent une intervention chirurgicale, 90 (le même 90 que la restriction hydrique) seront mis à mort et 460 seront gardés en vie. Ces 460 pourront être mises à mort et utilisé pour contrôles histologiques en fin d’expérimentation.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront une tâche comportementale : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 550 souris sur 5 ans. Les techniques d’enregistrement (électrodes très fines et lentilles à gradients d'indices) que nous prévoyons d’utiliser permettent de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés car un grand volume de données pourra être collecté sur plusieurs jours au sein d’un même animal. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début de leur entraînement, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L'accoutumance à l'expérimentateur et aux conditions expérimentales permettra également aux animaux d'accomplir les tâches comportementales avec un minimum de stress.

Choix des espèces

Ce projet vise à comprendre les mécanismes neuronaux qui explique comment la valence hédonique d'une odeur affecte son encodage dans le cortex olfactif, et comment cette information est acheminée pour guider les comportements adaptatifs. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que la souris est en train d’apprendre et d'exprimer leur préférences olfactifs : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. La souris est la seule espèce de mammifère qui possède un système olfactif très similaire à celui des humains dans lequel nous pouvons entraîner les animaux à s'approcher et à éviter différentes odeurs tout en enregistrant et en manipulant l'activité dans des groupes de neurones génétiquement et anatomiquement circonscrits. La boîte à outils pour ces manipulations chez la souris est bien plus développée que pour tout autre organisme modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Par précaution par rapport à ce dernier point, nous utiliserons uniquement des animaux dont le poids est compris entre 20 et 45g.